CN109258454B - 一种抗稻叶黑粉病的高产杂交水稻的育种方法 - Google Patents

一种抗稻叶黑粉病的高产杂交水稻的育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种抗稻叶黑粉病的高产杂交水稻的育种方法，包括以下步骤：(1)筛选籼稻抗源母本和常规粳稻父本，并鉴定父本稻叶黑粉菌毒素的耐受浓度C0；(2)父母本杂交；(3)F1代自交，进入分蘖期时，依次喷施浓度为C1、C2、C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗；(4)‑(6)F2代与父本进行三次回交，且灌浆期喷施C3浓度的所述毒素提取液；(7)BC3F2代自交，且灌浆期喷施C3浓度的所述毒素提取液；(8)BC3F3代自交，且灌浆期喷施C3浓度的所述毒素提取液，并进行分子标记辅助选择，筛选高抗高产阳性纯合单株。本发明育种方法简单、目标性状明确、成效显著，能将稻叶黑粉病抗性基因特定而高效地导入粳稻受体中，稳定性优良。

Description

一种抗稻叶黑粉病的高产杂交水稻的育种方法
技术领域
本发明属于杂交育种技术领域，具体涉及一种抗稻叶黑粉病的高产杂交水稻的育种方法。
背景技术
稻叶黑粉病，又叫叶黑肿病，由稻叶黑粉菌引起，广泛分布于世界各稻区，是危害水稻生长的常见农作物疾病。稻叶黑粉病的主要发病症状：在沿叶脉的叶片上出现长1-4mm、宽0.2-0.5mm的黑色短条状病斑，稍隆起，病斑周围组织变黄；严重时，叶片上线条状病斑密布，连接成小斑块，使叶片提早枯黄，甚至使叶尖破裂成丝状，降低稻株结实率和谷粒充实度。现有技术，主要通过栽培管理技术和合理施用化学药剂两方面综合防治稻叶黑粉病，但都无法从根本上消除稻叶黑粉病的传播和蔓延，此外，化学药剂防治不仅会增加农业生产成本，还会加剧土壤环境的污染问题。因此，水稻抗稻叶黑粉病抗性品种的选育和应用是防治稻叶黑粉病最经济、最高效、最环保的方式。目前，在抗稻叶黑粉病水稻品种的选育方面尚未有相关文献和专利记载、报道，仍是杂交水稻育种研究领域的空白。
水稻杂交育种技术是将不同表现型、不同基因型的亲本进行杂交，并在杂种后代中选育出优良水稻品种的方法。杂交可以使双亲的基因重新组合，形成各种不同的类型，为选择提供丰富的材料；基因重组可以将双亲控制不同性状的优良基因结合于一体，或将双亲中控制同一性状的不同微效基因积累起来，产生在各该性状上超过亲本的类型。
分子标记辅助选择是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，能从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。
综上所述，结合杂交育种技术和分子标记辅助选择技术选育出抗稻叶黑粉病的高产杂交水稻对于推动农业技术的发展具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种抗稻叶黑粉病的高产杂交水稻的育种方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种抗稻叶黑粉病的高产杂交水稻的育种方法，包括以下步骤：
(1)筛选含有稻叶黑粉病高抗基因且农艺性状优良的不育系籼稻抗源，作为母本，筛选农艺性状优良的常规恢复系粳稻，作为父本，并鉴定其稻叶黑粉菌毒素的耐受浓度C0；
(2)间行种植父、母本，扬花期进行人工授粉，收获F1代杂交种；
(3)种植F1代，进入分蘖期时，开始喷施浓度为C1的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，且C0＜C1≤1.5C0,7天后，对未感染水稻单株，进行第二次喷施，喷施浓度为C2，且C1＜C2≤1.3C1，7天后，对未感染水稻单株，进行第三次喷施，喷施浓度为C3，且C2＜C3≤1.2C2，筛选出抗病水稻单株进行自交，收获F2代杂交种；
(4)种植F2代和父本，进行回交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC1F2代杂交种；
(5)种植BC1F2代和父本，进行回交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC2F2代杂交种；
(6)种植BC2F2代和父本，进行回交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC3F2代杂交种；
(7)种植BC3F2代，进行自交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC3F3代杂交种；
