CN107858360A - 玉米籽粒大小基因ZmUrb2、其表达产物、其克隆引物、其表达载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米籽粒大小基因ZmUrb2、其表达产物、其克隆引物、其表达载体及应用，通过多种手段解析一份玉米籽粒大小自然突变体材料的调控机制，克隆了调控玉米籽粒大小和生育期的基因ZmUrb2，验证了其功能并发掘了其有利单倍型，为玉米育种的应用实践打下基础。ZmUrb2突变可以导致突变体材料对特定抗生素的敏感性降低，会导致pre‑rRNA加工滞后，使生长发育有明显缺陷，利用涵盖热带、亚热带和温带的479份玉米自然群体材料筛选出ZmUrb2区段的具有较高的基因表达量、较长的粒长和较短的生育期的最优单倍型，可用于改良玉米籽粒粒型和生育期，对提高玉米产量和改良热带玉米材料到温带种植提供帮助。

Description

玉米籽粒大小基因ZmUrb2、其表达产物、其克隆引物、其表达 载体及应用

技术领域

本发明属于玉米遗传育种技术领域，具体涉及一种玉米籽粒大小基因ZmUrb2、其表达产物、其克隆引物、其表达载体及应用。

背景技术

粮食高产和稳产是植物科学研究的重要目标。玉米不仅是主要的粮食来源，而且也是重要的饲料和工业原材料，对于国民经济发展具有十分重要的作用。随着人口增加和耕地减少，玉米的地位将会越来越重要。

穗粒数、粒重和单位面积穗数是玉米产量构成的基本要素，穗粒数由穗行数和行粒数决定，粒重由籽粒大小和容重决定。“粒型”不仅包括籽粒大小（长、宽、厚），还涉及籽粒形状，粒型相关性状直接决定了籽粒的库容大小，是形成粒重的直接决定因子（Austin et al.， 1996；Peng et al.， 2011；Li et al.， 2013.）。玉米籽粒发育是一个连续而又复杂的生物学过程，是由许多不同的基因紧密协作调控的。玉米籽粒大小是一个复杂的数量性状，是影响玉米产量的关键因素之一，也正是受到籽粒发育过程中不同的基因调控的。

大量研究表明作物的籽粒大小受到籽粒自身建成和后期发育的直接影响，籽粒的发育决定着籽粒最终的大小（Conlon，Raft，1999；Day，Lawrence，2000.），同时作物籽粒大小是经过人类长期驯化选择的结果。虽然籽粒大小是一个非常直观的产量性状，长期以来受到众多研究者的重视，但对于形成最终籽粒大小的遗传机制和分子调控机理的研究进展还比较有限。

水稻中关于粒型和籽粒大小的研究较为充分，中国科学院上海生命科学研究院克隆出的控制粒重的GW2位点基因，该基因控制细胞数目和颖壳大小，从而影响胚乳细胞数目和大小、籽粒灌浆速度，最终影响籽粒长宽和粒重，这个位点编码的一种未知的泛素E3环型连接酶可能与泛素-蛋白体的降解途径密切相关（Song等，2007.）。Motoyuki（2005）构建了一套Habataki（籼稻）×Koshihikan（粳稻）的RIL群体并利用这套群体定位到了调控水稻穗粒数的QTL位点Gnl，通过进一步的研究证明了改位点由Gnla和Gnlb共同组成。其中Gnla位点可以通过编码一种细胞分裂素氧化酶/脱氢酶来降解细胞分裂素氢受体，从而可以使花器分生组织细胞分裂素得到逐渐积累，进而使生殖器官的细胞数也逐渐变多，最终导致粒重增加。在前几年克隆的水稻籽粒大小的相关基因，如控制水稻粒长得主效QTL GS3（Fanet al.，2006，2009；Li et al.，2004.）、粒宽的QTL GW2（Song et al.，2007.）、GW5（qSW5）（Shomura et al.，2008；Wan et al.，2008；Weng et al.，2008.）等，都有着各自不同的调控作用机制。

玉米粒型相关性状对籽粒大小的遗传改良和玉米单产水平的提高具有重要意义。然而目前我国科学家在玉米粒型相关基因生物学功能的研究有限，亟待发掘优异等位变异，迫切需要探索其调控机理和互作网络，进而对提高玉米产量提供技术支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种玉米籽粒大小基因ZmUrb2、其表达产物、其克隆引物、其表达载体及应用。

为解决上述技术问题，本发明采用了如下技术研究路线：

利用一份玉米籽粒大小的自然突变体材料，克隆调控玉米籽粒大小的基因ZmUrb2，通过多种手段解析该基因的调控机制，并利用涵盖热带、亚热带和温带的479份玉米自然群体材料对进行单倍型分析，检测其表达量，粒长和生育期。 获得的具体技术方案如下：

定位一种玉米籽粒大小基因ZmUrb2，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，其CDS序列如SEQ ID NO.2所示，其亚细胞定位在细胞核。

确认了上述的玉米籽粒大小基因ZmUrb2的表达产物，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

设计出了扩增玉米籽粒大小基因ZmUrb2的克隆引物，其碱基序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

构建了扩增玉米籽粒大小基因ZmUrb2的表达载体35S::YFP-ZmUrb2，其碱基序列含ZmUrb2基因的cDNA碱基序列。

所述的玉米籽粒大小基因ZmUrb2 在玉米对抗生素的响应中的应用。

优选的，所述抗生素为卡那霉素，潮霉素，壮观霉素，放线菌素，氯霉素，链霉素中的至少一种。

所述的玉米籽粒大小基因ZmUrb2在玉米体内Pre-rRNA 加工、玉米遗传育种中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1. 本发明克隆了调控玉米籽粒大小和生育期的基因ZmUrb2，发现了其DNA序列，CDS序列和编码蛋白序列，为玉米育种的应用实践打下基础。

