CN112772404B - 一种水稻雌性核不育恢复系的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水稻雌性核不育恢复系的选育方法，属于农业和生物技术领域。为了获得杂交稻种子生产中理想的花粉供体，本发明提供了一种可获得雌性败育率100％的雌性核不育恢复系的选育方法。通过选用不同遗传背景水稻品种(系)与雌性核不育品种(系)进行聚合杂交，结合表型和/或水稻雌性核不育基因FST分子鉴定的方法，选育获得具有性状稳定的优良水稻雌性核不育恢复系。通过本选育方法可快速、准确、高效地通过小群体选育获得优良的水稻雌性核不育恢复系，可从根本上解决由于父本必须单种单收、其种子混杂导致的杂交种纯度不高的问题，为实现父母本混播混种混收全程机械化操作制种技术体系提供实践基础。

Description

一种水稻雌性核不育恢复系的选育方法

技术领域

本发明属于农业和生物技术领域，涉及一种水稻雌性核不育恢复系的选育方法。

技术背景技术

杂种优势即两个遗传背景不同的亲本进行杂交，其杂交种在多个性状上优于双亲的现象。在农作物的生产实践中，中国作为世界上第一个发展并推广杂交水稻的国家，从1964年开始对水稻雄性不育(Male-sterile,MS)进行研究(袁隆平.水稻的雄性不孕性.科学通报,1966,17: 185–188)，并在核质互作雄性不育系(CMS)的基础上，成功利用了水稻的杂种优势，促进了水稻产业在中国乃至世界范围内的发展，为粮食安全做出了巨大贡献。“三系法”杂种优势的利用需要核质互作雄性不育系、保持系、恢复系来配套完成杂交种子的生产和不育系的繁殖，受到恢保关系的制约，不育系资源较少，优良保持系选育比较困难，对水稻丰富的种植资源利用的范围有限。基于光温敏雄性核不育系(T/PGMS)建立起来的“两系法”杂交水稻技术也已经发展三十余年(牟同敏.中国两系法杂交水稻研究进展和展望.科学通报,2016, 61:3761–3769)，其杂交制种和繁殖受到了时空条件的限制，不可人为控制的外界环境变化可以随时影响不育系的育性转换，其制种存在潜在的风险(吴锁伟，万向元.利用生物技术创建主要作物雄性不育杂交育种和制种的技术体系[J].中国生物工程杂志,2018(1):78-87.)。因此，开发一种资源利用率高、杂交制种安全、高效的水稻杂种优势利用的新型的育种技术是杂交水稻发展的趋势所在(邓兴旺,王海洋,唐晓艳,等.杂交水稻育种将迎来新时代.中国科学:生命科学,2013,43:864–868.)。

目前，最具有代表性的第三代杂交水稻技术，即基于雄性育性恢复基因(OsNP1)、花粉致死基因(a-淀粉酶基因)和红色荧光蛋白(DsRed)基因设计的多控雄性不育系分子设计育种体系(Chang,Z.,Chen,Z.,Wang,N.,et al.Construction of a male sterilitysystem for hybrid rice breeding and seed production using a nuclear malesterility gene[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2016,113(49),14145-14150.)，其核心就是遗传工程雄性不育系的创制。遗传工程雄性不育系可以解决水稻雄性核不育系的繁殖问题，为杂交水稻制种提供广泛的杂交母本材料，为组配筛选更多的优势组合提供更大的可能。但是，在大面积繁殖和制种过程中，目前生产上所用恢复系(即花粉供体材料)的混杂直接影响杂种一代的纯度，而且制种田的花粉供体材料需要单种单收割，依然不能降低杂交种制种成本，更难于实现制种全程机械化和现代化的发展。唯有选育不受恢保关系制约，适合于混播混种混收全程机械化制种的亲本材料，即花粉供体材料和受体材料，才能从本质上解决水稻种质资源利用率低、杂交种制种成本高的问题。