(8)种植BC3F3代，进行自交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选出抗病、高产水稻单株，并对其进行分子标记辅助选择，收获阳性纯合单株种子，即得目标性状水稻新品种。
优选的是，所述稻叶黑粉菌毒素的耐受浓度的鉴定方法具体如下：
(1)将常规恢复系粳稻父本的花药接种到离体培养基中，25℃离体培养50-55d，得到花药愈伤组织；
(2)在30组含有不同梯度浓度稻叶黑粉菌毒素提取液的分化培养基中接种花药愈伤组织，25℃诱导分化培养40-45d，筛选出花药愈伤组织分化率在1-2％范围内的稻叶黑粉菌毒素的浓度水平，计算浓度平均值，即为所述常规恢复系粳稻对稻叶黑粉菌毒素的耐受浓度C0。
优选的是，所述离体培养基：MS培养基+1.2mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+25g/L葡萄糖+8％琼脂。
优选的是，所述分化培养基：MS培养基+1mg/LKT+0.8mg/L6-BA+1mg/LNAA+30g/L葡萄糖+8％琼脂+梯度浓度稻叶黑粉菌毒素提取液。
优选的是，所述稻叶黑粉菌毒素提取液的制备方法如下：按1:2000的固液比稻叶黑粉病菌接种于PDA液体培养基中，25℃扩培3-5d，以25-35KHz、500W的超声波进行破壁处理，离心、灭菌后，即得稻叶黑粉菌毒素提取液。
本发明的有益效果：
(1)本发明以抗稻叶黑粉病不育系籼稻为抗源基因的供体亲本，以常规粳稻为受体亲本，通过一次杂交、三次自交、三次回交，并利用分子标记辅助选择技术对BC3F3代抗病水稻单株的基因型进行跟踪检测，培育出阳性纯合可育水稻品种，不存在性状分离现象，抗病基因的稳定性好。
(2)本发明利用梯度法预先鉴定出待改良常规粳稻对稻叶黑粉菌毒素的耐受浓度C0，进而确定筛选压，通过对F1代分蘖期水稻连续喷施C1、C2、C3浓度的稻叶黑粉菌毒素提取液，进行连续压力选择，锁定抗稻叶黑粉病的水稻单株，并进行自交，基因累加，降低后代性状分离比。
(3)本发明育种方法简单、目标性状明确、成效显著，能将稻叶黑粉病抗性基因特定而高效地导入粳稻受体中，稳定性优良，不会使稻叶黑粉菌产生抗药性、引起环境污染，从根本上防治稻叶黑粉病的发生和传播。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明提供一实施例的一种抗稻叶黑粉病的高产杂交水稻的育种方法，包括以下步骤：
(1)筛选抗稻叶黑粉病不育系籼稻抗源/常规恢复系粳稻：
筛选含有稻叶黑粉病高抗基因且农艺性状优良的不育系籼稻抗源，即高产、米质优良、高抗稻叶黑粉病的具有雄性不育特征的籼稻品种，作为母本，筛选农艺性状优良的常规恢复系粳稻，即高产、米质优良、抗倒伏的恢复系粳稻品种，作为父本；
(2)鉴定常规恢复系粳稻对稻叶黑粉菌毒素的耐受浓度C0：
a.制备稻叶黑粉菌毒素提取液：按1:2000的固液比稻叶黑粉病菌接种于PDA液体培养基中，25℃扩培3-5d，以25-35KHz、500W的超声波进行破壁处理，离心、灭菌后，即得稻叶黑粉菌毒素提取液；
b.培养花药愈伤组织：将常规恢复系粳稻父本的花药接种到MS培养基+1.2mg/L6-BA+0.3mg/L NAA+25g/L葡萄糖+8％琼脂的离体培养基中，25℃离体培养50-55d，得到花药愈伤组织；
c.在30组含有不同梯度浓度稻叶黑粉菌毒素提取液的分化培养基中接种花药愈伤组织，所述分化培养基配方：MS培养基+1mg/LKT+0.8mg/L 6-BA+1mg/LNAA+30g/L葡萄糖+8％琼脂+梯度浓度稻叶黑粉菌毒素提取液，25℃诱导分化培养40-45d，筛选出花药愈伤组织分化率在1-2％范围内的稻叶黑粉菌毒素的浓度水平x1、x2、x3…xn，按
Figure BDA0001838104030000061
公式计算浓度平均值，即为所述常规恢复系粳稻对稻叶黑粉菌毒素的耐受浓度C0；
(3)亲代杂交：
间行种植含有稻叶黑粉病高抗基因且农艺性状优良的不育系籼稻母本和农艺性状优良的常规恢复系粳稻父本，扬花期进行人工授粉，收获F1代杂交种；
(4)F1代自交：
种植F1代，进入分蘖期时，开始喷施浓度为C1的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，且C0＜C1≤1.5C0,7天后，对未感染水稻单株，进行第二次喷施，喷施浓度为C2，且C1＜C2≤1.3C1，7天后，对未感染水稻单株，进行第三次喷施，喷施浓度为C3，且C2＜C3≤1.2C2，筛选出抗病水稻单株进行自交，收获F2代杂交种；
(5)F2代与父本回交：
种植F2代和父本，进行回交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC1F2代杂交种；
(6)BC1F2代与父本回交：
