CN104789678A - 小麦染色体组中无芒山羊草染色体的鉴定方法 - Google Patents

小麦染色体组中无芒山羊草染色体的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及小麦染色体组中无芒山羊草染色体的鉴定方法，属于细胞遗传学领域。本发明以Oligo-pTa535-1、Oligo-pSc119.2-1和(GAA)8为探针对小麦-无芒山羊草创新种质的染色体进行荧光原位杂交，与小麦42条染色体双色FISH标准图比较，获得无芒山羊草的7对染色体的杂交信号和核型信息。以Oligo-pTa535-1、Oligo-pSc119.2-1和(GAA)8为探针对待测小麦-无芒山羊草杂交后代的染色体进行荧光原位杂交，分别与小麦-无芒山羊草创新种质的杂交信号、无芒山羊草染色体的核型信息比对，完成鉴定。本发明提供了检测小麦染色体组中无芒山羊草染色体的新方法。

Description

小麦染色体组中无芒山羊草染色体的鉴定方法
技术领域
本发明涉及小麦染色体组中无芒山羊草染色体的鉴定方法，属于细胞遗传学领域。
背景技术
山羊草属包含23个物种，其中，11个为二倍体，其余12个为多倍体。该属物种的基本基因组包括C、D、U、S、M、N 和T。基因组T仅出现在二倍体物种中，其余基因组则均同时出现在在二倍体和多倍体物种中。该属物种被植物分类学家分成6个不同的亚类： Polyeides、Comopyrum、Cylindropyrum、Sitopsis、Vertebrata 和 Amblyopyrum。最后一个亚类仅包含无芒山羊草（Ae. mutica，也作 Amblyopyrum muticum）一个物种，说明该物种的独特性。无芒山羊草的独特性不仅仅是因为其独特的灌浆期小穗特点（Ohta S, Saruhashi Y. Geographical distribution of B chromosomes in Aegilops mutica Boiss., a wild relative of wheat. Hereditas 1999, 130: 177-183），更重要的是因为其基因组是T，而其细胞质具有T和T2两种不同类型（Kimber G, Tsunewaki K. Genome symbols and plasma types in the wheat group. Proc. 7th Int. Wheat Genet Symp, Cambridge, 1988, 1209-1211）。细胞质T可以使植株生长发育迟缓，而细胞质T2则可以引起雄性不育(Maan SS. Cytoplasmic homology between Aegilops mutica Boiss. and Ae. ovate L. Euphytica, 1977, 26:601-613)。
从上个世纪开始，已经有少数几个科学家开始了将无芒山羊草染色体转移给小麦创制出小麦-无芒山羊草中间材料的研究（Dover GA, Riley R. Prevention of pairing of hommlogms meiotic chromosomes of wheat by an activity of supernumerary chromosomes of Aegilops. Nature, 1972, 240: 159-161；Panayotov I, Tsujimoto H. Fertility restoration and NOR suppression caused by Aegilops mutica chromosomes in alloplasmic hybrids and lines. Euphytica, 1997, 94: 145-149），获得了几份杂交后代种质资源。英国John Innes Centre 的Miller教授课题组也开展了类似工作，获得了10多份小麦-无芒山羊草渐渗系（未发表资料）。上述研究仅从植株形态学或分子生物学水平上对获得的种质进行了粗略鉴定。近年来，我们也开展了将无芒山羊草种质抗小麦白粉病转移给小麦中国春和绵阳11的研究，获得了一批抗小麦白粉病的小麦-无芒山羊草新种质，并建立了无芒山羊草染色体的候选分子标记（刘成，宫文萍，杨足君，李根英，黄承彦，赵振东. 2014. 免疫小麦白粉病的小麦-无芒山羊草中间材料的鉴定. 第五届全国小麦基因组学及分子育种大会 p139），然而。少数几个分子标记远远不能满足小麦染色体组中无芒山羊草染色体的导入数量及状态，而细胞遗传学检测方法可以弥补上述不足，因此，建立可以鉴定小麦染色体组中无芒山羊草染色体的细胞遗传学标记对已经获得的群体材料进行精确鉴定，进而将其优异基因转移给小麦进行小麦育种工作至关重要。
