CN101736076A - 小麦抗白粉病基因的分子标记定位研究进展 - Google Patents

Abstract

综合多种抗源，选育抗病品种是防治小麦白粉病的一项既安全又经济有效的措施，小麦白粉病具有小种多、变异快、侵染时期长、气流传播、适应范围广等特点，新小种不断出现经常导致生产品种抗性丧失。因此，建立抗病基因的分子标记，利用标记辅助选择进行抗病基因积累，创造新抗源，对实现小麦白粉病持久抗病性具有重要意义。

Description

小麦抗白粉病基因的分子标记定位研究进展

技术领域

小麦抗白粉病基因的分子标记定位研究进展，属于分子生物学领域。

背景技术

小麦白粉病是由小麦白粉菌(Erysiphe graminis.f.sp tritici)引起的真菌性病害，过去仅在具有充沛雨量的海洋性和半大陆性气候环境的小麦种植区流行并造成严重的产量损失(Bennett，1984，PlantPathol 33：279-300；Miranda et al.，2006，Theor Appl Genet113：1497-1504)。20世纪60年代以来，小麦矮秆、半矮秆品种的推广，氮肥施用量的增加，白粉病的危害日趋严重，在世界主要麦区由次要病害上升为主要病害，成为影响和限制小麦稳产和高产的一大障碍。据统计，小麦白粉病引起的产量损失一般为5-10％，严重发生时可高达50％，甚至绝产。如在1990年，我国小麦白粉病为害面积达1.8亿亩，产量损失达32亿公斤(刘万才、邵振润，1998，植保技术与推广18(1)：3-5)。

培育和推广抗病品种被公认为是防治小麦白粉病最经济、有效、安全的途径，其一方面可以减少农药的使用，避免污染环境，另一方面可以降低生产成本。抗病品种的传统选育方法是通过接种鉴定后选择抗病植株，使用这种方法有时会因为接种不充分或发病条件不适宜而影响选择效率。随着分子标记技术的产生和不断发展完善，可以利用分子标记进行抗病基因的鉴定选择，从而发展了分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)新方法。用分子标记进行抗病基因的检测，在早代就可以进行选择，提高选择的准确性，缩小育种群体，并且不受环境、生长季节的限制，结合加代技术能大大缩短育种年限、提高育种效率。

小麦白粉病菌具有群体大、适应范围广、生理小种多且毒力变异快等特点，在生产上应用的含有单个抗病基因的品种很容易丧失抗性。因此，应培育多抗品种或耐病品种，将多个抗病基因累加到同一个体中，以保持品种的持久抗性，提高抗病品种的使用年限。传统的表型鉴定方法，难以准确、快速选择具有两个或两个以上抗病基因的个体，应用分子标记技术则可以解决这一问题。同时，还需要不断地发掘外源抗病基因，并将这些优良基因尽快转移到普通小麦中，以应用于小麦遗传改良。小麦的野生近缘种属中蕴藏着丰富的抗性资源，是小麦抗病基因的重要来源。在已知的38个抗小麦白粉病基因中，除部分基因源于普通小麦，其余来自黑麦、山羊草、簇毛麦、二粒小麦、野生二粒小麦、提莫菲维小麦、斯卑尔塔小麦等小麦的近缘种属。

综合多种抗源，选育抗病品种是防治小麦白粉病的一项既安全又经济有效的措施。小麦白粉病具有小种多、变异快、侵染时期长、气流传播、适应范围广等特点，新小种不断出现经常导致生产品种抗性丧失。因此，建立抗病基因的分子标记，利用标记辅助选择进行抗病基因积累，创造新抗源，对实现小麦白粉病持久抗病性具有重要意义。

发明内容

1.小麦抗白粉病基因及其分子标记

1.1小麦抗白粉病基因的抗性遗传、来源及染色体定位

小麦对白粉病的抗性可分为两种类型，即由主效基因控制的质量抗性和由微效多基因控制的数量抗性。质量抗性由显性或隐性单基因控制，已报道的抗白粉病基因绝大多数为显性，仅来自于栽培二粒小麦的Pm5和来自于野生二粒小麦的Pm26为隐性(Rong et al.，2000Euphytica 115：121-126)。在未定名的抗白粉病基因中，还有一些为隐性遗传。Robe和Doussinault(1995，Mol Gen Genet 246：327-333)通过苗期离体叶片鉴定发现，法国的一个重要抗病品系RE714除含有抗病基因Pm4b外，还含有一个隐性抗病基因MLRE，并推测该基因来自二粒小麦。Singrün等(2004)在普通小麦品系TA2682c中发现了两个抗白粉病基因，其中一个为隐性，根据抗性反应的不同，将这一隐性基因确定为新的小麦抗白粉病基因，命名为mlRD30，并利用中国春缺-四体的AFLP标记验证，将其定位到染色体7A上。在我国，Huang等(2000，2002)鉴定了几个重要抗病农家品种，如红卷芒、苯三月黄、小白冬麦、游白兰和复壮30，其对白粉病的抗性均受隐性基因控制。小麦对白粉病的数量抗性又称之为慢粉性(Shaner，1973，Phytopathology 63：867-872)、部分抗性(Hautea et al.，1987，Theor Appl Genet73：609-615)、田间抗性或成株抗性，由微效多基因控制。少数被克服的主效基因的残效也提供成株的抗性。

