CN1101644C - 一种改良杂交稻恢复系抗性的方法 - Google Patents

Abstract

一种改良杂交稻恢复系抗性的方法，属于植物新品种选育技术领域。其特征在于，通过一次杂交，三次回交和一次自交的育种程序，将目标基因导入到待改良的杂交稻恢复系中，采用聚合酶链式反应(PCR)检测并选择与目标基因共分离和/或紧密连锁的分子标记基因型，使含有目标基因的转移片段尽可能小，应用扩增片段长度多态性(AFLP)标记对遗传背景实施选择，使除开目标基因区段之外，改良型恢复系基因组与原恢复系相同。

Description

一种改良杂交稻恢复系抗性的方法

技术领域：

本发明属于植物新品种选育的方法，具体涉及到一种改良杂交稻恢复系抗性的方法。其国际专利分类号为A01H1/00。

背景技术：

我国自1973年实现杂交稻三系配套以来，培育了许多优良的杂交稻恢复系亲本，配制了许多强优势的杂交稻组合，为我国的粮食生产作出了卓越的贡献。但目前应用的大多数恢复系的抗性较差，严重制约了我国杂交稻的进一步推广应用。回交育种长期以来是对综合性状优良但个别性状较差的现有品种实施改良的有效手段，尤其是提高现有品种抗性的常用方法。通常以待改良的品种为轮回亲本，以带有理想目标性状的材料为供体亲本，二者杂交后杂种再与轮回亲本回交，从回交后代中选择含有目标性状的单株与轮回亲本再次回交。如此回交数代后可以得到遗传背景大致与轮回亲本相同但导入了目标性状的单株。但常规回交育种的周期往往较长，且存在轮回亲本基因型恢复的偏离等问题，难以适应对杂交稻恢复系进行抗性改良的需要。究其原因，主要是由于常规回交育种是基于田间表型的选择，而不是对基因型的选择。发明者认为，由于存在多因一效、一因多效，以及调控基因、修饰基因等的作用，许多性状与基因间并非一对一的关系，加之表型又是基因型与环境相互作用的结果，因此以表型来推测基因型存在着一定程度的不可靠性。而且，植株的表型选择本身要求具有丰富的实践经验和艺术家般的鉴赏眼光。表型选择的效率较低，制约了品种改良的进程。此外，对某些特殊性状的直接鉴定还受到许多条件的限制。例如对某些抗病虫性的选择，有时依靠自然鉴定难以进行，采用人工接种或接虫的方法也很困难或费用太高，或基于安全考虑受到明令禁止。因此，在育种过程中，如何将基因型选择与表型选择有机结合，从而提高选择的效率，是进一步加快新品种选育进程的关键。

近年来发展起来的分子标记辅助选择技术，为解决上述问题创造了条件。所谓分子标记辅助选择，就是借助与目标基因紧密连锁的分子标记基因型的分析，鉴定分离群体中含有目标等位基因的个体，从而加速育种的进程。由于分子标记辅助选择技术使得传统的表型选择发展到对理想基因型的直接选择，从而可以大大提高选择的效率，缩短育种的周期。近年来，将分子标记辅助选择技术应用于作物遗传改良的尝试已有报道。例如，在水稻中，Yoshimura等(1995)和Huang等(1997)借助分子标记辅助选择技术将数个白叶枯病抗性基因聚合在一起。然而，他们既没有跟踪导入抗性基因片段的大小，也没有对抗性基因区段外的遗传背景实施选择，因而不可能用于杂交稻恢复系的抗性改良。发明者认为，作为一种杂交稻恢复系抗性改良的方法，最重要的两个方面是：(1)在导入目标抗性基因的同时，要尽可能避免供体亲本中与目标基因紧密连锁的其他不利基因渗入到改良体中，导致改良体与预期目标不尽一致；(2)在改良目标抗性的同时，要确保原恢复系所特有的高配合力、强适应性等优良性状得以保持。因此，作为一种高效、可靠的分子标记辅助的杂交稻恢复系抗性改良的新方法，不但要有效地跟踪导入抗性基因片段的大小，而且要对抗性基因区段外的遗传背景实施快速而有效的选择。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效、可靠的分子标记辅助的杂交稻恢复系抗性改良方法。

