CN106480062B - 重组核酸片段RecCR012080及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了重组核酸片段及其检测方法。本申请还提供了含有重组核酸片段的水稻植株的选育方法，利用分子标记对重组植株进行前景选择和背景选择，获得了含有重组核酸片段的水稻植株。

Description

重组核酸片段RecCR012080及其检测方法

技术领域

本申请涉及全基因组选择育种技术。具体而言，本申请涉及利用全基因组选择育种技术选育含有重组核酸片段的水稻植株，以及由此而获得的重组核酸片段及其检测方法。

背景技术

长期以来，传统育种的选择方法主要依赖于田间表现型的评价，根据育种家个人经验进行取舍，其最大的缺点在于耗时长，效率较低。要提高选择的效率，最理想的方法应是能够直接对基因型进行选择。随着分子生物技术的发展，分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可能。近年来，已开始应用分子标记辅助选择方法来改良个别目标性状，能够显著的缩短育种年限。

稻瘟病是水稻最严重的病害之一，全球每年由稻瘟病引起的水稻产量损失占11％～30％，因此稻瘟病及其抗性的研究显得尤为重要。随着对稻瘟病研究的逐步深入，许多水稻抗稻瘟病基因DNA片段相继被定位和克隆。其中，水稻第6染色体的Pi2区间被定位和克隆了很多稻瘟病抗性基因，如Pi2、Piz-t、Pi9、Pigm、Pi50，该区间包含一个稻瘟病抗性基因的基因簇(Qu等，Genetics.2006,172:1901-1914；Wang等，Phytopathology.2012,102:779-786；Xiao等，Mol Breeding.2012,30:1715-1726；Liu等，Mol Genet Genomics.2002,267:472-480；Jiang等，Rice.2012,5:29-35；Zhu等，Theor Appl Genet.2012,124:1295-1304；Deng等，Theor Appl Genet.2006,113:705-713)。

发明内容

一方面，本申请提供了重组核酸片段，其选自：i)包含SEQ ID NO:1所示序列第987-1664位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；ii)包含SEQ ID NO:1所示序列的序列或其片段或其变体或其互补序列；iii)包含SEQ ID NO:2所示序列第640-969位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；iv)包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其片段或其变体或其互补序列；以及以上片段的组合。在一实施方案中，所述重组核酸片段为基因组重组核酸片段。

此外，本申请提供了检测所述重组核酸片段的引物，其选自：(I)特异性识别SEQID NO:1所示序列第1-987位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1664-1769位核苷酸的序列的反向引物；(II)以下第一组引物对与第二组引物对的组合，其包含(a)第一组引物对：特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-987位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第988-1663位核苷酸的序列的反向引物；和(b)第二组引物对：特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第988-1663位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1664-1769位核苷酸的序列的反向引物；(III)特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第987-988位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第1663-1664位核苷酸的序列的反向引物；(IV)特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第987-988位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1664-1769位核苷酸的序列的反向引物；(V)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-987位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第1663-1664位核苷酸的序列的反向引物；(VI)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-640位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第968-4260位核苷酸的序列的反向引物；(VII)以下第三组引物对与第四组引物对的组合，其包含(c)第三组引物对：特异性识别SEQID NO:2所示序列第1-640位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第641-967位核苷酸的反向引物；和(d)第四组引物对：特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第641-967位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第968-4260位核苷酸的反向引物；(VIII)特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第640-641位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第968-969位核苷酸的序列的反向引物；(IX)特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第640-641位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第968-4260位核苷酸的序列的反向引物；(X)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-640位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第968-969位核苷酸的序列的反向引物。

在一实施方案中，用于扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对为，例如，5’-GCATTATCGTTGATTCTTGGAGG-3’，5’-AACTAGACGCAAACAGGGCAGTA-3’。用于检测SEQ ID NO:1所示序列的测序引物为，例如，5’-GCATTATCGTTGATTCTTGGAGG-3’；5’-GATTTCGGAGTTGATGTGAT-3’；和5’-AACTAGACGCAAACAGGGCAGTA-3’。

