CN111763757B - 能引起陆地棉致死的异常棉染色体片段及分子标记和应用 - Google Patents

能引起陆地棉致死的异常棉染色体片段及分子标记和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能引起陆地棉致死的异常棉染色体片段及其分子标记和应用，所述染色体片段A11‑9来自于异常棉，位于棉花染色体组的第11号染色体，通过6对SSR标记：NAU5192、A11_175、JAAS3191、A11_243、JAAS3310、A11_193标记，以异常棉的DNA为模板，使用6对SSR标记同时对异常棉的DNA扩增，同时含有6对SSR标记的目的条带的染色体片段即为异常棉的染色体片段A11‑9；本发明获得了源于异常棉致死性状的单片段渐渗系，为促进目标基因的精细定位及其以后的图位克隆创造了重要材料。利用本发明的分子标记，可为渐渗系致死形成的分子机制研究奠定技术基础。

Description

能引起陆地棉致死的异常棉染色体片段及分子标记和应用
技术领域
本发明属于分子育种技术领域，具体涉及一种能引起陆地棉致死的异常棉染色体片段及其分子标记和应用。
背景技术
早在20世纪初人们就意识到利用野生资源可以补偿现代育种失去的优异等位基因，但是种间生殖隔离限制了野生资源在育种中的利用。生殖隔离主要分为3种类型(Stebbins，1950)。第一类叫做地理隔离，同一种生物由于地理上的障碍而分成不同的种群，使种群间不能发生基因交流的现象。第二类是受精前的生殖隔离，它发生在受精以前，这种隔离障碍是由于物种之间不同的开花时间，或植物授粉后由于花粉管不能萌发或者花粉管不能完全穿过花柱达到子房，或者因为雌雄配子间不相容等原因而导致杂种合子不能形成。第三类是受精后生殖隔离，包括杂种致死(hybrid lethality) 或称为杂种劣势(hybrid weakness)和杂种衰退(hybrid breakdown)两种类型。其中杂种致死或杂种劣势发生在F1代，表现出植株死亡、不育、矮小以及生活力下降等；而有些种间杂交能产生正常的杂种F1，然而其F2代的植株往往表现劣势或者致死，这种现象称为杂种衰退。致死基因作为有害的遗传物质，在生产上很容易被育种家忽视而淘汰，然而其特殊的功能和作用机制仍然赋予其在科研和生产中的意义。阐明生殖隔离背后的机制可以为传统作物育种打破生殖障碍，促进种间基因组的交换，将有利于促进野生种优异性状在现代育种中的应用。
目前，有关杂种致死和杂种衰退在不同植物中均有报道，它们具有简单的遗传方式。杂种致死表型发生在F1代，大多由一对或者两对显性基因控制，而杂种衰退则在F2代表现，大多由一对或者两对隐性基因控制。Bateson(1909)、Dobzhansky(1937) 和Muller(1942)提出Bateson-Dobzhansky-Muller(BDM)模型解释了杂种致死及杂种衰退产生的遗传基础。经典的BDM模型包括两位点的上位性互作，从共同祖先分化出来的每一个分支可以在进化过程中形成不同的新位点，这些位点在各自基因组中是无害的，然而在杂交种中，这些进化而来的基因产生互作，当新突变基因为显性时，从而导致F1杂种致死；新突变基因为隐性时，则在F2代表现杂种衰退。显性BDM 互作模式也可以发生在单个位点之间。单位点不协调的进化过程，表示祖先的一个基因位点在不同的分支中向不同的方向进化，从而在不同的种群中形成了不同的基因，在进化过程中祖先基因与进化后形成的基因是协调的。单位点与两位点互作模式没有根本区别，在进化过程中这些基因独立进化，而且这些位点在各自的基因组内是没有负作用的。大多数杂种致死和杂种衰退的报道(Bomblies et al.，2007；Yamamoto et al.， 2007；Chen et al.，2013；Tikhenko et al.，2017)都是由两位点模型作用的结果。而单位点模式的报道则较少(Smith et al.，2011)。
植物杂种致死基因的克隆是解析杂种致死机理的分子基础，也是在根本上理解植物杂种致死现象的发生作用机理的关键，并有助于了解杂种致死基因的进化在生殖隔离与物种形成中的重要作用。现有研究已对杂种致死和杂种衰退相关基因在不同物种中进行了基因定位，部分基因已经被克隆。关于其致死分子机制，普遍认为杂种致死或衰退主要涉及到植物的免疫系统。目前棉花杂种致死研究相对滞后，不少学者相继发现了杂种致死现象，部分致死基因被染色体定位，未见其分子机制的研究报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种异常棉染色体片段A11-9，所述片段能引起陆地棉致死。
本发明的另一目的是提供一种异常棉染色体片段A11-9的分子标记及引物序列，该分子标记与陆地棉-异常棉渐渗系致死性状紧密连锁。
本发明还保护上述异常棉染色体片段A11-9的分子标记及引物的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种能引起陆地棉致死的异常棉染色体片段A11-9，所述异常棉染色体片段 A11-9来自于异常棉，位于棉花染色体组的第11号染色体，通过6对SSR标记： NAU5192，A11_175，JAAS3191，A11_243，JAAS3310，A11_193标记；以异常棉的DNA为模板，使用所述6对SSR标记同时对异常棉的DNA扩增，同时含有6个 SSR标记目的条带的染色体片段即为异常棉染色体片段A11-9；所述6个SSR标记引物序列及其扩增片段长度如下：
NAU5192：正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，扩增目的片段长度为280bp；
