CN101956019A - 水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记，属于遗传育种技术领域。对水稻抗虫品种RathuHeenati(♀)与感虫品种02428(♂)杂交获得的F₂各单株的基因型和F_2:3各家系的抗褐飞虱的抗性级别进行遗传连锁分析，获得抗虫品种RathuHeenati抗褐飞虱主基因Bph3。将该基因定位在分子标记A4和RM16533之间，且该区间的3个Indel标记RH784、RH786和RH007的选择效率均在97%左右。通过抗褐飞虱主基因的分子标记来检测抗虫品种RathuHeenati及其衍生品种(系)中是否含有该主基因，可预测其对褐飞虱的抗性水平，大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率。

Description

水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记

本发明为分案申请，原案发明名称：水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，申请日：2008.12.12申请号：200810243722.4。

一、技术领域

本发明提供了水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，属于分子遗传学领域，专用于水稻抗褐飞虱品种的选育与种质资源的利用。

二、背景技术

水稻是我国的重要粮食作物。褐飞虱是一种水稻单食性害虫，属同翅目飞虱科。通过口针吸食水稻茎秆韧皮部汁液，为典型的刺吸式害虫。严重时引起稻株下部变黑、腐烂发臭、倒瘫，称之为“虱烧”，导致水稻减产或失收。目前，对褐飞虱的防治主要依赖于化学农药，但此措施不但增加了生产成本，且污染环境，因此，最为经济有效而不造成污染的防治措施是抗虫品种的应用。

迄今，已发现和鉴定了13个抗褐飞虱主基因。其中，显性基因6个，即Bph-1(Athwal et al.，1971)、Bph-3(Lakshiminarayana and Khush，1977)、Bph-6(Kabirand Khush，1988)、Bph-9(Ikeda et al.，1985；Nemoto et al.，1989a)、Bph-10(t)(Multani et al.，1994；Ishii et al.，1994)和Bph-13(t)(刘国庆等，2001)。隐性基因7个，即bph-2(Athwal et al.，1971)、bph-4(Lakshiminarayana and Khush，1977)、bph-5(Khush et al.，1985)和bph-7(Kabir and Khush，1988)、bph-8(Ikeda，1985；Nemoto et al.，1989a)、bph-11(t)和bph-12(t)(Hirabayashi and Ogawa，1999)。其他研究还进行了抗褐飞虱的QTL(quantitive trait locus，数量性状位点)定位研究，已鉴定了26个抗褐飞虱QTL。但真正用于水稻抗虫育种的抗褐飞虱基因并不多。

国际水稻研究所自1973年先后选育了一系列分别携带Bph-1、bph-2和Bph-3等抗褐飞虱主基因的水稻品种，在种植这些品种的地区有效地控制了褐飞虱的暴发。然而，由于褐飞虱新生物型的产生，抗褐飞虱品种逐渐丧失抗性或面临抗性丧失的危险(Pathak and Khush，1979；Pathak and Saxena，1980；Heinrichs，1986；Saxena and Khan，1989；Heinrichs，1994；Gallagher et al.，1994)。我国也先后育成一系列含有抗褐飞虱基因Bph-1的品种(组合)，对褐飞虱的防治起了积极的作用。吕仲贤等(2002)对1986～2000年国家和浙江省育种攻关协作组提供的3328份水稻新品种(系)进行了抗褐飞虱鉴定和筛选，结果发现从“七五”、“八五”到“九五”抗虫品种鉴出率呈下降趋势，水稻抗褐飞虱育种未受到足够重视。目前，国内褐飞虱以生物型2为主，致害力强的孟加拉型生物型比例上升，原来带有Bph-1的抗虫品种，已逐渐失去抗性，因而迫切需要培育新的携带多个抗性基因的抗虫品种。

由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。而在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因或QTL的聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是：提供了水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，通过检测与这些抗褐飞虱主基因连锁的分子标记，可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，加快抗褐飞虱水稻的选择进度。

技术方案

水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，水稻品种Rathu Heenati对褐飞虱的抗性由一个主基因Bph3控制，其特征在于：