物种染色体C带、染色体核型和原位杂交带型等均是细胞遗传学的重要研究内容。无芒山羊草染色体标准C带的建立（Friebe B, Badaeva ED, Kammer K, GILL BS. Standard karyotypes of Aegilops uniaristata, Ae. mutica, Ae. comosa subspecies comosaand heldreichii (Poaceae). P1. Syst. Evol. 1996，202:199-210），使得鉴定小麦背景中的无芒山羊草成为可能。然而，利用C分带技术获得的无芒山羊草染色体C带带纹非常微弱，因此，在使用上对该技术操作要求较高，不易被普遍使用。迄今为止，除无芒山羊草染色体C分带外，目前尚未见其它细胞遗传标记建立方面的报道。
基因组原位杂交（Genomic in situ hybridization, GISH）可用于小麦背景中外源物种染色体的鉴定工作，但是，该方法涉及外源物种基因组DNA的提取和打断，封阻DNA的制备、二者配比条件摸索等步骤，操作步骤繁琐，操作中还经常会出现打碎的外源物种DNA和封阻DNA长度偏长或偏短现象（长度不合适不能用于GISH），而且很难保证每次获得的打碎DNA片段长度完全一致，因此，相比以多聚核苷酸为探针进行的荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）具有明显劣势，后者具有探针合成容易、无需封阻DNA、重复性好、操作简单、荧光信号清晰可见等优点，但是，该方法目前并没有被用于小麦背景中无芒山羊草染色体的鉴定。
发明内容
本发明的目的是获得无芒山羊草细胞遗传学标记，提供一种小麦染色体组中无芒山羊草染色体的鉴定方法。
技术方案
一种小麦染色体组中无芒山羊草染色体的鉴定方法，
    (1)以小麦-无芒山羊草创新种质为材料，制备其染色体标本；以多聚核苷酸Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对染色体标本进行双色荧光原位杂交，获得双色FISH图；将Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1 的信号洗脱后，再以(GAA)8为探针对同一染色体标本进行单色荧光原位杂交，获得单色FISH图；将双色FISH图与小麦42条染色体双色FISH标准图比较，找出无芒山羊草的14条染色体；再根据单色FISH图，对无芒山羊草的14条染色体进行区分配对；进而获得染色体核型信息；
    (2)以多聚核苷酸Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对待测小麦-无芒山羊草杂交后代的染色体进行双色荧光原位杂交，获得双色FISH图；将Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1 的信号洗脱后，再对同一染色体标本以(GAA)8为探针进行单色荧光原位杂交，获得单色FISH图；将本步骤获得的双色FISH图和单色FISH图分别与步骤（1）的双色FISH图和单色FISH图比对，鉴定小麦-无芒山羊草杂交后代的染色体；
或者，
（3）以多聚核苷酸Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对待测小麦-无芒山羊草杂交后代的染色体进行双色荧光原位杂交，获得双色FISH图；获得核型信息；将本步骤获得的双色FISH图和核型信息分别与步骤（1）的双色FISH图和核型信息比对，鉴定小麦-无芒山羊草杂交后代的染色体；
其中，
Oligo-pSc119.2-1序列：
CCGTTTTGTGGACTATTACTCACCGCTTTGGGGTCCCATAGCTAT，如SEQ ID NO.1所示；
Oligo-pTa535-1序列：
AAAAACTTGACGCACGTCACGTACAAATTGGACAAACTCTTTCGGAGTATCAGGGTTTC，如SEQ ID NO.2所示；
(GAA)8序列：GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA，如SEQ ID NO.3所示；
所述小麦-无芒山羊草创新种质，是由小麦与无芒山羊草杂交获得杂种F1，再由杂种F1经加倍获得的材料。
所述小麦-无芒山羊草交后代,是指小麦-无芒山羊草创新种质与小麦的杂交回交后代。
所述小麦42条染色体的FISH标准图，是以多聚核苷酸Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对小麦染色体进行双色荧光原位杂交后获得的。
