CN111218523A - 二角山羊草7Sb染色体特异分子标记及其应用 - Google Patents

二角山羊草7Sb染色体特异分子标记及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111218523A
CN111218523A CN202010216703.3A CN202010216703A CN111218523A CN 111218523 A CN111218523 A CN 111218523A CN 202010216703 A CN202010216703 A CN 202010216703A CN 111218523 A CN111218523 A CN 111218523A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aegilops
chromosome
wheat
bicolor
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010216703.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111218523B (zh
Inventor
刘成
宫文萍
韩冉
汪晓璐
程敦公
曹新有
刘爱峰
李豪圣
刘建军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences filed Critical CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202010216703.3A priority Critical patent/CN111218523B/zh
Publication of CN111218523A publication Critical patent/CN111218523A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111218523B publication Critical patent/CN111218523B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于作物分子生物学与遗传育种领域，具体涉及二角山羊草7Sb染色体的特异分子标记的建立与应用。二角山羊草7Sb染色体特异分子标记的碱基序列如序列表所示。建立的分子标记可以对小麦背景中是否含有二角山羊草7Sb染色体进行有效检测，使用二角山羊草7Sb染色体特异分子标记进行PCR扩增，对小麦背景中是否含有二角山羊草7Sb染色体进行检测或辅助检测。本发明获得的特异分子标记不仅可用于小麦‑二角山羊草杂交群体的筛选、鉴定，还可以应用于辅助选育抗条锈病和白粉病小麦新品系/品种，提高筛选效率，缩短育种时间，具有积极的产业化价值。

Description

二角山羊草7Sb染色体特异分子标记及其应用
技术领域
本发明属于作物分子生物学与遗传育种领域，具体涉及二角山羊草7Sb染色体特异分子标记的建立及其在跟踪检测小麦背景中二角山羊草染色体方面的应用。
背景技术
山羊草属（Genus Aegilops）包含23个物种，都是小麦的远缘物种，基本基因组包括C、D、U、S、Sl、Ss、Ssh、Sb、M、N和T。该属的一年生二倍体物种（2n=2x=14）二角山羊草（Ae. bicornis），基因组为SbSb，主要分布在塞浦路斯沿海地区、利比亚、埃及和以色列/巴勒斯坦和约旦南部部分地区，在叙利亚境内也有零星分布，其基因组与栽培小麦（基因组AABBDD）的B基因组亲缘关系较近。研究发现，二角山羊草高抗小麦条锈病（Valkoun等，1985）、白粉病（Valkoun等，1985；Gill等，1985）、叶锈病和黑森瘿蚊病（Gill等，1985）、秆锈病（Anikster等，2005）、黄斑叶枯病（Alam和Gustapson，2006），此外，该物种还比较耐盐（Farooq等，1989；Nevo和Chen，2010），是小麦的珍贵基因源，可以通过远缘杂交和染色体工程将其优异基因导入小麦，用于小麦遗传改良。
在小麦-二角山羊草远缘杂交方面，仅见澳大利亚科学家Shepherd和Islam在第七届国际小麦遗传学会上提到，英国植物学家Riley和Chapman已经将小麦与二角山羊草杂交成功，获得了小麦-二角山羊草3Sb染色体附加系和7Sb染色体附加系（Shepherd KW, IslamAKMR (1988) Fourth compendium of wheat-alien chromosome lines. In: Koebner R,Miller TE (eds) Proc 7th Int Wheat Genet Symp, Institute of Plant ScienceResearch, Cambridge, UK, pp 1373–1395）。然而，迄今为止，Riley和Chapman一直未对上述两附加系发文报道。其后，经英国约翰英纳斯中心（John Innes Centre）种质库的Reader教授与Riley和Chapman联系，获得了小麦-二角山羊草3Sb染色体附加系和7Sb染色体附加系。不仅如此，Riley和Chapman还将他们创制的小麦-二角山羊草3Sb(3A)染色体代换系、小麦-二角山羊草3Sb(3B)染色体代换系、小麦-二角山羊草3Sb(3D)染色体代换系、小麦-二角山羊草7Sb(7A)染色体代换系和小麦-二角山羊草7Sb(7B)染色体代换系惠赠给了该种质库，公众可以通过网上申请，有偿获得这些种质资源，但是一直以来，未见对上述种质资源鉴定、评价和利用的报道。