水稻雌性核不育(Female-sterile,FS)的发掘和利用，为杂交水稻技术创新提供了最理想的花粉供体材料资源。水稻雌性核不育植株，可以在大面积制种过程中为雄性不育系提供大量正常可育的花粉，实现杂交种的生产。其最大的优点在于：可将杂交组合父母本双亲(雌性不育系-FS和雄性不育系-MS)种子混播混种混收，由于雌性核不育系因雌配子体发育异常而完全不能自交和/或异交结实，雄性不育系获得供体花粉后形成杂交种子，最终可以实现制种全程机械化操作，即“FS+MS(FM-line)”杂交水稻制种技术体系(陈丽娟，李东宣，李成云，谭学林，徐学洙，朱有勇.雌性不育基因FST用于杂交水稻育种的方法[P].中国专利： CN101658129B,2012-02-01.；Lee,D.S.,Chen,L.J.,Li,C.Y.,et al.The B_sisterMADS Gene FST Determines Ovule Patterning and Development of the ZygoticEmbryo and Endosperm.PLoS ONE, 2013,8(3),26-33.)。最新的研究报道表明，在借鉴遗传工程雄性不育系创制方法的基础上，遗传工程雌性不育系实现了雌性不育系的种子繁殖(Xia Y,Tang N,Hu Y,et al.A method for mechanized hybrid rice seed productionusing female sterile rice[J].Rice,2019,12(1).)，这为“FS+MS(FM-line)”杂交水稻制种技术体系创建和应用实践的可行性提供了支撑。

在上述“FS+MS(FM-line)”杂交水稻制种技术体系中，已有大量的雄性核不育系被选育并通过了审定，为花粉受体材料提供了丰富多样的资源，但是雌性核不育恢复系的选育报道还很少。目前选育获得的雌性不育水稻恢复系均无法实现植株雌性完全败育、自交和/或异交结实为零，无法解决杂交制种过程中由于父本材料自身不完全败育而导致的杂种一代混杂的问题，不能达到杂交制种生产实践应用的要求。如一种高频隐性雌不育水稻恢复系的单株雌性败育率仅在70％到90％(赵炳然等，高频隐性雌不育水稻恢复系的应用及培育方法[P].中国专利：CN101697706B,2012-06-06.)，水稻雌性不育突变体ptb1(pollen tube blocked 1)拥有1.80±0.14％的穗结实率(Li,S.,Li,W.,Huang,B.,etal.Natural variation in PTB1 regulates rice seed setting rate by controllingpollen tube growth[J].Nature Communications,2013,4, 1-13.)。因此，对于完善和实现“FS+MS(FM-line)”杂交水稻制种技术体系的创建和实践应用，选育花粉发育正常，雌性败育率为100％且雌不育性稳定，天然自交和/或异交结实率为零的水稻雌性核不育恢复系具有重要的实际意义。

发明内容

为了解决目前杂交育种或杂交制种中因父本必须单种单收、其自交和/或异交结实而导致的杂交种子混杂的技术问题，本发明提供一种能够应用于杂交稻父母本混播混种混收、制种全程机械化操作的雌性败育率为100％的水稻雌性核不育恢复系的选育方法。

本发明提供的一种水稻雌性核不育恢复系的选育方法，包括以下步骤：

①选用至少1个雌性核不育基因型为隐性纯合(-/-)的水稻品种或品系作为雌性核不育基因fst供体，与不同遗传背景的正常可育的水稻品种或品系(+/+)进行聚合杂交，获得雌性核不育基因杂合型(+/-)的多交子代F₁；

②对步骤①中获得的多交子代F₁植株自交结实后的种子混收后，种植F₂分离群体，并从 F₂分离群体中选择20-30个正常结实的优良单株(+/+或+/-)，单株收种后，按株系种植40-50 株的F₃株系群体，自交加代；

③从步骤②获得的F₃株系群体中，淘汰fst性状不分离的F₃株系群体，从fst性状发生分离的各个F₃株系群体，即分离出现有完全不结实植株(-/-)的各个F₃株系分离群体中，根据表型选择不少于6株正常结实的优良单株(+/+或+/-)，和/或用水稻雌性核不育基因FST分子鉴定的方法筛选获得F₃中选单株中的雌性核不育基因FST杂合型(+/-)优良单株；F₃中选单株分株收种后，继续按株系种植40-50株的F₄株系群体；

④按步骤③继续选择自交加代并筛选获得高世代雌性核不育基因杂合型(+/-)的株系，直至获得分离群体中遗传性状稳定、综合农艺性状优良的雌性核不育系(-/-)及可正常结实的近等位基因系(+/+或+/-)，所获得的遗传性状稳定、综合农艺性状优良的雌性核不育系即为育成的水稻雌性核不育恢复系。

进一步，步骤①中所述的雌性核不育基因型为隐性纯合(-/-)的水稻品种或品系是植株表现为稻穗完全不育，雌性败育率为100％，雌不育性稳定，天然自交结实率和/或天然异交结实率为0，花粉育性正常。

