CN1475106A - 一种快速改良水稻品质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种分子标记辅助选择快速改良水稻蒸煮食味品质新品种的培育方法。仅需5个世代能将控制水稻中等直链淀粉含量和软胶稠度基因导入待改良品种，同时保持待改良品种的其它特征特性。方法包括采用杂交、回交、米质鉴定和分子标记检测相结合培育优质水稻新品种的程序和步骤，将目标基因导入到待改良的水稻品种中，以PCR检测并选择与目标基因共分离和/或紧密连锁的分子标记基因型，同时应用AFLP标记对试验亲本的遗传背景实施选择，使除开目标基因区段之外，改良型水稻品种的基因组与原品种相同，进而繁殖改良型优质新品种并用于生产。本发明也适合于优良食味与蒸煮品质即中等直链淀粉含量和软胶稠度性状的新品种选育上。

Description

一种快速改良水稻品质的方法

技术领域：

本发明属于水稻品质育种技术领域。涉及水稻的常规杂交育种和分子标记辅助选择育种技术领域。

背景技术：

水稻改良的主要目标是高产、优质、多抗。但是，在过去相当长的一段时间里，我国为解决粮食不足，在育种过程中一直将产量作为主要目标。这种以产量为主要目标的高产育种，使得目前我国大面积推广的一些主要品种，尤其是杂交水稻品种的品质较差(莫惠栋，我国稻米品质的改良，《中国农业科学》，1993，26(4)：8-14；周开达、李宏伟、成宇，优质杂交稻的必由之路，《杂交水稻》，1994，(3-4)：42-45；杨振玉，粳型杂交水稻育种的进展，《杂交水稻》，1994(3-4)：46-49)。随着人民生活水平的不断提高和出口贸易的发展，市场对稻米品质已提出愈来愈高的要求。要使稻米具有较强的竞争力，优良的品质是最为关键的因素。稻米品质差，不仅满足不了国内人民消费水平提高的需要，而且也影响我国稻米的出口。在这种情况下，稻米品质相对于产量来说已成为一个更为突出而且急需解决的问题。现阶段，立足于杂交水稻的高产而迅速改良其品质，达到高产优质相统一，是一条非常有效的育种途径。

稻米品质一般包括：(1)蒸煮和食味品质：直链淀粉含量(Amylose content AC)、胶稠度(Gel consistency GC)、糊化温度(Gelatinization temperature GT)、香味；(2)加工品质：出糙率、出精率、整精米率；(3)外观品质：垩白、透明度、粒形、光泽；(4)营养品质：蛋白质含量和脂肪含量等。稻米品质是多种性状的综合表现，其中蒸煮和食味品质最为重要，一般认为中等直链淀粉含量、软胶稠度和中等糊化温度是稻米食味与蒸煮品质的重要指标。

除直链淀粉含量外，有关稻米品质其他性状的遗传国内外都缺乏系统的研究，主要是由于稻米品质是多个性状的综合表现，而这些性状又很难控制，评价时缺乏客观的标准，同时受环境的影响也比较大，以表型来推测基因型存在一定程度的不可靠性。而且植株表型的选择需要很强的经验，选择效率较低。特别是稻米品质只有在成熟后才能选择，而又需借助于仪器分析、测试，使其育种显得更加困难，效率更低。因此如何加快优良稻米品质的选择进程，提高优质稻米的选择效率，是优质稻米品质育种急需解决的重要问题。

近年来发展起来分子标记辅助选择技术，为解决上述问题创造了条件。分子标记辅助选择就是借助与目标基因紧密连锁或处于目标基因上的分子标记基因型的分析，鉴定分离含有目标等位基因的个体，从而加速育种的进程。由于分子标记辅助选择技术使得传统的表型选择发展到理想基因型的直接选择，从而大大提高选择的效率，缩短育种周期。近年来，将分子标记辅助选择技术应用于作物遗传改良的尝试已有报道。例如，YoshYoshimura S，Yoshimura A，Iwata N，McCouch S R，Abenes M L，Baraoidan M R，MewT W，Nelson R J.Tagging and combining bacterial blight resistance genes in riceusing RAPD and RFLP markers.Mol Breed，1995，1：375-387和Huang N，Angeles ER，Domingo J，Magpantay G，Singh S，Zhang G，Kumaravadivel N，Bennett J，KhushG S.Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice：Marker-assistedselection using RFLP and PCR.Theor Appl Genet，1997，95：313-320.)，借助分子标记辅助选择技术将数个白叶枯病基因聚合在一起。然而它们既没有跟踪导入抗性基因片段的大小，也没有对抗性基因区段外的遗传背景实施选择，因而使得改良的水稻新品种与被改良的品种在农艺性状上有很大的变化，难以使得改良的水稻新品种直接应用于生产。