鉴于上述现状，我们开展了小麦-二角山羊草远缘杂交种质资源的鉴定与评价工作，结果发现，小麦-二角山羊草7Sb(7B)染色体代换系高抗小麦条锈病和白粉病，因此，可以将7Sb(7B)染色体代换系与小麦或小麦ph1b基因突变体杂交，利用双单体方法（Liu C,Qi L, Liu W, et al. 2011. Development of a set of compensating Triticum aestivum-Dasypyrum villosum Robertsonian translocation lines. Genome, 2011,54(10): 836-844）或诱导部分同源染色体配对方法（Qi L, Friebe B, Zhang P, et al.Homoeologous recombination, chromosome engineering and crop improvement.Chromosome Research, 2007, 15(1):3-19），从其自交F2群体中筛选获得可用于小麦育种的抗条锈病和白粉病小麦-二角山羊草7Sb染色体易位系。上述创制易位系的方法已经非常成熟，然而，可用于检测小麦背景中是否含有二角山羊草染色质的方法还非常缺乏。
在二角山羊草染色体特异标记建立方面，Sasanuma等（Wheat phylogenydetermined by RFLP analysis of nuclear DNA. 3. Intra- and interspecificvariations of five Aegilops Sitopsis species. Theoretical & Applied Genetics,1996,92(8):928-934）和Ciaffi等（Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)for protein disulfide isomerase (PDI) gene sequences in Triticum and Aegilopsspecies. Theoretical & Applied Genetics, 2000,101(1-2):220-226）先后建立了二角山羊草RFLP标记；吴磊等（利用比较基因组学开发山羊草属InDel分子标记，作物学报，2012,38(7):1334-1338）建立了二角山羊草InDel分子标记，除此之外，未见二角山羊草染色体特异标记建立的报道。然而，上述文献均未报道二角山羊草7Sb染色体特异分子标记，因此，非常有必要建立一种可用于快速检测小麦背景中二角山羊草7Sb染色体的特异分子标记，这对筛选鉴定杂交分离群体材料以及选育抗病小麦品系/品种均具有重要意义。
发明内容
为了解决以上现有技术中没有二角山羊草7Sb染色体特异PCR标记的问题，本发明提供了一种能够快捷、有效、简便地鉴定待测样本中是否含有二角山羊草7Sb染色体的特异分子标记，并提供了一种检测小麦背景中二角山羊草染色质的新方法。
一种二角山羊草7Sb染色体特异分子标记为下列六对引物中的一对以上的组合，其碱基序列如下：
TNAC1801：
F：5’-CAGCAACTCAGCTTTGGTCAC -3’，（见序列表中序列1）
R：5’-GCAAGCCTGTTTGGCATTT-3’； （见序列表中序列2）
TNAC1924：
F：5’-TAGCTTTGGAACGATGTGTGG-3’， （见序列表中序列3）
R：5’-TGTGGAGCAGTGCTGTTTATG-3’； （见序列表中序列4）
TNAC1791：
F：5’-GCTGCTGCTAAAGAGAAGGAA-3’， （见序列表中序列5）
R：5’-CCACGACACGTCCTGTAGC-3’； （见序列表中序列6）
TNAC1865：
F：5’-CTTACCATGAGCATGCAGAGC-3’， （见序列表中序列7）
R：5’-GATCGGCATGATAAGTTTCCA-3’； （见序列表中序列8）
TNAC1902：
F：5’-AATACCAGGTCCTCCAACTTT-3’， （见序列表中序列9）
R：5’-TGGAATCGCTGAGAAAGAATG-3’； （见序列表中序列10）
TNAC1937：
F：5’-AGCGGCATGTGGTAATCAATA-3’， （见序列表中序列11）
R：5’-CGGACGATCGAGAACACC-3’； （见序列表中序列12）。
本发明中所述的一种二角山羊草7Sb染色体特异分子标记的应用，具体为使用二角山羊草7Sb染色体特异分子标记进行PCR扩增，对小麦背景中是否含有二角山羊草7Sb染色体进行检测或辅助检测，以应用在杂交种质筛选与鉴定中。
进一步的，对小麦背景中是否含有二角山羊草7Sb染色体进行检测或辅助检测的方法包括以下步骤：
（1）以待测的可能含有二角山羊草7Sb染色体的小麦背景系的基因组总DNA为模板，用二角山羊草7Sb染色体特异分子标记分别对其进行PCR扩增，扩增产物使用凝胶电泳进行检测；
（2）如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有与阳性对照相同的特异DNA条带而阴性对照无该带，则说明待测小麦背景系的基因组中含有二角山羊草7Sb染色体；如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中不含有与对照相同的特异多态性DNA条带，则说明待测小麦背景系的基因组中不含有二角山羊草7Sb染色体。
进一步地，步骤（1）中所述的阳性对照为中国春-二角山羊草7Sb染色体附加系；所述的阴性对照为中国春小麦和/或其他不同小麦品种/品系。
进一步地，所述的6对引物对扩增特征在于30μL PCR反应体系为：25ng/μL的模板DNA 2.0μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.3μL，200μM的dNTPs，含Mg2+的10×PCR buffer3.0μL，10μM的上、下游引物各2μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至30μL。