小麦与无芒山羊草杂交获得杂种F1，杂种F1经加倍获得小麦-无芒山羊草创新种质（XX001）。本发明首先以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对XX001进行双色荧光原位杂交，获得双色FISH图；与小麦42条染色体的FISH标准图进行比对、分析，发现：XX001中的20对小麦染色体的杂交信号各不相同（小麦的1对7B染色体丢失），与14条无芒山羊草染色体不同。因此，根据以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针进行的双色FISH，可以有效识别小麦染色体组中的无芒山羊草染色体。但是，XX001中的14条无芒山羊草染色体的杂交信号并不是7组不同的杂交信号，而是仅包含三组不同的杂交信号。因为双色FISH在无芒山羊草上的信号具有类似性，因而，仅凭双色FISH无法将无芒山羊草的14条染色体进行有效配对、区分。
    为了解决该问题，本发明进行了进一步分析研究。将以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对XX001进行双色FISH后的染色体标本的Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1 的信号洗脱后，再以(GAA)8为探针进行单色荧光原位杂交，获得单色FISH图。由于单色FISH与双色FISH在同一细胞染色体上进行，所以，将单色FISH图与双色FISH图进行比对，可以直接获得无芒山羊草的14条染色体的(GAA)8杂交信息。(GAA)8杂交信号显示，14条无芒山羊草染色体杂交信号可分为7类，即可以将14条无芒山羊草染色体进行配对为7对（随机按照T1-T7编号）。所以，将单色FISH图与双色FISH结合，可以一次性区分所有小麦染色体以及无芒山羊草染色体。
    另外，物种染色体核型可以用于其染色体的识别与鉴定。由于六倍体小麦染色体有21对，部分染色体臂比和无芒山羊草臂比差异不大，因而，仅用无芒山羊草核型信息无法对小麦染色体组中的无芒山羊草染色体进行鉴定。而在以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针进行的双色FISH，将无芒山羊草染色体识别出来的前提下；对无芒山羊草的14条染色体和小麦3B染色体的长臂、短臂长度进行测量，获得无芒山羊草各染色体长臂、短臂、染色体总长度以及它们与小麦3B染色体长度的比例关系等染色体核型信息，同样可以将14条无芒山羊草染色体进行配对为7对（按照T1-T7编号）。
    综上，同时鉴定小麦染色体组中的无芒山羊草染色体需要用如下方法组合中的任一方案方可解决此问题：（方案1）无芒山羊草核型信息+以Oligo-pTa535-1、Oligo-pSc119.2-1为探针进行的双色FISH；（方案2）以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针进行的双色FISH+以(GAA)8为探针且在上述双色FISH进行的同一细胞染色体上进行FISH。
本发明中，荧光原位杂交的具体步骤为：
  (1) 根尖处理：取2-3cm根尖置于含有0.2 mol/L盐酸的指管中，60℃水浴条件下处理7min；
（2）制片：将根尖取出放于载玻片上，切去根冠，用解剖针剥出分生组织细胞，滴上一滴45%的冰醋酸、压片，室温晾干，获得中期分裂相染色体标本；
（3）配置配杂交液：以单张染色体标本为例，取8ng探针Oligo-pTa535-1、8ng探针Oligo-pSc119.2-1和6ng探针(GAA)8加入到8μl的缓冲液中，混匀，配成杂交液；探针的浓度均为10μmol/L；所述缓冲液：1×TE+2×SSC，PH=7；
（4）杂交：将杂交液滴加到染色体标本上，盖上盖玻片，放置于底部铺有湿润滤纸的塑料盒内，盖上盒盖，置于37℃的杂交箱中杂交不低于5h；
（5）洗脱：杂交完成后，取出染色体标本放入盛有双蒸水的洗脱缸中浸泡至盖玻片自然滑落，镊子夹住染色体标本在双蒸水中上下运动清洗2-3次，取出染色体标本，在避光的通风橱中晾干；
（6）照相：向干燥后的染色体标本加入5μl含DAPI(DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚)的抗褪色剂，盖上盖玻片，在荧光显微镜下镜检照相；抗褪色剂中4',6-二脒基-2-苯基吲哚的含量为1μg/ml。
步骤（4），盖上盖玻片时，避免气泡出现；步骤5的浸泡时间优选为：30-60s。
本发明的荧光原位杂交步骤中，步骤（3）中探针的用量是针对本发明的待测染色体标本优化设计的；超出本发明的用量范围，则无法获得较为清晰的FISH图；进而影响鉴定结果的准确性(如图5和6所示)。