A11_175：正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，扩增目的片段长度为210bp；
JAAS3191：正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，扩增目的片段长度为270bp；
A11_243：正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，扩增目的片段长度为280bp；
JAAS3310：正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10，扩增目的片段长度为250bp；
A11_193：正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12，扩增目的片段长度为250bp；
本发明还公开了异常棉染色体片段A11-9的分子标记，所述分子标记分别为NAU5192，A11_175，JAAS3191，A11_243，JAAS3310，A11_193，各分子标记的引物序列及其扩增目的条带的长度如下：
NAU5192：正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，在异常棉基因组中扩增目的片段长度为280bp；
A11_175：正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，，在异常棉基因组中扩增目的片段长度为210bp；
JAAS3191：正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，在异常棉基因组中扩增目的片段长度为270bp；
A11_243：正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，在异常棉基因组中扩增目的片段长度为280bp；
JAAS3310：正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10，在异常棉基因组中扩增目的片段长度为250bp；
A11_193：正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12，在异常棉基因组中扩增目的片段长度为250bp；
另一方面，还公开了异常棉染色体片段A11-9上的SSR标记引物，所述标记引物的序列为：
SSR标记NAU5192正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2；
SSR标记A11_175正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4；
SSR标记JAAS3191正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6；
SSR标记A11_243正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8；
SSR标记JAAS3310正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10；
SSR标记A11_193正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12。
另外，本发明还公开了上述分子标记或分子标记引物的应用，包括在异常棉致死基因定位中的应用以及在鉴定棉花植株致死性状中的应用。上述这些应用均可以按照常规的方法进行。
本发明还公开了陆地棉-异常棉渐渗系的构建方法，所述方法包括如下步骤：
(1)以陆地棉苏8289为母本，异常棉为父本，通过秋水仙素加倍获得了六倍体 F1杂种。利用形态学、细胞学、分子标记等技术鉴定证明我们获得加倍成功的六倍体杂交种(Zhang et al.，2014)。以六倍体F1为母本、苏8289为轮回亲本继续连续回交四次，每一世代结合标记辅助选择，获得了一批异常棉来源的渐渗系群体，其中 A11染色体上的单片段渐渗系CSSL11-9存在致死现象。
(2)种植单片段渐渗系CSSL11-9产生的BC4F2植株，取幼嫩叶片，用CTAB 法提取DNA作为模板，用所述的6对SSR标记为引物，进行PCR扩增，所述6对 SSR标记在异常棉基因组中扩增的特异条带分子量分别是：280bp，210bp，270bp， 280bp，250bp，250bp，选择同时包含6个分子标记特异条带的染色体片段即为异常棉染色体片段A11-9，仅包含纯合的异常棉分子标记特异条带的植株表现为致死性状。
(3)致死性状调查在大田分单株进行，从移栽前的幼苗期开始至成熟期，每隔两星期调查一次。表型性状划分为致死型和正常型两种。其致死性状具体表现为：植株大约长至7-8果枝时，顶端叶片变为红色，逐渐蔓延整个植株，随后整株叶片枯萎脱落，同时植株顶端坏死，最后植株呈光杆状；有少部分植株顶端在坏死后从侧面新发出两个侧端，能正常开花、成铃吐絮，但成铃较少。凡叶片正反面表现红色，并出现致死症状的单株归为致死型，而整个植株具有正常绿色叶片的单株归为正常型。
本发明具有如下优点：
本发明获得了源于异常棉致死性状的单片段渐渗系，为促进目标基因的精细定位及其以后的图位克隆创造了重要材料。
利用本发明的分子标记，可为渐渗系致死形成的分子机制研究奠定技术基础。
本发明的分子标记具有检测方便、扩增产物稳定、特异性高的特点，可以简便、快速、高通量地应用于棉花材料鉴定。
