CN114591967B - 玉米tcp基因在杂交育种中的应用 - Google Patents

玉米tcp基因在杂交育种中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了两种玉米TCP基因在杂交育种中的应用。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功将ZmTCP11和ZmTCP15基因进行定点编辑，获得在靶位点突变的多个纯合株系。通过与野生型以及其单突变株系进行表型比较，发现仅双基因功能缺失突变体植株表现出雄穗出现雌性结构表型，后期继续发育形成额外的籽粒，而其他基本农艺性状不受影响，不会减少最终产量。ZmTCP11和ZmTCP15双基因功能缺失突变体可以在杂交育种过程中节约母本材料繁育的步骤，将杂交前去雄的步骤改成给雄穗套袋，即可收回纯合母本种子，提高生产效率，此外该双基因功能缺失突变体还是研究玉米雄穗性别分化分子调控机制的优良突变体。

Description

玉米TCP基因在杂交育种中的应用
技术领域
本发明涉及玉米杂交育种技术领域，更具体地，涉及两个玉米TCP基因ZmTCP11和ZmTCP15在玉米杂交育种中的应用。
背景技术
玉米(拉丁学名：Zea mays L.)是禾本科玉蜀黍属一年生草本植物，玉米是一年生雌雄同株异花授粉植物，植株高大，茎强壮，是重要的粮食作物和饲料作物，也是全世界总产量最高的农作物，其种植面积和总产量仅次于水稻和小麦。
杂交育种是将不同品种作为父母本杂交，形成不同的遗传多样性组合，再通过筛选获得具有父母本优良性状的新品种的育种方法，在水稻、玉米等谷类作物中应用广泛。玉米是雌雄同株异花植物，异花授粉使得杂交育种在玉米中简单易行、经济，在玉米生产上应用最广。
玉米雄穗花序和雌穗花序的位置不同，顶端的雄穗属于有限分枝的圆锥花序结构，雌穗位处于玉米茎间叶腋部位，是穗柄木质加厚的肉穗花序结构，被包在穗短枝上的苞片中。在杂交育种过程中经常会在母本雄穗散粉前将其去除，避免影响杂交授粉过程，同时还需要对育种中使用的母本材料进行定期繁育，才能继续使用，由此增加杂交育种中的土地资源和人力资源成本。
TCP家族作为一类植物特有的转录因子，广泛参与各类群植物多个阶段的生长发育调控。其中ClassⅡTCP转录因子亚家族在植物的叶片发育、侧枝形成及花发育中发挥核心调控功能。ZmTCP11和ZmTCP15是玉米中两个与高粱增产基因MSD1直接同源的TCP ClassⅡ类基因，目前关于ZmTCP11和ZmTCP15在玉米雄穗性别分化分子调控的作用还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有杂交育种技术中存在的母本材料繁育繁琐的不足，提供ZmTCP11和ZmTCP15基因和/或其双突变在调控玉米雄穗性别决定或培育雄穗雌化的玉米品种中的应用，从而用于杂交育种母本材料繁育中。
本发明的第二个目的在于提供ZmTCP11和ZmTCP15基因和/或其双突变在研究玉米雄穗性别分化中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明利用CRISPR/Cas9转基因编辑技术将玉米Kn5585中与高粱增产基因MSD1直接同源的两个TCP ClassⅡ类基因ZmTCP11和ZmTCP15进行敲除后，观察发现双基因功能缺失突变体植株表现出雄穗雌化结实表型，但是其他的基本农艺性状并没有受到影响。并且ZmTCP11和ZmTCP15两者的单基因功能缺失突变体并没有表现出和野生型(WT)有差异的外在性状表型。通过对大田实验中的ZmTCP11和ZmTCP15两者的单、双基因功能缺失突变体的基本农艺性状进行观察并统计数据，结果显示ZmTCP11和ZmTCP15两者的单、双基因功能缺失突变体的基本农艺性状和野生型并没有显著性差异，表明ZmTCP11和ZmTCP15基因在调控玉米雄穗性别决定中具有重要作用，且对玉米产量影响甚微。因此，获得的ZmTCP11和ZmTCP15双基因功能缺失突变体在制备玉米杂交种中可以拥有更多显著优势，以双突变体作为杂交育种的母本进行制种，一方面在雄穗发育早期将雄穗套袋即可在雄穗上得到母本后代，并高效保证种子纯合度；另一方面雌穗性状不受影响，正常杂交种制种产量不会减少。运用此突变体不需要额外对母本进行繁育，能够有效节省土地人力资源等成本，从而提高生产效率。同时该双突变体也是研究玉米雄穗性别分化分子调控机制的优良突变体，为玉米分子遗传改良育种提供了重要的理论依据。综上所述，本发明对玉米杂交育种以及分子遗传改良育种具有较大的理论和应用前景。