在另一实施方案中，用于扩增SEQ ID NO:2所示序列的引物对为，例如，5’-TCGGTTGGAAAGTGACAATAGG-3’，5’-TTGGGACATAGGACGTTAGATG-3’。用于检测SEQ ID NO:2所示序列的测序引物为，例如，5’-TCGGTTGGAAAGTGACAATAGG-3’；5’-TGGTGGTTCTGGCAGCGATT-3’；5’-TGGGTGCGGAGGTAGAGGTG-3’；5’-CCTAGTCCCGATTGTGCCG-3’；5’-TGCGGCTATGCGTAGTTTGG-3’；5’-CCGTCTTCCCGACCGTGTCC-3’；和5’-TTGGGACATAGGACGTTAGATG-3’。

另一方面，本申请提供了选育含有重组核酸片段的水稻植株的方法，其包括以不含目的基因组片段的水稻受体植物亲本作为轮回亲本，将其与含有目的基因组片段的水稻供体植物进行杂交，然后将所得到的杂交种与轮回亲本进行回交，再将所得到的回交种进行自交的步骤，其中利用分子标记对重组植株进行前景选择和背景选择。例如，所述重组核酸片段如前所述。

在上述方法中，用于所述前景选择的分子标记选自Pi2-4、Pi2S67和Pi2S122中的一种或多种；和/或利用水稻全基因组育种芯片进行所述背景选择。

在一实施方案中，本申请提供的选育含有抗稻瘟病重组核酸片段的水稻植株的方法，其包括以下步骤：1)将轮回亲本与供体植物进行杂交，将所得到的杂交种与轮回亲本进行回交，获得回交一代，利用正向选择标记Pi2-4和负向选择标记Pi2S67、Pi2S122对其进行抗稻瘟病基因组片段的单侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片，例如RICE6K，对其进行背景选择；2)选择背景回复较好的重组单株(此世代背景回复值超过75％)与轮回亲本再次进行回交，获得回交二代，利用正向选择标记Pi2-4对其进行检测，选择含有抗稻瘟病基因组片段的重组单株，然后利用水稻全基因组育种芯片，例如RICE6K，对其进行背景选择；3)选择背景回复好的重组单株(此世代背景回复值超过87.5％)与轮回亲本又一次进行回交，获得回交三代，利用正向选择标记Pi2-4和负向标记Pi2S67、Pi2S122对其进行抗稻瘟病基因组片段的另一侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片，例如RICE60K，对其进行背景选择；以及4)选择导入片段小，且背景回复好的重组单株(背景回复值超过93.75％)，将选中的重组单株自交一次，获得自交种，利用正向选择标记Pi2-4对其进行检测，并利用水稻全基因组育种芯片，例如RICE60K，对其进行背景选择，最终获得含抗稻瘟病基因组重组片段纯合且背景回复(背景回复值超过99％)的水稻植株。

在另一实施方案中，利用分子标记对重组植株进行前景选择时采用的扩增引物，包括：用于扩增分子标记Pi2-4的引物对，其中正向引物为5’-CGGTAAGAGTAACACCAAGC-3’，反向引物为5’-GACGTGCGAGTTGTGACAGCT-3’；用于扩增分子标记Pi2S67的引物对，其中正向引物为5’-CCGATGCAAGAACAAGCTAA-3’，反向引物为5’-CCACCACATCACCAGTGTTT-3’；以及用于扩增分子标记Pi2S122的引物对，其中正向引物为5’-GACTTGAAAACCAGTGCGTG-3’，反向引物为5’-CCTACCTAATGGAAAGGATTGC-3’。

又一方面，本申请提供了检测重组核酸片段的方法，其包括根据如前所述的重组核酸片段设计特异性地引物，以待测基因组为模板进行PCR反应，并分析PCR扩增产物的步骤。具体地，例如，所述引物如前所述。可选择地，利用Sanger测序法分析PCR扩增产物。

具体而言，本申请提供的检测重组核酸片段的方法中，用于扩增及检测SEQ IDNO:1所示序列的引物组合如下：扩增引物对，包括正向引物：5’-GCATTATCGTTGATTCTTGGAGG-3’，反向引物：5’-AACTAGACGCAAACAGGGCAGTA-3’；测序引物，包括正向引物：5’-GCATTATCGTTGATTCTTGGAGG-3’，反向引物：5’-GATTTCGGAGTTGATGTGAT-3’，和反向引物：5’-AACTAGACGCAAACAGGGCAGTA-3’。所述方法以待测样品基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，然后利用上述测序引物对获得的扩增产物进行测序，若测序结果与SEQ ID NO:1序列一致或互补，则待测样品中含有SEQ ID NO:1所示同源重组片段。