发明内容：

本发明的目的在于克服传统杂交育种和转基因育种方法的不足，提供一种快速、有效培育优质水稻品种的方法，在常规育种和轮回选择的基础上，结合分子标记辅助选择育种方法，在导入优质目标基因的同时，尽可能避免供体亲本与目标基因紧密连锁的其他不利基因渗入到改良体中；在改良目标基因优质的同时，要确保改良体在米质改良的同时，而农艺性状、配合力、适应性等优良性状与原亲本完全一致。不但要跟踪导入优质基因片段的大小，而且要对导入优质基因区段以外的遗传背景实施快速而有效的选择。

本发明通过以下技术方案实现：

一种利用常规杂交育种和分子标记辅助选择育种的快速改良水稻品质的方法，以常规杂交为基础，快速地将决定水稻优良食味与蒸煮品质的基因同时导入到被改良的水稻亲本中，将被改良水稻亲本的品质性状改良为中等直链淀粉含量和软胶稠度；所述的常规育种方法包括一次杂交、三次回交和一次自交的育种及选择，以目标基因序列上合成引物进行PCR扩增选择目的基因，在每一世代予以对目的基因进行检测，进而以AFLP对所述水稻亲本的遗传背景实施选择，筛选农艺性状与原水稻品种完全相同、且带有优良米质基因的目标基因区段的单株为改良的优质水稻。

本发明的两个重要方面在于：(1)在导入优质目标基因的同时，尽可能避免供体亲本与目标基因紧密连锁的其他不利基因渗入到改良体中，导致改良体与被改良的亲本不一致；(2)在改良目标基因优质的同时，要确保改良体在米质改良的同时，而农艺性状、配合力、适应性等优良性状与原亲本完全一致。因此作为一种高效、可靠的分子标记辅助育种改良米质的新方法，不但要跟踪导入优质基因片段的大小，而且要对导入优质基因区段以外的遗传背景实施快速而有效的选择。

本发明的具体育种步骤包括常规育种和轮回选择以及分子标记辅助选择步骤。

1、常规育种和轮回选择采用以下步骤：

(1)以含有中等直链淀粉含量、软胶稠度的优良品质基因的品种作为供体亲本，以待改良亲本为轮回亲本，将二者杂交，得到的F₁杂种一代再与轮回亲本杂交，获得基因型为BC₁F₁的回交一代；

(2)对BC₁F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因者进行AFLP分析筛选，选出含轮回亲本带型最多的单株再与轮回亲本回交，得到基因型为BC₂F₁的回交二代；

(3)对BC₂F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因且在该基因一侧与紧密连锁的分子标记发生交换者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到基因型为BC₃F₁的回交三代；

(4)对BC₃F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因且在该基因另一侧与另一紧密连锁的分子标记发生交换的单株，套袋自交，得到基因型为BC₃F₂的杂交后代；

(5)对BC₃F₂单株进行PCR检测，选出含目标基因纯合的单株进行AFLP筛选，选出除目标基因区段外的遗传背景全为轮回亲本的单株，即为遗传背景与待改良亲本完全一致，且带有供体亲本的优质基因表现为中等直链淀粉含量和软胶稠度的改良型优质水稻品种。

2、PCR检测步骤：

(1)PCR反应体系：抽取各待测单株的DNA各10-50ng，依据与目标基因共分离或紧密连锁的分子标记设计的特异正向引物和反向引物各0.25μm，Taq DNA聚合酶1U，四种脱氧核糖核苷酸dATP，dTTP，dCTP，dGTP各0.1mM，Tris-HCl(pH8.3)和KCl各10mM，以及MgCl₂各2mM，PCR反应体系为15-25ul；

(2)PCR反应程序：首先在94℃变性3-5分钟，然后在94℃变性45秒，56℃退火0.5-1.5分钟，72℃延伸1-2分钟，运行25-40个循环，最后在72℃延伸5-8分钟；

(3)PCR产物检测：以1-1.4％的琼脂糖凝胶点样，在50-100V直流电压电泳4-6小时，溴化乙啶染色，置于紫外灯下读取各样品的PCR带型，确定各样品的分子标记基因型。

3、利用AFLP筛选试验亲本遗传背景的步骤：

(1)在37℃下对各待测单株的DNA进行限制性内切酶Mse I和EcoR I双酶消3小时后，再加入T4 DNA连接酶，温育3小时；

(2)加入EcoR I+1引物以及Taq DNA酶在60℃的退火温度下进行选择性预扩增；

(3)在另一管中加入EcoR I+3引物、T4激酶和γ-³²P[ATP]，在37℃温育0.5小时，对EcoR I+3引物进行末端标记；

(4)加入预扩增产物、EcoR I+3引物、Mse I+3引物以及Taq酶，在65℃的退火温度下进行选择性扩增；

(5)PCR产物在6-8％的聚丙烯酰胺凝胶上点样，在70W瓦功率下2.5-3小时后，揭下凝胶，放射自显影3-24小时；在放射自显影的X光片上读取各样品的AFLP带型，计算各样品恢复轮回亲本基因型的比率。