进一步，步骤①中所述的雌性核不育基因型为隐性纯合(-/-)的水稻品种或品系是除fst 以外的由其它核基因控制的雌性不育材料，且其雌性败育率100％，雌不育性稳定，天然自交和/或天然异交结实率为0，花粉育性正常。

步骤①中雌性核不育基因型为隐性纯合(-/-)的水稻品种或品系为G39、AWG、NWG中的一种或两种以上。

步骤④中所获得的杂合型(+/-)近等位基因系，简称FS-NILs，植株正常结实，可用于该水稻雌性核不育恢复系种子的持续繁衍。

所述雌性核不育基因型为隐性纯合(-/-)的水稻品种或品系是水稻雌性核不育自然突变体G39，或以该突变体材料做为雌性核不育基因fst供体，通过常规杂交选育获得的纯合雌性核不育水稻品种或品系。

所述不同遗传背景的水稻品种或品系可为籼型、粳型或籼粳中间型，优选“两系”或“三系”杂交稻的恢复系品种(系)或保持系品种(系)。

本发明还提供采用上述水稻雌性核不育恢复系的选育方法在水稻新品种的培育或改良或杂交稻制种中的应用。采用上述水稻雌性核不育恢复系的选育方法获得水稻雌性核不育恢复系在水稻新品种的培育或改良或杂交稻制种中的应用。

术语：

水稻雌性核不育恢复系(通称雌性不育系或雌性核不育系)：植株所有颖花雌性器官发育异常、导致授粉后稻穗自交和/或异交完全不结实，但其雄性器官发育正常、花粉正常可育，可作为杂交水稻的恢复系或花粉供体，通常用FS或FR表示。

单交：两个亲本进行杂交称为单交，以符号A×B或A/B表示。

三交：三个亲本间的杂交，例如以单交的F₁杂种再与另一亲本杂交，以符号A/B//C表示。

四交：四个亲本间的先后杂交，以符号A/B//C///D表示。

多交：涉及三个或三个以上的亲本，要进行两次或两次以上的杂交。

雌性核不育基因fst：是一个B_sister类群MADS-box转录因子编码的细胞核隐性突变型基因，英文全称为female-sterile，简写为fst，来自于本发明人发现并报道的水稻雌性核不育自然突变体G39。突变体G39株植表现为孢子体遗传的雌性器官发育异常及合子胚完全败育，导致稻穗完全不结实，天然自交和/或异交结实率为0，花粉发育正常。

雌性核不育基因FST：为雌性核不育基因fst的野生型基因，简写为FST。

fst性状分离：FST杂合体单株(+/-)自交结实收获的种子种植后，其后代群体中分离出现的雌性核不育(fst)植株(-/-)。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

第一：通过上述的一种水稻雌性核不育恢复系的选育方法选育获得的水稻雌性核不育恢复系，与亲本雌性核不育材料G39、AWG和NWG相比，具有本质上的不同。雌性核不育亲本材料G39、AWG和NWG种植于云南昆明，植株矮小、综合农艺性状表现不佳，根本无法直接应用于传统的水稻制种技术体系当中。本发明选育获得的水稻雌性核不育恢复系，植株生长势旺盛、株高适中、综合农艺性状表现优良，作为花粉供体，与“两系”或“三系”杂交稻的雄性不育系(T/PGMS,GMS，或CMS)组配，其F₁植株结实正常，配合力明显优于亲本雌性核不育材料G39、AWG和NWG，更适合应用于FS+MS(FM-line)创新体系中父母本混播混种混收的全程机械化制种操作和大面积推广。

第二：本发明提供的一种水稻雌性核不育恢复系的选育方法具有选育群体小，结合表型和/或水稻雌性核不育基因FST分子鉴定的方法能够快速、准确和高效的选育获得所需优良的雌性核不育恢复系，大幅度节省了劳动力和材料种植成本。选育的水稻雌性核不育恢复系雌性不育性稳定，雌性败育率为100％，天然自交结实率和/或天然异交结实率为0，花粉发育正常。

第三：利用本发明选育获得的水稻雌性核不育恢复系作为父本(花粉供体亲本)，核质互作雄性不育系(CMS)、光温敏雄性核不育系(T/PGMS)或雄性核不育系(GMS)作为母本，通过父母本混播混种混收进行杂交制种，获得的杂交种100％不含有父本自交和/或异交结实的种子，从根源上杜绝了父本种子的混杂，提高了杂交种的纯度，并可以降低杂交种制种成本，实现全程机械化、规模化和高效化制种。