2. 本发明的ZmUrb2突变可以导致突变体材料对卡那霉素和链霉素的敏感性降低。

3. 本发明的ZmUrb2突变会导致pre-rRNA加工滞后，会导致生长发育上的一系列缺陷。

4.本发明在玉米自然群体中筛选出了ZmUrb2区段的具有较高的基因表达量、较长的粒长性状和较短的生育期性状的最优单倍型Hap3，可以用于改良玉米籽粒粒型和生育期，对于提高玉米产量和改良热带玉米材料到温带种植提供帮助。

5. 本发明对ZmUrb2基因的发掘方法可用于独特的鉴定相关玉米表型突变性状相关的核糖体生物合成和pre-rRNA加工过程中的突变基因的鉴定，相关核糖体生物合成和pre-rRNA加工过程中的关键基因突变一般会引起多重性的表型变异，异常的核糖体图谱分析和异常的rRNA前体的加工，同时可能产生对某些抗生素敏感性降低的表型性状。

附图说明

图1为玉米籽粒大小突变体ks1的籽粒表型图；

图2为玉米籽粒大小突变体ks1灌浆过程分析图；

图3为玉米籽粒大小突变体ks1调控基因的定位图；

图4为玉米籽粒大小突变体ks1调控基因的候选区段基因分析图；

图5为玉米穗部籽粒同样呈现3:1的籽粒大小分离图；

图6为玉米转基因分离穗子上的突变籽粒进行测序分析图；

图7为玉米籽粒大小突变体ks1调控基因的进化树分析图；

图8为玉米籽粒大小突变体ks1调控基因的同源性分析图；

图9为玉米籽粒大小突变体ks1中ZmUrb2基因的表达分析图；

图10为玉米籽粒大小突变体ks1中ZmUrb2在激光共聚焦显微镜下的亚细胞定位图；

图11为玉米籽粒大小突变体ks1中ZmUrb2的突变对核糖体的影响图；

图12为玉米籽粒大小突变体ks1中ZmUrb2的突变对抗生素抗性的影响图；

图13为玉米籽粒大小突变体ks1中ZmUrb2的突变对Pre-rRNA加工的影响图；

图14为玉米籽粒大小突变体ks1中ZmUrb2的单倍型分析图；

图15为热带、亚热带和温带材料的ZmUrb2的三种单倍型频率分析图；

图16 为ZmUrb2的两类单倍型的生育期分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验或检测方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：一种玉米籽粒大小突变型ks1的发现

2009年2月份在海南省乐东县河南农业大学南繁基地，河南农业大学汤继华教授在玉米育种材料的选育过程中，发现编号为6243的材料自交后穗子出现部分籽粒呈现为小粒及皱缩籽粒的表型突变，将该表型突变的材料命名为ks1。如图1中A、B、C、F、G、H部分所示：ks1突变体成熟籽粒表现为籽粒变小，粒长、粒宽和粒厚分别有不同程度的减少，百粒重降低，突变籽粒发育滞后但可以成苗，将ks1编号为6244。

对6244×B73的F₁、F₂和BC₁穗部籽粒大小分离情况进行调查分析，结果如图1中A部分和表1所示，（6244×B73）F₁穗部籽粒大小无分离，（6244×B73）F₂和6244×（6244×B73）BC₁穗部籽粒大小都有分离，构建的F₂穗子上有163个籽粒表现为正常，49个籽粒表现为扁小突变，χ ² 检验符合3：1的理论比值，构建的BC₁F₁穗部籽粒大小分离比也符合1：1的理论比值，表明该突变性状由一对隐性基因控制。

表 1 籽粒大小突变体ks1遗传分析

随后挑选正常籽粒和突变籽粒切开胚乳进行电镜扫描分析，结果如图1中D、E部分所示，大小籽粒中的内含物淀粉颗粒充实度及细胞的大小基本相同，ks1突变体籽粒扁小的表现型主要是由于胚乳细胞数目减少造成的。

对BC₁中正常株和突变株在幼苗期和成熟期的观察表明，突变株相对于正常株在幼苗期已经开始在形态上表现出差异，到成熟期这种差异表现的更加明显，突变株在株高和根系的发达程度上远不及正常株。

野生型杂合单株在自交授粉10天以后，在穗部上的籽粒性状差异开始逐渐表现出来。在第10天之前的灌浆初期，野生型和突变型大小籽粒都为透明状态，表型分离差异不明显；10天到25天，野生型和突变型大小籽粒分离逐渐显现出来；第25天到35天以后，随着灌浆的逐渐充实，大小籽粒逐渐脱水成熟，最终在穗子明显表现分离，见图2中A、B、C、D、E部分。授粉后25天胚乳的扫描电镜也发现突变体的灌浆进程要比野生型滞后，见图2中F、G部分。

实施例二：一种玉米籽粒大小突变型ks1调控基因的发现

1. 从玉米数据库maizegdb上挑选均匀覆盖玉米基因组10条染色体的400对SSR标记，筛选在两个亲本及构建的BSA池之间与目的基因紧密连锁具有多态性的标记，其中只在1.02 bin筛选到两个多态性标记bnlg1803和bnlg1007，说明目标基因位于第一染色体；