本发明建立了无芒山羊草T染色体细胞遗传学新标记，提供了检测小麦染色体组中无芒山羊草T染色体的新方法。无芒山羊草免疫小麦白粉病，是小麦抗病育种的重要基因源。我们开展了将无芒山羊草种质导入小麦的研究，获得了大批需要鉴定的包括高抗小麦白粉病的小麦-无芒山羊草杂交后代材料。结合材料抗病性调查结果，利用无芒山羊草染色体核型、FISH标准图对随机选取的30份小麦-无芒山羊草杂交后代材料（编号为XX002-XX031）进行细胞学鉴定，从中鉴定出了含无芒山羊草染色体（或染色体片段）的特异种质资源22份。 因此，本发明建立的无芒山羊草染色体核型和FISH显带方法补充了目前缺乏的无芒山羊草染色体核型信息，拓宽了多聚核苷酸探针在小麦族物种中的应用范围，可以作为其细胞遗传学标记应用于小麦-无芒山羊草远缘杂交新种质资源鉴定，为无芒山羊草染色体上有益基因转移到小麦中提供了有效的细胞遗传鉴定方法。
附图说明
图1， 以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1、(GAA)8为探针，对中国春-无芒山羊草创新种质XX001的有丝分裂中期染色体的FISH结果；图A为Oligo-pTa535-1（红色信号）和Oligo-pSc119.2-1（绿色信号）的双色FISH图，图B为(GAA)8的FISH图（红色信号）；黄色标尺代表10μm。
 图2，以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1、(GAA)8为探针，无芒山羊草的标准FISH图。T1-T7为无芒山羊草的7对染色体（因暂未确定其同源群归属，因而根据其FISH信号将其同源染色体并排按照T1-T7命名）；T1-T7下均有3对染色体，第1对是未做FISH之前染色体的形态，第2对是以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针的FISH图像，第3对是将Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1 的信号洗脱后，再用(GAA)8进行杂交的FISH图。
图3，中国春-无芒山羊草渐渗系XX009（图A）、XX011（图B）、XX008（图C）和XX004（图D）的FISH图；探针均为Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1；箭头所示为无芒山羊草染色体；黄色标尺代表10 μm。
  图4 ，中国春-无芒山羊草渐渗系XX007和XX002的FISH图；图A、B为XX007的FISH图；图C、D为XX002的FISH图，图A，C是探针Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1、的杂交图，图B、D是探针(GAA)8的杂交图，箭头所示为无芒山羊草染色体，黄色标尺代表10μm。
 图5，Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1探针用量对杂交信号的影响；其中，图A的探针用量为：（1）5ng和4ng；图B的探针用量为：（2）6 ng和5 ng；图C的探针用量为：（3）7 ng和6 ng；图D的探针用量为：（4）8 ng和7 ng；图E的探针用量为：（5）9 ng和8 ng，图F的探针用量为：（6）8 ng和8 ng；其中，组合（1）和（2）的两探针FISH信号均偏弱（图A和B）；组合（3）和（4）中Oligo-pTa535.1-1的信号比组合（1）和（2）有所加强，但是部分染色体的信号还稍稍偏弱(图3和4)；组合（3）和（4）的Oligo-pSc119.2-1信号相比，组合（4）更为清晰直观。组合（5）的Oligo-pSc119.2-1信号过强（图C）；组合（6）两探针的杂交信号强度最为适宜，便于观察统计；黄色标尺代表10μm。
图6，(GAA)8探针用量对杂交信号的影响；其中，图A的探针用量为：5ng；图B的探针用量为：6ng；图C的探针用量为：7ng；图D的探针用量为：8ng；5ng探针用量FISH信号过弱，而7ng和8ng的杂交信号过强，6ng的探针用量（每张染色体标本）较为适宜；黄色标尺代表10μm。
图7，以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针，小麦42条染色体双色FISH标准图。
具体实施方式