因此本发明请求保护关于ZmTCP11和ZmTCP15基因的以下新用途：
ZmTCP11和ZmTCP15基因和/或其双突变在在调控玉米雄穗性别决定中的应用。
具体地，所述调控玉米雄穗性别决定为控制玉米雄穗雌化。
ZmTCP11和ZmTCP15基因和/或其双突变在培育雄穗雌化结实表型的玉米品种中的应用；再进一利将其用于杂交育种母本材料繁育中。
具体地，所述杂交育种母本材料繁育应用为利用ZmTCP11和ZmTCP15基因双突变体雄穗雌化结实表型，用杂交母本的雄穗制备纯合母本材料，同时雌穗用于杂交且不影响杂交种产量。
ZmTCP11和ZmTCP15基因和/或其双突变在研究玉米雄穗性别分化中的应用。
具体地，所述ZmTCP11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ZmTCP15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
具体地，所述双突变为ZmTCP11和ZmTCP15双基因功能缺失性突变。
具体地，所述ZmTCP11和ZmTCP15基因和/或其双突变为敲除玉米中的ZmTCP11和ZmTCP15基因，得到ZmTCP11和ZmTCP15双突变转基因玉米植株。
优选地，为利用CRISPR/Cas9转基因编辑技术敲除玉米中的ZmTCP11和ZmTCP15基因。
优选地，ZmTCP11基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:3～4所示，ZmTCP15基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:5～6所示。
进一优选地，所述ZmTCP11和ZmTCP15双突变转基因玉米植株中，突变后的ZmTCP11的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，突变后的ZmTCP15的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了ZmTCP11和ZmTCP15基因和/或其双突变在调控玉米雄穗性别决定或培育雄穗雌化的玉米品种中的应用。本发明利用CRISPR/Cas9转基因编辑技术将玉米ZmTCP11和ZmTCP15进行敲除后，观察发现双基因功能缺失突变体植株表现出雄穗雌化结实表型，但是其他的基本农艺性状并没有受到影响，由此获得的ZmTCP11和ZmTCP15双基因功能缺失突变体可以作为杂交育种中的母本，雄穗用于制备母本纯合材料，雌穗用于杂交制种且不影响产量。并且ZmTCP11和ZmTCP15两者的单基因功能缺失突变体并没有表现出和野生型(WT)有差异的外在性状表型，因此该双基因功能缺失突变体也是研究玉米雄穗性别分化分子调控机制的优良突变体，它可以更好专注于雄穗小花性别演化过程的探究。
附图说明
图1为玉米TCP ClassⅡ类基因系统发育树。
图2为ZmTCP11和ZmTCP15转基因植株的基因型鉴定。突变体基因结构，蓝色代表敲除靶位点，红色代表突变位点。
图3为tcp11-2、tcp15-4、tcp15-8和tcp11-1 tcp15-4突变体表型。玉米整株(比例尺:30cm)、雄穗和雌穗(比例尺:5cm)图片。
图4为tcp11-1 tcp15-4双突变体雄穗表型。
图5为WT、tcp11-2、tcp15-4、tcp15-8和tcp11-1 tcp15-4基本农艺性状统计结果。株高、穗位高、雄穗分支数、雌穗长、雌穗宽、穗行数、行粒数以及百粒重。