2. 筛选了1.02区附近，即覆盖1.01，1.02，1.03 bin的SSR引物，一共筛选到7对多态性标记；

3. 利用筛选到的多态性标记对初步定位群体中各个单株进行遗传连锁分析，筛选其中的交换单株，分析目标基因走向；

4. 参照何祯祥等在1999年提出的作图方法，利用mapmaker进行遗传连锁作图，如图6中A部分所示，初步定位结果表明，目标基因位于玉米基因组第一染色体1.02 bin的两个标记bnlg1614和bnlg1953之间，实际物理距离为2.1Mb；

5. 扩大到38400株的BC₁精细定位群体，对这38400份的单株在室内进行切胚乳快速抽提DNA，然后根据初步定位结果，利用目标基因两侧最近的分子标记bnlg1614和bnlg1953对各个单株进行检测筛选，依据一侧标记为纯合带型,另外一侧标记为杂合带型即为交换单株的原则，一共筛选到了2017株的交换单株；

6. 将筛选到的交换单株室内育苗并移栽到大田，在这些交换单株的苗期抽提高质量DNA进行后续研究，并全部自交授粉观察其穗部籽粒大小分离以最终确认表型，

7. 在http://www2.genome.arizona.edu/genomes/maize上下载得到玉米自交系B73的全基因组序列chrv2，根据初步定位结果中两侧标记bnlg1614和bnlg1953的序列，在第一染色体上1.02 bin找到bnlg1614和bnlg1953之间的碱基序列，并用于设计新的标记；

8. 根据拿到新序列，开发不同类型的分子标记，然后筛选其中的多态性标记并进行交换单株的分析，一共筛选到了45对与目的基因紧密连锁的多态性标记。通过多轮分子标记的开发和对交换单株的分析，最终将目标基因定位在标记N-85和N-15之间，根据B73 chrv2的参考序列，它们之间的物理距离为129kb，见图6中B部分。

9. 把得到的候选区段序列放在FGENESH（http://linux1.softberry.com/）上进行基因预测，根据预测结果，在GO（www.geneontology.org/）上进行功能分析，并结合MaizeSequence（http://www.maizesequence.org/index.html）上对应区段的相关基因信息。如表2所示，最终确定N-85和N-15两个标记之间一共有四个候选基因：一号基因没有相关功能的注释，对应基因编号为GRMZM2G457178，二号基因的功能与细胞分裂周期相关，对应基因编号为GRMZM2G457201，三号基因功能与体细胞胚胎发育相关，对应基因编号为GRMZM2G119104，四号基因功能与阴离子通道相关，对应基因编号为GRMZM2G119104。

表 2 候选区段基因预测结果

。

实施例三：一种玉米籽粒大小突变型ks1调控基因的确定

授粉后15天提取野生型和突变型胚乳RNA对各个候选基因进行半定量，如图4所示：

一号基因在野生型和突变型中表达差异显著，二号基因整体表达量较低，三号基因和四号基因在野生型和突变型胚乳表达差异不显著；

在野生型和突变型材料中对四个候选基因区段进行测序和分析，结果发现在一号基因编码区存在一个特异的单碱基突变位点SNP22，由碱基C突变为T，对应编码氨基酸由正常的亮氨酸突变为脯氨酸，进一步的测序分析证明该位点在玉米自然群体和大刍草中相对保守，SNP22 C/T是一个稀有的单碱基突变，可能是功能性突变位点。

为了验证一号基因是否是候选基因，利用CRISPR/Cas9 系统构建了一号基因的定向突变载体，对玉米自交系C01材料进行遗传转化验证。设计了两个靶向位点，分别从两个位点对目的基因进行突变，得到阳性CRISPR/Cas9的T0与郑58的杂交后代，再种植后进行自交，如图5所示，结果发现穗部籽粒同样呈现3:1的籽粒大小分离。挑选转基因分离穗子上的突变籽粒进行测序分析，也证明了目的基因在靶向位点被突变，见图6。CRISPR/Cas9的转基因验证进一步证明了一号基因是玉米籽粒大小突变型ks1的调控基因。

实施例四：玉米籽粒大小突变型ks1具有高度保守结构域的蛋白

序列分析证明一号基因C端具有一个在许多物种中都很保守的Urb2结构域，与核糖体生物合成相关，将一号基因命名为ZmUrb2，其DNA序列为SEQ ID NO.1，其CDS序列为SEQ IDNO.2，其编码蛋白序列为SEQ ID NO.3。系统进化树显示，见图7，ZmUrb2与高粱中的同源基因亲缘关系最近，属于同一个分支。

氨基酸保守性分析证明，见图8，预测的该功能SNP编码的氨基酸位点在其它物种中也绝对保守，属于非常保守的功能位点。

实施例五：玉米籽粒大小突变型ks1调控基因ZmUrb2的表达分析

设计克隆引物，上游引物和下游引物的碱基序列如下：

ZmUrb2-QPCR-F：GCACTACTCTTCGGCACCAA

ZmUrb2-QPCR-R：GGGTTTCTCTCTGCTGGCG

如图9中A部分所示，通过QPCR发现ZmUrb2在玉米的根、茎、叶、茎尖、雌穗、雄穗、花丝、苞叶和籽粒中都有表达，没有组织特异性，这说明了ZmUrb2对玉米各组织器官和各生育期生长发育的重要性；如图9中B部分所示，对于授粉后不同发育时期的野生型和突变型胚乳RNA的QPCR对比说明ZmUrb2突变后，胚乳灌浆各个时期的ZmUrb2表达均比野生型上调。

