CN105349574A - 抑制玉米ZmDAR1家族基因表达提高玉米籽粒产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制玉米ZmDAR1家族基因表达提高玉米籽粒产量的方法，是利用转基因技术通过过表达突变基因ZmDAR1m抑制玉米ZmDAR1家族基因ZmDAR1功能，采用RNAi技术和转反义基因技术通过转入ZmDAR1反义基因或ZmDAR1RNAi结构或ZmDAR2RNAi结构降低ZmDAR1基因表达水平，获得籽粒产量明显高于未转基因自交系的转基因玉米株系。本发明方法显著提高了玉米植株的丰产性，且对植株形态特征和生育期无显著影响，在玉米育种中具有重要意义和有很好的应用价值。

Description

抑制玉米ZmDAR1家族基因表达提高玉米籽粒产量的方法

技术领域

本发明属于植物生物工程领域，涉及一种提高玉米籽粒产量的方法，尤其涉及一种抑制玉米ZmDAR1家族基因表达提高玉米籽粒产量的方法。

背景技术

玉米是世界上分布最广泛的饲料和粮食作物之一，也是重要的工业原料，总产量居世界第一，种植面积仅次于小麦和水稻而居第三位。提高玉米产量是玉米育种的永恒课题。

生物的表型是由基因型决定的，玉米产量取决于其遗传基础(基因)和环境条件的共同作用。虽然已检测出一些固有产量基因(IntrinsicYieldGenes,IYGs)或QTL，但它们的作用机制知之甚少。在大多数的情况下,人们还不知道这些基因或QTL是怎样促进产量形成的。在模式植物拟南芥研究中，人们发现一些基因的突变或异常表达能够使叶、根等器官变大，从而使生物量增多，展现出似乎有很好的应用前景。而在玉米等作物中，人们更关注的是单位面积的产量提高。若基因的异常表达或突变使植株产生更多和更大的叶片和花器官,同时伴随开花时间大大延迟和生长周期延长，则这些基因在作物育种中应用价值不大。也有一些基因在过量表达或在突变的情况下能够诱导大叶或种子增大，而对植株生育期和抗逆性影响不大，它们有可能在作物育种中有重要价值。由于固有产量基因参与很多其相互关系仍不是很清楚的生理活动，大器官形成是否仅含有更多的细胞或细胞体积也发生增大也需大量的研究，发掘固有产量基因仍是植物生物工程领域中富有挑战的领域。另外，特定基因的生物学功能在很大程度上取决于遗传背景，一个基因的表达变化对复杂性状如器官大小等的影响依赖于个体的基因型。物种不同，同源基因的功能往往有明显差异，特别是基因家族的基因。在模式植物中验证的基因效应往往与遗传距离较远作物中的同源基因的功能有明显不同，因同工基因的数量及分工有差异，基因调控机制不完全相同。

被子植物中，种子大小决定于胚、胚乳和母体组织的协调生长，几个在母体行使作用控制种子大小的因子，如AUXINRESPONSEFACTOR2、APETALA2、KLUH和DA1已被鉴定出来，然而控制种子大小的遗传学和分子生物学机制知之甚少。

DA1基因首先是由李云海等(2008)在拟南芥中发现的。拟南芥中DA1基因家族控制种子和器官的最终大小。DA1基因家族是植物特异的，在拟南芥中有7个蛋白的氨基酸序列与DA1蛋白氨基酸序列相似，它们被命名为DAR蛋白，其中有4个蛋白的基因在5号染色体上集簇。DA1等位基因的功能缺失没有产生明显表型，推测DA1有可能与DAR蛋白共同发挥作用。推测DA1与DAR蛋白共同发挥作用来控制器官发育。

DA1基因产物编码一种包含532个氨基酸的泛素受体，该泛素受体包含两个UIM结构域(ubiquitininiteractionmotifs)和一个能够与锌指蛋白结合的LIM(Lin-11,Isl-1,Mec-3三种转录因子首字母的缩写)结构域。此蛋白在植物中广泛存在，在动物中尚未发现同源蛋白。DA1能够通过限制细胞增殖进而调控植物种子和器官大小。DA1受ABA诱导，而其他激素如茉莉酸、生长素，细胞分裂素等不影响其表达。当DA1氨基酸序列358位上的精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)时，突变蛋白可能影响DA1和DAR1对底物的结合，进而以剂量依赖方式干扰DA1与DAR蛋白的功能，进而产生da1-1表型，该突变体植株的种子、器官体积相对于野生型大幅增加，其植株整体生物量也有所增加。Garcia(2005)和Schruff(2006)的研究表明，da1-1突变体中种子增大的现象是由于胚珠中珠被增大引起的。dal-l植株花变大，且包含更多花瓣和心皮，荚果变短，皱褶呈扁平状，叶片圆厚，莲秆增粗。并且，植株整体生物量亦有所增加。而不管花粉供体的基因型如何，dal-1产生的种子较野生型种子要大；而当突变体花粉授粉到野生型植株后所产生的种子变化不明显，提示DA1能通过母本来控制种子的生物量。拟南芥DA1通过限制细胞增生时期决定种子和器官的最终大小。da1-1编码的突变蛋白对DA1和一个DA1-related(DAR)蛋白有负的作用，过表达da1-1cDNA相对于野生型强烈地增加了种子和器官大小。

拟南芥中还存在另一个能够控制种子和器官大小的基因DA2，其产物具有E3泛素连接酶活性，能够与DA1协同作用，共同调控细胞分裂。DA2编码具有E3泛素连接酶活性的RING-type蛋白，后者控制发育种子的母体组织珠被的细胞增生。DA2突变体da2-1产生大种子，而野生型中过表达DA2降低种子大小。过表达水稻中DA2的同源基因GRAINWIDTHANDWEIGHT2，限制了拟南芥种子生长。泛素受体DA1通过和E3泛素连接酶DA2和DA1的增强子1(EOD1)/BIGBROTHER协同作用限制拟南芥种子生长。遗传学分析表明，DA2在功能上与DA1协同调节种子大小，且不依赖于EOD1。DA2在体外和体内均与DA1相互作用。DA1与DA1增强子1(EOD1)/BIGBROTHER，一个E3泛素连接酶协同作用调节拟南芥种子大小。