迄今已在小麦基因组的36个基因位点鉴定了52个主效抗白粉病基因(Huang et al.，2004；Zhu et al.，2005；Miranda et al.，2006Theor Appl Genet 113：1497-1504)。这些基因不是随机分布在基因组中(表2)，而是成簇存在于基因的富集区域(Gell et al.，1996a，b Genetics144：1883-1891)。小麦抗白粉病基因共有三类来源：一类来源于普通小麦，包括Pm1a、Pm1e、Pm3、Pm5b-5e、Pm9、Pm10、Pm11、Pm14、Pm15、Pm23、Pm24、Pm28、Pm38、Pm39；第二类来源于小麦近缘种，包括Pm1b(栽培一粒小麦)，Pm1c(一粒小麦)、Pm1d(斯卑尔塔小麦)，Pm4a、Pm5a(栽培二粒小麦)，Pm4b、Pm33(波斯小麦)，Pm6

Pm27、Pm37(提莫菲维小麦)，Pm16、Pm26、Pm30、Pm31、Pm36(野生二粒小麦)和Pm25(野生一粒小麦)；第三类来源于小麦近缘属，包括Pm7、Pm8、Pm17、Pm20(黑麦)，Pm12、Pm32(拟斯卑尔脱山羊草)，Pm13(高大山羊草)，Pm2、Pm19、Pm34、Pm35(粗山羊草)，Pm21(簇毛麦)，Pm29(卵穗山羊草)。其中Pm10，Pm11，Pml4和Pm15只抗冰草属白粉病菌，不抗小麦白粉病，Pm17是Pm8的等位基因，Pm18和Pm22均为Pm1的等位基因，分别被重新定名为Pm1c和Pm1e。另外，最近有关学者从栽培一粒小麦、提莫菲维小麦、乌拉尔图小麦和两个单粒小麦品种中分别发现了新的小麦抗白粉病基因，依次命名为NCA4，NCAG11，PmU，Mlm2033，Mlm80，Pm37。

对白粉病抗性基因进行染色体定位的经典方法是利用单体分析。1954年，美国密苏里州大学E.R.Sears从普通小麦品种中国春(CS)中获得了全套的小麦单体、三体、端体及缺体和四体衍生系，为小麦抗病基因染色体定位提供了材料，促进了小麦抗病基因染色体定位研究的发展。当前，采用单体或端体分析等细胞遗传学方法，已将绝大多数抗白粉病基因定位于染色体或染色体臂上。

DNA分子标记技术的发展及应用提高了小麦抗白粉病基因定位的可靠性。如利用单体分析曾将Pm12定位于6A上，Jia(1996)通过RFLP分析将其重新定位于6BS-6SS.6SL上；Pm16曾被定位到4A上，罗英皓(2003)通过SSR分析将其重新定位在5BS上；Pm24原定位于6D上(Huang et al.，1997b)，Huang(2000)通过SSR分析将其重新定位于1D上；Singrün(2003)通过SSR和AFLP分析将其重新定位于7A染色体上，并且认为Pm22为Pm1的等位基因，定名为Pm1e。

1.2小麦抗白粉病基因的分子标记

1.2.1DNA分子标记

小麦抗白粉病基因的分子标记筛选研究始于90年代初，在小麦抗白粉病基因分子标记研究中，常用的DNA分子标记，归纳起来主要包括以下三个方面：

1)基于分子杂交的分子标记，如RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性片断长度多态性)、VNTR(varible number of tandem repeat，可变串连重复)等。

2)基于PCR的分子标记，如RAPD(Random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AP-PCR(Arbitrary Primed PCR，任意引物聚合酶链反应)、DAF(DNA AmplifiedFingerprints)、AFLP(Amplified fragment length polymorphism扩增片断长度多态性)、SSR(Simple sequence repeats OR microsatellite，简单序列重复或微卫星DNA)、ISSR(Inter-SimpleSequence简单重复间序列)、SCAR(Sequence-characterized amplified region序列特异性扩增区)、STS(Sequence-tagged site序列标志位点)、CAPS(Cleaved amplified polymorphicsequence)、SPAR(Simple Primer Amplification Reaction，单引物扩增反应)等。

3)基于DNA芯片技术的分子标记，如SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)等

1.2.2寻找目标基因分子标记的方法

1)利用近等基因系筛选

培育特殊的遗传群体是筛选与目标基因紧密连锁的分子标记的基础。目标基因的近等基因系(NILs)是用于标记筛选的理想材料。近等基因系除了目标基因所在位点的局部区域外，基因组DNA序列的其余部分相同。由于NILs的遗传组成特点，一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记就极有可能位于目标基因的侧翼附近。Pugsley(1961)和The et al.(1979)以小麦Federation为背景创制了小麦抗白粉病主效基因Pm1、Pm2、Pm3a、Pm3c和Pm4b的近等基因系，Hartl等(1995)也开发了Pm2、Pm5、Pm6的NILs群体用于基因的分子标记研究，轮回亲本是小麦品种“Prins”。另外，以小麦品种“Chancellor”为背景的近等基因系也被广泛应用，如Pm1a、Pm2、Pm3a、Pm3b、Pm3c、Pm3f、Pm4a、Pm5和Pm7等(Zeller et al.，1993；Hu et al.，1997)。

2)分离群体分组分析法(BSA)