用标记引物A4，

左端序列AAGCAGCATAAACTGATTGA

右端序列TCATCTTCTGAAAAAGCAAT

或者用标记引物RM16533，

左端序列TTTGCTTAGTCGGCAGATGTCC

右端序列CATAAGAACGTACCTCCACTGATTCC

或者用标记引物RH7841，

左端序列TGCCAAGTATGTATGCCTAT

右端序列TTTTAGAGACCGTGTCCTTG

或者用标记引物RH786，

左端序列TTTGAAGTTCTTTCCATCTGA

右端序列AAATGTGCTATCTGGGGTAAA

或者用标记引物RH007，

左端序列CTTGCGTTCCGTAGGAGAAG

右端序列TGAGTGTAACCCGAAGTGGC

扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物A4能够扩增出193bp的扩增片段，或用引物RM16533能够扩增出285bp的扩增片段，或用引物RH7841能够扩增出213bp的扩增片段，或用引物RH786能够扩增出176bp的扩增片段，或用引物RH007能够扩增出182bp的扩增片段，均标志着该水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的存在，该主基因位于水稻第4染色体短臂上。

有益效果  本发明所提供的水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，具有以下优点：

(1)通过本发明在国际上首次用SSR标记精细定位了水稻品种Rathu Heenati中的抗褐飞虱的主基因Bph3。

(2)通过本发明分子标记定位的主基因位置明确，鉴定方便。通过检测这些与抗褐飞虱基因连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有褐飞虱抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于水稻育种。主基因位点的检测方便快速，不受环境影响；

(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗虫基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对褐飞虱抗性进行单株选择。对水稻抗褐飞虱进行表型鉴定复杂，同时受环境影响，首先要获得虫源、饲养褐飞虱，此外要获得接种虫源和水稻秧苗同步，非常困难，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗虫育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗褐飞虱主基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗褐飞虱的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率。

(4)同时可用于抗虫杂交品种的纯度鉴定和苗期快速鉴定。

四、附图说明

图1水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱基因在染色体上的分布。

五、具体实施方式

研究表明，抗褐飞虱基因资源主要存在于斯里兰卡和印度籼稻和野生稻种中(Ikeda and Vaughau，1991)。Athwal et al.(1971)报道Mudgo、CO22和MTU15携带同一抗褐飞虱基因Bph-1，ASD7携带一个隐性抗虫基因bph-2。Athwal andPathak(1972)报道MGL2含有抗虫基因Bph-1，Ptb18含有bph-2。Martinez andKhush(1974)报道IR747B2-6含有Bph-1，R1154-243和IR4-93含有bph-2。Lakshiminarayana and Khush(1977)报道斯里兰卡抗虫品种Rathu Heenati由一个与Bph-1独立分离的显性基因Bph-3控制；而品种Babawee则由一个与bph-2独立分离的隐性基因bph-4控制。Sidhu and Khush(1978)报道携带Bph-3或bph-4的水稻品种对所有的褐飞虱生物型都表现抗性。泰国水稻品种Col.5 Thailand和Col.11 Thailand，缅甸水稻品种Chin Saba由同一个与bph-2和bph-4都不等位的隐性抗虫基因bph-8控制(Ikeda，1985)。这些抗虫基因的鉴定和遗传研究为抗虫品种的培育提供了基础，其中Bph-1、bph-2和Bph-3已被应用到抗虫育种中。但是，由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。而在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因和QTL的聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。

通过本发明抗虫水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱主基因和微效基因位点的鉴定和分子标记的发现，特别抗褐飞虱主基因位点可用来指导抗褐飞虱水稻品种的选育工作，用与之连锁的分子标记对抗虫品种进行筛选，使不同抗虫主基因位点快速聚合在同一个植株中，从而大大提高育种效率。