2014年李云海等报道，拟南芥中泛素受体DA1通过特异的调节泛素特异的蛋白酶UBP15/SOD2的稳定性来调节种子和器官的大小。由SUPPRESSOR2OFDA1(SOD2)编码的UBIQUITIN-SPECIFICPROTEASE15(UBP15)通过促进母体器官胚珠的珠被和正发育种子的细胞增殖来调节细胞分裂。sod2/ubp15突变体形成了小籽粒，在野生型中过表达UBP15增加了种子大小。遗传学分析显示，UBP15和DA1在影响种子大小方面是在同一途径中行使拮抗功能的，且不依赖于DA2和EOD1。无论在体内还是在体外，DA1与UBP15的物理作用调节UBP15的稳定性。因此，这些发现建立了一个通过四种泛素关联蛋白DA1、DA2、EOD1和UBP15来调节种子大小的遗传和分子网络，提示它们是增加作物籽粒大小的靶点。

2015年，李云海等报道了拟南芥泛素受体DA1、DAR1和DAR2通过调节TCP14/15的稳定性冗余调节着细胞内加倍。细胞内加倍对应于细胞分化的起始，对应于细胞和器官大小，但它们之间的关系知之甚少。DA1和它密切的家庭成员DAR1和DAR2在叶片发育过程中是细胞内加倍所需的，但它们的作用呈现出冗余。DA1，DAR1、DAR2同转录因子TCP14和TCP15的直接作用调节细胞周期基因的表达，抑制了细胞内加倍。在拟南芥中DA1，DAR1、DAR2调节TCP14和TCP15蛋白的稳定性。遗传学分析表明DA1，DAR1和DAR2与TCP14和TCP15在同一通路上起作用，共同调控细胞内加倍过程。

2015年，He等报道在豆类植物进化中DA1-like家族基因序列和表达水平发生变化，提示在植株适应分布中有一定作用。栽培大豆被认为是从一年生的野生大豆驯化产生，比较栽培大豆和野生大豆的DA1-like基因的序列和表达水平可以明确DA1-like基因是否参与了豆科植物的进化。结果表明在栽培大豆和野生大豆之间，DA1-like基因之间对应序列的一致性是相当高的，而在同一物种中横向同源基因之间表现出相对较高的多样性。在发育和对非生物胁迫响应中，栽培大豆和野生大豆的DA1-like基因表达变化在不同种的同源基因之间的差异程度显著大于同一物种中的同源基因之间。过表达野生种DA1基因不影响种子大小，而过表达DA1基因减轻了转基因拟南芥种子萌发对盐胁迫的敏感性。DA1-like家族的大多数基因能够提高转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。这些结果提示豆类植物DA1-like基因的表达多样化与豆类植物的适应性变化相关联，植物特异的DA1家族基因表达增强会许在大豆对复杂环境的适应起作用。该工作表明，DA1-like家族基因具有功能多样性。

吴忠义课题组人工合成了与拟南芥DA1同源的基因玉米ZmDA1，同时引入da1-1(DA1R358K)的突变碱基，产生Zmda1-1。将后者重组到植物表达载体中通过花粉管通道法转入玉米，获得了转基因低水平表达的转基因植株。与转空载体的转化植株相比，转Zmda1-1基因植株种子质量平均增加了33.6％，收获产量增加了23.6％～114.1％(Wangetal.,2012)。

综合本领域的研究现状，可得出在不同物种中DA1-like家族基因的功能可能有明显不同；除拟南芥外，DA1家族基因的功能知之不多，更不清楚ZmDAR1基因ZmDAR2基因和ZmDA1基因在玉米中的确切作用，而通过抑制玉米ZmDAR1家族基因表达提高玉米籽粒产量的方法未见报道。

发明内容

针对现有技术，本发明的目的是提供一种通过抑制玉米ZmDAR1家族基因表达提高玉米籽粒产量的方法。

本发明所述抑制玉米ZmDAR1家族基因表达提高玉米籽粒产量的方法，其特征在于：利用转基因技术通过过表达突变基因ZmDAR1m抑制玉米ZmDAR1家族基因ZmDAR1功能，采用RNAi技术和转反义基因技术通过转入ZmDAR1反义基因或ZmDAR1RNAi结构或ZmDAR2RNAi降低ZmDAR1基因表达水平，获得籽粒产量明显高于未转基因自交系的转基因玉米株系，实现提高玉米籽粒产量；其中，所述玉米ZmDAR1家族基因ZmDAR1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示，所述突变基因ZmDAR1m为第322氨基酸由精氨酸变为赖氨酸的ZmDAR1突变蛋白的基因，该基因编码的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，所述ZmDAR1RNAi结构由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列5‵端376个核苷酸片段构建而成。

申请人通过玉米基因组序列分析发现：在玉米基因组中存在着DA1-like家族基因，其中GRMZM2G017845为AtDA1的同源基因，位于玉米Chr6:52,741,517-52,749,994。其cDNA全长2883bp，编码509个氨基酸，多肽链333位为精氨酸(R)，氨基酸相似性为73％。对其进行保守结构域分析，得出与拟南芥DA1相似性高，同样包含2个UIM结构域和LIM结构域，命名为ZmDA1基因。在玉米基因组中，还存在6个DAR(DA1related)基因：GRMZM2G099328(chr1:167,000,860-167,006,501)、GRMZM2G009438(Chr4:192,646,789-192,651,389)、GRMZM2G151934(chr9:140,212,757-140,217,688)、GRMZM2G342105(Chr1:253,767,677-253,777,541)、GRMZM2G160198(Chr1:39,036,064-39,039,903)、GRMZM5G869767(Chr1:253255499-253259969)。其中位于1号染色体上的GRMZM2G099328被命名为ZmDAR1，其cDNA全长2109bp，编码504个氨基酸，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示，在323位存在保守的精氨酸，与拟南芥DAR1相似性为64％。位于4号染色体的GRMZM2G009438被命名为ZmDAR2，其cDNA全长1864bp，编码364个氨基酸，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，在217位存在保守的精氨酸，而拟南芥DAR2多肽长达547个氨基酸。