近等基因系的培育是通过连续回交的途径获得，一般需要回交6-8代，十分费时。为此，Michelmore等(1991)建立了一个在目标基因组区域快速鉴定标记的方法：分离群体分组分析法(Bluked segregant analysis，BSA)。其方法是针对所研究的目标基因决定的性状将F₂分离群体中各个个体按双亲的表现型分为两组(如抗病、感病)。每一组中的各单株DNA等量混合，形成两个DNA混合池(如抗池、感池)。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个DNA混合池间理论上主要在目标基因所在的局部区域存在差异，相当于两个NILs。对两个DNA池进行标记筛选，如某一标记在池间产生多态性，表明该标记与目标基因连锁，用此标记对分离群体的所有单株进行筛选，就可计算标记与目标基因的距离。BSA法克服了用近等基因系或细胞遗传学材料鉴定与目标基因连锁的标记所产生的问题。与目标基因不连锁的区域在许多个体混合的样品间存在差异的机会最小，与之相对的，即使5次回交后，仅有一半在近等基因系间是多态性的位点有希望作图到选择的区域。

3)根据已有的遗传连锁图谱或物理图谱筛选分子标记

随着分子标记技术的发展，许多重要农作物都已建立了高密度的分子遗传图谱和物理图谱，为筛选与目标基因连锁的分子标记提供了简便、快捷的途径。通过20多年的努力，已经建立了许多不同类型的小麦分子遗传图谱和物理图谱(

et al.，1998；Gupta et al.，1999；Somers et al.，2004)。通过遗传分析，一些目标基因被定位在小麦的某一染色体上，通过已有的分子遗传图谱或物理图谱很容易找到与之连锁的标记(Nelson et.，1995a，b，c；Jia et al，1996；Huang et al.，1997b；Zeller et al.，2002；Hsam et al.，2003；Huang et al.，2004)。

4)应用比较基因组共享分子标记

比较基因组研究主要是利用共同的DNA分子标记在相关植物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同或相似性，并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。第一张禾本科作物比较图谱(Consensus grass comparative map)由Moore等(1995)完成，随后由Gale和Devos(1998)进一步补充。这张图谱仅根据25个水稻连锁区描绘了燕麦、大麦、小麦、玉米、高粱、两个基因组的甘蔗、谷子和水稻9个不同的基因组。另外小麦分别与小伞山羊草、高大山羊草和沙融山羊草的比较遗传图谱也已完成(Zhang et al.，1998；2001)。比较基因组作图为我们建立高密度遗传连锁图提供了大量可利用的标记资源，从而大大提高了获取离目标基因很近的分子标记的可能性。利用比较RFLP作图，Dubcovsky(1998)证明来自小麦、黑麦、大麦和栽培一粒小麦的春化基因在栽培一粒小麦连锁图谱上是连锁在一起的。

1.2.3目标基因区域的精细作图

在分子标记辅助育种中，分子标记与目标基因连锁距离应该在5cM之内，最好是完全连锁或者遗传距离小于1cM(Gupta et al.，1999)，如果超过这个距离就需构建精细的遗传图谱。在一条染色体上的已知区段增加分子标记的方法有两种：一是整合已有的遗传图谱，将定位在该区段内的不同类型分子标记整合一起，提高该区段的分子标记密度；另一种方法就是寻找新的分子标记。

目前，小麦7个同源群的详细RFLP连锁图谱已经完成(Chao et al.，1989；Devos et al.，1992；1993；Xie et al.，1993；Nelson et al.，1995a，b，c；Van Deynze et al.，1995；Marino et al.，1996；Jia etal.，1996)。随着新的分子标记技术的应用，一些在整个基因组水平上的不同分子标记类型的小麦遗传图谱也相继建立。如果将不同类型的分子标记整合在一起，覆盖整个小麦基因组的标记位点已超过3000个。因此，对于小麦基因组的某些区域，通过整合定位的分子标记，完全有可能找到与目标基因连锁更紧密或共分离的标记。

当获得一个与目标基因连锁的分子标记后，更直接的方法是通过已获得的信息寻找新的标记。Peng等(1999)对小麦抗条锈基因YrH52进行了微卫星标记，筛选出9个与YrH52连锁的标记，并构建了由10个SSR标记和YrH52组成的1B染色体遗传图，但他们发现在远侧边有24.5cM的间隙存在负交换干扰。由于这种干扰可以影响该基因的辅助选择和图位克隆，他们对YrH52基因区域再进行微卫星高密度作图，增加了11个与YrH52连锁的新微卫星位点，构建一个有23个标记和YrH52基因组成的1B染色体遗传图，且大部分标记被定位在YrH52附近区域，Xgwm413和Xgwm273a分别在YrH52两侧1.3cM和2.7cM处。

构建目标基因区域高密度物理图谱也是获得与之紧密连锁或共分离分子标记的有效方法。由于物理图谱上分子标记与目标基因之间的实际距离是按碱基数(bp)来计算的，因此是真正的基因图谱。物理图谱的种类很多，从简单的染色体分带图到精细的碱基全序列都是物理图谱，但限制酶切图谱、跨叠克隆群和DNA序列图谱最为常用。应用比较遗传作图和不同类型的分子标记技术，一些小麦基因组局部区域已被高密度物理作图(Gill et al.，1996；Faris et al.，2000)。

1.3小麦抗白粉病基因的利用和评价

由于小麦白粉病病原菌生理小种多，毒力变异快，一旦产生新的毒性小种或小种种群发生变化都会导致小麦白粉病的大发生，给小麦生产带来灾难性的后果。尽管目前已发现52个小麦抗白粉病基因，但是这些基因的抗病效果却不尽相同。例如，Pm10、Pm11、Pm14和Pm15只对冰草白粉菌表现抗性，不抗小麦白粉菌，在生产上几乎没有应用价值；在世界小麦生产中应用最广的抗白粉病基因为Pm8，但该基因已在绝大部分地区丧失抗性。由于在黑麦的1R染色体短臂易位到小麦的1A或1B染色体长臂形成的易位系中，1RS不仅补偿1AS和1BS的损失，而且对产量具有杂种优势效应，因此作为Pm8的替代基因，Pm17在欧洲已开始受到关注(Mohler et al.，2001)。

