CN106480053B - 重组核酸片段RecCR023414及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了重组核酸片段及其检测方法。本申请还提供了含有重组核酸片段的水稻植株的选育方法，利用分子标记对重组植株进行前景选择和背景选择，获得了含有重组核酸片段的水稻植株。

Description

重组核酸片段RecCR023414及其检测方法

技术领域

本申请涉及全基因组选择育种技术。具体而言，本申请涉及利用全基因组选择育种技术选育含有重组核酸片段的水稻植株，以及由此而获得的重组核酸片段及其检测方法。

背景技术

褐飞虱，学名Nilaparvata lugens

属同翅目，飞虱科。褐飞虱是单食性害虫，仅取食水稻，具有喜温、抗寒能力弱、生长周期短、远距离迁飞、暴发性和猖獗性等特征。褐飞虱是典型的刺吸式害虫，以取食韧皮部和木质部汁液为生，取食量大、繁殖快，一旦大爆发，可造成受害区域颗粒无收。此外，还可以传播水稻病毒病(如：草状丛矮病和齿叶矮缩病)，对水稻生产也造成严重危害。

自20世纪80年代以来，从野生稻和栽培稻中已经鉴定超过30个抗褐飞虱位点。由于褐飞虱表型鉴定的复杂性，导致近几年才克隆Bph14、Bph26和Bph3等个别基因(Du等，PNAS.2009,106(52):22163-22168；Tamura等，Sci Rep.2014,4:5872；Liu等，NatureBiotechnology.2015,33:301-305)。另外，随着抗褐飞虱品种在生产中的不断利用，褐飞虱对品种的适应能力逐渐增强。一些在生产上广泛利用的抗性品种正逐渐丧失对褐飞虱的抗性(Deen等，Rice Genet Newsl.2010,25:70-72)。目前，褐飞虱防治仍依靠化学农药，不仅增加生产成本，污染环境，而且促使褐飞虱抗药性增强。

由此可见，抗褐飞虱新品种的培育需求非常迫切。

发明内容

一方面，本申请提供了重组核酸片段，其选自：i)包含SEQ ID No.1所示序列403-454位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；ii)包含SEQ ID No.1所示序列的序列或其片段或其变体或其互补序列；iii)包含SEQ ID No.2所示序列342-605位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；或iv)包含SEQ ID No.2所示序列的序列或其片段或其变体或其互补序列；以及以上片段的组合。在一实施方案中，所述重组核酸片段为基因组重组核酸片段。

此外，本申请提供了检测所述重组核酸片段的引物，其选自：(I)特异性识别SEQID NO:1所示序列1-403位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列454-812位核苷酸的序列的反向引物；(II)以下第一组引物对与第二组引物对的组合，其包含(a)第一组引物对：特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-403位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第403-453位核苷酸的序列的反向引物；和(b)第二组引物对：特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第403-453位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第454-812位核苷酸的序列的反向引物；(III)特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第403-404位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ IDNO:1所示序列第453-454位核苷酸的序列的反向引物；(IV)特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第403-404位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第454-812位核苷酸的序列的反向引物；(V)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-403位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第453-454位核苷酸的序列的反向引物；和/或任选地，(VI)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列1-342位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列605-881位核苷酸的序列的反向引物；(VII)以下第三组引物对与第四组引物对的组合，其包含(c)第三组引物对：特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-342位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第343-604位核苷酸的序列的反向引物；和(d)第四组引物对：特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第343-604位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第605-881位核苷酸的序列的反向引物；(VIII)特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第342-343位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第604-605位核苷酸的序列的反向引物；(IX)特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第342-343位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第605-881位核苷酸的序列的反向引物；(X)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-342位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ IDNO:2所示序列第604-605位核苷酸的序列的反向引物。

在一实施方案中，用于扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对为，例如，5’-CGTCGCCGTCTTCGTCTTTCTTG-3’，和5’-TCCATAGGTCTCATTTGGGTTCA-3’。用于检测SEQ ID NO:1所示序列的测序引物为，例如，5’-CGTCGCCGTCTTCGTCTTTCTTG-3’；和5’-TCCATAGGTCTCATTTGGGTTCA-3’。