ZmDA1基因在玉米萌发种子、茎端、幼穗和花药中表达丰度高，在节居间分生组织区和幼叶及叶尖、正发育的籽粒中也有较高的表达丰度。ZmDAR1基因在玉米授粉后10天到20天的籽粒中表达强度最高，在幼叶及叶尖、花药和胚乳表达丰度较高，在茎尖、胚根、节居间分生组织区、幼嫩雄穗和正发育的籽粒中表达丰度明显低于ZmDA1基因的。即表达谱与ZmDAR1基因的有明显不同，很可能在玉米籽粒发育中起重要作用。ZmDAR2在玉米萌发种子、茎端、幼穗和花药、正发育的籽粒和胚中表达丰度高，在节居间分生组织区、幼叶及叶尖也表达丰度较高。即它的表达谱也与前2个基因明显不同。由于它们均在迅速增殖的组织区表达强度高，推测这3个基因均参与细胞的增殖调控，但生物学功能上有差别。

本发明中，建立高质量的玉米cDNA文库，从中克隆出ZmDA1、ZmDAR1和ZmDAR2基因，通过定点突变及重组，产生分别与ZmDA1、ZmDAR1和ZmDAR2对应的突变基因ZmDA1m(333K)、ZmDAR1m(322K)、ZmDAR2m(217K)。即参考拟南芥中研究结果，通过设计引物引入突变位点，在玉米ZmDA1基因CDS区998bp处、ZmDAR1基因CDS区965bp处和ZmDAR2基因CDS区653bp处，分别引入G→A的单碱基突变，从而使多肽链该位的精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)。突变后的序列采用常规技术连接入植物表达载体中，用于玉米骨干自交系细胞的遗传转化。

本发明中，所述的GRMZM2G017845基因共包括11个外显子，10个内含子，约8477bp长。所述的ZmDA1m是将GRMZM2G017845基因的cDNA开放阅读框第998个碱基由G变为A，使得编码的多肽链第333位氨基酸由精氨酸(R)变成赖氨酸(K)，即得突变基因为ZmDA1m。

所述的GRMZM2G099328基因也包括11个外显子，10个内含子，约5641bp长。所述的ZmDAR1m是将GRMZM2G099328基因的cDNA开放阅读框第965位碱基由G变为A，使得第323位氨基酸由精氨酸(R)变成赖氨酸(K)，即得突变基因为ZmDAR1m。

所述的GRMZM2G009438基因共包括10个外显子，9个内含子，约4.85kb,编码的多肽链为364个氨基酸。所述的ZmDAR2m是将GRMZM2G009438基因的cDNA开放阅读框第653位碱基由G变为A，使得第217位氨基酸由精氨酸(R)变成赖氨酸(K)，即得突变基因为ZmDAR2m。

本发明中，植物转化载体pB7WG2.0-Pubi::ZmDA1m-PCaMV35S::ba和pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR2m-PCaMV35S::bar，分别被导入到根瘤农杆菌LBA4404或AGL1菌株中，用于玉米遗传转化。

本发明中，植物转化载体pB7WG2.0-Pubi::ZmDA1m-PCaMV35S::bar、pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR1m-PCaMV35S::bar和pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR2m-PCaMV35S::bar构建时，所用质粒有：pT-easy-Blunt、pB7WG2.0-Ubi-MCS-TCaMV35S、pB7WG2.0-PCaMV35S::bar-Tnos。首先采用PCR技术从cDNA文库玉米中克隆出ZmDA1/ZmDAR1/ZmDAR2基因，分别重组到pT-easy-Blunt载体中测序验证，再通过PCR方法引入单碱基突变，产生ZmDA1m基因、ZmDAR1m基因和ZmDAR2m基因，通过重组反应产生pT-easy-ZmDA1m、pT-easy-ZmDAR1m、pT-easy-ZmDAR1m。以下以ZmDAR1m为例简述转化载体构建过程。

将pT-easy-ZmDAR1m中的ZmDAR1m片段用限制酶切下后重组到Gateway系统中的入门载体pENTR11中，产生pENTRY11-ZmDAR1m。后者与本实验室构建的目的载体pB7WG2.0-Ubi-MCS-TCaMV35S进行LR反应产生pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR1m。然后将Pubi::ZmDAR1m片段采用PCR方法扩增出，重组到pENTRY11中，产生pENTRY11-Pubi::ZmDAR1m。后者和pB7WG2.0-PCaMV35S::bar-Tons通过LR反应产生转化载体pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR1m-PCaMV35S::bar。

pB7WG2.0-PCaMV35S::bar-Tnos质粒为本实验室改造过的Gateway系统中的目的载体。

其中：

Pubi启动子2020bp，来自玉米，负责启动ZmDAR1m基因转录；

attB1来自大肠杆菌λ噬菌体的定点重组位点，88bp；

attB3来自大肠杆菌λ噬菌体的定点重组位点，89bp；

目的基因ZmDAR1m，全长1515bp，编码504个氨基酸，来自玉米；

attB2来自大肠杆菌λ噬菌体的定点重组位点，76bp；

TCaMV35S，35SRNA基因转录终止区，来自花椰菜花叶病毒，长203bp，负责终止目的基因ZmDAR1m的表达；

Tnos为根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区胭脂碱合成酶基因终止子,长326bp，负责终止bar基因表达；