90年代以来，我国的小麦育种家意识到小麦白粉病抗病基因单一化的严重后果，下大力量发掘、引入和转育含有新的抗白粉病基因的品种，Pm23由四川农业大学发现，Pm24来源于我国的农家品种Chiyacao(齿牙糙)，Pm2、Pm4a、Pm4b、Pm2+6等基因(组合)已在我国小麦抗病育种中得到了应用。欧洲目前有9个抗病基因正在被应用：Pm1、Pm2、Pm3c、Pm3d、Pm4b、Pm5、Pm6、Pm8、Pm9。其中有些品种携带的是单基因，有些携带的是结合基因如Pm1+Pm2+Pm9和Pm2+Pm6，这些结合基因在中欧地区表现出较高的抗性。

对Pm1到Pm8已知抗白粉病基因的抗效评价结果表明Pm1，Pm3a，Pm3b，Pm3c，Pm3f，Pm5，Pm7，Pm8等抗病基因已在我国丧失抗性(李隆业和黄元江，1990；盛宝钦等，1993；熊恩惠等，1994；向齐君等，1996；段霞瑜等，1998)。虽然，Pm4a在我国大部分地区仍然保持较高的抗性，但小麦白粉菌对它的毒性呈较快的上升趋势，特别是在西南地区正逐步丧失抗性，因此在生产上应该慎用(段霞瑜等，1998)。Pm4b，Pm2+6和Pm2+Mld在我国仍然保持很好的抗性，应广泛加以利用。Pm9没有单独的载体，和Pm1，Pm2共存于一个品种，但含Pm1+Pm2+Pm9的Normandie对我国的白粉病菌不具有抗性。

研究表明Pm12，Pm13，Pml6，Pm18(Pm1c)，Pm21，Pm23在我国表现高抗至免疫，而Pm17抗性较弱，Pm19对我国白粉病菌基本不具有抗性。在这些抗病基因中，Pm21不仅抗中国目前报道的所有白粉菌毒力型及被检测的120个欧洲小种，而且其载体品种无明显的不良性状，在不同小麦遗传背景下抗病性均表现稳定(刘金元等，1999)。目前，Pm21已经被转育到栽培品种(杨足君等，2000)，并在生产中应用。含有Pm12，Pm13，Pm16，Pm18(Pm1c)基因的品种或品系农艺性状较差，不宜直接作育种亲本。为了有效的利用这些基因，中国农业科学院作物品种资源研究所通过多年努力，已培育成这些基因的近等基因系(Zhou et al.，2005)。Pm17虽然对白粉病抗性较弱，但其1R具有良好的增产性能和拥有对麦二叉蚜的抗性，因此可以作为背景抗性与其它抗病基因组合使用。在Pm24(Huang et al.，2000b)以后鉴定的基因中，Pm30(Liu et al.，2002)、Pm31(Xie et al.，2003)和Pm33(Zhu et al.，2005)为我国学者发现并定名，其他基因还有待引进，在我国的利用价值还有待于进一步鉴定。

2.小麦抗白粉病基因的聚合及分子标记辅助选择

在常规植物育种中，育种者在从一个分离群体选择期望单株的过程中将面临着许多问题，如分离群体大小、环境影响、生育期等，特别是数量性状必须在高代材料中筛选，费工费时。另外，在一个材料中存在一个抗性基因的情况下再进行另一个抗性基因的选择是困难的，因此，利用常规育种的方法进行抗病基因累加更加困难。随着分子生物学发展，利用分子标记技术在植物育种的早期世代和苗期进行辅助选择将极大地提高植物育种的效率。

在已获得的小麦抗白粉病基因的分子标记中多为RFLP和RAPD标记，由于RFLP技术复杂，成本高，使用同位素，在小麦育种实践中要检测大量群体，这是不现实的；RAPD标记虽检测方便，但稳定性差。这使得大规模应用分子标记技术辅助选择育种受到一定限制，所以今后应开发共显性、多态性高、重复性稳定性好、简单易用、自动化程度高的新型理想分子标记技术，为普及应用分子标记辅助选择育种提供技术支持。

另一方面，为了提高小麦抗病广谱性、持久性，培育聚合多个抗白粉病基因的小麦品种，是小麦抗白粉病育种的当务之急。小麦白粉病菌具有群体大、适应范围广、生理小种多且毒力变异快等特点，单一抗源的品种容易“丧失”抗性，为了减小病原菌变异的选择压力，将多个抗病基因累加到同一个体中，是提高其抗病谱和保持抗性持久的有效手段(McDonald etal.，2002；Miranda et al.，2006)。分子标记辅助选择(MAS)技术体系的建立，为抗病聚合体的筛选提供了有效方法。