种植BC1F2代和父本，进行回交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC2F2代杂交种；
(7)BC2F2代与父本回交：
种植BC2F2代和父本，进行回交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC3F2代杂交种；
(8)BC3F2代自交：
种植BC3F2代，进行自交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC3F3代杂交种；
(9)BC3F3代自交：
种植BC3F3代，进行自交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选出抗病、高产水稻单株，并对其进行分子标记辅助选择，收获阳性纯合单株种子，即得目标性状水稻新品种。
实施例1
(1)筛选抗稻叶黑粉病不育系籼稻抗源/常规恢复系粳稻：分子标记辅助选择出含有稻叶黑粉病高抗基因的冈46A，作为不育系籼稻抗源，即母本，选择春江15作为常规恢复系粳稻，即父本；
(2)鉴定常规恢复系粳稻对稻叶黑粉菌毒素的耐受浓度C0：
a.制备稻叶黑粉菌毒素提取液：按1:2000的固液比稻叶黑粉病菌接种于PDA液体培养基中，25℃扩培3d，以25KHz、500W的超声波进行破壁处理，离心、灭菌后，即得稻叶黑粉菌毒素提取液；
b.培养花药愈伤组织：将常规恢复系粳稻父本的花药接种到MS培养基+1.2mg/L6-BA+0.3mg/L NAA+25g/L葡萄糖+8％琼脂的离体培养基中，25℃离体培养50d，得到花药愈伤组织；
c.在30组含有不同梯度浓度稻叶黑粉菌毒素提取液的分化培养基中接种花药愈伤组织，所述分化培养基配方：MS培养基+1mg/LKT+0.8mg/L 6-BA+1mg/LNAA+30g/L葡萄糖+8％琼脂+梯度浓度稻叶黑粉菌毒素提取液，25℃诱导分化培养40d，筛选出花药愈伤组织分化率在1-2％的稻叶黑粉菌毒素的浓度水平x1、x2、x3…xn，按
Figure BDA0001838104030000081
公式计算浓度平均值，即为所述常规恢复系粳稻对稻叶黑粉菌毒素的耐受浓度C0。
表1列出稻叶黑粉菌毒素的浓度水平x1、x2、x3…x9及耐受浓度C0
表1：
x<sub>1</sub> x<sub>2</sub> x<sub>3</sub> x<sub>4</sub> x<sub>5</sub> x<sub>6</sub> x<sub>7</sub> x<sub>8</sub> x<sub>9</sub> C<sub>0</sub>
12％ 12.5％ 13％ 13.5％ 14％ 14.5％ 15％ 15.5％ 16％ 14％
实施例2
(1)亲代杂交：
间行种植实施例1筛选出的冈46A母本和春江15父本，扬花期进行人工授粉，收获F1代杂交种；
(2)F1代自交：
种植F1代，进入分蘖期时，开始喷施浓度为C1的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，且C0＜C1≤1.5C0,7天后，对未感染水稻单株，进行第二次喷施，喷施浓度为C2，且C1＜C2≤1.3C1，7天后，对未感染水稻单株，进行第三次喷施，喷施浓度为C3，且C2＜C3≤1.2C2，筛选出抗病水稻单株进行自交，收获F2代杂交种。
表2列出稻叶黑粉菌毒素提取液的喷施浓度C1、C2、C3
表2：
C<sub>0</sub> C<sub>1</sub> C<sub>2</sub> C<sub>3</sub>
14％ 20％ 25％ 30％
实施例3
(1)F2代与父本回交：
种植实施例2所得F2代和父本，进行回交，进入灌浆期时，开始喷施30％稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC1F2代杂交种；
(2)BC1F2代与父本回交：
种植BC1F2代和父本，进行回交，进入灌浆期时，开始喷施30％稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC2F2代杂交种；
(3)BC2F2代与父本回交：
种植BC2F2代和父本，进行回交，进入灌浆期时，开始喷施30％稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC3F2代杂交种。
实施例4
(1)BC3F2代自交：
种植实施例3所得BC3F2代，进行自交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC3F3代杂交种；
(2)BC3F3代自交：
种植BC3F3代，进行自交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选出抗病、高产水稻单株，并对其进行分子标记辅助选择，收获阳性纯合单株种子，即得目标性状水稻新品种。