实施例六：玉米籽粒大小突变型ks1调控基因ZmUrb2的亚细胞定位

构建了ZmUrb2基因野生型和突变型cDNA的35S::YFP-ZmUrb2载体，对烟草进行瞬时表达实验，结果如图10所示，无论野生型还是突变型，ZmUrb2均定位在细胞核，ZmUrb2的融合蛋白信号与细胞核定位信号DAPI完全重叠。说明ZmUrb2主要在细胞核中发挥功能，SNP22的突变不改变ZmUrb2的亚细胞位置。

实施例七：玉米籽粒大小突变型ks1调控基因ZmUrb2对核糖体生物合成和特定抗生素的响应的影响

提取野生型和突变型核糖体后，利用密度梯度离心技术分离核糖体各个亚基和多聚核糖体，并进行测定分析。如图11所示：结果发现突变体中60S亚基对比40S亚基明显减少，且突变体中多聚核糖体比例增高。如图12所示：用不同浓度的抗生素水培处理野生型和突变型发现，ZmUrb2突变可以导致突变体材料对卡那霉素和链霉素的敏感性降低。由于不同类型的抗生素需要靶向不同的核糖体位点来起作用，而ZmUrb2突变会影响核糖体这些位点的构型，进而导致突变体材料对特定抗生素的敏感性降低。

实施例八：玉米籽粒大小突变型ks1调控基因ZmUrb2对玉米体内Pre-rRNA 加工的影响

rRNA的加工在真核生物中是一个十分保守而又精确进行的过程，ZmUrb2基因在肽链的C端有一个在各个物种中都非常保守的Urb2结构域，与核糖体生物合成和rRNA加工相关，而突变位点也发生在Urb2结构域中。如图13所示，Northern Blot实验结果显示Urb2基因的突变导致核糖体rRNA的加工受到影响，35S rRNA和P-A3片段在突变体中明显积累，27S pre-rRNA有部分降低；通过CRT-PCR定位了各个pre-rRNA片段的5′和3′端，确定了P，A2和A3位点的序列，其中A3位点和其它物种中A3的序列完全一致，证明确实A3位点十分保守。通过CRT-PCR发现突变体中各个pre-rRNA片段的3′末端加工都明显滞后，这证明了ZmUrb2突变会导致rRNA加工滞后。

由于核糖体装配和rRNA加工都是一个十分精密和保守的过程，各个步骤滞后或破坏都会对生长发育产生一系列的影响，所以ZmUrb2的突变会导致生长发育上的一系列缺陷。

实施例九：玉米籽粒大小突变型ks1调控基因ZmUrb2的最优单倍型分析

通过TASSEL V5.0软件的GML一般线性模型，利用ZmUrb2基因区段的SNP对籽粒粒型进行关联分析。结果如图14中A部分所示，在设定P＜0.01的阈值下，一共有8个SNP与粒长显著关联。这8个SNP当中，SNP -1951位于ATG上游且与粒长显著关联（P=2.71×10⁻³）；编码区分别有一个同义突变和一个非同义突变 （SNP 9617和 SNP 10898）也与粒长显著关联（P=3.05×10⁻³），其中的SNP 10898 的一个单碱基变异G/A导致氨基酸替换histidine/tyrosine；3′UTR区域也有四个SNP变异（SNP 10991，SNP 11235，SNP 11236和SNP 11253）与粒长显著相关（P=9.16×10⁻³）；另外3′UTR 的内含子区域也有一个SNP（SNP 11105）与粒长显著关联。3′UTR区域的这些SNP都与ATG上游的SNP-1951呈现出显著的LD水平（r²>0.8）。

如图13中B部分所示，根据这些与表型显著性关联的位点，可以将479份玉米自然群体材料明显分为三种单倍型。以Mo17为代表的第一种单倍型一共由345份材料组成，是最大的一组；以B73为代表的第三种单倍型一共包括127份材料，是第二大组；单倍型2是较小的一组，仅有部分材料组成。统计分析证明，单倍型1和单倍型2之间粒长差异不显著（P=0.69），而单倍型1和2与单倍型3之间差异十分显著（P=4.11×10⁻⁹），于是我们将单倍型1和2划分为同一类，为粒长较短单倍型，单倍型3为粒长较长单倍型。从粒长看来，Hap3可被视为一类优异等位基因。由于大部分显著相关变异都是位于3′UTR区域的，所以我们分析了授粉后15天籽粒中，ZmUrb2基因分别在单倍型Hap1/Hap2 和Hap3中的表达水平（表达量数据来自www.maizego.org，可开放获取）。如图13中C部分所示，Hap1/Hap2中ZmUrb2的表达水平明显要比Hap3中低（P=5.58×10⁻⁸）。这些结果证明：ZmUrb2基因的第三种单倍型Hap3是粒长的一个优良等位基因，同时ZmUrb2基因的较高表达水平也会影响籽粒的粒长。

分别分析100份热带来源的材料，120份亚热带来源材料和180份温带来源材料中ZmUrb2基因的三种单倍型的所占的比例，结果如图15所示：单倍型3（Hap3）在热带和亚热带材料中所占的频率分别仅为8% 和11%，而在温带材料中，Hap3的频率明显上升到了36%。由于大部分的热带材料引种到温带地区种植会出现生育期明显滞后的现象，进而分析了Hap1/Hap2 和 Hap3的三个生育期性状：silkingtime, pollenshed和headingdate。结果如图16所示：Hap3材料的这三个性状的生育期时间都比Hap1/Hap2要明显缩短。这些数据显示ZmUrb2基因的Hap3的等位基因频率从热带到温带地区是明显提升的，而Hap3的材料在温带地区对比Hap1/Hap2又具有较短的生育期，这样看来，在玉米从热带到温带的人工驯化中，Hap3作为一种优良的等位基因容易被人工选择。因此，ZmUrb2基因的Hap3的等位基因是在玉米从热带到温带的驯化过程中被人工选择的，因为这种单倍型具有较长的粒长和较短的生育期。同时，Hap3单倍型在温带材料中占有36%的频率，证明Hap3单倍型在热带到温带材料改良中还有继续提升的空间。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 玉米籽粒大小基因ZmUrb2、其表达产物、其克隆引物、其表达载体及应用