另外，在本申请提供的检测重组核酸片段的方法中，用于扩增及检测SEQ ID NO:2所示序列的引物组合如下：扩增引物对，包括正向引物：5’-TCGGTTGGAAAGTGACAATAGG-3’，反向引物：5’-TTGGGACATAGGACGTTAGATG-3’；测序引物，包括正向引物：5’-TCGGTTGGAAAGTGACAATAGG-3’，反向引物：5’-TGGTGGTTCTGGCAGCGATT-3’，反向引物：5’-TGGGTGCGGAGGTAGAGGTG-3’，正向引物：5’-CCTAGTCCCGATTGTGCCG-3’，反向引物：5’-TGCGGCTATGCGTAGTTTGG-3’，反向引物：5’-CCGTCTTCCCGACCGTGTCC-3’，和反向引物：5’-TTGGGACATAGGACGTTAGATG-3’。所述方法以待测样品基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，然后利用上述测序引物对获得的扩增产物进行测序，若测序结果与SEQ IDNO:2序列一致或互补，则待测样品中含有SEQ ID NO:2所示同源重组片段。

通过检测确定了待测样品中含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列的重组核酸片段，即可确定待测样品中包含含有抗性基因的重组核酸片段。

此外，本申请还提供了检测重组核酸片段的试剂盒，其包括如前述的引物。

进一步地，本申请还提供了筛选含有重组核酸片段的水稻植株或种子的方法，其包括检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段的步骤。在一实施方案中，采用如前所述的引物来检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段。在另一实施方案中，采用如前所述的检测重组核酸片段的方法来检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段。在又一实施方案中，采用如前所述的试剂盒来检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段。

在又一方面，本申请提供了通过所述方法筛选得到的含有本申请公开的重组核酸片段的水稻植株或其种子。

由此可见，本申请提供的基于全基因组选择育种技术的选育含有抗稻瘟病基因组重组核酸片段的水稻植株的方法，至少具有以下一种优势：(一)快速：利用高密度分子标记技术进行全基因组背景选择，显著提高育种效率、加快育种进程，最快经五个世代转育即可获得目标植株。(二)准确：利用精确的前景选择标记能够对目标基因组片段进行准确筛选，可以使导入的目标基因组片段很小(理论上可以精确到单个基因水平)，去掉与目标基因组片段紧密连锁的累赘；利用高密度分子标记技术进行全基因组背景选择，去除供体亲本转育过程中导入的非目标基因组片段。最终可以获得背景与受体亲本完全一致、仅含供体目标基因组片段，即完全保留受体亲本现有优势，导入供体亲本优良特性的目标植株。(三)稳定：由于使用了高密度分子标记全基因组背景选择技术对育种过程进行精确控制，可清楚地了解每个筛选到的单株全基因组水平基因型，因此获得的目标植株能够稳定遗传。

附图说明

图1为本申请实施例1中CR012080水稻RICE60K全基因组育种芯片检测结果；其中，横坐标数字所指示方框依次表示水稻12条染色体，纵坐标数字为水稻基因组上的物理位置[以兆碱基(Mb)为单位]，图中第6号染色体黑色圆点处线条显示区段即为导入的抗稻瘟病基因组重组核酸片段RecCR012080。

图2为本申请实施例2中RecCR012080上游同源重组片段测序比对结果；图中所示星号代表比对结果中相同碱基，图中CR012080为获得的新品系，KY131为受体亲本‘空育131’，‘BL6’为供体亲本。

图3A至图3B为本申请实施例2中RecCR012080下游同源重组片段测序比对结果。

图4为本申请实施例2中RecCR012080两侧同源重组片段的结构图；其中，(A)为上游同源重组片段结构图；(B)为下游同源重组片段结构图，上方碱基为供体‘BL6’的SNP或InDel标记，下方碱基为受体“空育131”的SNP或InDel标记。灰色区段为来源于‘空育131’基因组区段，黑色区段为来源于‘BL6’基因组区段，白色区段为同源重组区段，横坐标为片段长度，以碱基对数目(bp)为单位。