用小麦中国春（CS）与无芒山羊草（TA2193）杂交，获得杂种F1；杂种F1经加倍获得中国春-无芒山羊草创新种质（编号XX001）。编号为XX002-XX031的材料为XX001与CS的杂交回交（BC2F5）后代。小麦中国春（CS）由电子科技大学生命科学与技术学院杨足君教授提供。无芒山羊草（TA2193）由美国堪萨斯州立大学小麦基因组学与遗传资源中心Raupp J博士提供。探针Oligo-pSc119.2-1、探针Oligo-pTa535-1和 (GAA)8由成都瑞信生物公司合成。3个探针序列如下：
探针Oligo-pSc119.2-1序列：
CCGTTTTGTGGACTATTACTCACCGCTTTGGGGTCCCATAGCTAT，如SEQ ID NO.1所示；
探针Oligo-pTa535-1序列：
AAAAACTTGACGCACGTCACGTACAAATTGGACAAACTCTTTCGGAGTATCAGGGTTTC，如SEQ ID NO.2所示；
探针(GAA)8序列：GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA，如SEQ ID NO.3所示。
    所述荧光原位杂交方法：
（1）根尖处理：取2-3cm根尖置于含有0.2 mol/L盐酸的指管中，60℃水浴条件下处理7min；
（2）制片：将根尖取出放于载玻片上，切去根冠，用解剖针剥出分生组织细胞，滴上一滴45%的冰醋酸、压片，室温晾干，获得中期分裂相染色体标本；
（3）配置配杂交液：以单张染色体标本为例，每种探针取8ng（探针Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1）或6ng（探针(GAA)8）加入到8μl的缓冲液中，混匀，配成杂交液；探针的浓度均为10μmol/L；所述缓冲液：1×TE+2×SSC，PH=7；
（4）杂交：将杂交液滴加到染色体标本上，盖上盖玻片，避免气泡出现，放置于底部铺有湿润滤纸的塑料盒内，盖上盒盖，置于37℃的杂交箱中杂交不低于5h；
（5）洗脱：杂交完成后，取出染色体标本放入盛有双蒸水的洗脱缸中浸泡30-60s，至盖玻片自然滑落，镊子夹住染色体标本在双蒸水中上下运动清洗2-3次，取出染色体标本，在避光的通风橱中干燥；
（6）照相：向干燥后的染色体标本加入5μl含DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)的抗褪色剂，盖上盖玻片，在荧光显微镜下镜检照相；
抗褪色剂中4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的含量为1μg/ml。
1.      中国春-无芒山羊草创新种质XX001的细胞学鉴定
    （1） 以多聚核苷酸Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对小麦中国春（CS）染色体进行双色荧光原位杂交，获得小麦42条染色体的FISH标准图(图7)；
   （2）以XX001为材料，制备其染色体标本；以多聚核苷酸Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对染色体标本进行双色荧光原位杂交，获得双色FISH图（图1A）；将Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1 的信号洗脱后，再以(GAA)8为探针进行单色荧光原位杂交，获得单色FISH图（图1B）。
首先，将双色FISH图与步骤（1）的FISH标准图比较；发现该XX001中含有20对与步骤（1）FISH标准图中相同的染色体（小麦的1对7B染色体缺失），且这20对染色体的杂交信号各不相同，与剩余14条无芒山羊草染色体信号不同。由此可见，XX001中含有20对小麦染色体（标记为：1A-6D，7A和7D）和14条无芒山羊草染色体（图1A）。因此，以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针进行的双色FISH可以有效识别小麦染色体组中的无芒山羊草染色体。而进一步分析双色FISH图中的14条无芒山羊草染色体，可以发现：有6条染色体在两臂末端或近末端有Oligo-pSc119.2-1杂交信号，有6条染色体在其中一臂末端或近末端有Oligo-pSc119.2-1杂交信号，有2条染色体一臂末端有Oligo-pSc119.2-1信号，另一臂末端或近末端有Oligo-pTa535-1信号（图1A和1B）。因此，以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针进行的双色FISH仅能鉴定出无芒山羊草的其中一对染色体（命名为T7），而不能将无芒山羊草另外的12条染色体进行配对、区分。