本发明可以通过以下技术方案实现：

一种改良杂交稻恢复系抗性的方法，包括杂交，回交，抗性鉴定和分子标记检测方法，其特征在于，采用一次杂交，三次回交和一次自交的育种程序，将目标基因导入到待改良的杂交稻恢复系中，采用聚合酶链式反应(PCR)检测并选择与目标基因共分离和/或紧密连锁的分子标记基因型，使含有目标基因的导入片段尽可能小，应用扩增片段长度多态性(AFLP)标记对遗传背景实施选择，使除开目标基因区段之外，改良型恢复系基因组与原恢复系相同，并对改良型恢复系进行抗性鉴定，繁殖和杂种生产。

下面详细叙述本发明的细节：

一种改良杂交稻恢复系抗性的方法如下：

所述改良杂交稻恢复系抗性的方法采用如下步骤：

a.以含有目标抗性基因的品系为供体亲本，以待改良的杂交稻恢复系为轮回亲本，二者杂交，所得杂种一代(F₁)再与轮回亲本回交，得到回交一代(BC₁F₁)；

b.对BC₁F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到回交二代(BC₂F₁)；

c.对BC₂F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因且在该基因一侧与紧密连锁的分子标记发生交换者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到回交三代(BC₃F₁)；

d.对BC₃F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因且在该基因另一侧与另一紧密连锁的分子标记发生交换的单株，套袋自交，得到BC₃F₂；

e.对BC₃F₂单株进行PCR检测，选出目标基因纯合者进行AFLP筛选，选出除目标基因区段外的遗传背景全为轮回亲本的单株，即为改良型恢复系。

所述PCR检测方法包括：

a.PCR反应体系为，各待检测单株的DNA各10-50ng，依据与目标基因共分离或紧密连锁的分子标记设计的特异正向引物和反向引物各0.25uM，Taq DNA聚合酶各0.5-1.5U，四种脱氧核糖核苷酸dATP，dTTP，dGTP和dCTP各0.1mM，Tris-HCl(pH8.3)和KCl各10mM，以及MgCl₂各2mM，PCR反应体积为15-25uL；

b.PCR循环程序为，首先在94℃变性3-5分钟，然后在94℃变性30-45秒，50-60℃退火0.5-1.5分钟，72℃延伸1-2分钟，运行25-40个循环，最后在72℃延伸5-8分钟；

c.PCR产物的检测为，在1％-1.4％的琼脂糖凝胶上点样，在50-100伏直流电压下电泳4-6小时，进行溴化乙啶染色，置于紫外光下读取各样品的PCR带型，确定各样品的分子标记基因型。

所述运用AFLP筛选遗传背景的方法包括如下步骤：

a.在37℃对各待测单株的DNA进行限制性内切酶MseI和EcoRI双酶消化3小时后，再加入T4 DNA连接酶，继续温育3小时；

b.加入EcoRI+1引物和MseI+1引物以及Taq DNA聚合酶在60℃的退火温度下进行选择性预扩增；

c.在另一管中加入EcoRI+3引物、T4激酶和γ-³²P[ATP]，在37℃温育0.5小时，对EcoRI+3引物进行末端标记；

d.加入预扩增产物、EcoRI+3引物、MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃的退火温度下进行选择性扩增；

e.PCR产物在6-8％的聚丙烯酰胺凝胶上点样，在70瓦功率下电泳2.5-3.5小时后，揭下凝胶，放射自显影3-24小时；

f.在放射自显影的X光胶片上读取各样品的AFLP带型，计算各样品恢复轮回亲本基因型的比率。

所述改良型恢复系的抗性鉴定方法是在水稻生长的分蘖盛期实施自叶枯病菌液剪叶接种鉴定。接种菌液浓度为10⁸-10⁹/mL。每株接种5-8片健康叶片。2-3周后测量病斑长度。病斑长度小于3cm者为抗病(R)，3-6cm者为中抗(MR)，6-9cm者为中感(MS)，9cm以上者为感病(S)。