PCaMV35S为35SRNA基因启动子(增强型)，组成型启动子，来自花椰菜花叶病毒，长781bp，负责启动bar基因表达；

bar基因来自可变盐单胞菌(Halomonasvariabilis)，长552bp，赋予转基因植株抗除草剂草丁膦特性。

将所述的植物表达载体进行转化入大肠杆菌后挑单克隆振荡培养，提取质粒进行酶切鉴定和测序，结构及序列正确的质粒用于转化农杆菌。

本发明中，在抑制ZmDAR家族基因表达方法中，还采用RNAi方式抑制ZmDAR家族基因的表达。RNAi是指通过反义链RNA与正链RNA形成双链结构在特异性酶作用下产生21-24bp的小RNA分子，后者促进靶基因表达产物降解或抑制转录。可通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA)诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。本工作以ZmDA1、ZmDAR1和ZmDAR2基因分别为模板进行PCR扩增，产生基因特征性片段，以植物表达载体pFGC5941为受体构建RNAi结构，产生转化载体pFGC5941-ZmDA1RNAi、pFGC5941-ZmDAR1RNAi和pFGC5941-ZmDAR2RNAi。

在ZmDA1RNAi结构构建中，设计引物扩增其开放读码框的5‵段的407bp片段。

在ZmDAR1RNAi结构构建中，设计引物扩增其开放读码框的5‵段的376bp片段。

在ZmDAR2RNAi结构构建中，设计引物扩增其开放读码框的3‵段的476bp片段。

质粒pFGC5941含有CHSA内含子序列，在该内含子序列两侧分别有限制酶酶切位点，通过连接反应插入ZmDA1片段或ZmDAR1片段或ZmDAR2片段，且插入片段在两侧的连接方向相反，使转录产物形成颈环结构。即插入片段的互补碱基形成颈结构，而CHSA内含子形成单链环。用于构建的ZmDA1干扰结构的臂序列长407bp，产生质粒pFGC5941-ZmDA1RNAi。用于构建的ZmDAR1干扰结构的臂序列长376bp，产生质粒pFGC5941-ZmDAR1RNAi。用于构建的ZmDAR2干扰结构的臂序列长467bp，产生质粒pFGC5941-ZmDAR2RNAi。

质粒pFGC5941携带“PCaMV35S::bar-TCaMV35S”融合基因，即带有植物细胞除草剂草丁膦抗性筛选基因。将这些重组的转化质粒分别导入到根瘤农杆菌LBA4404或AGL1菌株中，用于玉米遗传转化。

本发明中，干扰结构及转化载体的构建过程为：首先，依据靶基因的序列分析，选出干扰效果可能较好且特异性强的靶序列片段进行克隆，并重组于pT-easy-Blunt质粒上，用于干扰结构的构建。然后用限制酶XhoI切下靶序列片段，插入到用限制酶XhoI切开的质粒pFGC5941，插入到CHSA内含子序列的一侧，产生质粒pFGC5941-靶序列片段。后者再用限制酶XbaI和BamHI双酶切开CHSA内含子序列的另一侧，切口一侧为XbaI粘性末端，另一侧为BamHI粘性末端，即成为载体；同时用XbaI和BamHI酶切pT-easy-靶序列片段，回收靶序列片段。然后将载体与回收片段连接，产生含有RNAi结构的质粒pFGC5941-ZmDAR1RNAi或pFGC5941-ZmDA1RNAi或pFGC5941-ZmDAR2RNAi。

本发明中，玉米遗传转化采用农杆菌介导法转化玉米无菌苗茎尖-除草剂草丁膦筛选的方案。具体步骤如下：

1)受体系统的建立以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、昌7-2、6WC、DH4866等。种子用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10～15分钟，然后用无菌水洗涤3--5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量(30～40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23～30℃)下1～2天。萌动(露白)后种子放在MS培养基上于黑暗条件下继续萌发。待胚芽伸长止3～4厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥，用于农杆菌介导的玉米遗传转化。

2)农杆菌培养及活化

将带有双元载体(Mini-Ti质粒pB7WG2.0-Pubi::ZmDA1m-PCaMV35S::bar、或pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR1m-PCaMV35S::bar或pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR2m-PCaMV35S::bar、或pFGC5941-ZmDA1RNAi或pFGC5941-ZmDAR1RNAi、或pFGC5941-ZmDAR2RNAi，均带有除草剂草丁膦抗性基因bar)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100μmol/l乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。

3)玉米无菌苗转化

(1)将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0.5×10⁵Pa大气压下处理8-12分钟。

(2)浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在改良MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。

(3)将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。

4)转化植株筛选与定植

转化植株长出3片叶后，添加0.1-0.2％Tween-20的0.9％草丁膦水溶液，喷洒12天后受体自交系(对照)小苗明显受害，20天后死亡率在90-95％。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。

本发明中，转基因植株后代分析逐代进行。

T1代植株长到3叶期用0.1-0.2％Tween-20的1.2％草丁膦的水溶液，观察统计抗性和敏感性个体比例；采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。存活植株移栽到大田，套袋自交。

转基因植株的PCR检测PCaMV35S::bar基因的引物为：

PCaMV35S::bar,F:TGACGCACAATCCCACTATCC

PCaMV35S::bar,R:AACCCACGTCATGCCAGTTCC

PCR扩增体系：10×buffer2.5μL，Mg²⁺1.2μL，基因组DNA1μL，引物各0.5μL(浓度为10μmol/l)，10mMdNTP0.5μL，rTaq0.125μL，ddH₂O18.375μL。PCR扩增程序：94℃5min；94℃1min，61℃1min，72℃50s，38cycles；72℃7min。

检测ZmDA家族转基因的引物：F-324：5’-TATGTATCATCCGCCTCG-3’，R-621：5’-GGTGAAACTGCTCCTTGTA-3’。PCR反应体系为：50μl体系中，包括模板1μl，10×PCRreactionbuffer5μl，dNTP4μl，引物1μl(浓度为10μmol/l)，TaqDNApolymerase(TaKaRa)0.25μl，ddH2O余量。PCR反应程序：94℃预变性6min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min，18℃保存。以转化载体为模板在相同条件下的PCR扩增产物作为阳性对照；以未转基因玉米植株DNA为模板在相同条件下的PCR扩增产物为阴性对照。