其次，在步骤（2）利用双色FISH将14条无芒山羊草染色体识别出来的前提下（图1A），分析步骤（2）的单色FISH图（图1B）：(GAA)8在小麦和无芒山羊草染色体上的强杂交信号主要集中在着丝粒区，在14条无芒山羊草染色体上弱杂交信号强度及杂交位置可以明显分为7种类型（图1B），即可以对无芒山羊草的14条染色体进行区分配对，获取无芒山羊草的7对染色体（标记为T1-T7）。Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针进行的双色FISH可以弥补(GAA)8为探针进行的单色FISH不能同时鉴定小麦所有染色体的不足，而后者又能弥补前者不能同时鉴定并配对小麦背景中无芒山羊草染色体的不足，所以，结合Oligo-pTa535-1、Oligo-pSc119.2-1和(GAA)8的FISH结果可以一次性区分所有小麦染色体以及无芒山羊草染色体。
为了清晰明了的对无芒山羊草的多聚核苷酸FISH带型进行分析描述，对XX001中的7对无芒山羊草染色体进行了提取分析，如图2所示。
2.      无芒山羊草染色体核型分析
物种染色体核型可以用于其染色体的识别与鉴定。本研究对XX001的10个细胞中的无芒山羊草1T-7T染色体长臂和短臂、小麦最长染色体3B的长臂和短臂长度进行了测量。由于XX001中小麦染色体有21对，其有的染色体臂比（长臂长度/短臂长度）和无芒山羊草臂比差异不大，因而，仅用无芒山羊草核型信息无法对小麦染色体组中的无芒山羊草染色体进行鉴定。
而在步骤（2）将14条无芒山羊草染色体识别出来的前提下，对XX001的10个细胞中的无芒山羊草长臂、短臂进行了测量，同时计算出长臂/短臂比例；结果显示，染色体长度总体差异不大，但是其臂比差异较大且各不相同，分别为1.14、1.77、1.17、1.59、0.93、1.30和1.04。T2、T4和T6为典型的非等臂染色体（表1），T1和T5具有随体（图2）。这些核型信息可以对无芒山羊草的14条染色体进行区分配对，获取无芒山羊草的7对染色体（标记为T1-T7，同上）。对小麦3B染色体长臂和短臂长度进行了测量，将7对无芒山羊草染色体长度（长臂长度+短臂长度）与小麦3B染色体长度进行比较，获得相应的比例关系（表1）。T1-T7无芒山羊草7对染色体与小麦3B染色体的长度比例也各不相同，分别为：73.53%、81.93%、64.68、73.31、72.49、67.96和80.52。
T1和T5的Oligo-pSc119.2-1杂交信号分布在染色体长臂和短臂末端，均具有随体，但是若去掉随体，T1是非等臂染色体，T5是等臂染色体，因此，可以将二者区分。T6的Oligo-pSc119.2-1杂交信号也分布在短臂和长臂末端，但是该染色体没有随体，可以有效区分于T1和T5。T7染色体在短臂近末端有Oligo-pSc119.2-1的信号，在长臂末端有Oligo-pTa535-1的信号，是唯一两条具有这种信号的染色体。T2，T3，T4均在染色体末端有杂交信号，但是T2为明显的非等臂染色体，因此，可以从这3条染色体中鉴别出来。因此，综合Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针进行的双色FISH及无芒山羊草染色体核型信息可以一次性区分所有小麦染色体以及无芒山羊草染色体。
所以，同时鉴定小麦染色体组中的无芒山羊草染色体需要用如下方法组合中的任一方案方可解决此问题：（方案1）无芒山羊草核型信息+以Oligo-pTa535-1、Oligo-pSc119.2-1为探针进行的双色FISH；（方案2）以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针进行的双色FISH+以(GAA)8为探针且在上述双色FISH进行的同一细胞上进行FISH。
表1 无芒山羊草染色体核型信息
染色体 短臂平均长度（标准差） 长臂平均长度（标准差） 染色体总长度（标准差） 长臂/短臂 占小麦3B染色体长度百分比
T1 0.46(0.07) 0.53(0.07) 0.99(0.13) 1.14 73.53
T2 0.40(0.06) 0.70(0.13) 1.10(0.19) 1.77 81.93
T3 0.40(0.04) 0.47(0.09) 0.87(0.10) 1.17 64.68
T4 0.38(0.06) 0.61(0.08) 0.99(0.14) 1.59 73.31
T5 0.51(0.07) 0.47(0.07) 0.98(0.13) 0.93 72.49
T6 0.40(0.04) 0.52(0.11) 0.91(0.14) 1.30 67.96
T7 0.53(0.08) 0.55(0.08) 1.08(0.16) 1.04 80.52
3B 0.59(0.06) 0.76(0.13) 1.35(0.19) 1.29 -