Yoshimura等(1995)利用RFLP、RAPD标记辅助选择，已将水稻抗白叶枯病基因Xa₃、Xa₄、Xa₅和Xa₁₀累加到一起；刘金元等(1997)利用与Pm2和Pm4a紧密连锁的RFLP标记对F₂群体进行双纯合子抗病株的选择，成功地将3个抗白粉病基因组合Pm2+Pm4a、Pm2+Pm21和Pm4a+Pm21聚合到优异小麦品种“扬麦158”中，Liu等(2000)也对这个聚合群体材料进行了筛选鉴定；刘志勇等(1999)将与Pm21连锁的RAPD标记OPH17₁₄₀₀转化为SCAR₁₂₆₅和SCAR₁₄₀₀，用于“滚动式加代回交转育”中Pm21地检测，现已获得许多具有不同遗传背景、农艺性状优良的抗白粉病品系；王心宇等(2001)采用在早代进行抗性鉴定，淘汰感病株，保留抗病株继续种植，在F₄代进行抗病鉴定结合分子标记辅助选择的策略成功获得了Pm4a+Pm21、Pm2+Pm4a、Pm8+Pm21抗白粉病基因聚合体；张增艳等(2002)利用小麦抗白粉病基因Pm4、Pm13、Pm21的特异PCR标记对含有Pm4b、Pm13、Pm21的小麦复合杂交F₂代进行检测，从中选择出聚合Pm4b+Pm21+Pm13、Pm4b+Pm13、Pm4b+Pm21和Pm13+Pm21的抗病植株；高安礼等(2005)也利用与小麦抗白粉病基因Pm2、Pm4a和Pm21紧密连锁的PCR标记对含有Pm2、Pm4a和Pm21的小麦复合杂交后代经3轮分子标记选择得到了一批聚合有Pm2+Pm4a+Pm21三个基因的抗病植株和Pm2+Pm21、Pm4a+Pm21、Pm2+Pm4a两基因聚合的植株，抗病性人工接种鉴定结果表明，含有Pm21的聚合体与Pm21基因单独存在时抗性相当均对自粉病免疫，聚合体Pm2+Pm4a的抗性好于Pm2或Pm4a单独存在时的抗性。

利用分子标记技术，如SSR(G-SSR，EST-SSR)、ISSR，对不同来源的抗白粉病基因进行精细作图，寻找与抗白粉病基因紧密连锁的标记，用于抗性基因的识别和多基因聚合体的筛选鉴定，在小麦育种实践中具有重要意义.

具体实施方式

1.小麦抗白粉病基因及其分子标记

1.1小麦抗白粉病基因的抗性遗传、来源及染色体定位

小麦对白粉病的抗性可分为两种类型，即由主效基因控制的质量抗性和由微效多基因控制的数量抗性。质量抗性由显性或隐性单基因控制，已报道的抗白粉病基因绝大多数为显性，仅来自于栽培二粒小麦的Pm5和来自于野生二粒小麦的Pm26为隐性(Rong et al.，2000Euphytica 115：121-126)。在未定名的抗白粉病基因中，还有一些为隐性遗传。Robe和Doussinault(1995，Mol Gen Genet 246：327-333)通过苗期离体叶片鉴定发现，法国的一个重要抗病品系RE714除含有抗病基因Pm4b外，还含有一个隐性抗病基因MLRE，并推测该基因来自二粒小麦。Singrün等(2004)在普通小麦品系TA2682c中发现了两个抗白粉病基因，其中一个为隐性，根据抗性反应的不同，将这一隐性基因确定为新的小麦抗白粉病基因，命名为mlRD30，并利用中国春缺-四体的AFLP标记验证，将其定位到染色体7A上。在我国，Huang等(2000，2002)鉴定了几个重要抗病农家品种，如红卷芒、苯三月黄、小白冬麦、游白兰和复壮30，其对白粉病的抗性均受隐性基因控制。小麦对白粉病的数量抗性又称之为慢粉性(Shaner，1973，Phytopathology 63：867-872)、部分抗性(Hautea et al.，1987，Theor Appl Genet73：609-615)、田间抗性或成株抗性，由微效多基因控制。少数被克服的主效基因的残效也提供成株的抗性。

迄今已在小麦基因组的36个基因位点鉴定了52个主效抗白粉病基因(Huang et al.，2004；Zhu et al.，2005；Miranda et al.，2006Theor Appl Genet 113：1497-1504)。这些基因不是随机分布在基因组中，而是成簇存在于基因的富集区域(Gell et al.，1996a，b Genetics 144：1883-1891)。小麦抗白粉病基因共有三类来源：一类来源于普通小麦，第二类来源于小麦近缘种，第三类来源于小麦近缘属。其中Pm10，Pm11，Pml4和Pm15只抗冰草属白粉病菌，不抗小麦白粉病，Pm17是Pm8的等位基因，Pm18和Pm22均为Pm1的等位基因，分别被重新定名为Pm1c和Pm1e。另外，最近有关学者从栽培一粒小麦、提莫菲维小麦、乌拉尔图小麦和两个单粒小麦品种中分别发现了新的小麦抗白粉病基因，依次命名为NCA4，NCAG11，PmU，Mlm2033，Mlm80，Pm37。

对白粉病抗性基因进行染色体定位的经典方法是利用单体分析。1954年，美国密苏里州大学E.R.Sears从普通小麦品种中国春(CS)中获得了全套的小麦单体、三体、端体及缺体和四体衍生系，为小麦抗病基因染色体定位提供了材料，促进了小麦抗病基因染色体定位研究的发展。当前，采用单体或端体分析等细胞遗传学方法，已将绝大多数抗白粉病基因定位于染色体或染色体臂上。

DNA分子标记技术的发展及应用提高了小麦抗白粉病基因定位的可靠性。如利用单体分析曾将Pm12定位于6A上，Jia(1996)通过RFLP分析将其重新定位于6BS-6SS.6SL上；Pm16曾被定位到4A上，罗英皓(2003)通过SSR分析将其重新定位在5BS上；Pm24原定位于6D上(Huang et al.，1997b)，Huang(2000)通过SSR分析将其重新定位于1D上；Singrün(2003)通过SSR和AFLP分析将其重新定位于7A染色体上，并且认为Pm22为Pm1的等位基因，定名为Pm1e。

1.2小麦抗白粉病基因的分子标记

1.2.1DNA分子标记

小麦抗白粉病基因的分子标记筛选研究始于90年代初，在小麦抗白粉病基因分子标记研究中，常用的DNA分子标记，归纳起来主要包括以下三个方面：

1)基于分子杂交的分子标记，如RFLP、VNTR等。

2)基于PCR的分子标记，如RAPD、AP-PCR、DAF、AFLP、SSR、ISSR、SCAR、STS、CAPS、SPAR等。

3)基于DNA芯片技术的分子标记，如SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)等

1.2.2寻找目标基因分子标记的方法

1)利用近等基因系筛选

培育特殊的遗传群体是筛选与目标基因紧密连锁的分子标记的基础。目标基因的近等基因系(NILs)是用于标记筛选的理想材料。近等基因系除了目标基因所在位点的局部区域外，基因组DNA序列的其余部分相同。由于NILs的遗传组成特点，一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记就极有可能位于目标基因的侧翼附近。

2)分离群体分组分析法(BSA)

近等基因系的培育是通过连续回交的途径获得，一般需要回交6-8代，十分费时。为此，Michelmore等(1991)建立了一个在目标基因组区域快速鉴定标记的方法：分离群体分组分析法(Bluked segregant analysis，BSA)。其方法是针对所研究的目标基因决定的性状将F₂分离群体中各个个体按双亲的表现型分为两组(如抗病、感病)。每一组中的各单株DNA等量混合，形成两个DNA混合池(如抗池、感池)。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个DNA混合池间理论上主要在目标基因所在的局部区域存在差异，相当于两个NILs。对两个DNA池进行标记筛选，如某一标记在池间产生多态性，表明该标记与目标基因连锁，用此标记对分离群体的所有单株进行筛选，就可计算标记与目标基因的距离。BSA法克服了用近等基因系或细胞遗传学材料鉴定与目标基因连锁的标记所产生的问题。与目标基因不连锁的区域在许多个体混合的样品间存在差异的机会最小，与之相对的，即使5次回交后，仅有一半在近等基因系间是多态性的位点有希望作图到选择的区域。

3)根据已有的遗传连锁图谱或物理图谱筛选分子标记

随着分子标记技术的发展，许多重要农作物都已建立了高密度的分子遗传图谱和物理图谱，为筛选与目标基因连锁的分子标记提供了简便、快捷的途径。通过20多年的努力，已经建立了许多不同类型的小麦分子遗传图谱和物理图谱。通过遗传分析，一些目标基因被定位在小麦的某一染色体上，通过已有的分子遗传图谱或物理图谱很容易找到与之连锁的标记。

4)应用比较基因组共享分子标记

比较基因组研究主要是利用共同的DNA分子标记在相关植物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同或相似性，并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。第一张禾本科作物比较图谱(Consensus grass comparative map)由Moore等(1995)完成，随后由Gale和Devos(1998)进一步补充。这张图谱仅根据25个水稻连锁区描绘了燕麦、大麦、小麦、玉米、高粱、两个基因组的甘蔗、谷子和水稻9个不同的基因组。另外小麦分别与小伞山羊草、高大山羊草和沙融山羊草的比较遗传图谱也已完成(Zhang et al.，1998；2001)。比较基因组作图为我们建立高密度遗传连锁图提供了大量可利用的标记资源，从而大大提高了获取离目标基因很近的分子标记的可能性。利用比较RFLP作图，Dubcovsky(1998)证明来自小麦、黑麦、大麦和栽培一粒小麦的春化基因在栽培一粒小麦连锁图谱上是连锁在一起的。

1.2.3目标基因区域的精细作图

在分子标记辅助育种中，分子标记与目标基因连锁距离应该在5cM之内，最好是完全连锁或者遗传距离小于1cM(Gupta et al.，1999)，如果超过这个距离就需构建精细的遗传图谱。在一条染色体上的已知区段增加分子标记的方法有两种：一是整合已有的遗传图谱，将定位在该区段内的不同类型分子标记整合一起，提高该区段的分子标记密度；另一种方法就是寻找新的分子标记。

目前，小麦7个同源群的详细RFLP连锁图谱已经完成(Chao et al.，1989；Devos et al.，1992；1993；Xie et al.，1993；Nelson et al.，1995a，b，c；Van Deynze et al.，1995；Marino et al.，1996；Jia etal.，1996)。随着新的分子标记技术的应用，一些在整个基因组水平上的不同分子标记类型的小麦遗传图谱也相继建立。如果将不同类型的分子标记整合在一起，覆盖整个小麦基因组的标记位点已超过3000个。因此，对于小麦基因组的某些区域，通过整合定位的分子标记，完全有可能找到与目标基因连锁更紧密或共分离的标记。

当获得一个与目标基因连锁的分子标记后，更直接的方法是通过已获得的信息寻找新的标记。Peng等(1999)对小麦抗条锈基因YrH52进行了微卫星标记，筛选出9个与YrH52连锁的标记，并构建了由10个SSR标记和YrH52组成的1B染色体遗传图，但他们发现在远侧边有24.5cM的间隙存在负交换干扰。由于这种干扰可以影响该基因的辅助选择和图位克隆，他们对YrH52基因区域再进行微卫星高密度作图，增加了11个与YrH52连锁的新微卫星位点，构建一个有23个标记和YrH52基因组成的1B染色体遗传图，且大部分标记被定位在YrH52附近区域，Xgwm413和Xgwm273a分别在YrH52两侧1.3cM和2.7cM处。

构建目标基因区域高密度物理图谱也是获得与之紧密连锁或共分离分子标记的有效方法。由于物理图谱上分子标记与目标基因之间的实际距离是按碱基数(bp)来计算的，因此是真正的基因图谱。物理图谱的种类很多，从简单的染色体分带图到精细的碱基全序列都是物理图谱，但限制酶切图谱、跨叠克隆群和DNA序列图谱最为常用。应用比较遗传作图和不同类型的分子标记技术，一些小麦基因组局部区域已被高密度物理作图(Gill et al.，1996；Faris et al.，2000)。

1.3小麦抗白粉病基因的利用和评价

由于小麦白粉病病原菌生理小种多，毒力变异快，一旦产生新的毒性小种或小种种群发生变化都会导致小麦白粉病的大发生，给小麦生产带来灾难性的后果。尽管目前已发现52个小麦抗白粉病基因，但是这些基因的抗病效果却不尽相同。例如，Pm10、Pm11、Pm14和Pm15只对冰草白粉菌表现抗性，不抗小麦白粉菌，在生产上几乎没有应用价值；在世界小麦生产中应用最广的抗白粉病基因为Pm8，但该基因已在绝大部分地区丧失抗性。由于在黑麦的1R染色体短臂易位到小麦的1A或1B染色体长臂形成的易位系中，1RS不仅补偿1AS和1BS的损失，而且对产量具有杂种优势效应，因此作为Pm8的替代基因，Pm17在欧洲已开始受到关注(Mohler et al.，2001)。

90年代以来，我国的小麦育种家意识到小麦白粉病抗病基因单一化的严重后果，下大力量发掘、引入和转育含有新的抗白粉病基因的品种，Pm23由四川农业大学发现，Pm24来源于我国的农家品种Chiyacao(齿牙糙)，Pm2、Pm4a、Pm4b、Pm2+6等基因(组合)已在我国小麦抗病育种中得到了应用。欧洲目前有9个抗病基因正在被应用：Pm1、Pm2、Pm3c、Pm3d、Pm4b、Pm5、Pm6、Pm8、Pm9。其中有些品种携带的是单基因，有些携带的是结合基因如Pm1+Pm2+Pm9和Pm2+Pm6，这些结合基因在中欧地区表现出较高的抗性。

对Pm1到Pm8已知抗白粉病基因的抗效评价结果表明Pm1，Pm3a，Pm3b，Pm3c，Pm3f，Pm5，Pm7，Pm8等抗病基因已在我国丧失抗性(李隆业和黄元江，1990；盛宝钦等，1993；熊恩惠等，1994；向齐君等，1996；段霞瑜等，1998)。虽然，Pm4a在我国大部分地区仍然保持较高的抗性，但小麦白粉菌对它的毒性呈较快的上升趋势，特别是在西南地区正逐步丧失抗性，因此在生产上应该慎用(段霞瑜等，1998)。Pm4b，Pm2+6和Pm2+Mld在我国仍然保持很好的抗性，应广泛加以利用。Pm 9没有单独的载体，和Pm1，Pm2共存于一个品种，但含Pm1+Pm2+Pm9的Normandie对我国的白粉病菌不具有抗性。

研究表明Pm12，Pm13，Pml6，Pm18(Pm1c)，Pm21，Pm23在我国表现高抗至免疫，而Pm17抗性较弱，Pm19对我国白粉病菌基本不具有抗性。在这些抗病基因中，Pm21不仅抗中国目前报道的所有白粉菌毒力型及被检测的120个欧洲小种，而且其载体品种无明显的不良性状，在不同小麦遗传背景下抗病性均表现稳定(刘金元等，1999)。目前，Pm21已经被转育到栽培品种(杨足君等，2000)，并在生产中应用。含有Pm12，Pm13，Pm16，Pm18(Pm1c)基因的品种或品系农艺性状较差，不宜直接作育种亲本。为了有效的利用这些基因，中国农业科学院作物品种资源研究所通过多年努力，已培育成这些基因的近等基因系(Zhou et al.，2005)。Pm17虽然对白粉病抗性较弱，但其1R具有良好的增产性能和拥有对麦二叉蚜的抗性，因此可以作为背景抗性与其它抗病基因组合使用。在Pm24(Huang et al.，2000b)以后鉴定的基因中，Pm30(Liu et al.，2002)、Pm31(Xie et al.，2003)和Pm33(Zhu et al.，2005)为我国学者发现并定名，其他基因还有待引进，在我国的利用价值还有待于进一步鉴定。

2.小麦抗白粉病基因的聚合及分子标记辅助选择

在常规植物育种中，育种者在从一个分离群体选择期望单株的过程中将面临着许多问题，如分离群体大小、环境影响、生育期等，特别是数量性状必须在高代材料中筛选，费工费时。另外，在一个材料中存在一个抗性基因的情况下再进行另一个抗性基因的选择是困难的，因此，利用常规育种的方法进行抗病基因累加更加困难。随着分子生物学发展，利用分子标记技术在植物育种的早期世代和苗期进行辅助选择将极大地提高植物育种的效率。