<130> 2017

<160> 5

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 10924

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

atgacagacg ccattgccat ggagacggct gccgcgaccg cgaggcccgg cgcagcgagg 60

aagcggcggt ggaaccaatc gcagccttgc caaggggagg gtccgagcga tctcaagttc 120

gctagacttc gcttcgacgg cgacggcggc gccaagggcg cgtgggaaca cctcgacctc 180

gtcctctccc tccagagcaa ggagctgtcg ctcgaaaggt cacccttctg cttctgtttc 240

ggtgaacgtt agctcatgta accctgtggc taggaattcc gtttatgtga ttatgcttcc 300

atcgttttag tcgcctcttt taatggagga ttgcgtatta cttgtttact gccataaaca 360

atgcacgaga tgattttgtt aattcagtgt gaataggatt ttataagaga tacaattttg 420

ttgttagcat ttttagcttg gctttatatt tgttgatttt gcacaataat cgcattgatg 480

tatgccaaat agtactttct ctttttactt tctaggatga tagaagcagt aagatggaca 540

aatttgacat attatgttca tgattagtac cttatgtaat ttttctgatt catacagaag 600

cactgaagct ggagtatttt gtggaatcct gtttagatca accttattct aatcttctca 660

cttgtaatct acatcttcac aacggcatgt ttatttgtgc agaaagattg agctagcggt 720

cgaatttcta accacactgc caaataactc aagctgcagc attcagctat tgcggctggt 780

gtcatttatt ggaaactggt tgcagtctat cttaaatttt cctgagaata gtaaaaagat 840

tctacatatt tttgatccag cattggatag tagatgctgg gcaattttga gagtgtgtgt 900

tgaaaagaaa ccatccattt caatatctct gaacttactt aaatccctta gtcgagttgc 960

aagtcatggt ttgggcagag ttgatagcaa cacatcatgt cctgacaatg aatctattga 1020

gctctttgaa caagtgtttg actgcatgtc attgcttttc tcttccaata caagagcttt 1080

cttcaacgct ggtgtggatt tatgggcctc ttgtgccatt gaggttgtca atcttgctca 1140

gaaggtgtca gctaaaaagg acaatttttg ccctgttctt cagaagcttg caaattgcct 1200

cctcgggcaa ttcgcatgct tcctgagatt ttatgcaaat ccgaagaata ttttccatgc 1260

ttttgttgat aaggttcttg ggccattgtt ggaattgtta gttttactta attcacaagc 1320

acattccagt gaacacaagc agacaggaac aatgttgaaa attgttgaag atgttttttc 1380

aaatggactg tttcatcccc aacatcttag tggatatttc ggtctcagga gtttgaataa 1440

atcttctgct gctaaggata tcaaaggaag ctaccataga catctatttc agcgattcaa 1500

aggaataaaa acagaaaaca aggctgtatt gctggctggg tttggctact tgtttcaatt 1560

gtttgttagg agggctagaa atcaaagaac aactgtagca ccaagtagaa cgactttggg 1620

tacgctgcac aaaagcaatg atggttctga agaaccacaa catagggaat cactttttga 1680

agtgtttatt atgttcatgg aacccatcgt attagagtgt aaatcgtatt cccaaaagga 1740

cttctctaag ttaggggtga caaggctagt agaggtccat tgcatgctga aatccattaa 1800

tgtgatgctg ataaccctta ttgaagagaa gatctatgtt cctacagagg acacattgga 1860

aggatctcac ttcaattttt tgcaagatat ttactctgtc ttgatcttaa tatctgaaaa 1920

gatgtacaaa ttctggatgt ctgctgtgca tctagaagat gtaaacatta agaagatagt 1980

acctttaatg tttgcagaga ttatttctgc agttggcaat tttctagaaa tcgagtacaa 2040

agttctagga gacgaccttg tgaaattgtg gttaatgatt tttgctttgt ctgctattaa 2100

tacatcttcc aaggacatcg aaccctgttt tctgcttgct tcaaagattt caagcctctc 2160

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tactttcagt acttcctcac tcaattatct gataagattg caaacaagtg atgctctttg 2280

tttgagtgga cccttttccc ctcgaacatg ctaaagagct atgtatcatt atattaagaa 2340

gatatgagtc taagaagatc cattgaagcc caatgtttgg gtggactttg tgtgtctttc 2400

tacattctgc ttgcacgctc ttcttttccc ctaccctgat ctgatgtttt cccccctctt 2460

ttgttcataa tataggtttc ccgctcaatt ttcagtctgt gtgatgctgt gagggcattc 2520

agagttgagg gccctgatgg agtacatggc tcattttctg tggcctcttt atcgtcccag 2580

gagtgtttgg gatcattgac aacactgttg agttccgaaa cattgatggg tgctattcgc 2640

acttcaatta agtcgatgcc tcaaggccag tctagccgat gtatagagga gcttacatcg 2700

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<400> 3

Met Thr Asp Ala Ile Ala Met Glu Thr Ala Ala Ala Thr Ala Arg Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ala Arg Lys Arg Arg Trp Asn Gln Ser Gln Pro Cys Gln Gly