在另一实施方案中，用于扩增SEQ ID NO:2所示序列的引物对为，例如，5’-CAGCCCGTATCAGCAACCTTCAC-3’，和5’-TTAATCATGTCGCCGATCACCAC-3’。用于检测SEQ ID NO:2所示序列的测序引物为，例如，5’-CAGCCCGTATCAGCAACCTTCAC-3’；5’-CATATCCCAGACAACAAGG-3’；和5’-TTAATCATGTCGCCGATCACCAC-3’。

另一方面，本申请提供了选育含有重组核酸片段的水稻植株的方法，其包括以不含目的基因组片段的水稻受体植物亲本作为轮回亲本，将其与含有目的基因组片段的水稻供体植物进行杂交，然后将所得到的杂交种与轮回亲本进行回交，再将所得到的回交种进行自交的步骤，其中利用分子标记对重组植株进行前景选择和背景选择。例如，所述重组核酸片段如前所述。

在上述方法中，用于所述前景选择的分子标记选自BphC04ID06、RM6659和BphC04S08中的一种或多种；和/或利用水稻全基因组育种芯片进行所述背景选择。

在一实施方案中，本申请提供的选育含有抗褐飞虱基因组重组核酸片段的水稻植株的方法，其包括以下步骤：1)将轮回亲本与供体植物进行杂交，将所得到的杂交种与轮回亲本进行回交，获得回交一代，利用正向选择标记BphC04ID06和负向选择标记RM6659、BphC04S08对其进行抗褐飞虱基因组片段的单侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片，例如RICE6K，对其进行背景选择；2)选择背景回复较好的重组单株(此世代背景回复值超过75％)与轮回亲本再次进行回交，获得回交二代，利用正向选择标记BphC04ID06对其进行检测，选择含有抗褐飞虱基因组片段的重组单株，然后利用水稻全基因组育种芯片，例如RICE6K，对其进行背景选择；3)选择背景回复好的重组单株(此世代背景回复值超过87.5％)与轮回亲本又一次进行回交，获得回交三代，利用正向选择标记BphC04ID06和负向选择标记RM6659、BphC04S08对其进行抗褐飞虱基因组片段的另一侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片，例如RICE60K，对其进行背景选择；以及4)选择导入片段小，且背景回复好的重组单株(背景回复值超过93.75％)，将选中的重组单株自交一次，获得自交种，利用正向选择标记BphC04ID06对其进行检测，并利用水稻全基因组育种芯片，例如RICE60K，对其进行背景选择，最终获得含纯合抗褐飞虱基因组重组核酸片段且背景回复(背景回复值超过99％)的水稻植株。

在另一实施方案中，利用分子标记对重组植株进行前景选择时采用的扩增引物，包括：用于扩增分子标记BphC04ID06的引物对，其中正向引物为5’-CCTAGCCGTCAGGTTAATAGATCAT-3’，反向引物为5’-ACCAGGTCTACTAGCTTTTACGGAG-3’；用于扩增分子标记RM6659的引物对，其中正向引物为5’-TGTGGAGGCTTAGGAAATTCTGG-3’，反向引物为5’-TGTGAAACATGCCACGATACTGC-3’；用于扩增分子标记BphC04S08的引物对，其中正向引物为5’-GAGCGATCCATTAGCACGTGACT-3’，反向引物为5’-GTTTCTAGGTGTTCCCAACTCTCCC-3’。

又一方面，本申请提供了检测重组核酸片段的方法，其包括根据如前所述的重组核酸片段设计特异性引物，以待测基因组为模板进行PCR反应，并分析PCR扩增产物的步骤。具体地，例如，所述引物如前所述。可选择地，利用Sanger测序法分析PCR扩增产物。

具体而言，本申请提供的检测重组核酸片段的方法中，用于扩增及检测SEQ IDNo.1所示序列的引物组合如下：扩增引物，包括正向引物：5’-CGTCGCCGTCTTCGTCTTTCTTG-3’，和反向引物：5’-TCCATAGGTCTCATTTGGGTTCA-3’；测序引物，包括正向引物：5’-CGTCGCCGTCTTCGTCTTTCTTG-3’，和反向引物：5’-TCCATAGGTCTCATTTGGGTTCA-3’。所述方法以待测样品基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，然后利用上述测序引物对获得的扩增产物进行测序，若测序结果与SEQ ID No.1序列一致或互补，则待测样品中含有SEQ ID No.1所示同源重组片段。