第四：利用本发明选育获得的水稻雌性核不育恢复系完全打破了目前“两系”或“三系”杂交稻中恢保关系的限制，同时也不受环境变化和地理区域的限制，拓宽了水稻资源利用的范围，为筛选更多更优的杂交稻组合提供了技术支撑。

附图说明

图1：本发明水稻雌性核不育恢复系选育流程图。

图2：水稻雌性核不育恢复系田间长势图，其中a为水稻雌性核不育恢复系“DW8S0373FS”田间长势；b为水稻雌性核不育恢复系“云岭318FS”田间长势；c为水稻雌性核不育恢复系“云岭319FS”田间长势。

图3：水稻雌性核不育恢复系穗部性状图，其中，a为水稻雌性核不育恢复系“DW8S0373FS”；b为水稻雌性核不育恢复系“云岭318FS”；c为水稻雌性核不育恢复系“云岭319FS”)。

图4：水稻雌性核不育恢复系盛花期花粉I₂-KI染色图，其中，a为水稻雌性核不育恢复系“DW8S0373FS”；b为水稻雌性核不育恢复系“云岭318FS”；c为水稻雌性核不育恢复系“云岭319FS”。

图5：水稻雌性核不育恢复系田间农艺性状调查结果图。

图6：水稻雌性核不育恢复系测配杂种F₁田间表现图。图6中，a为水稻雌性核不育恢复系“DW8S0373FS”测配杂种F₁田间表现；b为水稻雌性核不育恢复系“云岭318FS”测配杂种F₁田间表现；c为水稻雌性核不育恢复系“云岭319FS”测配杂种F₁田间表现。

图7：实施例1水稻雌性核不育恢复系“DW8S0373FS”的选育程序图。

图8：实施例2水稻雌性核不育恢复系“云岭318FS”的选育程序图。

图9：实施例3水稻雌性核不育恢复系“云岭319FS”的选育程序图。

以上相关图及实施例中：水稻雌性核不育恢复系“DW8S0373FS”简称：DW8S0373FS，水稻雌性核不育恢复系“云岭318FS”简称：云岭318FS，水稻雌性核不育恢复系“云岭319FS”简称：云岭319FS。

具体实施方式

下面通过具体的实施例并结合附图对本发明做进一步的详细描述。

下述所使用的试验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有的常规方法和技术，所使用的试剂，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

所用的水稻材料：

“G39”，为雌性核不育基因fst的供体材料，由本发明人发现的水稻雌性核不育突变体，由细胞核遗传隐性单基因fst(female-sterile)控制的水稻雌性核不育突变体，表现为稻穗完全不育，雌性败育率为100％，天然自交/异交结实率为0，且花粉育性正常(Lee,D.S.,Chen, L.J.,Ha,W.G.et al.Single recessive genetic female sterility inrice.International Rice Research Notes,2002,27:22-23.；Lee,D.S.,Chen,L.J.,Li,C.Y.,et al.The B_sister MADS Gene FST Determines Ovule Patterning andDevelopment of the Zygotic Embryo and Endosperm[J].PLoS ONE,2013,8(3),26-33)。

“AWG”和“NWG”,又名“AWG-cyncyn”和“NWG-cyncyn”，为雌性核不育基因 fst的供体材料，由本发明人基于fst突变体材料经过多年杂交选育获得的水稻雌性核不育材料，植株均表现为稻穗完全不育，雌性败育率为100％，天然自交/异交结实率为0，且花粉育性正常(Chen,L.J.,Lee,D.S.,Tan,X.L.,et al,Characterization of female-sterile riceand its great potential for innovation of seed production technology ofhybrid rice,International Symposium on “100years of Rice Science and LookingBeyond”,India,2012)。

“CH8”，又名“Sanghaehyangheolua”，粳稻品种(Nadir,S.,Li,W.,Zhu,Q.,et al.Anovel discovery of a long terminal repeat retrotransposon-induced hybridweakness in rice[J].Journal of Experimental Botany,2019,70(4),1197–1207)。

“Gayabyeo”，籼粳中间型品种(Jeon,Y.,Ahn,S.,Choi,H.,et al.Identificationof a RAPD marker linked to a brown planthopper resistance gene in rice[J].Euphytica,1999,107,23–28)。