(一)Rathu Heenati/02428F₂群体构建及表型鉴定

(1)以抗褐飞虱品种Rathu Heenati(Ikeda和Kaneda 1981，Jpn J Breed，31(3)：279-285)为母本，感褐飞虱粳稻品种02428(邹江石等，中国农业科学，1989，22(1)：6-14)为父本，配制杂种，构建了包含156个单株的Rathu Heenati/02428F₂分离群体，每个F₂单株通过自交获得相应的Rathu Heenati/02428F_2:3家系，进行抗虫鉴定。

(2)采用苗期接种对亲本、F1、F2:3进行抗虫性鉴定，褐飞虱为生物型1和生物型2混合种群(Sun，LH等2005)。为确保亲本、F₁和F_2:3群体中的每个家系生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系(品种)分别取25粒种子播种于一个直径8.5cm、高9.0cm，盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底部有一小孔，便于渗透吸水)，株距为2.5cm。各品种随机种植3钵。每28个塑料钵置于一个65cm×44cm×14cm的塑料箱内(箱内保持水层2cm左右)。播种7天后间苗，淘汰病弱苗，保留到每钵20株，待苗长到两叶一心期时按10头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网罩，当感虫品种TN1(Sun，LH等2005)全部死亡时，参照Athwal等(1971)、IRRI(1988)和Huang等(2001)的方法对每个单株进行0，1，3，5，7或9级的抗性评价(表1)，对亲本材料和群体的每个家系通过加权平均计算该家系的抗性级别，并根据抗性级别推测此单株基因型。

表1本研究所用的抗感褐飞虱评价标准

(二)Rathu Heenati/02428F₂群体的分子标记分析

(1)用SDS法提取亲本、F₁及F₂群体各株系的DNA。

(2)SSR分析参照Chen et al.(1997)的程序。10μl反应体系包括：10mMTris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，50μM dNTPs，0.2μM引物，0.5UTaq polymerase(TaKaRa，大连)和20ng of DNA模板。扩增反应在PTC-200(MJResearch Inc.)PCR仪上进行：94℃4min；94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，35个循环；72℃7min。扩增产物用8％的非变性PAGE胶分离，通过银染显色，银染程序根据Sanguinetti et al.(1994)的方法制定而成。扩增的DNA条带利用装有荧光灯的灯箱进行观察。记录结果，亲本间有多态的引物在F₂群体中进行分析，获取群体基因型资料；

(3)根据连锁交换规律，利用MAPMARKER/EXP3.0软件对各个分子标记的群体基因型资料构建水稻的遗传连锁图谱。

(4)利用Windows QTL Cartographer V2.0软件(Wang et al.，2003)复合区间作图法(Composite interval mapping，CIM)，以2cM为步长在全基因组范围内进行扫描。QTL的检测采用5％总体显著水平，相应LOD统计量的显著阈值用排列测验(Permutation test)(Churchill and Doerge，1994)方法进行估计，共重复抽样1000次。同时估计了各位点的加性效应和贡献率。根据工具公共数据库中提供的粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的基因组序列，利用PowerBlast分析软件，寻找籼、粳品种基因组序列中存在的插入/缺失位点，利用PrimerPremier 5.0软件开发InDel标记。

(三)结果与分析：

(1)抗性鉴定

苗期集团抗性鉴定显示Rathu Heenati、02428和F₁的抗虫级别分别为0.3、8.1和1.1，表明Rathu Heenati抗褐飞虱而02428感褐飞虱并且Rathu Heenati的抗虫性由显性基因控制，156个F_2:3家系对褐飞虱的抗虫级别频率分布呈连续分布，最小为0.1，最大为9.00，并在1、5和8三个位置出现3个明显的峰值。根据对褐飞虱的抗虫级别将F_2:3家系分为抗虫、抗感分离和感虫三种表现型，而相应的F₂单株的基因型则分别为记为RR(纯合抗虫)、Rr(杂合抗虫)和rr(纯合感虫)三种。F₂群体对褐飞虱的抗感分离符合1∶2∶1的比例(χ²＝1.69，χ² _0.05，2＝5.99)(表2)。