图5为本申请实施例3中CR012080稻瘟病抗性室内鉴定结果；图中所示叶片依次为：(A)稻瘟病感病品种丽江新团黑谷；(B)原品种‘空育131’；(C)改良新品系CR012080；(D)稻瘟病抗病品种谷梅4号。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向从左向右书写，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。在某些实施方案中，可以依照单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

具体地，本申请涉及对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2进一步优化所得的核苷酸序列。该方法的更多细节描述于Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。优化核苷酸序列可用于提高抗稻瘟病基因在水稻中的表达。

在一些实施方案中，本申请还涉及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的变体。一般来讲，特定核苷酸序列的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互补序列。这样的变体序列包括一个或多个核酸残基的添加、缺失或替换，从而可以导致相应的氨基酸残基的添加、移除或替换。通过本领域内已知的序列比对程序包括杂交技术确定序列同一性。实施方案的核苷酸序列变体与本申请的序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。

本申请还涉及包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列中特定位点的片段或其变体或其互补序列，例如，包含SEQ ID NO:1所示序列的987-1664位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列，或者包含SEQ ID NO:2所示序列的640-969位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列。根据包含上述特定位点的片段，能够特异性地鉴定出相应的SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列。进一步地，通过鉴定出含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的重组核酸片段，即可确定待测样品中包含含有抗性基因的重组核酸片段。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植株并包括可以与水稻育种的所有植物品种。如本文所用，“植株”或“植物”，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。

在本申请的方法可以适用于任何需要选育的水稻品种。也就是说，可以将任何缺少某种有利性状的优良品种(即综合性状较好，预计有发展前途的品种)用作轮回亲本。用另一具有该受体所缺少的有利性状的品种作为供体亲本，并且所提供的有利性状最好是显性单基因控制的。在本申请的实施方案中，采用水稻‘空育131’作为轮回亲本，采用已被证实具有良好的稻瘟病抗性的水稻‘BL6’作为供体。

在本申请所提供的重组植株的选育方法中，利用分子标记对重组植株进行前景选择。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度，为提高选择的准确率，一般同时用两侧相邻的两个标记对目标基因进行跟踪选择。

在本申请的实施方案中，采用的前景选择标记包括正向选择标记和负向选择标记，其中，正向选择标记是在距目标基因组片段(含抗稻瘟病基因)上、下游50kb(在水稻中其遗传距离为0.2cM)范围内筛选的多型性分子标记。负向选择标记是在距目标基因组片段上、下游500kb(在水稻中其遗传距离为2cM)范围内筛选的多型性分子标记。在具体实施方案中，经优化筛选使用的正向选择标记是与目标基因组片段紧密连锁的标记Pi2-4，负向选择标记是位于目标片段上游约170kb的标记Pi2S67，以及位于目标片段下游约380kb的标记Pi2S122。

在本申请的实施方案中，利用上述前景选择标记进行同源重组的检测时，一侧或单侧同源重组的判断标准是Pi2-4检出与‘BL6’相同带型，且Pi2S67或Pi2S122检出与‘空育131’相同带型；两侧或双侧同源重组的判断标准是Pi2-4检出与‘BL6’相同带型，Pi2S67和Pi2S122检出与‘空育131’相同带型。

在本申请中，可以使用任何一种可利用的芯片进行本申请所提供的育种方法中的背景选择。在优选的实施方案中，可以采用本申请人在中国专利申请CN102747138A中公开的水稻全基因组育种芯片RICE6K，或者在PCT国际申请WO/2014/121419中公开的水稻全基因组育种芯片RICE60K。这两份申请文件中的全部内容整体并入本文作为参考。

在进行背景选择时，选择背景回复好，即背景回复值高的植株。背景回复值指的是待选择植株的基因组与受体亲本植株基因组的相似程度。在可选择的实施方案中，使用水稻全基因组育种芯片来确定背景回复值。可以根据不同的育种需求自行设定选择标准，即背景回复值。在优选的实施方案中，设定的背景回复值标准如下：回交一代，超过75％；回交二代，超过87.5％；回交三代，超过93.5％；自交种，超过99％。

以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecularcloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本申请中所使用的水稻植株材料信息均可参见中国水稻品种及其系谱数据库(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本申请中所提到的水稻基因组物理位置均参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