本发明中，T2代植株除套袋自交结籽外，继续采用PCR技术检测外源基因，优良株系采用Southernblotting验证，并采用RT-PCR技术检查转基因表达强度。对于入选的转基因株系测定植株在不同光强和温度下净光合速率的变化，测定3-7叶期小苗生长速率，测定单株产量和生物量，并以未转基因植株为对照。选出优良的转基因株系后在大田栽培条件下进行玉米产量性状的观测和比较，选择高产株系进入生物安全性试验和玉米育种实验。

靶基因的表达强度采用real-timeRT-PCR进行检测，以Actin基因为内参。在PCR反应体系均为：50μl体系中，包括模板：0.25μl，10×PCRreactionbuffer：5μl，dNTP：4μl，引物：1μl(浓度为10μmol/l)，TaqDNApolymerase(TaKaRa)：0.25μl，ddH2O余量。PCR反应程序均为：94℃预变性6min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min，18℃保存；以上PCR反应均重复3次，得到相似的结果。

本发明中，在转入玉米植株的ZmDAR1m、ZmDAR2m或ZmDA1m基因由玉米ubiquitin1基因启动子驱动转录，转入玉米植株的ZmDA1RNAi结构或ZmDAR1RNAi结构、ZmDAR2RNAi结构分别由PCaMV35S(花椰菜花叶病毒35SRNA基因启动子)或P27kd(玉米27kd醇溶蛋白基因启动子)启动转录。由于转基因插入位点和拷贝数的不同，不同转基因株系中靶基因表达丰度差异很大。从植株形态特征、生育期及生长速率判断，转基因植株与未转基因对照(受体自交系)差异不大，只是转ZmDAR1m基因的叶片相对较长。但部分株系的果穗长度和籽粒产量明显提高(8％～28％)。其中一些独立转化体株系的百粒重显著增加(7％～12％)。并且转ZmDAR1m基因株系的增产幅度平均大于转ZmDA1m基因的或转转ZmDAR2m基因的。这些结果说明，通过转突变的ZmDA1或突变的ZmDAR1或突变的ZmDAR2基因可有效提高玉米籽粒产量。

本发明中，转入ZmDA1RNAi结构或ZmDAR1RNAi结构或ZmDAR2RNAi结构的部分株系，靶基因ZmDA1、ZmDAR1和ZmDAR2的表达丰度显著低于同条件下的受体植株的。在下降幅度大于40％的株系中，转入ZmDA1RNAi结构或转ZmDAR1RNAi结构或ZmDAR2RNAi结构的植株在形态特征和生育期方面与受体自交系无明显变化，但果穗重和单株产量高于受体自交系的，通常增产8％以上；一些株系的籽粒也显著增大。并且转ZmDA1RNAi结构产生的效果更明显。这些结果说明，通过RNAi干扰技术下调ZmDA1或ZmDAR1或ZmDAR2基因的表达丰度可增加玉米籽粒产量。

这些结果表明，玉米ZmDAR1基因、ZmDAR2基因和ZmDA1基因参与调控玉米的籽粒产量，降低其表达水平或改变其编码蛋白的活性能有效提高玉米产量，且对玉米自交系形态特征和生育期无显著影响。

本发明利用构建玉米ZmDAR1家族基因的抑制表达结构或引入突变基因降低ZmDAR1蛋白的功能，通过转基因方法创制大籽粒高产玉米新种质，实现了提高玉米籽粒产量。本发明体现的有益效果是：已知报道中不清楚ZmDAR1基因ZmDAR2基因和ZmDA1基因在玉米中的确切作用，但本发明公开的基因和RNAi结构在与高等植物组成型启动子(花椰菜花叶病毒(CAMV)35SRNA基因启动子或玉米Ubiquitin1基因启动子)融合后转入玉米，转基因株系表现出显著提高了籽粒产量，提高了玉米植株的丰产性，且对植株形态特征和生育期无显著影响，在玉米育种中具有重要意义和有很好的应用价值。

具体实施方式

实施例1转ZmDAR1RNAi结构提高玉米自交系产量

本发明中，从玉米cDNA文库中克隆出ZmDAR1，重组到pT-easy-Blunt载体中测序验证，再通过PCR方法克隆出干扰效果较好的特异性强的ZmDAR1的376bp片段(开放读码框5‵段)，用于构建ZmDAR1RNAi结构。

本发明中，ZmDAR1RNAi结构的构建以质粒pFGC5941为基础。该质粒含有CHSA内含子序列和来自可变盐单胞菌(Halomonasvariabilis)bar基因，后者赋予转基因植株抗除草剂草丁膦特性。CHSA内含子序列一侧带有限制酶XhoI酶切位点，另一侧带有限制酶XbaI和BamHI酶切位点，靶基因片段可通过2次重组，分别插入到CHSA内含子序列的两侧，且两个靶基因片段插入的方向相反。这样，当ZmDAR1RNAi结构由PCaMV35S启动子启动转录后，初级转录本产生颈环结构，即CHSA内含子序列形成单链环，互补的两侧序列形成双链的颈结构，在细胞内Dicer酶等作用下，产生小分子干扰RNA片段，后者与一个核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割靶mRNA，导致靶基因转录本丰度下降或基因沉默。

用构建的植物表达载体pFGC5941-ZmDAR1RNAi转化大肠杆菌，挑选阳性克隆并进行振荡培养和提取质粒，通过质粒的酶切鉴定确定所述质粒是否构建正确。

将构建正确的质粒pFGC5941-ZmDAR1RNAi转入根瘤农杆菌中用于玉米遗传转化。

本发明中，玉米遗传转化采用农杆菌介导法转化玉米无菌苗茎尖-除草剂草丁膦筛选的方案。具体步骤如下：

首先以我国农业生产上所用的骨干自交系郑58的种子为起始材料。种子用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10～15分钟，然后用无菌水洗涤3--5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水，封口后放在黑暗条件(23～30℃)下1～2天。萌动(露白)后种子放在MS培养基上于黑暗条件下继续萌发。待胚芽伸长止3～4厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥,用于农杆菌感染。