“Taebaegbyeo”，籼稻品种(Senthil-Nathan S.,Kalaivani K.,Choi M.Y.,etal.Effects of jasmonic acid-induced resistance in rice on the plantbrownhopper,Nilaparvata lugens

(Homoptera:Delphacidae)[J].PesticideBiochemistry&Physiology,2009,95(2):77-84)。

“M23”，又名“密阳23”，籼型常规稻(韩龙植,乔永利,高熙宗,等.水稻幼苗期耐冷性选择对主要农艺性状的影响[J].中国水稻科学,2002(04):22-27)。

“H479A”，滇I型雄性不育系(程贤宇,板自兵,王存,等.高原优质滇型杂交粳稻滇禾优34高产制种技术[J].种子,2013,32(12):112-113+116)。

“圳18A”，籼稻广三系雄性不育系(Chang,Z.,Chen,Z.,Wang,N.,etal.Construction of a male sterility system for hybrid rice breeding and seedproduction using a nuclear male sterility gene[J].Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,2017,114(1),E107–E107)。

“明S”，籼型温敏两用核不育系(孙佳丽,彭既明.水稻强分蘖两系不育系‘明S’农艺性状研究[J].中国农学通报,2016,32(24):31-35)。

上述材料均为已公开的育种材料，其中G39、AWG、NWG、H479A、M23、CH8、Gayabyeo和Taebaegbyeo申请人有保存，可提供，联系地址：云南省昆明市盘龙区沣源路452号，云南农业大学(可注明：云南农业大学稻作研究所)，邮政编码：650201。

圳18A和明S可通过商业途径获得。

以下实施例所述的水稻雌性核不育基因FST分子鉴定的方法(相关附图中表示为MAS，即分子标记辅助选择，Marker-assisted selection，MAS)筛选雌性核不育基因杂合型(+/-)的优良单株，即为本申请人获得的CN101654703B的发明名称为“水稻雌性不育基因FST分子鉴定的方法”，可以准确、快速、高效的通过特异性引物筛选获得雌性核不育基因FST的野生型(+/+)、突变型(-/-)以及杂合型(+/-)的水稻植株。具体方法为：取待鉴定水稻材料叶片，提取水稻总DNA，利用雌性核不育基因FST的四条特异性引物：Gf1、Gr1、Jf1和Jr1对水稻叶片总DNA进行PCR扩增，PCR反应后加入3μl的loading buffer混匀上样6μl，用含EtBr 0.1μg/ml的2％琼脂糖凝胶，1×TAE buffer、125V电泳40min；紫外透射仪上检测。扩增体系总体积为15μl，其中，ddH₂O 11.24μl，含Mg²⁺10×buffer1.5μl，2.5mM dNTP 1.2μl，4个引物浓度均为50pmol/μl各0.12μl，5U/μl Takara Taq HS 0.08μl，100ng/μl模板DNA0.5μl。扩增程序为94℃5min；94℃30s、58℃30s、72℃1min，30个循环；72℃5min。水稻雌性核不育基因FST野生型(+/+)的PCR产物大小为395bp及663bp两条条带，突变型(-/-) 的PCR产物大小为298bp及655bp两条条带，杂合型(+/-)的PCR产物大小为298bp、395 bp及663bp三条条带或298bp、395bp及655bp三条条带。