图6为野生型玉米和tcp11-1 tcp15-4突变体的雄穗小花观察。a.野生型V7早期雄穗小花；b.野生型V8晚期雄穗小穗上位花；c.野生型V11时期雄穗小穗；d.野生型V11时期雄穗上位花；e.野生型V11时期雄穗上位花；f.玉米tcp11-1 tcp15-4突变体V7早期雄穗小花；g.玉米tcp11-1 tcp15-4突变体V8晚期雄穗小穗上位花；h.玉米tcp11-1 tcp15-4突变体V11时期雄穗小穗；i.玉米tcp11-1 tcp15-4突变体V11时期雄穗上位花；j.玉米tcp11-1tcp15-4突变体V11时期雄穗下位花。其中a、f图比例尺＝200μm，b、g图比例尺＝0.5mm，c、d、e、h、i、j图比例尺＝1mm。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 ZmTCP11和ZmTCP15基因的CRISPR/Cas9转基因植株的构建与基因型鉴定
我们首先对玉米TCP ClassⅡ类基因进行分析，并加入部分已报道的拟南芥、水稻和高粱TCP ClassⅡ类基因构建系统发育进化分析(图1)，结果显示玉米中的两个TCPClassⅡ类基因ZmTCP11和ZmTCP15与高粱增产基因MSD1直接同源，所述ZmTCP11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ZmTCP15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
为了获得ZmTCP11和ZmTCP15的功能缺失突变体，我们对这两个基因的结构进行分析，按照CRISPR/Cas9基因敲除系统靶点设计5'-G-(N)19-NGG-3'的标准分别在ZmTCP11和ZmTCP15上各挑选了两段sgRNA序列，其序列如SEQ ID NO:3～6所示：
ZmTCP11 sgRNA：CCACAGCAAGATCCGCACGGCGC(SEQ ID NO:3)；
GACGGACTCGAGGGAGGAGCTGG(SEQ ID NO:4)；
ZmTCP15 sgRNA：CCACAGCAAGATCCGCACGGCGC(SEQ ID NO:5)；
GCCGACGACCGACGGTGGTGAGG(SEQ ID NO:6)；
利用基因工程手段构建ZmTCP11和ZmTCP15的转基因敲除载体，采用农杆菌介导法，以Basta为筛选抗性，用KN5585自交系为转化背景材料进行转基因材料创制，通过Basta抗性筛选出T0代阳性苗并收回T1代玉米转基因种子。
通过对转基因植株的鉴定和分离，找到了ZmTCP11和ZmTCP15的单双基因功能缺失突变体，它们分别是ZmTCP11单突变体：tcp11-2，ZmTCP15单突变体：tcp15-4、tcp15-8及ZmTCP11和ZmTCP15双突变体：tcp11-1 tcp15-4；其具体基因突变类型如图2所示，其中基因突变类型序列为SEQ ID NO:7：tcp11-1；SEQ ID NO:8：tcp11-2；SEQ ID NO:9：tcp15-4；SEQID NO:10：tcp15-8。
实施例2 ZmTCP11和ZmTCP15的单双基因功能缺失突变体的表型观察
在海南三亚和河北廊坊的转基因试验田种植了野生型玉米和分离到的四种ZmTCP11和ZmTCP15的单双基因功能缺失突变体：tcp11-2、tcp15-4、tcp15-8和tcp11-1tcp15-4，通过大田实验对突变体材料与野生型玉米的基本农艺性状进行观察并统计相关数据。
通过观察发现玉米tcp11-1 tcp15-4双基因功能缺失突变体的雄穗上有部分小花的性别分化发生障碍，产生了雌雄同体的双性小花并伸出细长的花柱并且能够结实(图4)。而tcp11-1 tcp15-4突变体除雄穗上有部分小花性别分化障碍，其他基本农艺性状并没有表现出与野生型玉米有显著性差异；在随后的发育过程中，雌化的雄穗继续发育形成额外的籽粒，产生果穗表型。另外三个单基因功能缺失突变体tcp11-2、tcp15-4和tcp15-8的外在性状和野生型玉米也没有显著差异(图3)。数据统计结果也显示这些突变体材料与野生型玉米的基本农艺性状(株高、穗位高、雄穗分支数、雌穗长、雌穗宽、穗行数、行粒数以及百粒重)没有显著性差异(图5)。表明ZmTCP11和ZmTCP15具有特异调控玉米雄穗性别决定的功能，其双突变体雄穗雌化结实且不影响雌穗产量。