同时将带有双元载体(Mini-Ti质粒pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR1m-PCaMV35S::ba)的根瘤农杆菌LBA4404在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100μmol/l乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。

然后将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0.5×10⁵Pa大气压下处理10-12分钟。浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在改良MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。

将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。转化植株长出3片叶后，用添加0.1％Tween-20的0.9％草丁膦水溶液喷洒，以受体自交系(对照)小苗为对照。12天后受体自交系(对照)小苗明显受害，死亡率在90-95％。转化植株在喷洒后多数个体变化同对照植株，逐渐死亡；一些个体虽叶片严重受损，但可长出新叶，逐渐恢复生长；少数个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。

本发明中，T1代植株长到3叶期用0.1-0.2％Tween-20的0.12％草丁膦的水溶液，存活植株采用PCR技术检测转基因，并观察统计抗性和敏感性个体比例。初步确定的转基因套袋自交留种。

T2代植株长到3叶期时继续用0.1-0.2％Tween-20的0.12％草丁膦的水溶液喷洒，统计抗性植株的分离比例。存活植株套袋自交，选择纯合系。T2代植株除套袋自交结籽外，继续采用PCR技术检测转基因，纯合株系采用Southernblotting分析转基因拷贝数，采用RT-PCR技术检查靶基因表达强度。对于入选的转基因株系观测植株生长速率、生育期和主要形态性状，测定单株产量和生物量，并以未转基因植株为对照。选出优良的转基因株系后在大田栽培条件下进行玉米产量性状的观测和比较。

本发明中，转基因材料的PCR检测选择标记基因bar，所用引物为：F:TGACGCACAATCCCACTATCC，R:AACCCACGTCATGCCAGTTCC。PCR扩增体系：10×buffer2.5μL，Mg²⁺1.2μL，gDNA1μL，引物各0.5μL(浓度为10μmol/l)，10mMdNTP0.5μL，rTaq0.125μL，ddH₂O18.375μL。PCR扩增程序：94℃5min；94℃1min，61℃1min，72℃50s，38cycles；然后，72℃7min。

以转化载体为模板在相同条件下进行PCR扩增，产物为阳性对照；以未转基因玉米植株DNA为模板在相同条件下的PCR扩增产物为阴性对照。靶基因的表达强度采用real-timeRT-PCR进行检测，以Actin基因为内参。3次重复。

本发明中，不同转基因株系的靶基因表达丰度差异很大。从植株形态和生长速率看，转基因植株与未转基因对照(受体自交系)差异不大，以授粉后10天的籽粒为材料，只有略多于半数的独立转化体中靶基因ZmDAR1的表达丰度低于受体自交系的40％。在下降幅度大于40％的7个株系中，转ZmDAR1RNAi结构的植株形态特征和生育期方面与受体自交系无明显变化，但果穗重和单株产量高于受体自交系的。将这7个转基因纯合株系播种在大田，以转基因受体自交系郑58为对照，分小区种植，设4次重复，得出它们分别比对照增产8.8％、10.2％、13.7％、16.9％、18.1％、22.4％、23.3％。统计产量相关性状，得出转基因株系的果穗比受体自交系的略长，且顶端籽粒发育好，其中4个株系的粒重也显著增加。另外，双穗率也略高于受体自交系的。

实施例2转ZmDA1RNAi结构提高玉米自交系产量

本发明中，从玉米cDNA文库中克隆出ZmDA1基因，重组到pT-easy-Blunt载体中经测序验证正确，再用作模板通过PCR方法克隆出干扰效果较好的特异性强的ZmDA1的5‵端407bp片段，用于构建ZmDA1RNAi结构。

ZmDAsRNAi结构的构建以改造的质粒pFGC5941(选择标记基因用PCMV35S启动)为基础。通过2次重组过程将克隆的ZmDA1的407bp片段反向插入到pFGC5941的CHSA内含子两侧，产生植物转化载体pFGC5941-ZmDA1RNAi。后者经酶切鉴定确定正确后，转入根瘤农杆菌中用于玉米自交系遗传转化。

玉米遗传转化采用农杆菌介导法转化玉米无菌苗茎尖离体培养产生的丛生芽组织。具体步骤如下：

1)受体系统的建立以我国农业生产上所用的骨干自交系昌7-2为材料。种子用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10～15分钟，然后用无菌水洗涤3--5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水，封口后放在黑暗条件(23～30℃)下1～2天。萌动(露白)后种子放在改良MS培养基上于黑暗条件下继续萌发。待胚芽伸长止3～4厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，切下生长点，放在以改良MS培养基为基础的丛生芽块诱导培养基上产生丛生芽及愈伤组织，并通过继代培养基进行增殖。

改良MS培养基成分：KNO₃1900mg/l，NH₄NO₃1650mg/l，CaCl₂·2H₂O440mg/l，MgSO₄·7H₂O370mg/l，KH₂PO₄·H₂O170mg/l，FeSO₄·7H₂O27.8mg/l，ZnSO₄·7H₂O10mg/l，MnSO₄·4H₂O22.3mg/l，H₃BO₃10mg/l，KI0.83mg/l，Na₂MoO₄·2H₂O0.5mg/l，CuSO₄·5H₂O0.025mg/l，CoCl₂·6H₂O0.025mg/l，盐酸硫胺素20.0mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，烟酸1.0mg/l，肌醇100.0mg/l，蔗糖20g/l,琼脂粉7g/l，pH5.8～6.0。

丛生芽块诱导培养基：改良MS培养基附加生物素0.05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l,脯氨酸200mg/l,蔗糖10g/l,6-BA4.5～9.0μmol/l和2，4—D1.0～3.0μmol/l，用于丛生芽组织块诱导和继代培养。液体培养基则去掉琼脂粉。

2)农杆菌培养及活化

将带有双元载体(Mini-Ti质粒pFGC5941-ZmDA1RNAi)的根瘤农杆菌LBA4404在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100μmol/l乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。