在已获得的小麦抗白粉病基因的分子标记中多为RFLP和RAPD标记，由于RFLP技术复杂，成本高，使用同位素，在小麦育种实践中要检测大量群体，这是不现实的；RAPD标记虽检测方便，但稳定性差。这使得大规模应用分子标记技术辅助选择育种受到一定限制，所以今后应开发共显性、多态性高、重复性稳定性好、简单易用、自动化程度高的新型理想分子标记技术，为普及应用分子标记辅助选择育种提供技术支持。

另一方面，为了提高小麦抗病广谱性、持久性，培育聚合多个抗白粉病基因的小麦品种，是小麦抗白粉病育种的当务之急。小麦白粉病菌具有群体大、适应范围广、生理小种多且毒力变异快等特点，单一抗源的品种容易“丧失”抗性，为了减小病原菌变异的选择压力，将多个抗病基因累加到同一个体中，是提高其抗病谱和保持抗性持久的有效手段(McDonald etal.，2002；Miranda et al.，2006)。分子标记辅助选择(MAS)技术体系的建立，为抗病聚合体的筛选提供了有效方法。

Yoshimura等(1995)利用RFLP、RAPD标记辅助选择，已将水稻抗白叶枯病基因Xa₃、Xa₄、Xa₅和Xa₁₀累加到一起；刘金元等(1997)利用与Pm2和Pm4a紧密连锁的RFLP标记对F₂群体进行双纯合子抗病株的选择，成功地将3个抗白粉病基因组合Pm2+Pm4a、Pm2+Pm21和Pm4a+Pm21聚合到优异小麦品种“扬麦158”中，Liu等(2000)也对这个聚合群体材料进行了筛选鉴定；刘志勇等(1999)将与Pm21连锁的RAPD标记OPH17₁₄₀₀转化为SCAR₁₂₆₅和SCAR₁₄₀₀，用于“滚动式加代回交转育”中Pm21地检测，现已获得许多具有不同遗传背景、农艺性状优良的抗白粉病品系；王心宇等(2001)采用在早代进行抗性鉴定，淘汰感病株，保留抗病株继续种植，在F₄代进行抗病鉴定结合分子标记辅助选择的策略成功获得了Pm4a+Pm21、Pm2+Pm4a、Pm8+Pm21抗白粉病基因聚合体；张增艳等(2002)利用小麦抗白粉病基因Pm4、Pm13、Pm21的特异PCR标记对含有Pm4b、Pm13、Pm21的小麦复合杂交F₂代进行检测，从中选择出聚合Pm4b+Pm21+Pm13、Pm4b+Pm13、Pm4b+Pm21和Pm13+Pm21的抗病植株；高安礼等(2005)也利用与小麦抗白粉病基因Pm2、Pm4a和Pm21紧密连锁的PCR标记对含有Pm2、Pm4a和Pm21的小麦复合杂交后代经3轮分子标记选择得到了一批聚合有Pm2+Pm4a+Pm21三个基因的抗病植株和Pm2+Pm21、Pm4a+Pm21、Pm2+Pm4a两基因聚合的植株，抗病性人工接种鉴定结果表明，含有Pm21的聚合体与Pm21基因单独存在时抗性相当均对自粉病免疫，聚合体Pm2+Pm4a的抗性好于Pm2或Pm4a单独存在时的抗性。

利用分子标记技术，如SSR(G-SSR，EST-SSR)、ISSR，对不同来源的抗白粉病基因进行精细作图，寻找与抗白粉病基因紧密连锁的标记，用于抗性基因的识别和多基因聚合体的筛选鉴定，在小麦育种实践中具有重要意义。

Claims (1)

1.迄今已在小麦基因组的36个基因位点鉴定了52个主效抗白粉病基因，这些基因不是随机分布在基因组中，而是成簇存在于基因的富集区域，小麦抗白粉病基因共有三类来源：一类来源于普通小麦，包括Pm1a、Pm1e、Pm3、Pm5b-5e、Pm9、Pm10、Pm11、Pm14、Pm15、Pm23、Pm24、Pm28、Pm38、Pm39；第二类来源于小麦近缘种，包括Pm1b(栽培一粒小麦)，Pm1c(一粒小麦)、Pm1d(斯卑尔塔小麦)，Pm4a、Pm5a(栽培二粒小麦)，Pm4b、Pm33(波斯小麦)，Pm6、Pm27、Pm37(提莫菲维小麦)，Pm16、Pm26、Pm30、Pm31、Pm36(野生二粒小麦)和Pm25(野生一粒小麦)；第三类来源于小麦近缘属，包括Pm7、Pm8、Pm17、Pm20(黑麦)，Pm12、Pm32(拟斯卑尔脱山羊草)，Pm13(高大山羊草)，Pm2、Pm19、Pm34、Pm35(粗山羊草)，Pm21(簇毛麦)，Pm 29(卵穗山羊草)；其中Pm10，Pm11，Pm14和Pm15只抗冰草属白粉病菌，不抗小麦白粉病(Tosa et al.，1987；1988；1990)，Pm17是Pm8的等位基因(Hsam and Zeller 1997)，Pm18和Pm22均为Pm1的等位基因，分别被重新定名为Pm1c和Pm1e，另外，最近有关学者从栽培一粒小麦、提莫菲维小麦、乌拉尔图小麦和两个单粒小麦品种中分别发现了新的小麦抗白粉病基因，依次命名为NCA4，NCAG11，PmU，Mlm2033，Mlm80，Pm37。