CN103571852A - 一个能显著增加陆地棉衣分的海岛棉染色体片段及其ssr 标记 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个能显著增加陆地棉衣分的海岛棉染色体片段及其SSR标记。所述的海岛棉染色体片段D1‐3来自于海岛棉品种海7124，位于棉花染色体组的D1号染色体，通过4个SSR标记：NAU3576，NAU5172，BNL3090，NAU2573标记；使用所述的4各SSR标记引物扩增海岛棉品种海7124基因组DNA，同时含有4个分子标记位点的染色体片段即为海岛棉染色体片段D1-3。含有该片段的染色体片段导入系其衣分为39.22%‐45.08%，比对照陆地棉遗传标准系TM‐1的衣分31.81%。本发明海岛棉染色体片段及其分子标记应用于棉花分子育种，能极大地增加棉花衣分，提高棉花的产量和育种效率。
Description
技术领域
本发明属于作物遗传育种领域，涉及一个能显著增加陆地棉衣分的海岛棉染色体片段及其SSR标记。
技术背景
棉花是世界性的重要经济作物。中国是棉花的生产大国，消费大国和纺织大国。作为棉花生产大国，我国主产棉区覆盖16个省、市（自治区），常年植棉面积7000—8000万亩，总产约600万吨，占世界总产的四分之一。棉花产量分为籽棉产量和皮棉产量，其中高皮棉产量是育种的棉花育种的首要目标。棉花皮棉产量由单株铃数、衣分、单铃重等因素组成。其中衣分在各因素中的遗传率最高，同时也是产量育种中重要的鉴定指标。
一般棉花品种的产量性状的遗传分析均表现出典型数量性状遗传方式，易受环境条件影响。在不同分离群体中，加性、显性或上位性效应均可能占主导地位。海岛棉生育期长，成熟晚，铃小，产量低于陆地棉，但纤维细强，是纺高支纱原料；而陆地棉的产量高，适应性广，纤维品质中等，但显著优于亚洲棉和草棉。但是海岛棉中同时存在着高衣分的基因或染色体片段。陆地棉、海岛棉两者杂交的F1可育，表型正常，且有明显的产量、品质的杂种优势，印度、以色列、中国已成功培育出海、陆杂交种在生产上大面积推广利用。但是，两者杂交的后代表现典型的种间杂交的疯狂分离。分子标记技术在棉花产量改良育种中的应用大大减少了育种过程中选择的盲目性，快速实现外源优良种质向栽培品种渗透，拓宽了品种的遗传基础。国内外研究人员对棉花产量进行了大量的QTL定位研究，有的已经用于标记辅助选择育种实践。
染色体片段导入系(Chromosome segment introgression lines，CSIL)是利用杂交，回交和分子标记辅助选择(marker-assisted selection,MAS)构建的覆盖作物整个基因组的一系列近等基因系。它的基因组内只有来自供体亲本的一个纯合的染色体片段，而基因组的其余部分与轮回亲本相同。它是进行基因组研究，特别是QTL定位和分子设计育种的理想材料。万建民（万建民.作物分子设计育种.作物学报，2006,32（3）：455-462.）已利用由粳稻Asominori(轮回亲本)和籼稻IR24(非轮回亲本)构建的染色体片段置换系进行了分子育种的实践。
发明内容
本发明的目的在于提供一个能显著增加陆地棉衣分的海岛棉染色体片段。
本发明的另一目的是提供该海岛棉染色体片段D1-3的分子标记及其SSR引物。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一个能显著增加陆地棉衣分的海岛棉染色体片段D1-3，所述的海岛棉染色体片段D1-3来自于海岛棉品种海7124，通过4个SSR标记：NAU3576215，NAU5172170，BNL3090210，NAU2573260标记；使用所述的4各SSR标记引物扩增海岛棉品种海7124基因组DNA，同时含有4个分子标记位点的染色体片段即为海岛棉染色体片段D1-3；所述的4个SSR标记引物及扩增的目的片段长度如下：
NAU3576215的正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，扩增的目的片段长度为215bp的DNA片段；
NAU5172170的正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，扩增的目的片段长度为170bp的DNA片段；
BNL3090210的正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，扩增的目的片段长度为210bp的DNA片段；
NAU2573260的正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，扩增的目的片段长度为260bp的DNA片段。
本发明所述的海岛棉染色体片段D1-3的4个SSR分子标记，分别为NAU3576215，NAU5172170，BNL3090210，NAU2573260；各分子标记的引物及扩增的目的片段长度如下：