由实施例4选育出的水稻新品种平均年产量为624.7Kg/亩，糙米率80.3％,精米率72.6％,整精米率54.9％，垩白粒率44.8％，垩白度7.6％,直链淀粉含量21.8％,糊化温度6.5，胶稠度58mm，蛋白质含量8.4％，稻叶黑粉病抗性级数为0.4级、表现高抗，稻瘟病抗性级数为2.7级、表现中抗。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (3)

1.一种抗稻叶黑粉病的高产杂交水稻的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)筛选含有稻叶黑粉病高抗基因且农艺性状优良的不育系籼稻抗源，作为母本，筛选农艺性状优良的常规恢复系粳稻，作为父本，并鉴定其稻叶黑粉菌毒素的耐受浓度C0；
所述稻叶黑粉菌毒素的耐受浓度的鉴定方法具体如下：
i.将常规恢复系粳稻父本的花药接种到离体培养基中，25℃离体培养50-55d，得到花药愈伤组织；
ii.在30组含有不同梯度浓度稻叶黑粉菌毒素提取液的分化培养基中接种花药愈伤组织，25℃诱导分化培养40-45d，筛选出花药愈伤组织分化率在1-2％范围内的稻叶黑粉菌毒素的浓度水平，计算浓度平均值，即为所述常规恢复系粳稻对稻叶黑粉菌毒素的耐受浓度C0；
所述稻叶黑粉菌毒素提取液的制备方法如下：按1:2000的固液比稻叶黑粉病菌接种于PDA液体培养基中，25℃扩培3-5d，以25-35KHz、500W的超声波进行破壁处理，离心、灭菌后，即得稻叶黑粉菌毒素提取液；
(2)间行种植父、母本，扬花期进行人工授粉，收获F1代杂交种；
(3)种植F1代，进入分蘖期时，开始喷施浓度为C1的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，且C0＜C1≤1.5C0， 7天后，对未感染水稻单株，进行第二次喷施，喷施浓度为C2，且C1＜C2≤1.3C1，7天后，对未感染水稻单株，进行第三次喷施，喷施浓度为C3，且C2＜C3≤1.2C2，筛选出抗病水稻单株进行自交，收获F2代杂交种；
(4)种植F2代和父本，进行回交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC1F2代杂交种；
(5)种植BC1F2代和父本，进行回交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC2F2代杂交种；
(6)种植BC2F2代和父本，进行回交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC3F2代杂交种；
(7)种植BC3F2代，进行自交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选抗病、高产水稻单株，收获BC3F3代杂交种；
(8)种植BC3F3代，进行自交，进入灌浆期时，开始喷施浓度为C3的稻叶黑粉菌毒素提取液进行炼苗，筛选出抗病、高产水稻单株，并对其进行分子标记辅助选择，收获阳性纯合单株种子，即得目标性状水稻新品种。
2.根据权利要求1所述一种抗稻叶黑粉病的高产杂交水稻的育种方法，其特征在于，所述离体培养基：MS培养基+1.2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+25g/L葡萄糖+8％琼脂。
3.根据权利要求1所述一种抗稻叶黑粉病的高产杂交水稻的育种方法，其特征在于，所述分化培养基：MS培养基+1mg/LKT+0.8mg/L 6-BA+1mg/LNAA+30g/L葡萄糖+8％琼脂+梯度浓度稻叶黑粉菌毒素提取液。
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Marker-assisted breeding of Indonesia local rice variety Siputeh for semi-dwarf phonetype, good grain quality and disease resistance to bacterial blight;Yanchang Luo et al.;《Rice》;20141218;第7卷(第33期);第1-8页 *
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聚合抗稻白叶枯病双基因三系不育系R106A的选育研究;罗彦长 等;《中国农业科学》;20051231;第38卷(第11期);第2157-2164页 *

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