进一步地，所述的PCR反应扩增程序为：94 ℃预变性3min，随后35个循环：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，4℃保存。
进一步地，所述的PCR反应扩增程序还包括利用限制性内切酶酶切，具体为引物TNAC1791、TNAC1865、TNAC1902和TNAC1937使用限制性内切酶HaeIII或TaqI进行酶切。
进一步地，步骤（1）中使用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
PCR产物（未酶切）经琼脂糖电泳后发现，仅引物TNAC1924和TNAC1801分别能在小麦-二角山羊草7Sb(7B)染色体代换系中扩增出长度约为490bp和750bp的特异DNA条带，而该两特异条带不能在阴性对照中扩增出，表明这两条特异条带可能是二角山羊草7Sb染色体特异片段。除上述两引物外，其他引物例如TNAC1792、TNAC1793、TNAC1794、TNAC1795、TNAC1797、TNAC1826、TNAC1829、TNAC1834、TNAC1838和TNAC1842均不能直接在阳性对照和阴性对照中扩增出多态性DNA条带；为了获得更多的多态性，分别用限制性内切酶HaeIII或TaqI对除了引物TNAC1801和TNAC1924扩增产物外的所有PCR产物进行酶切（包含无菌双蒸馏水6.5μL,10×NEB buffer 3.0μL,10×BSA0.3Μl,限制性内切酶0.2μL，HaeIII酶切温度为37℃，TaqI酶切温度为65℃，二者的酶切时间均为2h）后电泳，结果发现，引物TNAC1791/HaeIII、TNAC1865/TaqI、TNAC1902/TaqI和TNAC1937/TaqI分别可以在小麦-二角山羊草7Sb(7B)染色体代换系中获得长度约为600bp、950bp、1400bp和750bp的多态性片段，而不能在阴性对照中获得这些多态性片段，这表明，这些片段可能是二角山羊草7Sb染色体特异片段。
有益效果：
1、本发明建立了二角山羊草7Sb染色体的新标记，提供了使用新标记检测小麦背景中二角山羊草7Sb染色体的新方法，本发明获得的特异分子标记可用于杂交群体的筛选、鉴定与辅助选育抗条锈病和白粉病的小麦新品系/品种；
2、所筛选出的特异性分子标记，对小麦背景中是否含有二角山羊草7Sb染色体进行检测或辅助检测，特异性强，检测准确率高，提高筛选效率，缩短育种时间，具有积极的产业化价值。
附图说明
图1.引物TNAC1792、TNAC1793、TNAC1794、TNAC1795、TNAC1797、TNAC1801、TNAC1826、TNAC1829、TNAC1834、TNAC1838、TNAC1842和TNAC1924的扩增产物（未经过酶切）在2%琼脂糖凝胶中的电泳结果，箭头所示为多态性条带。M=Marker（DL2000），泳道上的1-4分别代表中国春、Holdfast、小麦-二角山羊草3Sb染色体附加系和小麦-二角山羊草7Sb(7B)染色体代换系，电泳图上排自左至右所用引物（Marker除外，每4个泳道为一组）依次为TNAC1792、TNAC1793、TNAC1794、TNAC1795、TNAC1797和TNAC1801，下排自左至右所用引物依次为TNAC1826、TNAC1829、TNAC1834、TNAC1838、TNAC1842和TNAC1924。
图2.引物TNAC1924、TNAC1801、TNAC1791、TNAC1865、TNAC1902和TNAC1937扩增产物（部分引物的扩增产物用限制性内切酶酶切）在2%琼脂糖凝胶中的电泳结果，箭头所示为多态性带，其中泳道上的1-13分别代表Holdfast、小麦-二角山羊草3Sb(3A)代换系、小麦-二角山羊草3Sb(3B)代换系、小麦-二角山羊草3Sb(3D)代换系、小麦-二角山羊草3Sb附加系、小麦-二角山羊草7Sb(7B)代换系、小麦对照品种济麦22、济麦23、济麦229、济麦262、济麦44、济麦4075和中国春。图A-图F分别为引物TNAC1924(PCR产物未酶切)、TNAC1801(PCR产物未酶切)、TNAC1791(PCR产物用HaeIII酶切)、TNAC1865(PCR产物用TaqI酶切)、TNAC1902(PCR产物用TaqI酶切)和TNAC1937(PCR产物用TaqI酶切)的扩增结果。M=Marker（DL2000）。
图3.引物TNAC1924、TNAC1801、TNAC1791、TNAC1865、TNAC1902和TNAC1937扩增产物（部分引物的扩增产物用限制性内切酶酶切）在2%琼脂糖凝胶中的电泳结果，箭头所示为多态性带，其中泳道上的1-24分别代表小麦-二角山羊草7Sb(7B)代换系/中国春杂交F2后代材料。图A-图F分别为引物TNAC1924(PCR产物未酶切)、TNAC1801(PCR产物未酶切)、TNAC1791(PCR产物用HaeIII酶切)、TNAC1865(PCR产物用TaqI酶切)、TNAC1902(PCR产物用TaqI酶切)和TNAC1937(PCR产物用TaqI酶切)的扩增结果。M=Marker（DL2000）。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