所述改良型恢复系的繁殖方法是将改良型恢复系种植于人工隔离或天然屏障隔离良好的条件下，株行距为16×26cm。种子成熟后收获繁殖的改良型恢复系种子。

所述改良型恢复系的杂种生产方法是将改良型恢复系与不育系种植于人工隔离或天然屏障隔离良好的条件下，改良型恢复系与不育系的行比为1∶8，株行距为16×26cm。种子成熟后于不育系上收获种子，即为改良型恢复系的杂种。

具体实施方式：

实例1：杂交稻恢复系明恢63的白叶枯病抗性改良

a.以含有广谱高抗白叶枯病基因Xa21的品系IRBB21为供体亲本，以我国应用最广的杂交稻恢复系明恢63为轮回亲本，二者杂交，所得F₁再与轮回亲本回交，得到BC₁F₁；

b.对BC₁F₁单株进行PCR分析，选出含Xa21基因者进行AFLP分析，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到BC₂F₁；

c.对BC₂F₁单株进行PCR分析，选出含Xa21基因且在该基因一侧与分子标记AB9发生交换者进行AFLP分析，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到BC₃F₁；

d.对BC₃F₁单株进行PCR分析，选出含Xa21基因且在该基因另一侧与分子标记C189发生交换的单株，套袋自交，得到BC₃F₂；

e.对BC₃F₂单株进行PCR分析，选出Xa21基因纯合者进行AFLP分析，选出除Xa21基因区段外的遗传背景全为轮回亲本的单株，即为改良型明恢63。

实例2：改良型汕优63的杂种生产方法

将改良型明恢63与不育系珍汕97A种植于天然屏障隔离良好的条件下(四周100米的范围内无花期相遇的其他水稻材料)，改良型明恢63与珍汕97A的行比为1∶8，株行距为16×26cm。种子成熟后于珍汕97A上收获种子，即为改良型汕优63。

实例3：明恢63及其改良型、汕优63及其改良型的多菌系接种鉴定结果

1998年夏，采用来自我国各主要稻区和菲律宾、日本等国的14个对明恢63致病的白叶枯病菌株在武汉市华中农业大学病圃对明恢63及其改良型、汕优63及其改良型进行了多菌系接种鉴定(详见表1)。结果表明，改良型明恢63及其配组而得的改良型汕优63对所有供试菌株均表现抗病，与原抗性亲本IRBB21达到同一抗性水平，而与原明恢63和汕优63相比，抗性显著增强，完全达到了预期的目标。

表1.明恢63及其改良型、汕优63及其改良型的多菌系接种鉴定结果

                      (1998年夏，武汉)菌系    来源    菌群    明恢63    汕优63    IRBB21    明恢63    汕优63    珍珠矮

                    (改良型)  (改良型)72-67   湖南             S         S        MR        MR        MR        SHB17    河北     2       MR        MS       R         R         R         SJS49-6  湖南     7       MR        MS       R         R         R         SKS6-6   江苏     2       MS        S        R         R         R         SLN42    辽宁             MR        MR       R         R         R         SLN44    辽宁     1       MS        S        R         R         R         SZJ173   浙江     4       S         S        R         R         R         SPxo61   菲律宾   1       MS        S        R         R         R         SPxo79   菲律宾   3       MR        MS       R         R         R         SPxo71   菲律宾   4       MR        MS       R         R         R         SPxo112  菲律宾   5       MS        S        R         R         R         SPxo99   菲律宾   6       S         S        R         R         R         ST7174   日本     1       MS        S        R         R         R         ST7133   日本     3       MS        S        R         R         R         S