20 25 30

Glu Gly Pro Ser Asp Leu Lys Phe Ala Arg Leu Arg Phe Asp Gly Asp

35 40 45

Gly Gly Ala Lys Gly Ala Trp Glu His Leu Asp Leu Val Leu Ser Leu

50 55 60

Gln Ser Lys Glu Leu Ser Leu Glu Arg Lys Ile Glu Leu Ala Val Glu

65 70 75 80

Phe Leu Thr Thr Leu Pro Asn Asn Ser Ser Cys Ser Ile Gln Leu Leu

85 90 95

Arg Leu Val Ser Phe Ile Gly Asn Trp Leu Gln Ser Ile Leu Asn Phe

100 105 110

Pro Glu Asn Ser Lys Lys Ile Leu His Ile Phe Asp Pro Ala Leu Asp

115 120 125

Ser Arg Cys Trp Ala Ile Leu Arg Val Cys Val Glu Lys Lys Pro Ser

130 135 140

Ile Ser Ile Ser Leu Asn Leu Leu Lys Ser Leu Ser Arg Val Ala Ser

145 150 155 160

His Gly Leu Gly Arg Val Asp Ser Asn Thr Ser Cys Pro Asp Asn Glu

165 170 175

Ser Ile Glu Leu Phe Glu Gln Val Phe Asp Cys Met Ser Leu Leu Phe

180 185 190

Ser Ser Asn Thr Arg Ala Phe Phe Asn Ala Gly Val Asp Leu Trp Ala

195 200 205

Ser Cys Ala Ile Glu Val Val Asn Leu Ala Gln Lys Val Ser Ala Lys

210 215 220

Lys Asp Asn Phe Cys Pro Val Leu Gln Lys Leu Ala Asn Cys Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gln Phe Ala Cys Phe Leu Arg Phe Tyr Ala Asn Pro Lys Asn Ile

245 250 255

Phe His Ala Phe Val Asp Lys Val Leu Gly Pro Leu Leu Glu Leu Leu

260 265 270

Val Leu Leu Asn Ser Gln Ala His Ser Ser Glu His Lys Gln Thr Gly

275 280 285

Thr Met Leu Lys Ile Val Glu Asp Val Phe Ser Asn Gly Leu Phe His

290 295 300

Pro Gln His Leu Ser Gly Tyr Phe Gly Leu Arg Ser Leu Asn Lys Ser

305 310 315 320

Ser Ala Ala Lys Asp Ile Lys Gly Ser Tyr His Arg His Leu Phe Gln

325 330 335

Arg Phe Lys Gly Ile Lys Thr Glu Asn Lys Ala Val Leu Leu Ala Gly

340 345 350

Phe Gly Tyr Leu Phe Gln Leu Phe Val Arg Arg Ala Arg Asn Gln Arg

355 360 365

Thr Thr Val Ala Pro Ser Arg Thr Thr Leu Gly Thr Leu His Lys Ser

370 375 380

Asn Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gln His Arg Glu Ser Leu Phe Glu Val