表2  Rathu Heenati/02428F₂分离群体156个单株对褐飞虱抗感分离比例

^a)RR，纯合抗虫；Rr，杂合抗虫；rr，纯合感虫^b)1RR：2Rr：1rr适合性测验值χ²为1.69(χ² _0.05，2＝5.99)；^c)本栏为抗虫级别值域；RS，Resistance Score(抗虫级别)

(2)连锁分析

连锁分析将Rathu Heenati中的抗褐飞虱基因Bph3定位在RM8213和RM5953之间，与两标记分别相距3.6cM和3.2cM(图1)，该位点对褐飞虱抗性的贡献率为83.9％，为抗性主基因位点。标记RM8213条带为168bp，RM8213引物：左端序列AGCCCAGTGATACAAAGATG和右端序列GCGAGGAGATACCAAGAAAG；标记RM5953条带为195bp，RM5953引物：左端序列AAACTTTCTGTGATGGTATC和右端序列ATCCTTGTCTAGAATTGACA。

结果显示抗性分离与两个SSR标记RM5953和RM8213的基因型值分离存在显著相关，进一步证明该抗褐飞虱基因与这两个标记的紧密连锁，该主基因位于水稻第4染色体短臂上。

(3)精确定位

为进一步精细定位主基因Bph3的位点，提高选择效率，以抗褐飞虱品种Rathu Heenati为母本，感褐飞虱粳稻品种02428为父本，配制杂种，构建了包含5687个单株的F₂分离群体，从中筛选标记RM8213和RM5953发生交换的单株，获得的交换单株通过自交获得相应的F_2:3家系，进行抗虫鉴定。

根据工具公共数据库中提供的粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的基因组序列，利用PowerBlast分析软件，寻找籼、粳品种基因组序列中存在的插入/缺失位点，利用Primer Premier 5.0软件开发InDel标记，构建了RM8213和RM5953之间的饱和连锁图谱，结合表型鉴定结果将Bph3定位在两分子标记A4和RM16533之间(图1)。从上述5687株F₂中随即挑选250株，对该区间的3个Indel标记RH784、RH786和RH007的选择效率进行评估，结果表明这三个标记的选择效率均达到97％左右(表3)。即用标记引物A4，

左端序列AAGCAGCATAAACTGATTGA

右端序列TCATCTTCTGAAAAAGCAAT

或者用标记引物RM16533，

左端序列TTTGCTTAGTCGGCAGATGTCC

右端序列CATAAGAACGTACCTCCACTGATTCC

或者用标记引物RH7841

左端序列TGCCAAGTATGTATGCCTAT

右端序列TTTTAGAGACCGTGTCCTTG

或者用标记引物RH786

左端序列TTTGAAGTTCTTTCCATCTGA

右端序列AAATGTGCTATCTGGGGTAAA

或者用标记引物RH007

左端序列CTTGCGTTCCGTAGGAGAAG

右端序列TGAGTGTAACCCGAAGTGGC

扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物A4能够扩增出193bp的扩增片段，或用引物RM16533能够扩增出285bp的扩增片段，或用引物RH7841能够扩增出213bp的扩增片段，或用引物RH786能够扩增出176bp的扩增片段，或用引物RH007能够扩增出182bp的扩增片段，均标志着该水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的存在，该主基因位于水稻第4染色体短臂上。

表3F₂群体的抗虫指数按RH784、RH786和RH007标记的基因型进行分类

^a)1/1表示02428的基因型，2/2表示Rathu Heenati的基因型，1/2表示杂种基因型

通过上述分子标记鉴定主基因位点来预测水稻植株抗性，预计可迅速提高我国水稻抗褐飞虱品种的育种进程。

Claims (1)

1.水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，水稻品种Rathu Heenati对褐飞虱的抗性由一个主基因Bph3控制，其特征在于：

用标记引物RM16533

左端序列   TTTGCTTAGTCGGCAGATGTCC

右端序列   CATAAGAACGTACCTCCACTGATTCC

扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物RM16533能够扩增出285bp的扩增片段，或用引物RH7841能够扩增出213bp的扩增片段, 则标志着水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的存在，该主基因位于水稻第4染色体短臂上。

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