附图说明
图1是本发明6对异常棉染色体片段A11-9上分子标记在苏8289、CSSL11-9和异常棉基因组中扩增的目的条带；
图中，泳道1、2、3分别代表苏8289、CSSL11-9和异常棉，箭头所示为异常棉特异扩增的目的条带。
图2是本发明正常植株和致死植株的田间表型；
图中，图2a和图2c为正常表型植株，图2b和图2d为致死表型植株。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
1.试验材料
本实验所用的陆地棉苏8289(轮回亲本)以及异常棉(供体亲本)由江苏省农业科学院引进，均记载于“Caijiao Zhai，Peng Xu，Xia Zhang等.Development of Gossypiumanomalum derived microsatellite markers and theiruse for genome-wideidentification of recombination between the G.anomalumand G.hirsutumgenomes.Theoretical andApplied Genetics，2015,128(8)：1531-1540”中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用，也可以通过购买的途径获得。
2.试验方法
2.1提取基因组DNA的方法
种植CSSL11-9、苏8289和异常棉种子长成植株，提取基因组DNA。提取基因组DNA的方法为：
(1)将5g冻叶(或鲜叶)放入预冷的研钵中，加入液氮研磨。分2次加入10ml 新鲜配制的提取缓冲液(表1)，转入50ml的离心管中，涡旋混匀，冰浴保存10min。 4000rpm离心20min(4℃)，弃上清；
(2)于沉淀中加入15ml 65℃预热的裂解缓冲液(表2)，并用铜丝搅松，涡旋混匀，65℃水浴30min；
(3)加入15ml氯仿：异戊醇(24∶1，体积比)混合液，翻转50次以上，4000rpm 离心20min(15℃)，将上清转入50ml的离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，4000rpm，离心10min(室温)，弃上清，于沉淀中加入2ml 70％的乙醇洗涤，并转入10ml的离心管中，10000rpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min；
(4)加3ml TE缓冲液(PH＝8.0，1.0M Tris-HCl溶液2.5ml和0.5M EDTA溶液 0.5ml混匀，蒸馏水定容至250ml灭菌)溶解，65℃培养10～30min，加等体积的氯仿：异戊醇(24∶1，体积比)，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心 10min；
(5)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的3M醋酸钠(pH 5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min。弃上清液，加2ml70％乙醇洗DNA小团，10000rpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min；
(6)加3ml TE缓冲液溶解，65℃培养10～30min；
(7)加5μl RNAase A(10mg/ml)，37℃温育30～60min。加等体积的氯仿：异戊醇(24∶1，体积比)，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；
(8)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的3M醋酸钠(pH 5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次；
(9)将絮状沉淀挑入加有800μl 70％乙醇的1.5ml的离心管中，10000rpm离心5min。弃上清液，自然通风干燥DNA小团；
(10)加200μl TE缓冲液[10mM Tris/HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)] 溶解DNA(4℃，1～2天)，-20℃保存。
(11)以5μl大连宝生物50bp DNA Ladder作为对照，将DNA依次稀释5倍， 10倍和20倍，通过1％琼脂糖凝胶电泳，确定DNA的浓度、纯度以及完整性。
(12)根据提取DNA的浓度，用TE将DNA稀释至20ng/μl工作液，混匀备用。
表1 DNA提取缓冲液配方
Figure GDA0003654785800000061
Figure GDA0003654785800000071
表2裂解缓冲液配方
Figure GDA0003654785800000072
2.2 PCR方法
(1)所用试剂及主要仪器
PCR反应所用Taq酶和dNTPs均购自大连宝生物工程有限公司，PAGE胶所用试剂包括丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，Tris-碱，硼酸，硝酸银，氢氧化钠，TEMED等试剂从荣胜达实验仪器有限公司采购。主要仪器包括Applied Biosystems PCR仪， Eppendor高速冷冻离心机，水浴锅，摇床和北京六一仪器厂生产的电泳槽和电泳仪。
(2)PCR反应体系及扩增程序