Gf1的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

Gr1的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

Jf1的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

Jr1的序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

昆明温室：云南省昆明市云南农业大学稻作研究所的温室。

元阳早稻季节：云南省元阳县的早稻季节，余类推。

实施例1水稻雌性核不育恢复系“DW8S0373FS”的选育

1.1水稻雌性核不育恢复系“DW8S0373FS”的选育程序图如下图7所示。

1.2选育程序具体步骤如下：

①2011年在昆明温室，选用韩国粳稻品种“CH8”作母本，籼粳中间型品种“Gayabyeo”单株作父本杂交，获得单交子代F₁。

②2012年在昆明温室种植单交子代F₁(+/+)作为母本，以雌性核不育突变体植株G39 (-/-)作为父本进行杂交，获得三交子代F₁(+/-)。

③2013年在昆明温室种植三交子代F₁，自交结实后混收种子(F₂)。

④2014年在元阳早稻季节，种植F₂分离群体，根据植株株形、株高、穗型、结实率表型表现，选择20个正常结实的优良单株，单株收获种子(F₃)并编号。

⑤2014年在元阳晚稻季节，按株系种植40-50株的F₃株系群体；根据雌性核不育fst性状表型(即稻穗完全不结实)和植株表型，淘汰fst性状不分离的F₃株系群体，从fst性状发生分离的各个F₃株系群体，即分离出现有完全不结实植株(-/-)的各个F₃株系分离群体中，均选择6株正常结实的优良单株(+/+或+/-)，进一步结合所述的水稻雌性核不育基因FST 分子鉴定的方法(MAS)，筛选获得雌性核不育基因FST杂合型(+/-)优良单株，来提高选育的效率，节省人工选育的成本。筛选获得的FST杂合型(+/-)优良单株自交结实后，单株收获种子(F₄)并编号。

⑥2015年元阳早稻季节，按株系种植40-50株的F₄株系群体，同样地，根据表型，从F₄各株系分离群体中都分别选择6个正常结实的优良单株，继续按株系种植各40-50株的株系群体并自交加代。自交加代过程中，根据植株表型选择正常结实的优良单株自交加代即可，淘汰fst性状不分离的株系群体，直至2018年元阳早稻季节获得fst性状分离的F₁₀株系分离群体。

其中F₁₀株系分离群体中雌性核不育系(-/-)及其近等位基因系(+/+或+/-)的遗传性状稳定，且与亲本植株G39(-/-)相比，株高适中，综合农艺性状优良，配合力更好，组合优势更明显，更适合于机械化生产应用。所获得的F₁₀株系分离群体中雌性核不育系即为育成的水稻雌性核不育恢复系，即“DW8S0373FS”。

⑦水稻雌性核不育恢复系“DW8S0373FS”的田间农艺性状进行鉴定表明：

该雌性核不育恢复系群体整齐一致，雌不育性稳定，株高适中，分蘖力强(图2中a)。元阳种植，在水稻成熟期随机选取3株测量株高，每株测量3个穗子，植株平均高度92.67cm，穗平均长度24.67cm，单穗平均粒数为174.00，单株平均有效穗数12.67(图3中a)。在水稻开花期，随机选取三株，每株取主穗上3朵部位一致的未开颖花于卡诺氏固定液固定两小时后，置换75％乙醇保存于4℃。观察时用1％I₂-KI溶液染色后，在光学显微镜下观察拍照，统计花粉育性。结果表明，植株雄性器官发育正常、花药肥大、呈嫩黄色、开裂散粉正常、花粉量充足，花粉可育率平均为96.80％(图4中a)；成熟期稻穗完全不育、天然自交结实率和/或天然异交结实率为0，不育株率及不育度均达100％(图5)；同样，随机选取组配F₁群体的3株植株，每株统计3个穗子的结实率取平均值。结果表明，“DW8S0373FS”雌性核不育恢复系与“H479A”组配，其杂种F₁植株结实率为87.00％(表1)，结实正常，优势明显(图6中a)。

实施例2水稻雌性核不育恢复系“云岭318FS”的选育

2.1水稻雌性核不育恢复系“云岭318FS”的选育程序图如图8所示。

2.2选育程序具体步骤如下：

①2011年在昆明温室，选用韩国粳稻品种“CH8”作母本，籼稻“Taebaegbyeo”单株作父本杂交，获得单交子代F₁。

②2012年在昆明温室种植单交子代F₁(+/+)作为母本，以雌性核不育突变体植株G39 (-/-)作为父本进行杂交，获得三交子代F₁(+/-)。

③2013年在昆明温室种植三交子代F₁作为母本，再用雌性核不育品系AWG(-/-)作为父本进行杂交，获得四交子代F₁(+/-)。

④2014年在昆明温室种植四交子代F₁，自交结实后混收种子(F₂)。

⑤2015年在元阳早稻季节，种植F₂分离群体，根据植株株形、株高、穗型、结实率表型表现，选择25个正常结实的优良单株，单株收获种子(F₃)并编号。

⑥2015年在元阳晚稻季节，按株系种植40-50株的F₃株系群体；根据雌性核不育fst性状表型(即稻穗完全不结实)，淘汰fst性状不分离的F₃株系群体；根据植株株形、株高、穗型、结实率表型表现，从fst性状发生分离的各个F₃株系群体，即分离出现有完全不结实植株(-/-)的各个F₃株系分离群体中，均选择6株正常结实的优良单株(+/+或+/-)，单株收获种子(F₄)并编号。