另外，在本申请提供的检测重组核酸片段的方法中，用于扩增及检测SEQ ID No.2所示序列的引物组合如下：扩增引物，包括正向引物：5’-CAGCCCGTATCAGCAACCTTCAC-3’，和反向引物：5’-TTAATCATGTCGCCGATCACCAC-3’；测序引物，包括正向引物：5’-CAGCCCGTATCAGCAACCTTCAC-3’，正向引物：5’-CATATCCCAGACAACAAGG-3’，和反向引物：5’-TTAATCATGTCGCCGATCACCAC-3’。所述方法以待测样品基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，然后利用上述测序引物对获得的扩增产物进行测序，若测序结果与SEQ IDNo.2序列一致或互补，则待测样品中含有SEQ ID No.2所示同源重组片段。

通过检测确定了待测样品中含有SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示序列的重组核酸片段，即可确定待测样品中包含抗性基因重组核酸片段。

此外，本申请还提供了检测重组核酸片段的试剂盒，其包括如前述的引物。

进一步地，本申请还提供了筛选含有重组核酸片段的水稻植株或种子的方法，其包括检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段的步骤。在一实施方案中，采用如前所述的引物来检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段。在另一实施方案中，采用如前所述的检测重组核酸片段的方法来检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段。在又一实施方案中，采用如前所述的试剂盒来检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段。

在又一方面，本申请提供了通过所述方法筛选得到的含有本申请公开的重组核酸片段的水稻植株或其种子。

本申请提供的基于全基因组选择育种技术选育含有抗褐飞虱基因组重组核酸片段的水稻植株的方法，具有快速、准确、稳定三大特点。仅通过五世代转育，即可仅将目标基因组片段导入受体材料，并同时实现背景的回复。本申请改良的受体材料为光温敏核不育系‘龙S’。利用上述方法，可以在不改变‘龙S’光温敏核不育特性的前提下，导入褐飞虱抗性基因组片段。进一步的，通过配组实现杂交种褐飞虱抗性的大幅度提高。本申请提供的重组核酸片段与褐飞虱抗性紧密相关，可作为抗性资源应用于其他品种的培育。

附图说明

图1为本申请实施例1中CR023414水稻RICE60K全基因组育种芯片检测结果；其中，横坐标数字所指示方框依次表示水稻12条染色体，纵坐标数字为水稻基因组上的物理位置[以兆碱基(Mb)为单位]，灰色线条代表受体亲本‘龙S’基因型，黑色线条代表供体亲本‘华130B’基因型，白色线条代表两亲本基因型一致即无多态性区段。图中第4号染色体黑色圆点处线条显示区段即为导入的抗褐飞虱基因组重组核酸片段RecCR023414。

图2为本申请实施例2中RecCR023414上游同源重组片段测序比对结果；图中所示星号代表比对结果中相同碱基，图中CR023414为获得的新品系，T007为受体亲本‘龙S’，R005为供体亲本‘华130B’。

图3为本申请实施例2中RecCR023414下游同源重组片段测序比对结果。

图4为本申请实施例2中RecCR023414两侧同源重组片段的结构图；其中，(A)为上游同源重组片段结构图；(B)为下游同源重组片段结构图，上方碱基为供体‘华130B’的SNP或InDel标记，下方碱基为受体‘龙S’的SNP或InDel标记。灰色区段为来源于‘龙S’基因组区段，黑色区段为来源于‘华130B’基因组区段，白色区段为同源重组区段，横坐标为片段长度，以碱基对数目(bp)为单位。

图5为本申请实施例3中CR023414褐飞虱抗性室内鉴定结果；图中所示叶片依次为：(A)高感褐飞虱品种‘台中在来1号’；(B)原品种‘龙S’；(C)改良新品系CR023414；(D)供体亲本‘华130B’。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向从左向右书写，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。在某些实施方案中，可以依照单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

具体地，本申请涉及对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2进一步优化所得的核苷酸序列。该方法的更多细节描述于Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。优化核苷酸序列可用于提高抗褐飞虱基因组重组核酸片段在水稻中的表达。