385 390 395 400

Phe Ile Met Phe Met Glu Pro Ile Val Leu Glu Cys Lys Ser Tyr Ser

405 410 415

Gln Lys Asp Phe Ser Lys Leu Gly Val Thr Arg Leu Val Glu Val His

420 425 430

Cys Met Leu Lys Ser Ile Asn Val Met Leu Ile Thr Leu Ile Glu Glu

435 440 445

Lys Ile Tyr Val Pro Thr Glu Asp Thr Leu Glu Gly Ser His Phe Asn

450 455 460

Phe Leu Gln Asp Ile Tyr Ser Val Leu Ile Leu Ile Ser Glu Lys Met

465 470 475 480

Tyr Lys Phe Trp Met Ser Ala Val His Leu Glu Asp Val Asn Ile Lys

485 490 495

Lys Ile Val Pro Leu Met Phe Ala Glu Ile Ile Ser Ala Val Gly Asn

500 505 510

Phe Leu Glu Ile Glu Tyr Lys Val Leu Gly Asp Asp Leu Val Lys Leu

515 520 525

Trp Leu Met Ile Phe Ala Leu Ser Ala Ile Asn Thr Ser Ser Lys Asp

530 535 540

Ile Glu Pro Cys Phe Leu Leu Ala Ser Lys Ile Ser Ser Leu Ser Ala

545 550 555 560

Gln Val Ile Cys Thr Phe Ser Glu Leu Arg Gln Val Ser Arg Ser Ile

565 570 575

Phe Ser Leu Cys Asp Ala Val Arg Ala Phe Arg Val Glu Gly Pro Asp

580 585 590

Gly Val His Gly Ser Phe Ser Val Ala Ser Leu Ser Ser Gln Glu Cys

595 600 605

Leu Gly Ser Leu Thr Thr Leu Leu Ser Ser Glu Thr Leu Met Gly Ala

610 615 620

Ile Arg Thr Ser Ile Lys Ser Met Pro Gln Gly Gln Ser Ser Arg Cys

625 630 635 640

Ile Glu Glu Leu Thr Ser Asp Leu Thr Glu Thr Leu Asn Trp Met Ala

645 650 655

Asp Cys Ser Phe Glu Asp Asp Val Ser Lys Leu Arg Glu Pro Ser Ile

660 665 670

Ala Arg Lys Ser Ile Phe Cys Gln Lys Ala Glu Leu Leu Gly Arg His

675 680 685

Leu Ser Glu Val Tyr Ala Ser Ile Leu Asp Ser Ile Thr Val Thr Val

690 695 700

Ser Asn Ser Thr Leu Val Gly Lys Ser Val Glu Arg Leu Val Asn Ala

705 710 715 720

Val Arg Arg Asn Phe Ser His Leu Val Arg Asn Lys Ser Lys Asn Ile

725 730 735

Asn Gly Phe Ile Ser Ser Ile Met Gly Lys Asn Val Ser Lys Lys Leu

740 745 750

His Ala Asn Arg Gln Lys Ile Pro Ser Phe Ser Trp Ile Phe Cys Leu

755 760 765

Phe Cys Arg Leu Tyr Ile Ser Cys Arg Ser Leu Tyr Gln Gln Ser Ile

770 775 780

Gly Leu Met Pro Pro Asp Val Ala Ile Asp Ala Thr Lys Leu Val Gly

785 790 795 800

Asn Pro Phe Ile Val Cys Ser Gly Lys Glu Trp Thr Asn Pro Thr Asn

805 810 815

Ile Leu Gly Lys Gly Tyr Phe Ala Leu Ile Asp Glu Asn Ser Asn Ser

820 825 830

Leu Leu Asp Val Ile Glu Ser Leu Ser Glu Ser Leu Ser Thr Asn Cys

835 840 845

Ala Ser Phe Ala Pro Leu Val Tyr Ile Phe His Val Met Val Leu Gln

850 855 860

Arg Leu Asn Asp Leu Asn Arg Gln Ile Lys Ala Phe Gln Phe Leu Leu

865 870 875 880

Glu Asp Asp Ala Trp Gln Ile Asp Asn Lys Asp Ile Gly Asn Thr Arg

885 890 895

Leu Leu Lys Glu Ser Cys Ser Leu Glu Ala Ala Lys Leu Met Ser Phe

900 905 910

Val Met Asn Tyr Val Lys Leu Leu Ser Ser Gly Glu Thr Gly Pro Phe

915 920 925

Gly Ser Tyr Asp Val Ser Ser Ser Trp Asp Leu Ser Leu Cys Ser Leu

930 935 940

Asp Glu Gly Ser Phe Pro Ile Ala Thr Trp Gln Leu Leu Cys Glu Asn

945 950 955 960

Ile Asp Val Trp Ser Ser His Val Ser Lys Lys Asp Leu Lys Asn Phe

965 970 975

Phe Ser Asn Leu Ile Arg Phe Ser Phe Thr Gln Lys Arg Ser Ser Leu

980 985 990

Asp Lys Glu Asn Asn Gly Thr Gln Ser Ser Gly Arg Glu Met Thr Leu

995 1000 1005

His Ser Val Ser Ile Gly Val Leu Cys Asp Thr Ile Ile Tyr Glu

1010 1015 1020

Lys Lys Val Ile Leu Lys Asn Leu Ala Ser Ser Phe Cys His Ala

1025 1030 1035

Leu Lys Lys Ser Phe Ser Phe Val Thr Asn Ser Asp Gly Asp Asn

1040 1045 1050

Val Phe Leu Asp Thr Ser Pro Asp Leu Met Glu Thr Ile Ser Asn

1055 1060 1065

Leu Glu Asn Glu Lys Leu Ile Gly Thr Gly Ser Gly Ala Thr His

1070 1075 1080

Ala His Cys Leu Asp Lys His Trp Ile Cys Glu Asp Phe Leu Asn

1085 1090 1095

Phe Phe Ser Ala Val Pro Gly Phe His Ala Asn Ser Lys Ala Phe

1100 1105 1110

Ile Arg Leu Ile Asn Tyr Ile Leu His Leu Glu Arg Leu Leu Leu

1115 1120 1125

Leu Lys Leu Leu Gly Leu Arg Cys Glu Ser Cys Asn Pro Met Lys

1130 1135 1140

Leu Leu Arg Leu Phe Ile Cys Cys Arg Arg Ala Leu Ile Asn Leu

1145 1150 1155

Ile Leu Lys Phe Gly Lys Glu Cys Pro Glu Ala Arg Gln Tyr Leu

1160 1165 1170

Ser Phe Ser Asn Lys Asn Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Val Trp Phe