PCR反应体系见表3。
表3 PCR反应体系
Figure GDA0003654785800000073
Figure GDA0003654785800000081
PCR反应在Applied Biosystems PCR仪上进行，反应程序为：
Figure GDA0003654785800000082
电泳溶液配制：
扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度9％，电泳缓冲液为 0.5×TBE，180V恒压电泳1.5～2小时。
9％PAGE胶：43.5g丙烯酰胺，1.5g甲叉丙烯酰胺，100ml 5×TBE，加蒸馏水定容至500ml，4℃保存。
10％过硫酸铵：10g过硫酸铵溶解在100ml蒸馏水中，4℃保存。
上样缓冲液：0.25g溴酚蓝+0.25g二甲苯氰+40g蔗糖，蒸馏水定容至100ml。
5×TBE：54g Tris-碱，27.5g硼酸，0.5M EDTA(PH＝8.0)20ml，蒸馏水定容至 1L，室温保存。
染色液：1g硝酸银+500ml蒸馏水。
显色液：7.5g氢氧化钠+750μL甲醛+500ml蒸馏水。
凝胶制备及电泳过程：
(1)用清水将玻璃板、胶条和梳子洗净，晾干备用。
(2)将玻璃板、胶条和梳子按要求安装好，并用1％的琼脂糖凝胶封底，待凝胶凝固，将其固定在电泳槽上。
(3)在锥形瓶中倒入已经配制好的9％的PAGE胶，加入10％AP和TEMED，迅速灌胶，灌满后插入梳子，15-20分钟后，拔出梳子，准备电泳。
(4)电泳前在PCR扩增产物中加入2μL上样缓冲液，拔掉梳子，将电泳缓冲液 (1×TBE)加入正负极电泳槽中，缓冲液高度要超过短玻璃板，每个点样孔上样2μL，180V恒压电泳1.5～2小时。到蓝色指示标记距胶下面2cm即可停止，小心拆开玻璃板去除凝胶，并对凝胶进行标记。
染色及显色过程：
(1)固定：将拆下来的凝胶放入固定液中(10％乙醇+0.5％冰乙酸)12min，
(2)染色：固定结束后，将固定液到出去，将染色液倒入(0.2％硝酸银水溶液)，12min后，蒸馏水漂洗3次。
(3)显色：1.5％氢氧化钠+0.4％甲醛加入，摇晃，到胶片上条带显示清楚即可结束，适倒掉显色液，用自来水冲洗4次，将胶片放置在灯箱上拍照。
2.3标记的选择与鉴定
(1)以陆地棉苏8289为母本，异常棉为父本，通过秋水仙素加倍获得了六倍体 F1杂种。利用形态学、细胞学、分子标记等技术鉴定证明我们获得加倍成功的六倍体杂交种(Zhang et al.，2014)。以六倍体F1为母本、苏8289为轮回亲本继续连续回交四次，每一世代结合标记辅助选择，获得了一批异常棉来源的渐渗系群体，其中 A11染色体上的单片段渐渗系CSSL11-9存在致死现象。
(2)种植单片段渐渗系CSSL11-9产生的BC4F2植株、轮回亲本苏8289以及异常棉，分别取幼嫩叶片，用CTAB法提取DNA作为模板，用本课题组开发的均匀覆盖异常棉染色体组的230对SSR引物进行检测，对单片段渐渗系CSSL11-9进行全基因组前景与背景鉴定。其中仅如表4中的6对SSR分子标记引物的扩增产物在单片段渐渗系CSSL11-9和轮回亲本苏8289之间有差异。然后取幼嫩叶片，用CTAB法提取DNA作为模板，用所述的6对SSR标记为引物，进行PCR扩增，选择同时包含6个分子标记特异条带的染色体片段即为异常棉染色体片段A11-9，仅包含纯合的异常棉分子标记特异条带的植株表现为致死性状。
6个分子标记(NAU5192，A11_175，JAAS3191，A11_243，JAAS3310，A11_193) 在异常棉基因组中扩增的特异条带分子量分别是：280bp，210bp，270bp，280bp，250bp， 250bp(图1)。并且对其进行了初步的定位，其在棉花染色体组第11号染色体上。选择同时包含该片段的单株(见表4)。通过标记鉴定，我们确定BC4F2单株中可扩增出6个分子标记的目的片段，仅同时包含纯合的异常棉分子标记特异条带的植株表现为致死性状，即致死植株包含了异常棉染色体片段A11-9。
表4 A11-9染色体片段上的SSR分子标记及其序列
Figure GDA0003654785800000091
Figure GDA0003654785800000101
然后再以苏8289为母本，CSSL11-9为父本构建了一个含有2337个单株的F2群体，在大田分单株进行性状调查，从移栽前的幼苗期开始至成熟期，每隔两星期调查一次。表型性状划分为致死型和正常型两种。凡叶片正反面表现红色，并出现致死症状的单株归为致死型，而整个植株具有正常绿色叶片的单株归为正常型。结果显示 2337个F2单株中，表现为致死表型的单株545株，正常表型单株1792株，χc 2＝3.516＜χc 2 0.05，1＝3.84，表明正常表型和致死型符合3∶1分离比，因此认为源于异常棉的致死性状在此群体中是由一对隐性基因控制的遗传规律。
表5不同表型材料的基因型
Figure GDA0003654785800000102
1：苏8269基因型；2：异常棉基因型；3：杂合基因型
2.4致死性状的表型鉴定
致死性状调查在大田分单株进行，从移栽前的幼苗期开始至成熟期，每隔两星期调查一次。表型性状划分为致死型和正常型两种。其致死性状具体表现为：首先植株大约长至7-8果枝时，顶端叶片变为红色(图2b)，逐渐蔓延整个植株，随后整株叶片枯萎脱落，同时植株顶端坏死，最后植株呈光杆状(图2d)；有少部分植株顶端在坏死后从侧面新发出两个侧端，能正常开花、成铃吐絮，但成铃较少。凡叶片正反面表现红色，并出现致死症状的单株归为致死型，而整个植株具有正常绿色叶片的单株归为正常型(图2a、图2c)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 能引起陆地棉致死的异常棉染色体片段及分子标记和应用