注：长度单位为μm；随体长度包含在内计算长臂/短臂的比值。
3.对中国春-无芒山羊草杂交后代材料进行鉴定检测
    以多聚核苷酸Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针分别对XX002-XX031的染色体进行双色荧光原位杂交，获得双色FISH图；将本步骤获得的双色FISH图与步骤（2）的双色FISH图比对，然后将本步骤的无芒山羊草染色体核型信息与步骤（2）的无芒山羊草染色体核型信息对比，即可鉴定出小麦-无芒山羊草杂交后代中所含的无芒山羊草T1-T7染色体归属及小麦染色体；（方案1）
或者，以多聚核苷酸Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针分别对XX002-XX031的染色体进行双色荧光原位杂交，获得双色FISH图；将Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1 的信号洗脱后，再以(GAA)8为探针进行单色荧光原位杂交，获得单色FISH图；将本步骤获得的双色FISH与单色FISH图分别与步骤（2）的双色FISH和单色FISH图比对；即可鉴定出小麦-无芒山羊草杂交后代中的无芒山羊草T1-T7染色体归属及小麦染色体；（方案2）
鉴定结果如表2所示；
表2小麦-无芒山羊草种质资源的细胞遗传学随机检测情况
材料编号 含T染色体情况 所用检测方案 材料编号 含T染色体情况 所用检测方案
XX002  1对T6 （1）和（2） XX017 -  （1）和（2）
XX003 - （1）和（2） XX018 1条T7  （1）和（2）
XX004 tT6S和tT6L （1）和（2） XX019 - （1）和（2）
XX005 - （1）和（2） XX020 1对T2 （1）和（2）
XX006 1对T6 （1）和（2） XX021 1对T2 （1）和（2）
XX007 1对T7 （1）和（2） XX022 1对T6  （1）和（2）
XX008 1对T1 （1）和（2） XX023 - （1）和（2）
XX009 1条T2 （1）和（2） XX024 - （1）和（2）
XX010 1对T7 （1）和（2） XX025 1条T4  （1）和（2）
XX011 1对T7 （1）和（2） XX026 1对T2 （1）和（2）
XX012 1对T2 （1）和（2） XX027 1条T5 （1）和（2）
XX013 1条T1  （1）和（2） XX028 - （1）和（2）
XX014 1条T5  （1）和（2） XX029 1条T1  （1）和（2）
XX015 1对T5  （1）和（2） XX030 1对T7 （1）和（2）
XX016 1条T7  （1）和（2） XX031 - （1）和（2）
注：“-”=未检测到T染色体。tT6S和tT6L中，“t”=端体，“S”=短臂，“L”=长臂。
根据表2可以得知，采用两种方案的鉴定结果一致。其中，XX004和XX029的小麦背景中分别含有1对和1条无芒山羊草T1染色体；XX009、XX020和XX021的小麦背景中分别含有1条、1对和1对无芒山羊草T2染色体；XX011和XX030的小麦背景中各含有1对无芒山羊草T7染色体；XX014和XX015的小麦背景中分别含有1条和1对无芒山羊草T5染色体；XX004的小麦背景中含有T6染色体短臂端体和长臂端体；XX025的小麦背景中含有1条T4染色体；而XX017和XX028中则未检测到无芒山羊草染色体。XX009、XX011、XX008和XX004的鉴定图分别如图3A-3D所示；XX007和XX002的FISH鉴定图如图4A-4D所示。
采用本发明的方法对其他品种小麦进行实验，同样可鉴定出小麦-无芒山羊草杂交后代中的无芒山羊草T1-T7染色体归属及小麦染色体。
<110>山东省农业科学院作物研究所
<120>小麦染色体组中无芒山羊草染色体的鉴定方法
<160>3
   
<210>1
<211>45
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
CCGTTTTGTG GACTATTACT CACCGCTTTG GGGTCCCATA GCTAT                                  45
 
<210>2
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
AAAAACTTGA CGCACGTCAC GTACAAATTG GACAAACTCT TTCGGAGTAT CAGGGTTTC      59
                                          