实施例3野生型(WT)玉米和tcp11 tcp15突变体的雄穗小花观察
选取具有七片成熟叶(V7)以及十一片成熟叶(V11)两个时期的野生型玉米和tcp11-1tcp15-4突变体的雄穗小穗，利用扫描电镜和体视显微镜对这些小穗进行观察。
结果显示，在V7时期的野生型玉米的雄穗小花(图6a)和tcp11-1tcp15-4突变体的雄穗小花(图6f)在原基的发育上并没有显著性的差异；但是到了V8时期，野生型玉米雄穗小花中的心皮原基开始退化败育(图6b)，而tcp11-1tcp15-4突变体雄穗小穗中上位花的心皮原基得以保留并继续膨大发育(图6g)；到V11时期，野生型玉米雄穗上的小花都发育成为了单性雄花(图6c、d、e)，而tcp11-1tcp15-4突变体的雄穗小穗中上位花中长出了雌性化的心皮结构并伸出了细长的花柱(图6h、i、g)。表明tcp11-1tcp15-4突变体的雄穗小花是在V8-V10性别分化时期中与野生型玉米产生分化差异的。
因此，获得的ZmTCP11和ZmTCP15双基因功能缺失突变体在制备玉米杂交种中可以拥有更多显著优势，以双突变体作为杂交育种的母本进行制种，一方面在雄穗发育早期将雄穗套袋即可在雄穗上得到母本后代，并高效保证种子纯合度；另一方面雌穗性状不受影响，正常杂交种制种产量不会减少。运用此突变体不需要额外对母本进行繁育，能够有效节省土地人力资源等成本，从而提高生产效率，同时该双突变体也是研究玉米雄穗性别分化分子调控机制的优良突变体，为玉米分子遗传改良育种提供了重要的理论依据。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 玉米TCP基因在杂交育种中的应用
<141> 2022-03-02
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 723
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays L.)
<400> 1
atgccgtcga ccgcgatgtc ttgggacggg tacggcgcgc agatcttcct cgccgacatg 60
tcgttccacc accaggatac cctggaggcg gtgttccagc agcctgcaga gacgacgctc 120
ctgcaggcgc cggcggggga gaaggagctg cccagcaacg ggtcgccgcc ggtggtggat 180
gacgccggcg tccaggccgc ggccgtacta cggaagcggc cgttccggac ggatcgccac 240
agcaagatcc gcacggcgca gggcgtccgc gaccgccgga tgcggctctc ggtcggggtc 300
gcgcgagagt tcttcgcgct gcaggaccgc ctcgggttcg acaaggccag caagaccgtg 360
aactggctcc tcgcccagtc caagccggcc atcgaccgcc tcgtcgacgc cgccgaccag 420
gcggctgtag tcacaggagg aggaccgacg ctggtgaagg ggagagggga ggggagcaac 480
tcaagcactt gctgtttgac ggactcgagg gaggagctgg ccacggagaa gggaagaagc 540
agagccggtg acgccggtct tgattggcca ccgcctctta ttgaagaaca cggctgcggc 600
gagctgggat ggatcatgtc ggaggcaaca gcaacgccgg agcaggacgg gctggagtgc 660
tactaccagt attgcctgca gctcgaggag ttgatgagat gcaacggcgg aatgccaagg 720
tga 723
<210> 2
<211> 825
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays L.)