<130> 2020
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 1
acaatggaag aaaagccttg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 2
ttcttgctct gtttcccttt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 3
acacctatgc gccaatggat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 4
accttgcctc tccccatttc 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 5
agtggaaatg gtgataaggt gct 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 6
gcaaccccca aaaccacatc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 7
gctgtcgagt gaggattgct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 8
gagcttaact ccgaccaccc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 9
cctgcaccga tctgccttta 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 10
ctgagttcga cccagtttcc a 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 11
ccgctcttgg catctcctag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 12
tcacgattct ccctctgctt 20

Claims (3)

1.与以陆地棉和异常棉为亲本的世代群体致死性状相关的异常棉染色体片段A11-9的分子标记，其特征在于，所述分子标记由SSR标记NAU5192、A11_175、JAAS3191、 A11_243、JAAS3310、A11_193组成，各SSR标记的引物序列及其扩增目的条带的长度如下：
NAU5192：正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，在异常棉基因组中扩增目的片段长度为280bp；
A11_175：正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，在异常棉基因组中扩增目的片段长度为210bp；
JAAS3191：正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，在异常棉基因组中扩增目的片段长度为270bp；
A11_243：正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，
在异常棉基因组中扩增目的片段长度为280bp；
JAAS3310：正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10，在异常棉基因组中扩增目的片段长度为250bp；
A11_193：正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12，在异常棉基因组中扩增目的片段长度为250bp。
2.用于扩增权利要求1所述的与以陆地棉和异常棉为亲本的世代群体致死性状相关的异常棉染色体片段A11-9分子标记的 SSR标记引物，其特征在于：所述SSR标记引物的序列为：
NAU5192：正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2；
A11_175：正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4；
JAAS3191：正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6；
A11_243：正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8；
JAAS3310：正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10；
A11_193：正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12。
3.权利要求2所述的SSR标记引物在辅助鉴定以陆地棉和异常棉为亲本的世代群体致死性状中的应用，其特征在于，用所述SSR标记引物进行PCR扩增，同时包含权利要求1所述的SSR标记NAU5192、A11_175、JAAS3191、A11_243、JAAS3310、A11_193的目的条带的植株表现为致死性状。
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