实例4：明恢63及其改良型、汕优63及其改良型在不同条件下的农艺性状表现

1999年春，在海南省陵水县华中农业大学育种基地对明恢63及其改良型、汕优63及其改良型在不同条件下进行了农艺性状考察。结果发现，明恢63及其改良型、汕优63及其改良型在正常条件下的各种农艺性状均无显著差异(详见表2)，表明通过分子标记辅助选择之后，轮回亲本基因型得到了很好的恢复。在人工接种ZJ173、LN44和Pxo99等三个白叶枯病菌株的条件下，明恢63及其改良型、汕优63及其改良型在株高、穗长等形态性状和生育期等方面无显著差异但在产量性状方面存在显著差异(详见表3)，主要表现为：原明恢63在千粒重和结实率上较改良型明恢63分别降低了6.61％和11.39％，原汕优63在穗粒数、千粒重和单株产量等方面较改良型汕优63分别降低18.11％、6.63％和29.79％。综合表2和表3的结果，可以看出，由于导入了广谱高抗白叶枯病基因Xa21，改良型明恢63和改良型汕优63的抗性显著增强，其在病害条件下和在正常条件下的表现相同，可以确保高产稳产；而原明恢63和原汕优63在病害条件下则表现较差，造成减产减收。

表2.明恢63及其改良型、汕优63及其改良型和IRBB21

在未接种条件下的农艺性状表现(1999年春，海南)

        抽穗期     株高    穗长    单株    穗粒数     粒重     单株产量   结实率

         (天)      (厘米)  (厘米) 有效穗数          (克/千粒)    (克)      (％)明恢63      116.7      76.2     22.7     5.1    73.5      28.04     10.45      69.12明恢63      116.9      76.4     23.0     5.2    74.1      28.25     10.79      68.94(改良型)IRBB21      110.5      64.7     20.2     5.2    75.1      19.95     7.80       74.44汕优63      100.8      81.2     24.4     5.2    92.2      28.30     13.55      78.34汕优63      100.3      81.4     24.3     5.2    92.2      29.08     13.98      80.42(改良型)LSD_0.05  0.943      3.076    1.941    7.443  1.122     1.971     4.986LSD_0.01  1.563      5.101    3.220    12.344 1.861      3.269    8.269，LSD_0.05和LSD_0.01分别表示在0.05和0.01概率水平上达到差异显著的最小差数。

表3.明恢63及其改良型、汕优63及其改良型和IRBB21

在人工接种条件下的农艺性状表现(1999年春，海南)

       抽穗期   株高     穗长    单株    穗粒数     粒重     单株产量   结实率

        (天)   (厘米)   (厘米)  有效穗数          (克/千粒)    (克)      (％)明恢63      117.5  77.5      22.9     5.3      68.6      26.12     9.52      59.28明恢63      116.9  76.7      23.1     4.8      73.2      27.97     9.81      66.90(改良型)IRBB21      110.5  64.9      20.4     5.4      73.1      20.14     7.96      74.67汕优63      100.1  82.8      23.6     4.8      74.6      26.89     9.52      81.63汕优63      100.3  80.9      23.7     5.2      91.1      28.80     13.56     79.36(改良型)LSD_0.05   1.693  2.802     2.015    12.197   1.209     1.087     5.445LSD_0.01   2.808  4.648     3.343    20.229   2.005     1.803     9.031，LSD_0.05和LSD_0.01分别表示在0.05和0.01概率水平上达到差异显著的最小差数。

本发明的优点在于：

1.通过对与目标基因共分离和紧密连锁的分子标记基因型的PCR分析和选择，有效地解决了常规回交育种中长期存在的连锁累赘问题，即由于不利基因与目标基因紧密连锁致使所得改良体与预期的目标不尽一致的现象；