在一些实施方案中，本申请还涉及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的变体。一般来讲，特定核苷酸序列的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互补序列。这样的变体序列包括一个或多个核酸残基的添加、缺失或替换，从而可以导致相应的氨基酸残基的添加、移除或替换。通过本领域内已知的序列比对程序包括杂交技术确定序列同一性。实施方案的核苷酸序列变体与本申请的序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。

本申请还涉及包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列中特定位点的序列或其片段或其变体或其互补序列，例如，包含SEQ ID No.1所示序列的403-454位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列，或者包含SEQ ID No.2所示序列的342-605位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列。根据包含上述特定位点的片段，能够特异性地鉴定出相应的SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列。进一步地，通过鉴定出含有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列的重组核酸片段，即可确定待测样品中包含抗性重组核酸片段。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植株并包括可以与水稻育种的所有植物品种。如本文所用，“植株”或“植物”，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。

在本申请的方法可以适用于任何需要选育的水稻品种。也就是说，可以将任何缺少某种有利性状的优良品种(即综合性状较好，预计有发展前途的品种)用作轮回亲本。用另一具有该受体所缺少的有利性状的品种作为供体亲本。在本申请的实施方案中，采用水稻‘龙S’作为轮回亲本，采用具有良好的褐飞虱抗性的水稻‘华130B’作为供体。

在本申请所提供的重组植株的选育方法中，利用分子标记对重组植株进行前景选择。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因组片段间连锁的紧密程度，为提高选择的准确率，一般同时用两侧相邻的两个标记对目标基因组片段进行跟踪选择。

在本申请的实施方案中，采用的前景选择标记包括正向选择标记和负向选择标记，其中，正向选择标记是在距目标基因组片段(含抗褐飞虱基因)上、下游50kb(在水稻中其遗传距离为0.2cM)范围内筛选的多型性分子标记。负向选择标记是在距目标基因组片段上、下游500kb(在水稻中其遗传距离为2cM)范围内筛选的多型性分子标记。在具体实施方案中，经优化筛选使用的正向选择标记是与目标基因组片段紧密连锁的标记BphC04ID06，负向选择标记是距目标片段上游约370kb的分子标记RM6659，以及距目标片段下游约200kb的分子标记BphC04S08。

在本申请的实施方案中，利用上述前景选择标记进行同源重组的检测时，一侧或单侧同源重组的判断标准是BphC04ID06检出与‘华130B’相同带型，且RM6659或BphC04S08检出与‘龙S’相同带型；两侧或双侧同源重组的判断标准是BphC04ID06检出与‘华130B’相同带型，且RM6659和BphC04S08检出与‘龙S’相同带型。

在本申请中，可以使用任何一种可利用的芯片进行本申请所提供的育种方法中的背景选择。在优选的实施方案中，可以采用本申请人在中国专利申请CN102747138A中公开的水稻全基因组育种芯片RICE6K，或者在PCT国际申请WO/2014/121419中公开的水稻全基因组育种芯片RICE60K。这两份申请文件中的全部内容整体并入本文作为参考。

以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecularcloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本申请中所使用的水稻植株材料信息均可参见中国水稻品种及其系谱数据库(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本申请中所提到的水稻基因组物理位置均参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

本申请所提到的公开SSR分子标记可参见网站http://www.gramene.org/。

实施例1选育导入抗褐飞虱基因组片段的重组植株

本实施例中使用的材料为水稻‘龙S’及水稻‘华130B’。

水稻‘华130B’具有良好的褐飞虱抗性，推测可能是第4号染色体的Bph3(Liu等，Nature Biotechnology.2015,33:301-305)、QBph4(Hu等，Molecular Breeding.2015,35:3)和Bph15(Yang等，Theoretical and Applied Genetics.2004,110:182-191)所在的基因簇区域对该材料的褐飞虱抗性起了关键作用。

在重组植株的选育过程中，利用分子标记对重组植株进行前景选择，对所采用的前景选择分子标记进行了筛选。所使用的分子标记部分来源于网站http://www.gramene.org/，部分自行设计。设计方法为，参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版，下载前述区段DNA序列。使用SSRLocator软件对上述序列中的SSR位点进行扫描。利用Primer Premier 3.0软件对寻找出的SSR位点设计引物，共设计引物106对。通过PCR的方法，筛选上述引物对在‘华130B’及‘龙S’中的多态性，最终挑选出在两份材料中具有多态性、扩增效率高的前景选择分子标记，分别是正向选择标记BphC04ID06和负向选择标记RM6659、BphC04S08。用于PCR扩增上述分子标记的具体引物信息见表1。