NAU3576215的正向引物序列为SEQ ID No.1，反向引物序列为SEQ ID No.2，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为215bp的DNA片段；
NAU5172170的正向引物序列为SEQ ID No.3，反向引物序列为SEQ ID No.4，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为170bp的DNA片段；
BNL3090210的正向引物序列为SEQ ID No.5，反向引物序列为SEQ ID No.6，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为210bp的DNA片段；
NAU2573260的正向引物序列为SEQ ID No.7，反向引物序列为SEQ ID No.8，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为260bp的DNA片段。
本发明所述的海岛棉染色体片段D1-3的4个SSR分子标记引物，分别为
分子标记NAU3576215的正向引物序列为SEQ ID No.1，反向引物序列为SEQ ID No.2；
分子标记NAU5172170的正向引物序列为SEQ ID No.3，反向引物序列为SEQ ID No.4；
分子标记BNL3090210的正向引物序列为SEQ ID No.5，反向引物序列为SEQ ID No.6；
分子标记NAU2573260的正向引物序列为SEQ ID No.7，反向引物序列为SEQ ID No.8。
所述的海岛棉染色体片段在增加棉花衣分育种中的应用。
利用本发明染色体片段D1-3获得衣分显著增加的陆地棉导入系IL008的方法，包含以下步骤：
(1)、陆地棉遗传标准系TM-1（♀）和海岛棉品种海7124（♂）杂交产生F1代，然后以TM-1为轮回亲本，回交5次，自交2次产生BC5S2种子。
(2)、种植BC5S2种子产生植株，应用CTAB法提取DNA，采用分子标记引物对NAU3576215，NAU5172170，BNL3090210，NAU2573260进行PCR扩增，各分子标记的引物及扩增的目的片段长度如下：
NAU3576215的正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为215bp的DNA片段；
NAU5172170的正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为170bp的DNA片段；
BNL3090210的正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为210bp的DNA片段；
NAU2573260的正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为260bp的DNA片段；
选择同时含有4个分子标记位点（分子量分别是215bp；170bp；210bp；260bp）的染色体片段即为海岛棉染色体片段D1-3；
(3)、将含有该染色体片段的导入系IL008分别于2008年和2009年种植在江苏省南京市江浦试验基地、2009和2010年种植在山东德州棉花试验基地及2009和2010年种植在新疆石河子市棉花试验基地，每个试验基地种植1行15-20株的导入系，共种植2行，同时种植TM-1和海7124各2行，待棉花收获后测量单株的衣分。经过实际测量后得出的数据是：含有海岛棉染色体片段D1-3的导入系IL008的衣分为39.22%-45.08%，TM-1的衣分是31.37%-33.58%。
所述的分子标记在筛选海岛棉染色体片段以增加棉花衣分中的应用。
所述的分子标记引物在筛选海岛棉染色体片段以增加棉花衣分中的应用。
有益效果
1、本发明所提供的一个能显著增加陆地棉衣分的海岛棉染色体片段导入系IL008经过3年3点的2次重复试验后发现该染色体片段能显著地增加棉花的衣分，比对照TM-1增加23.29%-41.72%（表1）。因此IL008染色体片段导入系的D1-3的海岛棉染色体片段应用于棉花分子育种，能极大地增加棉花衣分，提高棉花的产量和育种效率。
2、本发明所提供的海岛棉染色体片段D1-3的4个SSR分子标记及其引物能大大提高棉花衣分的选择效率（图1）。分子标记辅助目标片段选择，具有早期鉴定、快速鉴定及其稳定性高等特点，将加快高产棉花新品种培育与种子产业化进程。
附图表说明
图1 6个SSR引物在TM-1和海7124中的扩增位点
生物保藏：
IL008，分类命名为陆地棉Gossypium hirsutum.，导入海岛棉染色体片段D1-3。2013年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.7755。
具体实施方式