实施例1 选育导入抗稻瘟病基因组片段的重组植株

本实施例中使用的材料为水稻‘空育131’及水稻‘BL6’。

水稻‘BL6’已被证实具有良好的稻瘟病抗性，并推测可能是第6号染色体的Pi2、Pi9和Pigm所在的基因簇区域对该材料的稻瘟病抗性起到了关键作用。

在重组植株的选育过程中，利用分子标记对重组植株进行前景选择，对所采用的前景选择分子标记进行了筛选。参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版，下载第6染色体9,559,000至10,990,000DNA序列。使用SSRLocator软件对上述序列中的SSR位点进行扫描。利用Primer Premier 3.0软件对寻找出的SSR位点设计引物，共设计引物162对。通过PCR的方法，筛选上述引物对在‘BL6’及‘空育131’中的多态性，最终挑选出在两份材料中具有多态性、扩增效率高的前景选择分子标记，分别是正向选择标记Pi2-4和负向选择标记Pi2S67、Pi2S122。用于PCR扩增上述分子标记的具体引物信息见表1。

表1前景选择分子标记引物信息

将水稻‘BL6’中前述基因簇所在的基因组片段导入到水稻‘空育131’中，具体过程如下：

以‘空育131’为轮回亲本，‘BL6’为供体亲本进行杂交，将得到的杂交种与轮回亲本‘空育131’进行回交，获得BC₁F₁种子，育苗后利用正向选择标记Pi2-4和负向选择标记Pi2S67、Pi2S122进行重组单株选择，筛选出5个在目标基因组片段一侧同源重组的单株，即Pi2-4检出与‘BL6’相同带型，且Pi2S67或Pi2S122检出与‘空育131’相同带型，并利用水稻全基因组育种芯片RICE6K(CN102747138A)对其进行背景选择(Yu等,Plant BiotechnologyJournal.2014,12:28-37)。

在筛选出的5个单侧同源重组单株中比较芯片结果，选择背景回复最好的重组单株(此世代背景回复值超过75％)，使其与轮回亲本‘空育131’再次进行回交，获得BC₂F₁种子，育苗后利用正向选择标记Pi2-4对其进行检测，选择含有目标基因组片段的重组单株，即Pi2-4检出与‘BL6’相同带型，利用水稻全基因组育种芯片RICE6K对其进行背景选择。

选择背景回复较好的单株(此世代背景回复值超过87.5％)，使其与轮回亲本‘空育131’又一次进行回交，获得BC₃F₁种子，育苗后利用正向选择标记Pi2-4和负向标记Pi2S67、Pi2S122对收获的种子进行目标基因组片段另一侧同源重组片段的筛选，获得2个在目标片段两侧重组的单株，即Pi2-4检出与‘BL6’相同带型，且Pi2S67和Pi2S122检出与‘空育131’相同带型。

利用水稻全基因组育种芯片RICE60K(WO/2014/121419)对上述2个双侧交换单株进行背景和目标片段选择(Chen等，Molecular Plant.2014,7:541-553)，筛选到导入目标片段较小，且背景回复好的目标单株一个(此世代背景回复值超过93.75％)。

将选中的单株自交一次，获得BC₃F₂，育苗后利用正向选择标记Pi2-4对其进行检测，选择含有目标基因组片段的单株，即Pi2-4检出与‘BL6’相同带型，利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景选择。

最终获得目标片段纯合，且背景回复(背景回复值超过99％)的株系一个，命名为CR012080。将CR012080所含的抗稻瘟病基因组重组核酸片段命名为RecCR012080。芯片检测结果见图1，在RICE60K的探针中仅2个探针检测结果为未回复(图中非圆点处所示的两条线)。

实施例2 导入稻瘟病抗性基因组片段后同源重组片段的确定

为了确定导入的稻瘟病抗性基因组片段大小，对‘空育131’导入片段的纯合单株进行了目标基因组片段两侧同源重组片段的测序。

通过水稻全基因组育种芯片RICE60K检测结果初步确定，RecCR012080位于两个SNP标记R0610320442CT和F0610603979GA之间。

同时，使用Miseq测序技术对‘空育131’、‘BL6’和CR012080三个样本进行全基因组测序。使用TruSeq Nano DNA LT Kit(illumina)试剂盒进行文库建立，使用LibraryQuantification Kit–Universal(KAPA Biosystems)试剂盒进行定量，使用MiSeq V2Reagent Kit(illumina)试剂盒进行测序反应。使用Miseq台式测序仪(illumina)进行检测。具体步骤及方法参见各试剂盒及测序仪使用说明书。