本发明的优点：

1、通过与目的基因共分离和紧密连锁的分子标记基因型的PCR分析和选择，有效地解决了常规育种中长期存在的连锁累赘问题，即由于不利基因与目标基因紧密连锁致使所得改良体与预期目标不尽一致的现象。

2、通过运用AFLP技术对回交后代个体基因型的背景选择，有效地解决了常规回交育种中轮回亲本基因型恢复的偏离问题，使得在改良目标性状的同时，原品种的优良农艺性状得以完全保持，并使改良的品种能尽快、直接应用于生产。

3、本发明在改良水稻品质方面，仅需要一次杂交、三次回交和一次自交纯合目标基因的常规育种技术，结合分子标记辅助选择技术监测目的基因，能高效、快速、准确的改良水稻的稻米品质，是常规育种中无法达到的，因而本发明可大大缩短了育种进程，适应当前优质品种育种的需要，本发明通过五个选育世代就能将控制水稻中等直链淀粉含量和软胶稠度基因导入待改良品种，同时保持待改良品种的其它特征特性。而利用常规方法至少需要10代以上的育种程序，还不一定能够达到这一目标。

具体实施方式：

                         实施例1

杂交水稻保持系“珍汕97”的食味与蒸煮品质的遗传改良：

(1)以含有优良食味与蒸煮品质中等直链淀粉含量、软胶稠度的wx基因的品系明恢63为供体亲本，以中国应用最广的保持系“珍汕97B”为轮回亲本，二者杂交，所得F₁再与轮回亲本回交，得到BC₁F₁；

(2)对BC₁F₁单株进行PCR分析，选出wx基因者进行AFLP分析，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到BC₂F₁；

(3)对BC₂F₁单株进行PCR分析，选出含wx基因单株且在该基因一侧与分子标记C952发生交换的单株，再与轮回亲本回交，得BC₃F₁；

(4)对BC₃F₁进行PCR分析，选出含wx基因且在该基因另一侧与分子标记C688发生交换的单株，套袋自交，得到BC₃F₂；

(5)对BC₃F₂单株进行PCR分析，选出wx基因纯合者进行AFLP分析，选出除wx基因区段外的遗传背景全为轮回亲本的单株，即为改良型优质珍汕97，即其具有中等直链淀粉含量软胶稠度，且遗传背景与珍汕97完全一致。

                         实施例2

“明恢63”、“珍汕97”和“改良型珍汕97”等不同水稻品种种子(稻米)的蒸煮与食味品质的鉴定结果：

申请人分别用2000年在中国湖北武汉收获的水稻种子和2001年在中国海南收获的水稻种子对“改良珍汕97B”选系进行了稻米品质性状分析结果列于表1，表明：与原“珍汕97B”相比，在蒸煮和食味品质方面，在湖北武汉收获的水稻种子的测试结果为：直链淀粉含量从27.8％降到了16.08％，胶稠度从29.5mm增加到了53.3mm，与“明恢63”的直链淀粉含量16.9％，胶稠度53.8mm非常一致；在海南收获的水稻种子的测试结果为：直链淀粉含量从27.9％平均降到了15.9％，胶稠度从28.1mm平均增加到了54.28mm，与“明恢63”的直链淀粉含量16.17％，胶稠度54.9mm非常一致。证实本发明培育的水稻种子的(稻米)蒸煮和食味品质得到了显著改善。

表1 利用分子标记辅助选择育种对“珍汕97”的品质性状改良效果

品系及试验地点	品质性状指标
					直链淀粉含量(％)		胶稠度(mm)
	武汉	海南	武汉	海南
					珍汕97	27.8	27.9	29.5	28.1
明恢63	16.9	16.2	53.8	54.9
					本发明培育的改良珍汕97	16.8	16.1	53.3	54.3

                         实施例3

本发明培育的“改良珍汕97”品种的农艺性状与原“珍汕97”的比较鉴定：

在武汉2000年夏季的比较试验结果(如表2)表明，“改良珍汕97B”与原“珍汕97”在主要农艺性状和原“珍汕97B”相比基本相同。在2001年海南自然生长区，申请人对“改良珍汕97B”与“珍汕97”的农艺性状比较得到同样结果。尽管有些农艺性状表现有微小差异，但经统计分析，差异不显著。说明利用分子标记辅助选择改良稻米品质效果明显，但农艺性状与原对照品种无显著差异。