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ctgcaggcgc cggcggggga gaaggagctg cccagcaacg ggtcgccgcc ggtggtggat 180
gacgccggcg tccaggccgc ggccgtacta cggaagcggc cgttccggac ggatcgccac 240
agagccggcc atcgaccgcc tcgtcgacgc cgccgaccag gcggctgtag tcacaggagg 300
aggaccgacg ctggtgaagg ggagagggga ggggagcaac tcaagcactt gctgtttgac 360
ggactcgagg gaggtgacgc cggtcttgat tggccaccgc ctcttattga agaacacggc 420
tgcggcgagc tgggatggat catgtcggag gcaacagcaa cgccggagca ggacgggctg 480
gagtgctact accagtattg cctgcagctc gaggagttga tgagatgcaa cggcggaatg 540
ccaaggtga 549
<210> 9
<211> 684
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays L.)
<400> 9
atgccctcga ccgccgcgat gtcgtcgtct tgggacgggt acggcgggca gatcttcccc 60
gcagacatgt cgtcgttcca ccgccaccag gacaccctgg aggcggtgtt ccaccacccg 120
ccgcctgaga cgacgacgac gacggggctg ctgaggaacg acgggtcatc accggtggtg 180
gacgacggcg gcggccacgc cgcaccgcga aggcggccgt tccggacgga ccgccacaga 240
gccggccatc gaccgcctcg tcgacgccgc cgccgacgcc gacgaccccg cggcagtagc 300
agcctcagga ggccgacgac cgacggtgtg aggggcagag gcgagggcag ctcctcgagc 360
acttgctgct gcttgacgga ctcgagagag gccgccgagg aggcgacggg gaacgggaga 420
agcagaggcg gccctgacga cgggccaccg gcagcgcttc tggaaggaca cggcggctgc 480
ggcgagctgg gctggatcat gtcgggagcg cccacagcag cggtggcaac gacgacgacg 540
acgacgccgc agcagccgga cgggcacgag tactactacc agtattgcct gcagctcgag 600
gagatgatgc gatgcagcaa cgacgaagga gaaacaacgc caggtgattt cttgtatggt 660
atgcagacgc gtgataggtc ttga 684
<210> 10
<211> 745
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays L.)
<400> 10
atgccctcga ccgccgcgat gtcgtcgtct tgggacgggt acggcgggca gatcttcccc 60
gcagacatgt cgtcgttcca ccgccaccag gacaccctgg aggcggtgtt ccaccacccg 120
ccgcctgaga cgacgacgac gacggggctg ctgaggaacg acgggtcatc accggtggtg 180
gacgacggcg gcggccacgc cgcaccgcga aggcggccgt tccggacggc gcagggcgtg 240
cgcgaccgcc tcggcttcga caaggccagc aagacggtga actggctcct cacccagtcc 300
agccggccat cgaccgcctc gtcgacgccg ccgccgccgc cgacgacccc gcggccgtag 360
cagcctcagg aggccgacga ccgacggtgt gaggggcaga ggcgagggca gctcctcgag 420
cacttgctgc tgcttgacgg actcgagaga ggccgccgag gaggcgacgg ggaacgggag 480
aagcagaggc ggccctgacg acgggccacc ggcagcgctt ctggaaggac acggcggctg 540
cggcgagctg ggctggatca tgtcgggagc gcccacagca gcggtggcaa cgacgacgac 600
gacgacgccg cagcagccgg acgggcacga gtactactac cagtattgcc tgcagctcga 660
ggagatgatg cgatgcagca acgacgaagg agaaacaacg ccaggtgatt tcttgtatgg 720
tatgcagacg cgtgataggt cttga 745

Claims (4)

1.ZmTCP11和ZmTCP15基因双突变在培育雄穗雌化结实表型的玉米品种中的应用；所述ZmTCP11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ZmTCP15基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；所述双突变为ZmTCP11和ZmTCP15双基因功能缺失性突变。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，敲除玉米中的ZmTCP11和ZmTCP15基因，得到ZmTCP11和ZmTCP15双突变转基因玉米植株。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，为利用CRISPR/Cas9转基因编辑技术敲除玉米中的ZmTCP11和ZmTCP15基因。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，ZmTCP11基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:3～4所示，ZmTCP15基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:5～6所示。
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