根据前述SNP芯片及Miseq测序结果，将RecCR012080上游同源重组片段初步定位在第6染色体的10340719bp到10342487bp区间，下游同源重组片段定位于10584898bp到10589156bp区间。

在此基础上，参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版，下载对应区段DNA序列。使用Primer Premier 5.0软件设计扩增及测序引物，设计要求为引物长22nt左右、GC含量40-60％且没有错配。

以受体亲本‘空育131’和供体亲本‘BL6’为对照，对RecCR012080的上游和下游同源重组片段分别设计扩增引物，使用高保真酶KOD FX Neo(TOYOBO)进行扩增，使用两步法或三步法寻找最佳扩增条件，确保扩增产物在琼脂糖凝胶电泳检测中显示为单一明亮条带。其中确定的上游同源重组片段扩增引物反应条件为：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃60sec，37个循环；20℃1min。下游同源重组片段扩增引物反应条件为：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃150sec，37个循环；20℃1min。由此，最终筛选出两对扩增引物分别用于上游和下游同源重组片段的扩增。

另外，以扩增产物为模板，利用Sanger测序法进行测序，根据实际测序效果，最终筛选出3条和7条测序引物分别用于上游和下游同源重组片段的测序。具体的扩增引物及测序引物序列见表2，测序结果见图2和图3。

CR012080抗稻瘟病基因重组核酸片段上游同源重组片段测序长度为1769bp(SEQID NO:1)。1-987bp为受体‘空育131’的基因组区段，与供体‘BL6’比较，存在4个SNP，1个Indel。988-1663bp这一676bp区段为同源重组区段。1664-1769bp为供体‘BL6’基因组片段，与‘空育131’比较，存在3个SNP。

CR012080抗稻瘟病基因重组核酸片段下游同源重组片段测序长度为4260bp(SEQID NO:2)。1-640bp为供体‘BL6’的基因组区段，与‘空育131’比较，存在5个SNP，1个Indel。641-967bp这一327bp区段为同源重组区段。968-4260bp为受体‘空育131’的基因组区段，与供体‘BL6’比较，存在11个SNP，1个Indel。

图4为RecCR012080两侧同源重组片段的结构图。其中，(A)为上游同源重组片段结构图；(B)为下游同源重组片段结构图。上方碱基为供体‘BL6’的SNP或InDel标记，下方碱基为受体‘空育131’的SNP或InDel标记。灰色区段为来源于‘空育131’基因组区段，黑色区段为来源于‘BL6’基因组区段，白色区段为同源重组区段。横坐标为片段长度，以碱基对数目(bp)为单位。

表2抗稻瘟病基因组重组核酸片段扩增及测序引物信息

实施例3 ‘空育131’导入抗稻瘟病基因组片段后的抗性鉴定

为了鉴定抗性效果，对本申请选育的新品系CR012080、轮回亲本‘空育131’、稻瘟病抗病品种谷梅4号(作为阳性对照)，以及稻瘟病感病品种丽江新团黑谷(作为阴性对照)进行室内种植，将其培养至3-4叶期后采用如下方法进行鉴定：

选取2014年从黑龙江佳木斯病圃的稻瘟病病叶和病颈中分离的7株稻瘟病菌株作为接种菌株，编号分别为14-7301、14-7302、14-7303、14-7305、14-7309、14-7324和14-7328。菌株采用高粱粒法-20℃保存，使用前将保存的高粱粒取出至马铃薯葡萄糖培养基(PDA)平板活化(PDA：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L)，28℃光照培养5天后取直径5mm的新鲜菌丝块转接至高粱粒培养基中(高粱粒500g加入1.5L蒸馏水，煮至沸腾后滤去液体，将高粱粒捞出装入250ml三角瓶，100ml/瓶，湿热灭菌20分钟)，10块/瓶，接菌2天后每天将高粱粒摇散，28℃黑暗培养至菌丝长满高粱粒。然后将高粱粒摊在无菌纱布上，盖上无菌的潮湿纱布，在25℃，RH≥95％，12h光照条件下培养4-5天至大量孢子产生，用无菌水(含0.02％吐温20)洗下孢子，等孢子量混合接种菌株，调整浓度至5×10⁵个/ml。