3)遗传转化与植株再生

取继代后培养16天左右的丛生芽组织块为转基因受体。首先将丛生芽组织块切成2-3mm大小，浸泡在农杆菌菌液中感染12分钟左右。转化后的组织块用无菌滤纸吸干后放在丛生芽块诱导培养基上，在暗中进行恢复培养。2天后转入加有头孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧苄青霉素(Carb)500mg/l的丛生芽块诱导培养基上继续于黑暗中培养7～12天，抑制细菌生长。抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽块在加有选择剂草丁膦0.08％的培养基上连续筛选3～4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽组织块逐渐死亡，存活的组织块挑出后转移到新的培养基上继续选择，然后转移到无选择剂的去掉2，4—D的丛生芽诱导培养基上产生小芽。

将小芽放在成苗培养基上照光下生长，光强2000-3000lx，光照14-15小时/天。小苗长到3-4片叶时转入生根培养基(附加附加酪蛋白水解物200mg/l,蔗糖10g/l,6-BA2.25～4.5μmol/l和IBA3.6～4.5μmol/l的改良MS培养基)中生根。培养15天左右，约40％的小苗产生新根。对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，10天后大多数植株产生根系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下生长，日温22～28℃，夜温15～21℃，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。

4)转化植株筛选与定植

转化植株长出3片叶后，用添加0.1％Tween-20的0.09％草丁膦水溶液喷洒，以受体自交系(对照)小苗为对照。12天后受体自交系(对照)小苗明显受害，死亡率在90-95％。转化植株在喷洒后多数个体变化同对照植株，逐渐死亡；一些个体虽叶片严重受损，但可长出新叶，逐渐恢复生长；少数个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。

转基因植株后代分析工作同实施例1。

本发明中，来自不同独立转化体植株中靶基因表达丰度差异很大。以授粉后10天的籽粒为材料，6个独立转化体T2代纯合株系的靶基因ZmDA1的表达丰度分别下降为受体自交系的21-38％。检测这些株系中ZmDAR1的表达，与受体自交系相比，表达丰度仍在70％以上。

从植株形态特征和生长发育及生长速率看，转基因植株与未转基因对照(受体自交系)差异不大。在ZmDA1表达丰度显著下降(表达丰度为受体自交系的21-38％)的6个株系中，果穗重和单株产量高于受体自交系的。将这6个独立转化体的纯合株系播种在大田，以转基因受体自交系昌7-2为对照，分小区种植，设4次重复，得出它们比对照分别增产9.2％、11.2％、12.4％、18.9％、21.5％和21.7％。统计产量相关性状，得出转基因株系的果穗比受体自交系的略长，且顶端籽粒发育好，其中4个株系的籽粒也显著增大。另外，双穗率略高。盆栽试验也得出同样结论。这些结果表明，通过RNAi技术降低玉米ZmDA1及ZmDAR1基因表达可显著提高玉米籽粒产量，在玉米品种改良上是一条可行的途径。

实施例3转ZmDAR1m基因过表达结构提高玉米植株产量

玉米GRMZM2G099328基因共包括11个外显子，10个内含子，约5641bp长。本发明中，将其cDNA中开放阅读框的第968位碱基由G突变为A，使得第322位氨基酸由精氨酸(R)变成赖氨酸(K)，即产生突变基因ZmDAR1m。突变基因被重组到植物表达载体，产生质粒pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR1m-PCaMV35S::bar。后者被导入到根瘤农杆菌LBA4404菌株中，用于玉米骨干自交系昌7-2的遗传转化。

构建pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR1m-PCaMV35S::bar质粒时，首先采用PCR技术从cDNA文库玉米中克隆出ZmDAR1基因，重组到pT-easy-Blunt载体中测序验证，再通过PCR方法引入单碱基突变，产生ZmDAR1m，通过重组反应产生pT-easy-ZmDAR1m，并测序验证。再将pT-easy-ZmDAR1m中的ZmDAR1m片段用限制酶切下，重组到Gateway系统中的入门载体pENTR11中，产生pENTRY11-ZmDAR1m。后者与本实验室构建的目的载体pB7WG2.0-Ubi-MCS-TCaMV35S进行LR反应产生pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR1m。然后将Pubi::ZmDAR1m片段采用PCR方法扩增出，重组到pENTRY11中，产生pENTRY11-Pubi::ZmDAR1m。后者和pB7WG2.0-PCaMV35S::bar-Tons通过LR反应产生转化载体pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR1m-PCaMV35S::bar。

pB7WG2.0-PCaMV35S::bar-Tnos质粒为本实验室改造过的Gateway系统中的目的载体。

玉米遗传转化采用农杆菌介导法转化玉米无菌苗茎尖配合除草剂草丁膦筛选的方案。遗传转化的具体步骤同实施例1。

转化植株长出3片叶后，添加0.1-0.2％Tween-20的0.09％草丁膦水溶液，喷洒10天后受体自交系(对照)小苗明显受害，20天后死亡率在90-95％。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽(T1代)。

T1代植株长到3叶期用0.1％Tween-20的0.12％草丁膦水溶液喷洒，观察统计抗性和敏感性个体比例；采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。存活植株移栽到大田，套袋自交。

本发明中，转基因材料的PCR检测选择标记bar基因的引物为：F:TACGAATTGAAGATGATGGATGG，R:AGTGGTTGACGATGGTGC。

PCR扩增体系：10×buffer2.5μL，Mg²⁺1.2μL，gDNA1μL，引物各0.5μL(浓度为10μmol/l)，10mMdNTP0.5μL，rTaq0.125μL，ddH₂O18.375μL。PCR扩增程序：94℃5min；94℃1min，61℃1min，72℃50s，38cycles；72℃7min。