下述实施例中所用的植物材料（表1）和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，如无特殊说明，所用PCR体系方法与发明内容部分的描述的PCR体系及方法相同，所有引物合成均由成都瑞信生物公司完成。JIC编号的实验材料及Holdfast（表1）由英国约翰英纳斯中心（John Innes Centre）种质库的Reader教授惠赠，公众可从英国约翰英纳斯中心网站（https://www.jic.ac.uk/germplasm/）有偿获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的中国春（CS）（Liu C, Yang ZJ, Li GR, Zeng ZX, Zhang Y,Zhou JP, Liu ZH, Ren ZL. Isolation of a new repetitive DNA sequence fromSecale africanum enables targeting of Secale chromatin in wheat background.Euphytica,2008,159(1-2):249-258）由电子科技大学生命科学与技术学院杨足君教授提供；济麦22、济麦23、济麦229、济麦262、济麦44和济麦4075，均由申请人所在研究团队自主培育。上述小麦材料，公众可从山东省农业科学院作物所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。F2-1--F2-24为小麦-二角山羊草7Sb(7B)染色体代换系/CS杂交F2后代材料。
表1供试材料
Figure DEST_PATH_IMAGE002
1、引物的设计与合成
小麦、水稻和包括二角山羊草在内的小麦远源物种的基因具有较好的共线性，并且三者基因间可能具有序列多态性，因此，物种基因共线性关系设计引物，进而对二角山羊草和小麦基因组DNA进行扩增甚至对其扩增产物进行酶切来建立二角山羊草染色体特异标记。所用引物依据NCBI数据库中的水稻和小麦EST序列为基础，利用软件Primer5分析基因序列多态性及设计引物。
2.引物筛选与二角山羊草7Sb染色体特异DNA片段的获得
为了对设计引物进行筛选并初步获得二角山羊草7Sb染色体特异DNA片段，以小麦中国春、Holdfast以及小麦-二角山羊草3Sb染色体附加系为阴性对照，以7Sb(7B)染色体代换系为阳性对照，筛选基于PCR的地标式特异基因引物，基于PCR的地标式特异基因引物扩增特征在于30μL PCR反应体系为：25ng/μL的模板DNA 2.0μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.3μL，200μM的dNTPs，含Mg2+的10×PCR buffer 3.0μL，10μM的上、下游引物各2μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至30μL；PCR反应扩增程序为：94 ℃预变性3min，随后35个循环：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，4℃保存；
将上述30μL PCR产物均分到3个不同的PCR管中，向其中的两管中分别加入限制性内切酶HaeIII或TaqI酶切体系（包含无菌双蒸馏水6.5μL,10×NEB buffer 3.0μL,10×BSA0.3Μl,限制性内切酶0.2μL），对其进行酶切（HaeIII酶切温度为37℃，TaqI酶切温度为65℃，二者的酶切时间均为2h），未酶切及酶切后的PCR产物均在2%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE。扩增产物10uL在150V恒压下电泳约25min，然后用1ug/mL的溴化乙锭溶液进行染色30min，最后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝胶成像系统下扫描照像；
PCR产物（未酶切）经琼脂糖电泳后发现，仅引物TNAC1924和TNAC1801分别能在小麦-二角山羊草7Sb(7B)染色体代换系中扩增出长度约为490bp和750bp的特异DNA条带，而该两特异条带不能在阴性对照中扩增出（图1），这表明，这两条特异条带可能是二角山羊草7Sb染色体特异片段。除上述两引物外，其他引物例如TNAC1792、TNAC1793、TNAC1794、TNAC1795、TNAC1797、TNAC1826、TNAC1829、TNAC1834、TNAC1838和TNAC1842均不能直接在阳性对照和阴性对照中扩增出多态性DNA条带（图1）；
PCR产物（未酶切）经琼脂糖电泳后发现，仅引物TNAC1924和TNAC1801分别能在小麦-二角山羊草7Sb(7B)染色体代换系中扩增出长度约为490bp和750bp的特异DNA条带，而该两特异条带不能在阴性对照中扩增出（图1），这表明，这两条特异条带可能是二角山羊草7Sb染色体特异片段。除上述两引物外，其他引物例如TNAC1792、TNAC1793、TNAC1794、TNAC1795、TNAC1797、TNAC1826、TNAC1829、TNAC1834、TNAC1838和TNAC1842均不能直接在阳性对照和阴性对照中扩增出多态性DNA条带（图1）；
分别用限制性内切酶HaeIII或TaqI对除了引物TNAC1801和TNAC1924扩增产物外的所有PCR产物进行酶切后电泳，结果发现，引物TNAC1791/HaeIII、TNAC1865/TaqI、TNAC1902/TaqI和TNAC1937/TaqI分别可以在小麦-二角山羊草7Sb(7B)染色体代换系中获得长度约为600bp、950bp、1400bp和750bp的多态性片段，而不能在阴性对照中获得这些多态性片段，这表明，这些片段可能是二角山羊草7Sb染色体特异片段；
依据上述方法步骤，获得一种二角山羊草7Sb染色体特异分子标记，碱基序列如下表2所示：
表2. 二角山羊草7Sb染色体特异标记及其相关信息
Figure DEST_PATH_IMAGE004
注: “—” 表示PCR产物无需酶切即可获得多态性。
3、二角山羊草7Sb染色体特异片段的验证