表2 “改良珍汕97B”与原“珍汕97B”品种的在武汉和海南的农艺性状比较

                                         单位：厘米、个、千粒重/克、％、克

                                          有效   每穗             结实   单株

品种(系)      抽穗期      株高    穗长

                                                          粒重

                                          穗数   实粒数           率％   产量改良珍汕97(武汉)

               96.0       75.2    19.6    7.6    81.1     23.87   76.4   13.1(本发明)珍汕97B(武汉)      96.0       75.3    19.2    7.5    81.69    25.8    74.7   13.8改良珍汕97(海南)

               94.0       63.9    19.3    10.1   83.70    25.54   71.8   19.7(本发明)珍汕97B(海南)      93.0       59.7    18.5    9.1    87.2     27.3    72.5   20.7

Claims (4)

1、一种利用常规杂交育种和分子标记辅助选择育种的快速改良水稻品质的方法，其特征在于，以常规杂交为基础，快速地将决定水稻优良食味与蒸煮品质的基因同时导入到被改良的水稻亲本中，将被改良水稻亲本的品质性状改良为中等直链淀粉含量和软胶稠度；所述的常规育种方法包括一次杂交、三次回交和一次自交的育种及选择，以目标基因序列上合成引物进行PCR扩增选择目的基因，在每一世代予以对目的基因进行检测，进而以AFLP对所述水稻亲本的遗传背景实施选择，筛选农艺性状与原水稻品种完全相同、且带有优良米质基因的目标基因区段的单株为改良的优质水稻。

2、根据权利要求1所述快速改良水稻品质的方法，其特征包括以下步骤：

(1)以含有中等直链淀粉含量、软胶稠度的优良品质基因的品种作为供体亲本，以待改良亲本为轮回亲本，将二者杂交，得到的F₁杂种一代再与轮回亲本杂交，获得基因型为BC₁F₁的回交一代；

(2)对BC₁F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因者进行AFLP分析筛选，选出含轮回亲本带型最多的单株再与轮回亲本回交，得到基因型为BC₂F₁的回交二代；

(3)对BC₂F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因且在该基因一侧与紧密连锁的分子标记发生交换者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到基因型为BC₃F₁的回交三代；

(4)对BC₃F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因且在该基因另一侧与另一紧密连锁的分子标记发生交换的单株，套袋自交，得到基因型为BC₃F₂的杂交后代；

(5)对BC₃F₂单株进行PCR检测，选出含目标基因纯合的单株进行AFLP筛选，选出除目标基因区段外的遗传背景全为轮回亲本的单株，即为遗传背景与待改良亲本完全一致，且带有供体亲本的优质基因表现为中等直链淀粉含量和软胶稠度的改良型优质水稻品种。

3、根据权利要求2所述快速改良水稻品质的方法，其中的PCR检测步骤包括：

(1)PCR反应体系：抽取各待测单株的DNA各10-50ng，依据与目标基因共分离或紧密连锁的分子标记设计的特异正向引物和反向引物各0.25μm，Taq DNA聚合酶1U，四种脱氧核糖核苷酸dATP，dTTP，dCTP，dGTP各0.1mM，Tris-HCl(pH8.3)和KCl各10mM，以及MgCl₂各2mM，PCR反应体系为15-25ul；

(2)PCR反应程序：首先在94℃变性3-5分钟，然后在94℃变性45秒，56℃退火0.5-1.5分钟，72℃延伸1-2分钟，运行25-40个循环，最后在72℃延伸5-8分钟；

(3)PCR产物检测：以1-1.4％的琼脂糖凝胶点样，在50-100V直流电压电泳4-6小时，溴化乙啶染色，置于紫外灯下读取各样品的PCR带型，确定各样品的分子标记基因型。

4、根据权利要求3所述方法，其中的利用AFLP筛选亲本遗传背景的方法包括以下步骤：

(1)在37℃下对各待测单株的DNA进行限制性内切酶Mse I和EcoR I双酶消3小时后，再加入T4 DNA连接酶，温育3小时；

(2)加入EcoR I+1引物以及Taq DNA酶在60℃的退火温度下进行选择性预扩增；

(3)在另一管中加入EcoR I+3引物、T4激酶和γ-³²P[ATP]，在37℃温育0.5小时，对EcoR I+3引物进行末端标记；

(4)加入预扩增产物、EcoR I+3引物、Mse I+3引物以及Taq酶，在65℃的退火温度下进行选择性扩增；

(5)PCR产物在6-8％的聚丙烯酰胺凝胶上点样，在70W瓦功率下2.5-3小时后，揭下凝胶，放射自显影3-24小时；在放射自显影的X光片上读取各样品的AFLP带型，计算各样品恢复轮回亲本基因型的比率。