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAA                                                                          24
 
 

Claims (5)

1.一种小麦染色体组中无芒山羊草染色体的鉴定方法，
(1)以小麦-无芒山羊草创新种质为材料，制备其染色体标本；以多聚核苷酸Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对染色体标本进行双色荧光原位杂交，获得双色FISH图；将Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1 的信号洗脱后，再以(GAA)8为探针对同一染色体标本进行单色荧光原位杂交，获得单色FISH图；将双色FISH图与小麦42条染色体双色FISH标准图比较，找出无芒山羊草的14条染色体；再根据单色FISH图，对无芒山羊草的14条染色体进行区分配对；进而获得染色体核型信息；
(2)以多聚核苷酸Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对待测小麦-无芒山羊草杂交后代的染色体进行双色荧光原位杂交，获得双色FISH图；将Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1 的信号洗脱后，再对同一染色体标本以(GAA)8为探针进行单色荧光原位杂交，获得单色FISH图；将本步骤获得的双色FISH图和单色FISH图分别与步骤（1）的双色FISH图和单色FISH图比对，鉴定小麦-无芒山羊草杂交后代的染色体；
或者，
（3）以多聚核苷酸Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对待测小麦-无芒山羊草杂交后代的染色体进行双色荧光原位杂交，获得双色FISH图；获得核型信息；将本步骤获得的双色FISH图和核型信息分别与步骤（1）的双色FISH图和核型信息比对，鉴定小麦-无芒山羊草杂交后代的染色体；
其中，
Oligo-pSc119.2-1序列：如SEQ ID NO.1所示；
Oligo-pTa535-1序列：如SEQ ID NO.2所示；
(GAA)8序列：如SEQ ID NO.3所示；
所述小麦-无芒山羊草创新种质，是由小麦与无芒山羊草杂交获得杂种F1，再由杂种F1经加倍获得的材料。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述小麦-无芒山羊草交后代,是指小麦-无芒山羊草创新种质与小麦的杂交回交后代。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述小麦42条染色体的FISH标准图，是以多聚核苷酸Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对小麦染色体进行双色荧光原位杂交后获得的。
4.根据权利要求1、2或3所述的鉴定方法，其特征在于，荧光原位杂交的具体步骤为：
(1)根尖处理：取2-3cm根尖置于含有0.2 mol/L盐酸的指管中，60℃水浴条件下处理7min；
（2）制片：将根尖取出放于载玻片上，切去根冠，用解剖针剥出分生组织细胞，滴上一滴45%的冰醋酸、压片，室温晾干，获得中期分裂相染色体标本；
（3）配置配杂交液：以单张染色体标本为例，取8ng探针Oligo-pTa535-1、8ng探针Oligo-pSc119.2-1和6ng探针(GAA)8加入到8μl的缓冲液中，混匀，配成杂交液；探针的浓度均为10μmol/L；所述缓冲液：1×TE+2×SSC，PH=7；
（4）杂交：将杂交液滴加到染色体标本上，盖上盖玻片，放置于底部铺有湿润滤纸的塑料盒内，盖上盒盖，置于37℃的杂交箱中杂交不低于5h；
（5）洗脱：杂交完成后，取出染色体标本放入盛有双蒸水的洗脱缸中浸泡至盖玻片自然滑落，镊子夹住染色体标本在双蒸水中上下运动清洗2-3次，取出染色体标本，在避光的通风橱中晾干；
（6）照相：向干燥后的染色体标本加入5μl含4',6-二脒基-2-苯基吲哚的抗褪色剂，盖上盖玻片，在荧光显微镜下镜检照相；
抗褪色剂中4',6-二脒基-2-苯基吲哚的含量为1μg/ml。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，步骤5的浸泡时间为：30-60s。
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