为了验证上述DNA片段是二角山羊草7Sb染色体特异片段，以小麦中国春、Holdfast、济麦22、济麦23、济麦229、济麦262、济麦44、济麦4075、小麦-二角山羊草3Sb(3A)代换系、小麦-二角山羊草3Sb(3B)代换系、小麦-二角山羊草3Sb(3D)代换系、小麦-二角山羊草3Sb附加系和小麦-二角山羊草7Sb(7B)代换系基因组DNA为模板，以上述可以在小麦-二角山羊草7Sb(7B)代换系中获得多态性的引物TNAC1924、TNAC1801、TNAC1791、TNAC1865、TNAC1902和TNAC1937进行扩增，其中，TNAC1924和TNAC1801的扩增产物直接进行琼脂糖凝胶电泳，TNAC1791的扩增产物用HaeIII进行酶切可获得多态性条带，TNAC1865、TNAC1902和TNAC1937的扩增产物分别用TaqI进行酶切可获得多态性条带，结果发现，上述6对引物或引物/限制性内切酶组合分别能在小麦-二角山羊草7Sb(7B)代换系中获得长度约为490bp（图2A）、750bp（图2B）、600bp（图2C）、950bp（图2D）、1400bp（图2E）和750bp（图2F）的多态性片段，而在其他供试材料中没有获得这些多态性片段，因此，这些片段是二角山羊草7Sb染色体特异片段。
4、获得标记对杂交群体筛选与鉴定的实用性
为了验证获得标记的实用性，我们将小麦-二角山羊草7Sb(7B)染色体代换系与中国春杂交获得F2后代材料。利用上述引物或引物/限制性内切酶组合对上述F2后代材料中的F2-1-- F2-24进行扩增筛选和验证。结果发现，上述6对引物或引物/限制性内切酶组合均能在编号为F2-1、F2-9、F2-11、F2-13、F2-14、F2-15、F2-19、F2-22和F2-23的后代材料中分别获得长度约为490bp（图3A）、750bp（图3B）、600bp（图3C）、950bp（图3D）、1400bp（图3E）和750bp（图3F）的多态性片段，而在其他后代材料中没有获得这些多态性片段，因此，F2-1、F2-9、F2-11、F2-13、F2-14、F2-15、F2-19、F2-22和F2-23植株中含有二角山羊草7Sb染色体或染色体片段。上述扩增结果表明，这6个二角山羊草7Sb染色体特异标记应用于杂交群图的筛选与鉴定。
序列表
<110>山东省农业科学院作物研究所
<120>二角山羊草7Sb染色体特异分子标记及其应用
<160>12
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>1
CAGCAACTCAGCTTTGGTCAC 21
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>2
GCAAGCCTGTTTGGCATTT 19
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>3
TAGCTTTGGAACGATGTGTGG 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>4
TGTGGAGCAGTGCTGTTTATG 21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>5
GCTGCTGCTAAAGAGAAGGAA 21
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>6
CCACGACACGTCCTGTAGC 19
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>7
CTTACCATGAGCATGCAGAGC 21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>8
GATCGGCATGATAAGTTTCCA 21
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>9
AATACCAGGTCCTCCAACTTT 21
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>10
TGGAATCGCTGAGAAAGAATG 21
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>11
AGCGGCATGTGGTAATCAATA 21
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>12
CGGACGATCGAGAACACC 18

Claims (7)

1.一种二角山羊草7Sb染色体特异分子标记，其特征在于，为下列六对引物中一对以上的引物组合，引物对的碱基序列如下：
TNAC1801：
F：5’-CAGCAACTCAGCTTTGGTCAC -3’，
R：5’-GCAAGCCTGTTTGGCATTT-3’；
TNAC1924：
F：5’-TAGCTTTGGAACGATGTGTGG-3’，
R：5’-TGTGGAGCAGTGCTGTTTATG-3’；
TNAC1791：
F：5’-GCTGCTGCTAAAGAGAAGGAA-3’，
R：5’-CCACGACACGTCCTGTAGC-3’；
TNAC1865：
F：5’-CTTACCATGAGCATGCAGAGC-3’，
R：5’-GATCGGCATGATAAGTTTCCA-3’；
TNAC1902：
F：5’-AATACCAGGTCCTCCAACTTT-3’，
R：5’-TGGAATCGCTGAGAAAGAATG-3’；
TNAC1937：
F：5’-AGCGGCATGTGGTAATCAATA-3’，
R：5’-CGGACGATCGAGAACACC-3’。
2.一种权利要求1所述的二角山羊草7Sb染色体的应用，其特征在于，使用二角山羊草7Sb染色体特异分子标记进行PCR扩增，对小麦背景中是否含有二角山羊草7Sb染色体进行检测或辅助检测。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于,所述的检测或辅助检测的步骤如下：
（1）以待测的可能含有二角山羊草7Sb染色体的小麦背景系的基因组总DNA为模板，用二角山羊草7Sb染色体特异分子标记分别对其进行PCR扩增，扩增产物使用凝胶电泳进行检测；