以转化载体为模板的PCR扩增产物为阳性对照，以未转基因玉米植株DNA为模板在相同条件下的PCR扩增产物为阴性对照。

T2代植株除套袋自交结籽外，继续采用PCR技术检测外源基因，优良株系采用Southernblotting验证，并采用RT-PCR技术检查转基因表达强度。对于入选的转基因株系测定植株在不同光强和温度下净光合速率的变化，测定3-7叶期小苗生长速率，测定单株产量和生物量，并以未转基因植株为对照。选出优良的转基因株系后在大田栽培条件下进行玉米产量性状的观测和比较，选择高产株系进入生物安全性试验和玉米育种实验。

转入玉米植株的ZmDAR1m基因由玉米ubiquitin1基因启动子驱动转录，从植株形态特征和生长速率判断，转基因植株与未转基因对照(受体自交系)差异不大，只是转ZmDAR1m基因的叶片相对较长。但部分株系的果穗长度和籽粒产量明显提高(8.3％～28.2％)。其中一些独立转化体株系的百粒重显著增加(7％～12％)。同条件下比较实验得出，转ZmDAR1m基因株系的增产幅度平均大于转ZmDA1m基因的。这些结果说明，通过转突变的ZmDAR1可有效提高玉米籽粒产量。

实施例4转ZmDAR2RNAi结构提高玉米自交系产量

本发明中，从玉米cDNA文库中克隆出ZmDAR2，重组到pT-easy-Blunt载体中测序验证，再通过PCR方法克隆出干扰效果较好的特异性强的ZmDAR2开放读码框的3‵端的476bp片段，用于构建ZmDAR2RNAi结构。

本发明中，ZmDAR2RNAi结构的构建以质粒pFGC5941-Pubi为基础。该质粒含有CHSA内含子序列和来自可变盐单胞菌(Halomonasvariabilis)bar基因，后者赋予转基因植株抗除草剂草丁膦特性。CHSA内含子序列一侧为XhoI酶切位点，另一侧带有限制酶XbaI和BamHI酶切位点。该质粒原有的启动RNAi结构转录的PCaMV35S(位于CHSA内含子的5‵端，间距一个限制酶XhoI识别位点)被来自玉米27kd醇溶蛋白基因的启动子P27kd取代。ZmDAR2基因片段可通过2次重组，分别插入到CHSA内含子序列的两侧，且两个片段插入的方向相反。这样，当ZmDAR2RNAi结构转录后，初级转录本产生颈环结构，即CHSA内含子序列形成单链环，互补的两侧序列形成双链的颈结构，在细胞内Dicer酶等作用下，产生小分子干扰RNA片段，后者与一个核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割靶mRNA，导致靶基因转录本丰度下降或基因沉默。该RNAi结构在玉米胚乳中特异表达。

用于构建的ZmDAR2干扰结构的臂序列长467bp，产生质粒pFGC5941-ZmDAR2RNAi。

本发明中，玉米遗传转化采用农杆菌介导法转化，自交系郑58、6WC为受体材料。转基因株系产生、鉴定及选择同实施例1。ZmDAR2RNAi结构在转基因玉米胚乳中高强度表达，增加了百粒重和行粒数，显著提高了玉米产量，但对植株形态特征、抗逆性和发育期等无明显影响。

本发明中，获得的8个来自不同独立转化体的转基因纯合株系，其中来自郑58的转基因株系5个，来自6WC的转基因株系3个。它们的籽粒产量比受体自交系分别提高了17.2％、19.2％、20.3％、22.1％、25.2％、25.1％、27.5％、32.4％，在育种上有很好的应用价值。

实施例5转ZmDAR1反义基因提高玉米自交系产量

通过转基因技术向植物导入目标基因反义表达结构往往可有效的降低靶基因的表达水平。本发明采用这一策略产生转ZmDAR1反义基因的玉米株系，从中选出产量有明显提高的转基因材料。

本发明中，构建pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR1(反义)-PCaMV35S::bar质粒时，首先采用PCR技术从cDNA文库玉米中克隆出ZmDAR1基因，重组到pT-easy-Blunt载体中测序验证，再将pT-easy-ZmDAR1中的ZmDAR1基因用限制酶切下，重组到Gateway系统中的入门载体pENTR11中，产生pENTRY11-ZmDAR1(反向)。后者与本实验室构建的目的载体pB7WG2.0-Ubi-MCS-TCaMV35S进行LR反应产生pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR1(反义)。然后将Pubi::ZmDAR1(反义)片段采用PCR方法扩增出，重组到pENTRY11中，产生pENTRY11-Pubi::ZmDAR1m。后者再与pB7WG2.0-PCaMV35S::bar-Tons通过LR反应产生转化载体pB7WG2.0-Pubi::ZmDAR1(反义)-PCaMV35S::bar。

pB7WG2.0-PCaMV35S::bar-Tnos质粒为本实验室改造过的Gateway系统中的目的载体。

本发明中，玉米遗传转化采用农杆菌介导法转化，自交系郑58为受体材料。转基因株系产生、鉴定及选择同实施例1。

获得的3个来自不同独立转化体的转基因株系的产量比受体自交系郑58分别增产11.2％、17.6％和22.4％，在育种上有较好的应用价值。

Claims (1)

1.一种抑制玉米ZmDAR1家族基因表达提高玉米籽粒产量的方法，其特征在于：利用转基因技术通过过表达突变基因ZmDAR1m抑制玉米ZmDAR1家族基因ZmDAR1功能，采用RNAi技术和转反义基因技术通过转入ZmDAR1反义基因或ZmDAR1RNAi结构或ZmDAR2RNAi结构降低ZmDAR1基因表达水平，获得籽粒产量明显高于未转基因自交系的转基因玉米株系，实现提高玉米籽粒产量；其中，所述玉米ZmDAR1家族基因ZmDAR1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示，所述突变基因ZmDAR1m为第322氨基酸由精氨酸变为赖氨酸的ZmDAR1突变蛋白的基因，该基因编码的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，所述ZmDAR1RNAi结构由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列5‵端376个核苷酸片段构建而成；所述ZmDAR2RNAi结构由SEQIDNo.2所示的核苷酸序列3‵端的476个核苷酸片段构建而成。