⑦2016年元阳早稻季节，同样按株系种植40-50株的F₄株系群体，淘汰fst性状不分离的F₃株系群体，并从fst性状发生分离的各个F₄株系群体中都选择6个正常结实的优良单株，继续按株系种植各40-50株自交加代，直至2019年元阳早稻季节获得fst性状分离的F₁₀株系分离群体。

其中F₁₀株系分离群体中雌性核不育系(-/-)及其近等位基因系(+/+或+/-)的遗传性状稳定，且与亲本植株G39(-/-)和AWG(-/-)相比，株高适中，综合农艺性状优良，配合力更好，组合优势更明显，更适合于机械化生产应用。所获得的F₁₀株系分离群体中的雌性核不育系即为育成的水稻雌性核不育恢复系，即“云岭318FS”。

⑧水稻雌性核不育恢复系“云岭318FS”的田间农艺性状进行鉴定表明：

该雌性核不育恢复系群体整齐一致，雌不育性稳定，再生习性强，株高适中，分蘖力强 (图2中b)。元阳种植植株平均高度92.33cm，穗平均长度23.77cm，单穗平均粒数178.00，单株平均有效穗数13.67(图3中b)。开花期所有植株雄性器官发育正常、花药肥大、呈嫩黄色、开裂散粉正常、花粉量充足，花粉可育率平均为98.13±0.47％(图4中b)；成熟期稻穗完全不育、天然自交/异交结实率为0，不育株率及不育度均达100％(图5)，花期6-12天；与“明S”组配，杂种F₁结实率为85.32％(表1)，结实正常优势明显(图6中b)。

实施例3水稻雌性核不育恢复系“云岭319FS”的选育

3.1水稻雌性核不育恢复系“云岭319FS”的选育程序图如图9所示。

3.2选育程序具体步骤如下：

①2011年在昆明温室，选用韩国粳稻“CH8”作母本，籼稻“M23”单株作父本杂交，获得单交子代F₁。

②2012年在昆明温室种植单交子代F₁(+/+)作为母本，以雌性核不育突变体植株G39 (-/-)作为父本进行杂交，获得三交子代F₁(+/-)。

③2013年在昆明温室种植三交子代F₁作为母本，再用雌性核不育品系NWG(-/-)作为父本进行杂交，获得四交子代F₁(+/-)。

④2014年在昆明温室种植四交子代F₁，自交结实后混收种子(F₂)。

⑤2015年在元阳早稻季节，种植F₂分离群体，根据植株株形、株高、穗型、结实率表型表现，选择30个正常结实的优良单株，单株收获种子(F₃)并编号。

⑥2015年在元阳晚稻季节，按株系种植40-50株的F₃株系群体，淘汰fst性状不分离的 F₃株系群体，从fst性状发生分离的各个F₃株系群体，即分离出现有完全不结实植株(-/-) 的各个F₃株系分离群体中，利用所述的分子标记辅助选择(MAS)筛选获得雌性核不育基因 FST杂合型(+/-)的6个正常结实的优良单株，单株收获种子(F₄)并编号。

⑦2016年元阳早稻季节，继续按株系种植40-50株的F₄株系分离群体，从fst性状分离的各个F₄株系群体中继续利用所述的水稻雌性核不育基因FST分子鉴定的方法(MAS)筛选获得雌性核不育基因FST杂合型(+/-)的6个正常结实的优良单株，继续按株系种植各40-50 株自交加代，直至2019年元阳早稻季节获得fst性状分离的F₁₀株系分离群体。

其中F₁₀株系分离群体中的雌性核不育系(-/-)及其近等位基因系(+/+或+/-)的遗传性状稳定，且与亲本植株G39和NWG相比，株高适中，综合农艺性状优良，配合力更好，组合优势更明显，更适合于机械化生产应用。所获得的F₁₀株系分离群体中的雌性核不育系即为育成的水稻雌性核不育恢复系，即“云岭319FS”。

⑧水稻雌性核不育恢复系“云岭319FS”的田间农艺性状进行鉴定表明：

该雌性核不育恢复系群体整齐一致，雌不育性稳定，再生习性强，株高适中，分蘖力强 (图2中c)。元阳种植植株平均高度88.67cm，穗平均长度23.23cm，单穗平均粒数145.33，单株平均有效穗数10.33(图3中c)。开花期所有植株雄性器官发育正常、花药肥大、呈嫩黄色、开裂散粉正常、花粉量充足，花粉可育率平均为98.50％(图4中c)；成熟期稻穗完全不育、天然自交/异交结实率为0，不育株率及不育度均达100％(图5)，花期6-10天；与“圳18A”组配，杂种F₁结实率为82.33％(表1)，结实正常优势明显(图6中c)。