2.通过运用AFLP技术对各回交后代个体基因组的背景选择，有效地解决了常规回交育种中轮回亲本基因型恢复的偏离问题，使得在改良目标性状的同时，原恢复系所特有的高配合力、强适应性等优良性状得以保持，因而改良体可以替代原恢复系直接用于杂种生产。

3.分子标记技术的运用，使得回交育种的周期缩短，育种进程加快，适应了抗病育种的需要。

Claims (4)

1.一种改良杂交稻恢复系抗性的方法，包括杂交，回交，抗性鉴定和分子标记检测方法，其特征在于，采用一次杂交，三次回交和一次自交的育种程序，将目标基因导入到待改良的杂交稻恢复系中，采用聚合酶链式反应(PCR)检测并选择与目标基因共分离和/或紧密连锁的分子标记基因型，使含有目标基因的导入片段尽可能小，应用扩增片段长度多态性(AFLP)标记对遗传背景实施选择，使除开目标基因区段之外，改良型恢复系基因组与原恢复系相同，并对改良型恢复系进行抗性鉴定，繁殖和杂种生产。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述改良杂交稻恢复系抗性的方法采用如下步骤：

a.以含有目标抗性基因的品系为供体亲本，以待改良的杂交稻恢复系为轮回亲本，二者杂交，所得杂种一代(F₁)再与轮回亲本回交，得到回交一代(BC₁F₁)；

b.对BC₁F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到回交二代(BC₂F₁)；

c.对BC₂F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因且在该基因一侧与紧密连锁的分子标记发生交换者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到回交三代(BC₃F₁)；

d.对BC₃F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因且在该基因另一侧与另一紧密连锁的分子标记发生交换的单株，套袋自交，得到BC₃F₂；

e.对BC₃F₂单株进行PCR检测，选出目标基因纯合者进行AFLP筛选，选出除目标基因区段外的遗传背景全为轮回亲本的单株，即为改良型恢复系。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述PCR检测方法包括：

a.PCR反应体系为，各待检测单株的DNA各10-50ng，依据与目标基因共分离或紧密连锁的分子标记设计的特异正向引物和反向引物各0.25uM，Taq DNA聚合酶各0.5-1.5U，四种脱氧核糖核苷酸dATP，dTTP，dGTP和dCTP各0.1mM，Tris-HCl(pH8.3)和KCl各10mM，以及MgCl₂各2mM，PCR反应体积为15-25uL；

b.PCR循环程序为，首先在94℃变性3-5分钟，然后在94℃变性30-45秒，50-60℃退火0.5-1.5分钟，72℃延伸1-2分钟，运行25-40个循环，最后在72℃延伸5-8分钟；

c.PCR产物的检测为，在1％-1.4％的琼脂糖凝胶上点样，在50-100伏直流电压下电泳4-6小时，进行溴化乙啶染色，置于紫外光下读取各样品的PCR带型，确定各样品的分子标记基因型。

4.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述AFLP筛选遗传背景的方法包括如下步骤：

a.在37℃对各待测单株的DNA进行限制性内切酶MseI和EcoRI双酶消化3小时后，再加入T4 DNA连接酶，继续温育3小时；

b.加入EcoRI+1引物和MseI+1引物以及Taq DNA聚合酶在60℃的退火温度下进行选择性预扩增；

c.在另一管中加入EcoRI+3引物、T4激酶和γ-³²P[ATP]，在37℃温育0.5小时，对EcoRI+3引物进行末端标记；

d.加入预扩增产物、EcoRI+3引物、MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃的退火温度下进行选择性扩增；

e.PCR产物在6-8％的聚丙烯酰胺凝胶上点样，在70瓦功率下电泳2.5-3.5小时后，揭下凝胶，放射自显影3-24小时；

f.在放射自显影的X光胶片上读取各样品的AFLP带型，计算各样品恢复轮回亲本基因型的比率。