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室棉花研究所以陆地棉遗传标准系TM-1为轮回亲本，抗病、优质的海岛棉海7124品种为供体亲本（非轮回亲本），回交5次，自交2次产生BC5S2种子。TM-1和海7124经南京农业大学棉花研究所引进后，多年自交保存繁殖，如果其他同行需要，南京农业大学棉花研究所可向公众提供这些种质。
种植BC5S2种子产生植株，每株采集3-4片未展开的叶片放入1.5ml的eppendorf管中，并加入预冷的新鲜配制的提取缓冲液600μl，电钻研磨，应用CTAB法（Paterson AH,Brubaker CL,Wendel JF.A rapid method for extraction of cotton（Gossypium spp.）genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis[J].Plant Mol Biol Rep,1993,11,2:122-127）提取DNA，采用分子标记引物对NAU3576、NAU5172、BNL3090、NAU2573（表1）进行PCR扩增，扩增体系10μl，DNA模板1μl，94℃预变性5min，94℃变性0.5min，57℃复性0.5min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃再延伸10min，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度为8%，电泳缓冲液为0.5倍TBE，170V恒压电泳1.5小时。选择同时含有4个分子标记条带（在海7124中分子量分别是215bp；170bp；210bp；260bp）的染色体片段即为海岛棉染色体片段D1-3。
表1 D1-3染色体片段上的SSR分子标记
注:BNL编号的引物来自美国Research Genetics公司（http://www.resgen.com）;NAU编号的引物由本实验室从EST-SSR序列中开发（Han Z G,Guo W Z,Song X L,et al.Genetic mapping of EST-derived microsatellites from the diploid Gossypium arboreum in allotetraploid cotton.Mol Gen Genomics,2004,272:308-327;Han Z G,Wang C B,Song X L,et al.Characteristics,development and mapping of Gossypium hirsutum derived EST-SSRs in allotetraploid cotton.Theor Appl Genet,2006,112:430-439；Wangzhen Guo,Caiping Cai,Changbiao Wang,et al.A preliminary analysis of genome structure and composition in Gossypium hirsutum.BMC Genomics,2008,9:314-331.）.所有的引物信息可以从网站www.cottonmarker.org上下载。
将含有该染色体片度的导入系IL008分别于2008年和2009年种植在江苏省南京市江浦试验基地（代表长江流域棉区）、2009和2010年种植在山东德州棉花试验基地（代表黄河流域棉区）及2009和2010年种植在新疆石河子市棉花试验基地（代表西北内陆棉区），每个试验基地种植1行15-20株的导入系，共种植2行，同时种植TM-1和海7124各2行，待棉花收获后测量单株的衣分。经过实际测量后得出的数据是(表2)：含有海岛棉染色体片段D1-3的导 入系IL008的衣分为39.22%—45.08%，TM-1的衣分是31.37%-33.58%。结果表明含有海岛棉染色体片段D1-3的导入系IL008的衣分比对照TM-1增加23.29%-41.72%。因此D1-3的海岛棉染色体片段应用于棉花分子育种，能极大地增加棉花衣分，提高棉花的产量和育种效率。
表2 导入系IL008在不同年份、不同环境中衣分表现
Claims (7)
1.一个能显著增加陆地棉衣分的海岛棉染色体片段D1‐3，其特征在于：所述的海岛棉染色体片段D1‐3来自于海岛棉品种海7124，位于棉花染色体组的D1号染色体，通过4个SSR标记：NAU3576215，NAU5172170，BNL3090210，NAU2573260标记；使用所述的4各SSR标记引物扩增海岛棉品种海7124基因组DNA，同时含有4个分子标记位点的染色体片段即为海岛棉染色体片段D1-3；所述的4个SSR标记引物及扩增的目的片段长度如下：
NAU3576215的正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，扩增的目的片段长度为215bp的DNA片段；