用混合分生孢子悬浮液喷雾接种CR012080、‘空育131’、谷梅4号及丽江新团黑谷，接种三个重复。接种后罩上透明罩子，28℃黑暗培养24h，然后16h光照培养5天后调查。

调查标准为0级(高抗，HR)：没有症状；1级(抗，R)：很小的褐色病斑；2级(中抗，MR)：直径约为1mm的褐色病斑；3级(MS，中感)：直接约为2-3mm的带圆形病斑，中央灰白色，边缘褐色；4级(感，S)：长约1-3cm的椭圆形病斑，中央灰白色，边缘褐色；5级(高感，HS)：长且宽的大椭圆形病斑，病斑融合成片，至叶片枯死。其中0-2级为抗病，3-5级为感病。接种结果见表3和图5。

表3接种稻瘟菌后的抗性表现

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

Claims (9)

1.重组核酸片段，其由以下的第一重组核酸片段和第二重组核酸片段组成：

-第一重组核酸片段，其为SEQ ID NO:1所示序列的序列或其互补序列；

-第二重组核酸片段，其为SEQ ID NO:2所示序列的序列或其互补序列。

2.检测权利要求1所述片段的引物组，其中所述引物组由以下的检测第一重组核酸片段的引物和检测第二重组核酸片段的引物组成：

-检测第一重组核酸片段的引物，其选自：

(I)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-987位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1664-1769位核苷酸的序列的反向引物；

(II)以下第一组引物对与第二组引物对的组合，其包含

(a)第一组引物对：特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-987位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第988-1663位核苷酸的序列的反向引物；和

(b)第二组引物对：特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第988-1663位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1664-1769位核苷酸的序列的反向引物；

-检测第二重组核酸片段的引物，其选自：

(III)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-640位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第968-4260位核苷酸的序列的反向引物；

(VI)以下第三组引物对与第四组引物对的组合，其包含

(c)第三组引物对：特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-640位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第641-967位核苷酸的序列的反向引物；和

(d)第四组引物对：特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第641-967位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第968-4260位核苷酸的序列的反向引物。

3.检测权利要求1所述片段的引物组，其中所述引物组为：

(I)扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对

5’-GCATTATCGTTGATTCTTGGAGG-3’，

5’-AACTAGACGCAAACAGGGCAGTA-3’；

(II)测序SEQ ID NO:1所示序列的引物

5’-GCATTATCGTTGATTCTTGGAGG-3’；

5’-GATTTCGGAGTTGATGTGAT-3’；

5’-AACTAGACGCAAACAGGGCAGTA-3’；

(III)扩增SEQ ID NO:2所示序列的引物对

5’-TCGGTTGGAAAGTGACAATAGG-3’，

5’-TTGGGACATAGGACGTTAGATG-3’；以及

(IV)测序SEQ ID NO:2所示序列的引物

5’-TCGGTTGGAAAGTGACAATAGG-3’；

5’-TGGTGGTTCTGGCAGCGATT-3’；

5’-TGGGTGCGGAGGTAGAGGTG-3’；

5’-CCTAGTCCCGATTGTGCCG-3’；

5’-TGCGGCTATGCGTAGTTTGG-3’；

5’-CCGTCTTCCCGACCGTGTCC-3’；

5’-TTGGGACATAGGACGTTAGATG-3’。

4.检测权利要求1所述的重组核酸片段的方法，其包括采用权利要求2或3所述的引物组，以待测基因组为模板进行PCR反应，并分析PCR产物的步骤。

5.检测权利要求1所述的重组核酸片段的试剂盒，其包括权利要求2或3所述的引物组。

6.筛选含有权利要求1所述的重组核酸片段的水稻植株或种子的方法，其包括检测待测水稻植株或种子的基因组中是否含有权利要求1所述的重组核酸片段的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其中采用权利要求2或3所述的引物组来检测待测水稻植株或种子的基因组中是否含有权利要求1所述的重组核酸片段。

8.如权利要求6所述的方法，其中采用权利要求4所述的方法来检测待测水稻植株或种子的基因组中是否含有权利要求1所述的重组核酸片段。

9.如权利要求6所述的方法，其中采用权利要求5所述的试剂盒来检测待测水稻植株或种子的基因组中是否含有权利要求1所述的重组核酸片段。

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