综上，本发明上述实施例提供的这种水稻雌性核不育恢复系选育的方法，其得到的水稻雌性核不育恢复系(DW8S0373FS、云岭318FS、云岭319FS)，雌性100％败育，天然自交和 /或异交结实率为0，雌不育性极其稳定，且植株分蘖能力强，配合力高，田间表现抗稻瘟病和白叶枯病；雄性器官发育正常，花药开裂散粉正常，花粉量充足，花粉可育率大于95％以上，与“两系”或“三系”杂交稻的雄性不育系(T/PGMS,GMS，或CMS)组配，杂种F₁结实正常优势明显，可用于优势组合筛选，并进一步的应用于“FS+MS(FM-line)”杂交水稻制种技术体系的生产实践。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明方法可以有各种更改和变化。凡在本发明的选育思路和原则之内，所进行的任何修改、替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

表1本发明方法选育的水稻雌性核不育恢复系测配杂种F₁结实率统计

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 一种水稻雌性核不育恢复系的选育方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggcaggtga cattcgcggg 20

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggccgagaga aacttagccg aaaact 26

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtagccctc cccgcctc 18

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agctagttct tcatcctttc gcagcaa 27

Claims (3)

1.一种水稻雌性核不育恢复系的选育方法，其特征在于包括以下步骤：

①选用至少1个雌性核不育基因型为隐性纯合(-/-)的水稻品种或品系作为雌性核不育基因fst供体，与不同遗传背景的正常可育的水稻品种或品系(+/+)进行聚合杂交，获得雌性核不育基因杂合型(+/-)的多交子代F₁；雌性核不育基因型为隐性纯合(-/-)的水稻品种或品系为G39、AWG、NWG 中的一种或两种以上；雌性核不育基因fst是一个B_sister类群MADS-box转录因子编码的细胞核隐性突变型基因，全称为female-sterile，简写为fst；

②对步骤①中获得的多交子代F₁植株自交结实后的种子混收后，种植F₂分离群体，并从F₂分离群体中选择20-30个正常结实的优良单株，单株收种后，按株系种植40-50株的F₃株系群体，自交加代；

③从步骤②获得的F₃株系群体中，淘汰fst性状不分离的F₃株系群体，从fst性状发生分离的各个F₃株系群体中，根据表型选择不少于6株正常结实的优良单株，和/或用水稻雌性核不育基因FST分子鉴定的方法筛选获得所选F₃选单株中的雌性核不育基因FST杂合型(+/-)优良单株；F₃中选单株分单株收种后，继续按株系种植40-50株的F₄株系群体；所述水稻雌性核不育基因FST分子鉴定的具体方法为：取待鉴定水稻材料叶片，提取水稻总DNA，利用雌性核不育基因FST的四条特异性引物：Gf1、Gr1、Jf1和Jr1对水稻叶片总DNA进行PCR扩增，水稻雌性核不育基因FST野生型(+/+)的PCR产物大小为395bp及663bp两条条带，突变型(-/-)的PCR产物大小为298bp及655bp两条条带，杂合型(+/-)的PCR产物大小为298bp、395bp及663bp三条条带或298bp、395bp及655bp三条条带；Gf1的序列如SEQ ID NO：1所示；Gr1的序列如SEQ ID NO：2所示；Jf1的序列如SEQ ID NO：3所示；Jr1的序列如SEQ ID NO：4所示；

④按步骤③继续选择自交加代并筛选获得高世代雌性核不育基因杂合型(+/-)的株系，直至获得分离群体中遗传性状稳定、综合农艺性状优良的雌性核不育系(-/-)及可正常结实的近等位基因系；所获得的遗传性状稳定、综合农艺性状优良的雌性核不育系即为育成的水稻雌性核不育恢复系。

2.根据权利要求1所述的一种水稻雌性核不育恢复系的选育方法，其特征在于，步骤①中所述的雌性核不育基因型为隐性纯合(-/-)的水稻品种或品系是植株表现为稻穗完全不结实，雌性败育率为100％，雌不育性稳定，天然自交结实率和/或异交结实率为0，花粉育性正常。

3.权利要求1或2所述的选育方法在水稻品种的培育或改良、或杂交稻制种中的应用。

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