NAU5172170的正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，扩增的目的片段长度为170bp的DNA片段；
BNL3090210的正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，扩增的目的片段长度为210bp的DNA片段；
NAU2573260的正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，扩增的目的片段长度为260bp的DNA片段。
2.权利要求1所述的海岛棉染色体片段D1‐3的4个SSR分子标记，其特征在于所述的4个SSR标记分别为NAU3576215，NAU5172170，BNL3090210，NAU2573260；各分子标记的引物及扩增的目的片段长度如下：
NAU3576215的正向引物序列为SEQ ID No.1，反向引物序列为SEQ ID No.2，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为215bp的DNA片段；
NAU5172170的正向引物序列为SEQ ID No.3，反向引物序列为SEQ ID No.4，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为170bp的DNA片段；
BNL3090210的正向引物序列为SEQ ID No.5，反向引物序列为SEQ ID No.6，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为210bp的DNA片段；
NAU2573260的正向引物序列为SEQ ID No.7，反向引物序列为SEQ ID No.8，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为260bp的DNA片段。
3.权利要求1所述的海岛棉染色体片段D1‐3的4个SSR分子标记引物，其特征在于：
分子标记NAU3576215的正向引物序列为SEQ ID No.1，反向引物序列为SEQ ID No.2；
分子标记NAU5172170的正向引物序列为SEQ ID No.3，反向引物序列为SEQ ID No.4；
分子标记BNL3090210的正向引物序列为SEQ ID No.5，反向引物序列为SEQ ID No.6；
分子标记NAU2573260的正向引物序列为SEQ ID No.7，反向引物序列为SEQ ID No.8。
4.权利要求1所述的海岛棉染色体片段在增加棉花衣分育种中的应用。
5.利用权利要求1所述的染色体片段D1-3获得衣分显著增加的陆地棉导入系的方法，包含以下步骤：
(1)、陆地棉遗传标准系TM-1（♀）和海岛棉品种海7124（♂）杂交产生F1代，然后以TM-1为轮回亲本，回交5次，自交2次产生BC5S2种子。
(2)、种植BC5S2种子产生植株，应用CTAB法提取DNA，采用分子标记引物对NAU3576215，NAU5172170，BNL3090210，NAU2573260进行PCR扩增，各分子标记的引物及扩增的目的片段长度如下：
NAU3576215的正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为215bp的DNA片段；
NAU5172170的正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为170bp的DNA片段；
BNL3090210的正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为210bp的DNA片段；
NAU2573260的正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，在海岛棉品种海7124中可扩增出长度为260bp的DNA片段；
选择同时含有4个分子标记位点的染色体片段即为海岛棉染色体片段D1-3；
(3)、将含有该染色体片段的导入系分别于2008年和2009年种植在江苏省南京市江浦试验基地、2009和2010年种植在山东德州棉花试验基地及2009和2010年种植在新疆石河子市棉花试验基地，每个试验基地种植1行15-20株的导入系，共种植2行，同时种植TM-1和海7124各2行，待棉花收获后测量单株的衣分。经过实际测量后得出的数据是：含有海岛棉染色体片段D1-3的导入系IL008的衣分为39.22%-45.08%，TM-1的衣分是31.37%-33.58%。
6.权利要求2所述的分子标记在筛选海岛棉染色体片段以增加棉花衣分中的应用。
7.权利要求3所述的分子标记引物在筛选海岛棉染色体片段以增加棉花衣分中的应用。
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