表1前景选择分子标记引物信息

将‘华130B’中前述基因簇所在的基因组片段导入到‘龙S’中，具体过程如下：

以‘龙S’为轮回亲本，‘华130B’为供体亲本进行杂交，将所得到的杂交种与轮回亲本‘龙S’进行回交，获得BC₁F₁种子，育苗后利用正向选择标记BphC04ID06和负向选择标记RM6659、BphC04S08进行重组单株选择，筛选出10个在目标基因组片段一侧同源重组的单株，即BphC04ID06检出与‘华130B’相同带型，且RM6659或BphC04S08检出与‘龙S’相同带型，并利用水稻全基因组育种芯片RICE6K(CN102747138A)对其进行背景选择(Yu等,PlantBiotechnology Journal.2014,12:28-37)。

在筛选出的10个单侧同源重组单株中比较芯片结果，选择背景回复最好的重组单株(此世代背景回复值超过75％)，使其与轮回亲本‘龙S’再次进行回交，获得BC₂F₁种子，育苗后利用正向选择标记BphC04ID06对其进行检测，选择含有目标基因组片段的重组单株，BphC04ID06检出与‘华130B’相同带型，利用水稻全基因组育种芯片RICE6K对其进行背景选择。

选择背景回复较好的单株(此世代背景回复值超过87.5％)，使其与轮回亲本‘龙S’又一次进行回交，获得BC₃F₁种子，育苗后利用正向选择标记BphC04ID06和负向标记RM6659、BphC04S08对收获的种子进行目标基因组片段另一侧同源重组片段的筛选，获得2个在目标片段两侧重组的单株，BphC04ID06检出与‘华130B’相同带型，且RM6659和BphC04S08检出与‘龙S’相同带型。

利用水稻全基因组育种芯片RICE60K(WO/2014/121419)对上述2个双侧交换单株进行背景和目标片段选择(Chen等，Molecular Plant.2014,7:541-553)，筛选到导入目标片段较小，且背景回复好的目标单株一个(此世代背景回复值超过93.75％)。

将选中的单株自交一次，获得BC₃F₂，育苗后利用正向选择标记BphC04ID06对其进行检测，选择含有目标基因组片段的单株，BphC04ID06检出与‘华130B’相同带型，利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景选择。

最终获得目标片段纯合，且背景回复(背景回复值超过99％)的株系一个，命名为CR023414。芯片检测结果见图1。

因‘龙S’为两系不育系，在上述过程中的BC₁F₁、BC₂F₁、BC₃F₁及BC₃F₂世代入选单株均为不育单株，采取了以下办法实现不育单株的育性转化以回交或自交：当不育单株进入生殖期4期时，在低温处理区(21-23℃)处理10天左右，可利用植物人工气候箱、植物生长室、冷水浸灌池等；使用碘-碘化钾染色法对抽出穗的花粉进行育性鉴定，判定70％以上花粉可育的穗为育性成功转化穗，随即开展回交或自交。

实施例2导入褐飞虱抗性基因组片段后同源重组片段的确定

为了确定导入的抗褐飞虱基因组片段大小，对‘龙S’导入抗褐飞虱基因组片段的纯合单株进行了目标基因组片段两侧同源重组片段的测序。将CR023414所含的抗褐飞虱基因组重组核酸片段命名为RecCR023414。

通过水稻全基因组育种芯片RICE60K检测结果初步确定，RecCR023414位于两个SNP标记F0406623871GA和F0406992603GT之间。

同时，使用Miseq测序技术对‘龙S’、‘华130B’和CR023414三个样本进行全基因组测序。使用TruSeq Nano DNA LT Kit(illumina)试剂盒进行文库建立，使用LibraryQuantification Kit–Universal(KAPA Biosystems)试剂盒进行定量，使用MiSeqV2Reagent Kit(illumina)试剂盒进行测序反应。使用Miseq台式测序仪(illumina)进行检测。具体步骤及方法参见各试剂盒及测序仪使用说明书。

根据前述SNP芯片及Miseq测序结果，将CR023414抗褐飞虱基因组重组片段上游同源重组片段定位在第4染色体的6628224bp到6629035bp区间，下游同源重组片段定位于6991621bp到6992485bp区间。