（2）如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有与阳性对照相同的特异DNA条带而阴性对照无该带，则说明待测小麦背景系的基因组中含有二角山羊草7Sb染色体；如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中不含有与对照相同的特异多态性DNA条带，则说明待测小麦背景系的基因组中不含有二角山羊草7Sb染色体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的阳性对照为中国春-二角山羊草7Sb染色体附加系；所述的阴性对照为中国春小麦和/或其他不同小麦品种/品系。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的六对引物对扩增特征在于30μL PCR反应体系为：25ng/μL的模板DNA 2.0μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.3μL，200μM的dNTPs，含Mg2+的10×PCR buffer 3.0μL，10μM的上、下游引物各2μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至30μL；
所述的PCR反应扩增程序为：94 ℃预变性3min，随后35个循环：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，4℃保存。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的PCR反应扩增程序还包括利用限制性内切酶酶切，具体为引物TNAC1791、TNAC1865、TNAC1902和TNAC1937使用限制性内切酶HaeIII或TaqI进行酶切。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤（1）中使用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
CN202010216703.3A 2020-03-25 2020-03-25 二角山羊草7Sb染色体特异分子标记及其应用 Active CN111218523B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010216703.3A CN111218523B (zh) 2020-03-25 2020-03-25 二角山羊草7Sb染色体特异分子标记及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010216703.3A CN111218523B (zh) 2020-03-25 2020-03-25 二角山羊草7Sb染色体特异分子标记及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111218523A true CN111218523A (zh) 2020-06-02
CN111218523B CN111218523B (zh) 2022-01-25

Family

ID=70826466

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010216703.3A Active CN111218523B (zh) 2020-03-25 2020-03-25 二角山羊草7Sb染色体特异分子标记及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111218523B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111850161A (zh) * 2020-09-01 2020-10-30 山东省农业科学院作物研究所 沙融山羊草7Ssh染色体特异分子标记及其应用
CN114606341A (zh) * 2022-04-12 2022-06-10 山东省农业科学院作物研究所 希尔斯山羊草基于基因组重测序SNP的dCAPS分子标记及应用
CN117044616A (zh) * 2023-05-23 2023-11-14 贵州师范大学 一种用尾状山羊草高分子谷蛋白提高小麦品质的方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101736076A (zh) * 2008-11-19 2010-06-16 朱玉丽 小麦抗白粉病基因的分子标记定位研究进展
CN102373289A (zh) * 2011-12-07 2012-03-14 哈尔滨师范大学 一种鉴定山羊草属杀配子染色体2c的trap-scar585标记及其应用
CN104357571A (zh) * 2014-11-12 2015-02-18 山东省农业科学院作物研究所 检测小麦中是否含有高大山羊草染色体片段的方法及其专用引物
CN104371996A (zh) * 2014-11-20 2015-02-25 山东省农业科学院作物研究所 希尔斯山羊草1Ss染色体特异分子标记及其应用
WO2015036995A1 (en) * 2013-09-11 2015-03-19 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Resistance to rust disease in wheat
CN104498483A (zh) * 2014-12-02 2015-04-08 山东省农业科学院作物研究所 基于小麦和水稻EST序列的希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记及用途