1175 1180 1185

Leu Arg Ser Val Gln Glu Ile Val Gly Ser Ser His Lys Ile Phe

1190 1195 1200

Asp Glu Cys Thr Asp Glu Val Asn Arg Leu Met Phe Ser Leu Leu

1205 1210 1215

Asp Lys Thr Ser Glu Leu Phe Ser Thr Leu Ala Ser Leu Asn Ser

1220 1225 1230

Ser Val Tyr Leu Phe Asp Leu Lys Lys Gln Ile Glu Ser Ser Leu

1235 1240 1245

Asp Gly Ser Pro Ile Lys Lys Glu Thr Ser Glu His Asn Asp Gln

1250 1255 1260

Ala Phe Asp Ile Val Glu Val Ser Ala Leu Glu Cys Val Arg Ser

1265 1270 1275

Met Ala Glu Leu Leu Gln Lys Thr Ala Thr Gly Ile Pro Val Thr

1280 1285 1290

Ile Lys Asp Ser Lys Cys Val Ile Lys Ile Glu Asp Cys Arg Asn

1295 1300 1305

Thr Val Cys Trp Lys Arg Leu Ser Cys Ser Met Ser Cys Ile Gly

1310 1315 1320

Gly Phe Leu Gln Gly Leu Asn Ser Ala Leu Glu Ser Thr Phe Asn

1325 1330 1335

Asp His Pro Ile Ala Ser Pro Glu Asp Arg Lys Met Leu Leu Gln

1340 1345 1350

Tyr Cys Ser Arg Phe Ser Ser Tyr Val Ala Lys Phe Gly Thr Phe

1355 1360 1365

Val Asp Ile Cys Val His Val Leu Phe Met Asp Asn Lys Asp Ser

1370 1375 1380

Ala Ser Ile Asp Leu Val Ser Val His Leu Pro Gln Glu Leu Asp

1385 1390 1395

Cys Ala Asn Gly Phe Leu Asn Ile Glu Ala Ile Met Asp Glu Leu

1400 1405 1410

Thr Lys Cys Gly Ser His Gly Val Asp Leu Ser Lys Ile Gln Tyr

1415 1420 1425

Met Glu Asn Val Leu Leu Glu Asn Leu Leu Lys Gly Glu Cys Pro

1430 1435 1440

Leu Ile Ser Phe Thr Leu Arg Glu Ile Tyr Ser Ile Ser Ala Ala

1445 1450 1455

Ile Ile Lys Phe His Gly Tyr Leu Ser Phe Ser Ser Asp Val Ser

1460 1465 1470

Arg Gln Thr Cys Ser Pro Val Glu Gln Leu Ser Leu Gly Thr Met

1475 1480 1485

Leu Gly Ile Ala Phe Ile Thr Leu Gln Lys Val Ala Asp Met Ser

1490 1495 1500

Ser Trp Pro His Met Phe Cys Leu Val Trp Ile Asp Gly Val Leu

1505 1510 1515

Arg Tyr Leu Glu Val Leu Gly Ser Ala Phe Thr Leu Ser Glu Leu

1520 1525 1530

Asn Ile Ser Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Ile Ile Asn Ala Leu Leu

1535 1540 1545

Arg Ala Val Gly Lys Cys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Asn Ala Thr

1550 1555 1560

Leu Pro Thr His Glu Ile Gly Ser Ser Thr Lys Thr Leu Gln Leu

1565 1570 1575

Gln Asn Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Pro Lys Asp Phe Ile Asp Thr

1580 1585 1590

Gln Asn Arg Leu Asn Ser Leu Lys Ser Arg Leu Arg Leu Val Leu

1595 1600 1605

Gly Lys Phe Val Ser Ile Ala Ser Asn Thr His Leu Asn Ala Ala

1610 1615 1620

Leu Gln Val Ile Glu Arg Ala Leu Val Gly Val Asn His Cys Ser

1625 1630 1635

His Ser Ile Tyr Gln Ile Tyr Thr Gly Asn Pro Asp Gly Gly Thr

1640 1645 1650

Val Ser Ser Asp Val Ala Ala Gly Ile Asp Cys Leu Tyr Met Ile

1655 1660 1665

Leu Asp Phe Val Pro Gly Asn Lys Arg Val Phe Lys Arg Thr Val

1670 1675 1680

Pro Gly Leu Val Gly Ala Leu Phe Asn Ile Ile Leu His Leu Gln

1685 1690 1695

Ser Pro His Ile Phe Tyr Ser Gln Asn Leu Pro Pro Gln Gly Ser

1700 1705 1710

Val Phe His Pro Asp Ala Gly Ala Thr Val Leu Met Cys Val Glu

1715 1720 1725

Val Ile Thr Ser Phe Val Gly Arg His Ser Phe Gln Ile Asp Ala

1730 1735 1740

Ser His Val Ser Gln Cys Leu Leu Val Pro Val Thr Leu Phe Lys

1745 1750 1755

Glu Phe Lys His Leu Leu Ala Lys Tyr Cys Asn Gln Ser Val Gln

1760 1765 1770

His His Gly Asp His Ala Glu Tyr Ile Leu Asp Arg Gln Phe Ser

1775 1780 1785

Val Asp Ile Tyr Ala Ala Cys Cys Lys Leu Leu Cys Thr Thr Leu

1790 1795 1800

Arg His Gln Gln Arg Glu Ile Gly Trp Cys Val Ala Leu Leu Glu

1805 1810 1815

Asp Ser Val Ser Ile Leu Leu Gly Cys Leu Glu Ser Thr Asp Ser

1820 1825 1830

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1835 1840 1845

Ala Leu Lys Cys Ala Ser Phe Phe Arg Arg Ile Tyr Glu Glu Met

1850 1855 1860

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1865 1870 1875

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1910 1915 1920

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1925 1930 1935

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1940 1945 1950

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gcactactct tcggcaccaa 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gggtttctct ctgctggcg 19

Claims (10)

1.一种玉米籽粒大小基因ZmUrb2，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的玉米籽粒大小基因ZmUrb2，其特征在于，其CDS序列如SEQ IDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的玉米籽粒大小基因ZmUrb2，其特征在于，所述基因的亚细胞定位在细胞核。

4.一种权利要求1所述的玉米籽粒大小基因ZmUrb2的表达产物，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一对扩增玉米籽粒大小基因ZmUrb2的克隆引物，其特征在于，其碱基序列如SEQ IDNO.4 和SEQ ID NO.5所示。

6.一种扩增玉米籽粒大小基因ZmUrb2的表达载体35S::YFP-ZmUrb2，其特征在于，其碱基序列含ZmUrb2基因的cDNA碱基序列。

7.权利要求1所述的玉米籽粒大小基因ZmUrb2 在玉米对抗生素的响应中的应用。

8.根据权利要求7所述的在玉米对抗生素的响应中的应用，其特征在于，所述抗生素为卡那霉素，潮霉素，壮观霉素，放线菌素，氯霉素，链霉素中的至少一种。

9.权利要求1所述的玉米籽粒大小基因ZmUrb2在玉米体内Pre-rRNA 加工中的应用。

10.权利要求1所述的玉米籽粒大小基因ZmUrb2在玉米遗传育种中的应用。