在此基础上，参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版，下载对应区段DNA序列。使用Primer Premier 5.0软件设计扩增及测序引物，设计要求为引物长22nt左右、GC含量40-60％且没有错配。

以受体亲本‘龙S’和供体亲本‘华130B’为对照，对CR023414的上游和下游同源重组片段分别设计扩增引物，使用高保真酶KOD FX Neo(TOYOBO)进行扩增，使用两步法或三步法寻找最佳扩增条件，确保扩增产物在琼脂糖凝胶电泳检测中显示为单一明亮条带。其中确定的上游同源重组片段扩增引物反应条件为：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃60sec，37个循环；20℃1min。下游同源重组片段扩增引物反应条件为：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃60sec，37个循环；20℃1min。由此，最终筛选出两对扩增引物分别用于上游和下游同源重组片段的扩增。

另外，以扩增产物为模板，利用Sanger测序法进行测序，根据实际测序效果，最终筛选出2条和3条测序引物分别用于上游和下游同源重组片段的测序。

具体的扩增引物及测序引物序列见表2，测序结果见图2和图3。

RecCR023414上游同源重组片段测序长度为812bp(SEQ ID No.1)。1-403bp为受体‘龙S’的基因组区段，与供体‘华130B’比较，存在3个SNP。404-453bp这一50bp区段为同源重组区段。454-812bp为供体‘华130B’基因组片段，与‘龙S’比较，存在5个SNP。

RecCR023414下游同源重组片段测序长度为881bp(SEQ ID No.2)。1-342bp为供体‘华130B’的基因组区段，与‘龙S’比较，存在6个SNP，1个Indel。343-604bp这一262bp区段为同源重组区段。605-881bp为受体‘龙S’的基因组区段，与供体‘华130B’比较，存在4个SNP。

图4为RecCR023414两侧同源重组片段的结构图。其中，(A)为上游同源重组片段结构图；(B)为下游同源重组片段结构图。上方碱基为供体‘华130B’的SNP或InDel标记，下方碱基为受体‘龙S’的SNP或InDel标记。灰色区段为来源于‘龙S’基因组区段，黑色区段为来源于‘华130B’基因组区段，白色区段为同源重组区段。横坐标为片段长度，以碱基对数目(bp)为单位。

表2抗褐飞虱基因组重组核酸片段扩增及测序引物信息

实施例3‘龙S’导入抗褐飞虱基因组片段后的抗性鉴定

为了鉴定选育出的含重组核酸片段植株的褐飞虱抗性，对本申请选育的新品系CR023414、受体亲本‘龙S’、供体亲本‘华130B’(作为阳性对照)，以及高感褐飞虱品种‘台中在来1号’(作为阴性对照)进行褐飞虱室内抗性鉴定，鉴定方法如下。

将各份材料在室内浸种、催芽，随后播种在划好格子线的塑料面盆中，每份材料分3行共播种45株，待两叶一心期时，每行保留10株共30株健康长势一致的植株用于接虫。虫源来自从田间采集到的褐飞虱，并在室内饲养繁殖。取2-3龄若虫到待鉴定的植株上，每株有5-10头若虫即可。待‘台中在来1号’死苗95％时开始记录各鉴定苗的抗性等级，取30株苗的抗性等级的平均值，作为该材料的抗性等级，根据抗性等级评价其抗性水平。其中，抗性等级共分10级：0或1级，叶片未受害或第一片叶叶尖发黄；2级，第一片叶1/2发黄或者叶尖皱缩；3级，第一片叶发黄或是枯萎；4级，第二片叶部分发黄或心叶叶尖发黄；5级，第二片叶发黄、皱缩或是枯萎、心叶青卷；6级，心叶卷曲，心叶叶尖枯萎；7级，心叶卷曲枯萎，植株未死亡；8级，心叶枯萎，稍微倒伏；9级，整株倒伏。根据上述抗性等级，0-0.9级判定为高抗，1.0-2.9级为抗，3.0-5.9级为中抗，6.0-6.9级为中感，7.0-7.9级为感，8.0-9.0级为高感。

褐飞虱室内抗性鉴定结果见图5，其中‘台中在来1号’为高感，原品种‘龙S’为感，改良新品系CR023414为中抗，供体亲本‘华130B’为高抗。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

Claims (9)

1.重组核酸片段，其由以下的第一重组核酸片段和/或第二重组核酸片段组成：

-第一重组核酸片段，其选自：

i)包含SEQ ID No.1所示序列403-454位核苷酸的序列或其互补序列，或

ii)包含SEQ ID No.1所示序列的序列或其互补序列；

-第二重组核酸片段，其选自：

iii)包含SEQ ID No.2所示序列342-605位核苷酸的序列或其互补序列，或

iv)包含SEQ ID No.2所示序列的序列或其互补序列。

2.检测权利要求1所述片段的引物，其中所述引物选自以下的检测第一重组核酸片段的引物和/或检测第二重组核酸片段的引物：

-检测第一重组核酸片段的引物，其选自：

(I)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列1-403位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列454-812位核苷酸的序列的反向引物；

(II)以下第一组引物对与第二组引物对的组合，其包含

(a)第一组引物对：特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-403位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第403-453位核苷酸的序列的反向引物；和

(b)第二组引物对：特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第403-453位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第454-812位核苷酸的序列的反向引物；

(III)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列中包含SEQ ID NO:1所示序列第403-404位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列中包含SEQ ID NO:1所示序列第453-454位核苷酸的序列的反向引物；

(IV)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列中包含SEQ ID NO:1所示序列第403-404位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第454-812位核苷酸的序列的反向引物；或

(V)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-403位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列中包含SEQ ID NO:1所示序列第453-454位核苷酸的序列的反向引物；

-检测第二重组核酸片段的引物，其选自：

(VI)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列1-342位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列605-881位核苷酸的序列的反向引物；

(VII)以下第三组引物对与第四组引物对的组合，其包含

(c)第三组引物对：特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-342位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第343-604位核苷酸的序列的反向引物；和

(d)第四组引物对：特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第343-604位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第605-881位核苷酸的序列的反向引物；

(VIII)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列中包含SEQ ID NO:2所示序列第342-343位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列中包含SEQ ID NO:2所示序列第604-605位核苷酸的序列的反向引物；

(IX)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列中包含SEQ ID NO:2所示序列第342-343位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第605-881位核苷酸的序列的反向引物；或

(X)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-342位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列中包含SEQ ID NO:2所示序列第604-605位核苷酸的序列的反向引物。

3.检测权利要求1所述片段的引物，其中所述引物选自：

(I)扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对

5’-CGTCGCCGTCTTCGTCTTTCTTG-3’，

5’-TCCATAGGTCTCATTTGGGTTCA-3’；

(II)测序SEQ ID NO:1所示序列的引物

5’-CGTCGCCGTCTTCGTCTTTCTTG-3’，

5’-TCCATAGGTCTCATTTGGGTTCA-3’；和/或

(III)扩增SEQ ID NO:2所示序列的引物对

5’-CAGCCCGTATCAGCAACCTTCAC-3’，

5’-TTAATCATGTCGCCGATCACCAC-3’；

(IV)测序SEQ ID NO:2所示序列的引物

5’-CAGCCCGTATCAGCAACCTTCAC-3’；

5’-CATATCCCAGACAACAAGG-3’；

5’-TTAATCATGTCGCCGATCACCAC-3’。

4.检测权利要求1所述的重组核酸片段的方法，其包括采用权利要求2或3所述的引物，以待测基因组为模板进行PCR反应，并分析扩增产物的步骤。

5.检测权利要求1所述的重组核酸片段的试剂盒，其包括权利要求2或3所述的引物。

6.筛选含有权利要求1所述的重组核酸片段的水稻植株或种子的方法，其包括检测待测水稻植株或种子的基因组中是否含有权利要求1所述的重组核酸片段的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其中采用权利要求2或3所述的引物来检测待测水稻植株或种子的基因组中是否含有权利要求1所述的重组核酸片段。

8.如权利要求6所述的方法，其中采用权利要求4所述的方法来检测待测水稻植株或种子的基因组中是否含有权利要求1所述的重组核酸片段。

9.如权利要求6所述的方法，其中采用权利要求5所述的试剂盒来检测待测水稻植株或种子的基因组中是否含有权利要求1所述的重组核酸片段。

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