CN104789678A (zh) * 2015-04-21 2015-07-22 山东省农业科学院作物研究所 小麦染色体组中无芒山羊草染色体的鉴定方法
CN105907864A (zh) * 2016-05-06 2016-08-31 山东省农业科学院作物研究所 小麦中顶芒山羊草染色体的fish检测方法
CN106011299A (zh) * 2016-08-02 2016-10-12 山东省农业科学院作物研究所 检测小麦中顶芒山羊草2m、3m、6m和7m染色体的特异分子标记、试剂盒及方法
CN107058504A (zh) * 2017-02-16 2017-08-18 长江大学 鉴别S组山羊草属种Psy1基因等位变异的方法
CN112301142A (zh) * 2019-07-30 2021-02-02 山东省农业科学院作物研究所 拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12分子标记及其应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101736076A (zh) * 2008-11-19 2010-06-16 朱玉丽 小麦抗白粉病基因的分子标记定位研究进展
CN102373289A (zh) * 2011-12-07 2012-03-14 哈尔滨师范大学 一种鉴定山羊草属杀配子染色体2c的trap-scar585标记及其应用
WO2015036995A1 (en) * 2013-09-11 2015-03-19 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Resistance to rust disease in wheat
CN104357571A (zh) * 2014-11-12 2015-02-18 山东省农业科学院作物研究所 检测小麦中是否含有高大山羊草染色体片段的方法及其专用引物
CN104371996A (zh) * 2014-11-20 2015-02-25 山东省农业科学院作物研究所 希尔斯山羊草1Ss染色体特异分子标记及其应用
CN104498483A (zh) * 2014-12-02 2015-04-08 山东省农业科学院作物研究所 基于小麦和水稻EST序列的希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记及用途
CN104789678A (zh) * 2015-04-21 2015-07-22 山东省农业科学院作物研究所 小麦染色体组中无芒山羊草染色体的鉴定方法
CN105907864A (zh) * 2016-05-06 2016-08-31 山东省农业科学院作物研究所 小麦中顶芒山羊草染色体的fish检测方法
CN106011299A (zh) * 2016-08-02 2016-10-12 山东省农业科学院作物研究所 检测小麦中顶芒山羊草2m、3m、6m和7m染色体的特异分子标记、试剂盒及方法
CN107058504A (zh) * 2017-02-16 2017-08-18 长江大学 鉴别S组山羊草属种Psy1基因等位变异的方法
CN112301142A (zh) * 2019-07-30 2021-02-02 山东省农业科学院作物研究所 拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12分子标记及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEVTINA S. RUBAN等: "Evolution of the S-Genomes in Triticum-Aegilops Alliance: Evidences From Chromosome Analysis", 《FRONTIERS IN PLANT SCIENCE》 *
ANNAMA´RIA SCHNEIDER等: "Utilisation of Aegilops (goatgrass) species to widen the genetic diversity of cultivated wheat", 《EUPHYTICA》 *
GORO ISHIKAWA等: "Localization of anchor loci representing Wve hundred annotated rice genes to wheat chromosomes using PLUG markers", 《THEOR APPL GENET》 *
I.G. ADONINA等: "Transferability of wheat microsatellites to diploid Aegilops species and determination of chromosomal localizations of microsatellites in the S genome", 《GENOME》 *
MICHAŁ T. KWIATEK等: "Cytological markers used for identification and transfer of Aegilops spp. chromatin carrying valuable genes into cultivated forms of Triticum", 《COMPCYTOGEN》 *
TAO LANG等: "Precise identification of wheat – Thinopyrum intermedium translocation chromosomes carrying resistance to wheat stripe rust in line Z4 and its derived progenies", 《GENOME》 *
王坤杨: "高大山羊草优质麦谷蛋白亚基向小麦基因组中的易位转移和面包品质分析", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）农业科技辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111850161A (zh) * 2020-09-01 2020-10-30 山东省农业科学院作物研究所 沙融山羊草7Ssh染色体特异分子标记及其应用
CN111850161B (zh) * 2020-09-01 2022-06-03 山东省农业科学院作物研究所 沙融山羊草7Ssh染色体特异分子标记及其应用
CN114606341A (zh) * 2022-04-12 2022-06-10 山东省农业科学院作物研究所 希尔斯山羊草基于基因组重测序SNP的dCAPS分子标记及应用
CN114606341B (zh) * 2022-04-12 2023-10-13 山东省农业科学院作物研究所 希尔斯山羊草基于基因组重测序SNP的dCAPS分子标记及应用
CN117044616A (zh) * 2023-05-23 2023-11-14 贵州师范大学 一种用尾状山羊草高分子谷蛋白提高小麦品质的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111218523B (zh) 2022-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111218523B (zh) 二角山羊草7Sb染色体特异分子标记及其应用
Burow et al. Molecular tools for the study of complex traits
Richards et al. Fine mapping of the barley chromosome 6H net form net blotch susceptibility locus
CN111850161B (zh) 沙融山羊草7Ssh染色体特异分子标记及其应用
KR101835124B1 (ko) 고추 병 저항성 품종 판별을 위한 snp 기반 kasp용 프라이머 세트 및 이의 용도
Pandian et al. Analysis of population structure and genetic diversity in an exotic germplasm collection of Eleusine coracana (L.) Gaertn. using genic-SSR markers
CN107236811A (zh) 白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种分子标记及其应用
CN111893209B (zh) 一种与小麦千粒重相关的插入缺失位点检测标记及其应用
Wu et al. Cloning and characterization of repetitive sequences and development of SCAR markers specific for the P genome of Agropyron cristatum
CN106555001A (zh) 一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记及其应用
CN109234423B (zh) 大豆分子标记及其多态性在鉴定大豆分枝数性状中的应用
Parveen et al. Molecular markers and their application in plant biotechnology
CN102732514B (zh) 趋化因子受体9基因作为牛优良超数排卵性状分子标记的鉴定方法及其应用
CN107988410A (zh) 鉴定水稻抗稻瘟病基因Pita的分子标记、鉴定方法及应用
JP5799600B2 (ja) ユーカリ属の種間雑種の樹種識別法
Mohamed et al. Genetic diversity of some Saudi barley (Hordeum vulgare L.) landraces based on microsatellite markers
Widyawan et al. Genetic diversity analysis of yardlong bean genotypes (Vigna unguiculata subsp. sesquipedalis) based on IRAP marker
CN112779274B (zh) 桑树膏药病病原菌的核糖体rna基因及其应用
CN111363846B (zh) 一种检测小麦粒重基因QTkw.saas-2D的分子标记及应用
NL2028858B1 (en) Molecular markers specific to chromosome 7Sb of Aegilops bicornis and their utilization
CN114292942B (zh) 调控玉米叶片衰老的主效qtl及其分子标记和应用
Imam et al. Molecular analysis of Indian rice germplasm accessions with resistance to blast pathogen
Smirnova et al. Genetic relationship of the winter barley varieties assessed by the inter-primer binding site (ipbs) dna profiling method
CN114606341B (zh) 希尔斯山羊草基于基因组重测序SNP的dCAPS分子标记及应用
CN111778346A (zh) 一种用于检测抗条锈病QTL QYr.hbaas-4BL.1的分子标记及使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant