CN112375130B

CN112375130B - 玉米穗长基因和分子标记及其应用

Info

Publication number: CN112375130B
Application number: CN202011358613.4A
Authority: CN
Inventors: 严建兵; 罗芸; 张明亮; 刘喻; 李文强
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2040-11-27
Also published as: CN112375130A

Abstract

本发明涉及玉米穗长基因ZmEL1，启动子，与之连锁的分子标记，及其在筛选穗长性状和培育长穗品种中的应用，属于分子遗传学领域。本发明公开了玉米穗长基因ZmEL1，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2‑SEQ ID NO.3任意一个所示；所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。同时，本发明还公开了一个启动子序列(SEQ ID NO.4‑SEQ ID NO.7)以及与其紧密连锁的分子标记S2、S3、S4以及该标记的检测引物对(SEQ ID NO.8‑SEQ ID NO.16)和检测方法。进一步地，本发明提供了利用分子标记筛选玉米穗长性状和增加玉米穗长的方法。

Description

玉米穗长基因和分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及玉米穗长基因ZmEL1，启动子和与之连锁的分子标记及其在筛选玉米穗长性状和培育长穗玉米品种中的应用，属于分子遗传学领域。

背景技术

玉米是我国重要的粮食和饲料作物，除此之外，还是医疗、化工和酿造等许多行业的不可或缺的原料，在我国国民经济中发挥重要的作用。玉米的产量是单位面积的穗数以及单穗产量等因素协调发展的结果，因此对决定这些因素的株型及穗部性状进行遗传研究对产量的遗传改良具有重要意义。然而这些性状多为多基因控制的数量性状，遗传机制比较复杂，且容易受到环境条件的影响。

玉米产量由穗行数、行粒数和籽粒重构成。一般而言，穗长越长、行粒数越多，籽粒发育的可能性空间越大。因此，穗长是玉米产量性状的重要组成因子，属于复杂的数量性状，

如今，已经发现的玉米穗长基因或数量性状位点包括第四染色体上的qEL4(周子键.玉米穗长qEL4和穗位高qEH1的验证和定位[D].河南农业大学，2014.)，第一染色体279.9M-283.4M物理区间内的ZmEL-1(华中农业大学.控制玉米穗长QTL位点的分子标记引物及应用：CN201811561800.5[P].2019-03-19.)，第七染色体上的qEL7.2(华中农业大学.玉米基因ZmACO2在提高玉米产量中的应用：CN201910201675.5[P].2019-05-10.)。

对玉米穗长性状的遗传解析及优良基因型的挖掘，不仅能够加快对穗长性状遗传机制的剖析，也能为玉米产量性状改良工作提供优良的基因资源和可用的分子标记，具有很重要的理论及应用价值。

为解决上述问题，本发明利用玉米关联群体定位到一个控制玉米穗长性状的基因ZmEL1，并分析了基因的启动子序列，鉴定到与与之连锁的分子标记，利用上述基因、标记可以筛选玉米穗长性状，并培育长穗玉米品种，从而提高玉米产量。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一个影响玉米穗长性状的基因ZmEL1的核酸序列及其编码的氨基酸序列。

本发明的目的之二在于提供了一个与玉米穗长性状相关的启动子以及与其紧密连锁的分子标记S2、S3、S4。

本发明的目的之三在于公开一种利用分子标记鉴定和筛选玉米穗长性状的方法。

本发明的目的之四在于公开一种改良玉米穗长性状的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种蛋白，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有与SEQ ID NO.1所示的序列相同功能的序列。

本发明还提供了一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的蛋白；在一些实施方案中，所述核酸的核苷酸序列或互补序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3任意一个所示。

本发明还提供了一种启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列或互补序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.7任意一个所示。

本发明还提供了一种分子标记，其特征在于，所述标记包括S2、S3、S4标记任意一个，其中S2标记位于SEQ ID NO.4所示序列第452位碱基，呈C[T]多态性；S3标记位于SEQ IDNO.4所示序列第919位碱基，呈C[G]多态性；S4标记位于SEQ ID NO.4所示序列第1183位碱基，呈C[T]多态性。

本发明还提供了上述分子标记的检测方法，其特征在于，所述的分子标记的检测方法采用竞争性等位基因特异性PCR方法；在一些实施方案中，所述竞争性等位基因特异性PCR扩增采用的引物对由引物F1、F2和引物R组成，其中检测S2标记的引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，引物R的核苷酸序列如SEQID NO.9所示；检测S3标记的引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；检测S4标记的引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定玉米穗长性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)依次检测待测材料中上述的S2-S3-S4分子标记；(2)如果检测结果为T-G-C或C-C-C或C-G-C或C-G-T，待测材料将表现长穗性状；否则，待测材料将表现短穗性状；

本发明还提供了一种增加玉米穗长的方法，其特征在于，在待改良玉米材料中提高上述蛋白的表达和/或活性，选择玉米穗长增加的植株；在一些实施方案中，上述增加蛋白表达的方法为使用高活性启动子驱动编码蛋白的核酸序列表达；在一些实施方案中，上述的高活性启动子选自SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.17任意一个所示。

本发明还提供了利用上述的蛋白、核酸、分子标记、方法在玉米穗长育种中的应用。

与现有的技术相比，本发明的有益效果是，本发明提供的ZmEL1基因及其编码的蛋白具有调控玉米穗长性状的功能，该基因的功能是之前的公开资料中未报道的。本发明鉴定到的启动子具有高转录活性，能够用来激活目的基因的表达。本发明还提供了与ZmEL1紧密连锁的功能性分子标记S2、S3、S4以及标记的检测方法，能够从玉米群体中特异地鉴定出具有不同穗长表现的基因型，并对玉米品种的穗长性状进行辅助鉴定和改良，从而获得长穗玉米品种，增加玉米产量。

附图说明

图1玉米穗长QTL的定位结果。a：在1号染色体上30-70Mb全基因组关联信号。黑色虚线代表全基因关联分析显著性的阈值。b：QTL区间内基于玉米自交系B73 V2版本的基因组信息4个注释基因的位置分布。I：GRMZM2G329040，II：GRMZM2G703565，III：GRMZM2G008490；IV：AC208571.4-FG001。图2QTL区间内的4个基因在玉米自交系YU87-1和BK幼穗中的相对表达量。Relative Expression：相对表达量；p：统计分析P值。

图3基因编辑、超表达载体的载体图以及Mutator介导的突变体插入示意图。a：CRISPR-Cas9基因编辑载体图；b：超表达载体图；c：突变体插入示意图，在ATG上游1347bp位置插入Mutator7介导的转座子。

图4ZmEL1在关联群体中的单核苷酸多态性(SNP)以及编码氨基酸在物种中的保守性。a：ZmEL1在关联群体中存在多个与穗长显著关联的单核苷酸多态性位点(SingleNucleotide Polymorphism，SNP)，其中4个位于启动子区，11个位于编码区，2个位于3’调控区。位于编码区的11个SNPs，9个SNPs造成错义突变，2个造成同义突变。字母表示SNP类型，数字表示在基因序列上的位置，以起始密码子为1；ZmEL1^SEL代表短穗基因型，ZmEL1^LEL代表长穗基因型；b：9个造成错义突变的氨基酸(黑框标识，数字表示位置)在各物种中并不保守。图5ZmEL1表达量与穗长显著相关。a：ZmEL1中SNP位点与穗长关联分析结果；b：ZmEL1基因S4位点两种基因型与穗长的相关性；c：ZmEL1基因S4位点两种基因型与基因表达量的相关性；d.ZmEL1基因表达量和穗长的相关性及对应的S4位点基因型。Relative Expression：相对表达量；Ear length：穗长；p：统计分析P值；n：调查的样本数，阳性/阴性。

图6启动子区SNP对基因表达量的影响。a：双荧光报告系统表达载体示意图；b：各种不同SNP组合的启动子活性；ZmEL1^BK：BK自交系中ZmEL1的启动子；ZmEL1^YU87-1：YU87-1自交系中ZmEL1的启动子；ZmEL1^YU87-1-S1*：YU87-1自交系中ZmEL1的启动子突变S1位点；ZmEL1^YU87 ^-1-S2*：YU87-1自交系中ZmEL1的启动子突变S2位点；ZmEL1^YU87-1-S3*：YU87-1自交系中ZmEL1的启动子突变S3位点；ZmEL1^YU87-1-S4*：YU87-1自交系中ZmEL1的启动子突变S4位点；LUC/REN：报告基因Luc荧光信号与内参基因Ren荧光信号的比值c：3个SNPs的单倍型检测基因型与表达量和穗长性状的相关性。Relative Expression：相对表达量；Ear length：穗长；p：统计分析P值；n：调查的样本数，阳性/阴性。

图7 ZmEL1启动子中3个SNPs的几种组合在CUBIC群体中对玉米穗长的影响。柱状图中的数字表示分析的材料数；显著性用单因素方差分析计算获得，“*”代表差异显著；Earlength：穗长。

图8 20个玉米自交系中S4位点基因型与ZmEL1表达量和穗长的关系。1：CML189，2：CIMBL133，3：CML325，4：CIMBL14，5：CML134，6：CIMBL150，7：CF3，8：TY6，9：CIMBL146，10：YU87-1，11：GEMS9，12：By855，13：GEMS18，14：JH96C，15：Ji846，16：GEMS45，17：JH59，18：GEMS1，19：LY042，20：Gy386。1-10：S4为CC；11-20：S4为TT；Relative Expression：相对表达量。

图9在3个不同F_2:3群体中检测KASP标记S4与穗长表型的相关性。a：647×ZHNEG58，647×MO17，TY1×MO17构建的F_2:3群体中玉米穗长与基于S4开发的KASP标记显著相关；CC：基因型为纯合碱基C；TT：基因型为纯合碱基T；C/T：基因型为杂合碱基；b：KASP标记S4在3个F_2:3群体基因型分型示意图。C：基因型为纯合碱基C；T：基因型为纯合碱基T；H：基因型为杂合碱基。

图10利用3个KASP标记S2，S3，S4检测玉米自交系材料的基因型。在随机挑选的124份玉米自交系中进行基因型分型检测。fr,hr代表处理后的荧光信号值。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

术语“性状”是指植物或特定的植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特性。在一些情况下，此特性对人眼是可见的，诸如种子或植株大小，或者可通过生物化学技术测量，诸如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖或氮浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农艺观察结果诸如渗透胁迫耐受性或收率。

“转基因”是指其基因组因异源核酸(诸如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株。本文所用的术语“转基因”包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些，并且不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)改变。

“植物”包括对整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及它们的子代的标引。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。“子代”包含植物的任何后续世代。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。

阴性或对照植物可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32P的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探针法)。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度(异源探针法)。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为pH 7.0至8.3下，少于约1.5M Na离子，通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度条件为：当用于短探针时(例如10到50个核苷酸)，至少约30℃；当用于长探针时(例如大于50个核苷酸)，至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)杂交，50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。DNA-DNA杂合体的Tm(热力学熔点)可以近似自Meinkoth andWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的克分子浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而L是杂合体的碱基对长度。Tm是(确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使Tm降低约1℃；因而，可以调节Tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将Tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述Tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述Tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述Tm低11℃下进行杂交和/或清洗。

在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。

在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录形式)的任何过程。一般的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(LCR)以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。

当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“关联”。

本文所用术语“数量性状基因座”或“QTL”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群或子代中)，具有与表型性状的差异表达关联的至少一个等位基因的多态基因座。QTL能够通过单基因机制或多基因机制发挥作用。

本文所用术语“QTL定位”指采用类似单基因定位的方法将QTL定位在遗传图谱上，确定QTL与遗传标记间的距离(以重组率表示)。根据标记数目的不同，可分为单标记、双标记和多标记几种方法。根据统计分析方法的不同，可分为方差与均值分析法、回归及相关分析法、矩估计及最大似然法等。根据标记区间数可分为零区间作图、单区间作图和多区间作图。此外，还有将不同方法结合起来的综合分析方法，如QTL复合区间作图(CIM)多区间作图(MIM)、多QTL作图、多性状作图(MTM)等。

本文所用术语“分子标记”指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。

本文所用术语“主效基因”指由单个基因决定某一性状的基因称为主效基因，本文所述术语“微效基因”指对于同一性状的表型来讲，几个非等位基因中的每一个都只有部分的影响，这样的几个基因称为累加基因或多基因。在累加基因中每一个基因只有较小的一部分表型效应，所以又称为微效基因。

本文所用术语“自交系”指在人工控制自花授粉情况下，经若干代，不断淘汰不良的穗行，选择农艺性状较好的单株进行自交，从而获得农艺性状较整齐一致、遗传基础较单纯的系。

本文所用术语“回交”指子一代和两个亲本的任一个进行杂交的方法。

本文所用术语“杂交”或“杂交的”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植株)。该术语包括有性杂交(一株植株被另一株植株授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植株时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。

本文所用术语“回交”指其中杂交子代反复与其中一个亲本回交的过程。在一个回交方案中，“供体”亲本指具有将被渗入的期望基因或基因座的亲本植株。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植株。初始杂交产生F₁代；然后，术语“BC₁”指轮回亲本的第二次使用，“BC₂”指轮回亲本的第三次使用等。

本文所用术语“紧密连锁”指两个连锁基因座间重组的发生频率为等于或小于约10％(即在基因图谱上的分离频率不超过10cM)。换句话说，紧密连锁的基因座至少90％的情况下共分离。当标记基因座显示与期望性状(例如病原体抗性)共分离(连锁)的显著概率时，它们在本发明中尤其有用。紧密连锁的基因座如标记基因座和第二基因座可显示10％或更低、优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。在某些情况下，两个不同标记能够具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记彼此足够接近使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。

厘摩(“cM”)是重组频率的量度单位。1cM等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的1％的概率。

“有利等位基因”是在特定位点的等位基因，它赋予或有助于农学上所期望的表型，例如提高的玉米穗长，并允许对具有农学上所期望表型的植株的鉴定。标记的“有利”等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因。

“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。就每个基因图谱而言，基因座之间的距离通过它们间的重组频率进行测量，并且基因座之间的重组可使用多种标记进行检测。基因图谱是作图的种群、使用的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。一个基因图谱与另一个基因图谱在基因座之间的顺序和遗传距离可能不同。然而，使用常见标记的通用框能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用常见标记的框架来鉴定在各个个体基因图谱上的标记位置和受关注的基因座。

“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。

“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的种群分离、以及重组频率的标准遗传原则进行。

“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。

术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成，它与可观察到的性状(表型)形成对照。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已经从其亲本中继承所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座上的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或者更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。

“种质”指个体(例如植株)、一组个体(例如植株品系、品种或家族)、或来源于品系、品种、物种或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植株的细胞、种子或组织，或者植株部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。

“标记”是用作参考点的核苷酸序列或其编码产物(例如蛋白)。对于用于检测重组的标记，它们需要在被监测的种群内检测差异或多态性。对于分子标记，这意味着DNA水平的差异是由于多核苷酸序列差异(例如SSR、RFLP、FLP和SNP)。基因组可变性可为任何一种起源，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件或转座因子的存在和序列。分子标记可来源于基因组或表达的核酸(例如EST)，并且也可指用作探针或引物对的核酸，所述引物对能够通过使用基于PCR的方法扩增序列片段。

对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同工酶标记检测、通过等位基因特异性杂交进行的多核苷酸多态性检测(ASH)、植株基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。

“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座的多个多态性核苷酸序列的其中一个，它就标记基因座而言是多态的。

“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸分子探针。包含标记基因座的30个或更多邻接核苷酸(“所有或部分”标记基因座序列)的标记探针可用于核酸杂交。作为另一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。

如上所述，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标记”可用于指遗传标记，或其用作参照点的编码产物(例如蛋白质)。标记能够来源于基因组核苷酸序列或来源于表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA、cDNA等)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或两侧为标记序列的核酸序列，如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是可用于鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。作为另一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性杂交时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交，核酸是“互补的”。当位于插入缺失区域，例如本文所述的非共线区域时，本文所述的一些标记也称为杂交标记。这是因为，插入区域是关于无插入的植株的多态性。因此，标记仅需要指明插入缺失区域是否存在。任何合适的标记检测技术都可用于鉴定此类杂交标记，例如KASP技术。

本发明从一个玉米关联群体中定位到一个影响玉米穗长性状的QTL，qEL1，该位点位于第1号染色体52.9kb的区间内，包括4个有功能注释的基因。进一步通过基因表达、基因编辑敲除、超量达、突变体分析等工作，证实GRMZM2G00849是qEL1 QTL区间内控制玉米穗长性状的基因，命名为ZmEL1。

本发明进一步通过确定ZmEL1基因的转录本，确定了基因的编码区核苷酸序列和编码的蛋白序列。

本发明通过测试不同玉米材料中的启动子活性，找到了高活性的启动子序列，利用这些高活性启动子可以驱动其他基因的高表达。

本发明还进一步分析了不同穗长表型的玉米材料中的变异位点，找到了3个与性状连锁的位于基因启动子区的功能性SNP变异位点S2、S3、S4。

基于这些SNP位点，本发明开发了KASP标记检测方法，能够鉴定S2、S3、S4的基因型，并依据基因型鉴定结果选育长穗玉米品种。

本发明还提供了一种增加玉米穗长的方法，利用玉米泛素基因启动子ubiquitin或ZmEL1基因的高活性启动子提高ZmEL1蛋白的表达和/或活性，能够增加玉米穗长，并进而增加产量。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1玉米穗长QTL的定位

本发明从一个玉米关联群体中定位到一个玉米穗长QTL。该玉米关联群体收集了来自美国的54份、国际玉米与小麦改良中心的235份以及国内的238份具有广泛表型变异和遗传变异的527份玉米自交系材料(关联群体的构建方法参照：Yang X,Gao S,Xu S,ZhangZ,Prasanna BM,Li L,Li J,Yan J.2010.Characterization of a global germplasmcollection and its potential utilization for analysis of complex quantitativetraits in maize.Molecular Breeding 28(4):511-526.)。在2009年中国西安、三亚、云南和2010年广西、云南调查关联群体内玉米穗长表型值，并利用最佳线性无偏预测法(bestlinear unbiased predictions，BLUP)评估遗传效果，获得BLUP后的玉米穗长表型值。其中最有代表性的部分玉米自交系穗长表型值如下—BK：11.21cm；ZONG3(综3)：10.62cm；YU87-1，9.39cm；SC55：9.34cm；RY732：9.08cm；XZ698：9.08cm；GEMS46：9.03cm；CIMBL49：8.94cm；SK：8.89cm；HZS(黄早四)：8.51cm。

进一步将关联群体的513份自交系Illumina Maize SNP50 BeadChip基因型数据和368份RNA-seq数据，153份Mazie600 K芯片数据以及本实验室独自测序的522份GBS数据进行整合，获得1.25million的基因型数据(基因型数据的整合方法参照：Liu H,Luo X,NiuL,et al.Distant eQTLs and Non-coding Sequences Play Critical Roles inRegulating Gene Expression and Quantitative Trait Variation in Maize[J].MolPlant,2017,10(3):414-426.)，并结合表型数据进行全基因组关联分析，用于全基因组关联分析的SNP标记通过MAF≥0.05的标准过滤。不同来源的基因型控制同一群体结构和亲缘关系(368份材料)，采用混合线性模型MLM的方法(Yu J and Buckler E S.Geneticassociation mapping and genome organization of maize[J].Curr Opin Biotechnol,2006,17(2):155-60.)，并利用Tassel 3.0软件(使用方法参照：Bradbury P J,Zhang Z,Kroon D E,et al.TASSEL:software for association mapping of complex traits indiverse samples[J].Bioinformatics,2007,23(19):2633-5.)进行全基因组关联分析。分析结果显示，玉米第一号染色体上能够检测到一个控制玉米穗长的QTL，包含52.9kb的区间范围，将该QTL命名为qEL1(图1)。

实施例2玉米穗长基因的克隆和功能验证

进一步分析qEL1区间的基因组信息，发现在该QTL区间内，包含4个有功能注释的基因(基于玉米B73参考基因组v2版本)，分别为I：GRMZM2G329040，II：GRMZM2G703565，III：GRMZM2G008490和IV：AC208571.4-FG001。分别取短穗和长穗玉米自交系YU87-1和BK的玉米幼穗样品(取样时期为幼穗长到约2-5mm时)，抽提RNA并将其反转录成cDNA(操作方法参照华越洋试剂盒说明书)，再利用实时荧光定量PCR对这上述4个候选基因在YU87-1和BK幼穗组织中的表达量进行检测，以玉米内参基因Zm00001d010159表达量为参照(引物见表1)。每一个基因表达量的检测做2个生物学重复和3个技术重复，利用单因素方差分析基因表达量差异。结果显示基因I和III的表达量在短穗和长穗玉米自交系YU87-1和BK中存在显著差异，而基因II和IV表达量无显著差异(图2)。

表1基因表达检测所用的引物序列

为了进一步验证候选基因的功能，利用CRISPR-Cas9基因编辑系统，对玉米基因组QTL区间内的上述4个基因进行敲除，并通过敲除后玉米的穗长表型判断基因和性状的关系。利用在线软件CRISPR-P 2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)在4个基因CDS区域上各选取两个靶标编辑位点设计gRNA(序列见表2)。在上海生工公司直接合成约2000bp的“U6-promoter1-gRNA1-sgRNA-U6 promoter2-gRNA2-sgRNA”融合单元序列，利用双酶切体系将其从中间载体PUC57上切下，并通过同源重组的方法将酶切片段连接到骨架载体CPB-ZmUbi-hspCas9上(载体图见图3a)。将重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，检测目标序列，序列检测无误后交未米生物科技(江苏)有限公司进行基因遗传转化玉米自交系KN5585。对获得的T0代转化植株，每个基因的两个靶标位点进行检测。检测通过PCR扩增后测序，根据测序序列分析编辑类型。挑选大片段缺失的材料进行后续的表型分析。分析结果表明，GRMZM2G008490编码区缺失428bp的材料穗长相对于野生型显著变短。而GRMZM2G329040缺失355bp和1006bp，GRMZM2G703565缺失21bp以及AC208571.4-FG001缺失248bp的材料穗长相对于野生型材料都没有明显变化(表3)。因此，结合基因表达分析数据和基因编辑材料性状鉴定的结果，初步认为GRMZM2G008490是qEL1 QTL区间内控制玉米穗长性状的基因，命名为ZmEL1。

表2基因编辑的靶标序列和检测引物信息

表3基因编辑材料的穗长鉴定结果

穗长值以平均值±标准差表示，单位cm。差异显著性用单因素方差分析计算。

为了进一步确认ZmEL1基因调控玉米穗长性状的功能，通过调查基因超表达植株和突变体植株的穗长性状来验证基因的功能。超表达材料的创制过程如下：首先用玉米自交系B73的幼穗cDNA为模板，以OE1-F 5’-gacaaacgcactagtatcccgggATGAGGACATCGGAAGTGGG-3’和OE1-R 5’-tcaccatggcgcgccttcccgggAACCCAACTCCAGCCGCAT-3’为引物，将ZmEL1基因ATG至不包含终止子的序列扩增出来。再利用ClonExpress II试剂盒(www.vazyme.com)将扩增序列重组到改造的双元载体pZZ-EYFP上，构建好的载体ZmEL1基因编码区前是玉米泛素基因启动子ubiquitin(序列如SEQ ID NO.17所示)，后面与YFP蛋白标签序列融合，超表达载体图见图3b。重组载体至转化大肠杆菌感受态DH5α，获得阳性克隆，目标序列检测无误后交未米生物科技(江苏)有限公司转化玉米自交系KN5585。获得的基因超表达材料中ZmEL1基因在幼穗中的表达量和穗长都显著高于野生型对照(表4)。

从Maize Stock Center(https://maizecoop.cropsci.uiuc.edu/)处获得了一个在ZmEL1基因启动子区域插入Mutator7转座子的突变体，称为mum1(突变体结构见图3c)。通过对mum1突变体穗长性状调查的结果发现，ZmEL1基因在mum1突变体幼穗组织(发育至2-5mm)中的表达量相对于野生型玉米幼穗组织中的表达量显著降低，同时玉米穗长也明显变短(表4)。

表4突变体mum1及4个超表达转化体材料ZmEL1基因表达量及穗长性状表现

WT：野生型；mum1：ZmEL1启动子区插入一个Mutator7介导的转座子；OE1-4：4个独立转化的超表达材料；N：材料数，阳性/阴性。表达量和穗长以平均值±标准差表示，差异显著性用单因素方差分析计算获得。

因此，结合基因表达分析数据和基因编辑、突变体、超表达材料性状鉴定的结果，确认ZmEL1(GRMZM2G008490)是qEL1 QTL区间内控制玉米穗长性状的基因。

实施例3 ZmEL1基因转录本和编码蛋白序列分析

根据玉米参考基因组上的注释信息，ZmEL1(GRMZM2G00849)编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因组序列如SEQ ID NO.2所示。基因功能注释为未知蛋白，并无公开资料显示该基因控制玉米穗长性状。

根据Gramene数据库中玉米v4版本基因组信息发现，ZmEL1基因总共有20个预测的转录本，并不知道哪一个是基因真正的转录本。结合玉米V3版本基因组的信息，本发明对v4版本中的10种转录本，针对每种转录本分别设计3对从ATG至TGA的引物，以Yu87-1、BK和B73玉米2-5mm幼穗的cDNA做模板进行PCR扩增，发现只有transcript25能在Yu87-1、BK以及B73中扩增出来。基于该扩增出的序列，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification ofc DNA ends，RACE)，进一步获得了该基因5'和3'末端的序列(实验操作依据Clontech公司SMART RACE cDNA amplifcation kit试剂盒说明书进行)。通过测序确定了ZmEL1基因的蛋白编码序列(如SEQ ID NO.3所示)。

实施例4 ZmEL1基因启动子SNP位点分析

为了进一步挖掘基因的功能位点，对各种不同穗长表现的玉米材料中ZmEL1基因上下游的序列设计5对特异引物(引物序列见表5)，并利用引物对进行PCR扩增，对扩增产物进行序列分析，利用MAFFT7.0进行序列比对，并使用BioEdit进行手工调整，最后使用TASSEL3.0软件提取SNP和InDel。选取等位基因频率大于0.05的位点用作后续的关联分析。通过最佳线性无偏估计预测，计算多态性位点间的LD(连锁不平衡)值，然后利用R包中LDheatmap绘制LD block图。结合自交系的群体结构(Q)和系谱关系(K)，采用TASSEL 3.0中的MLM Q+K模型(Yu J and Buckler E S.Genetic association mapping and genomeorganization of maize[J].Curr Opin Biotechnol,2006,17(2):155-60.)，对基因定位关联群体中选取的448份自交系的ZmEL1基因型，结合5次试验的自交系穗长表型BLUP值，开展候选基因关联分析。结果显示，ZmEL1基因启动子区有4个SNP，编码区有11个SNP与穗长表型显著关联(图4a)。编码区的11个SNP有2个不改变氨基酸，其它9个SNP会改变氨基酸，但这些氨基酸在各物种中并不保守(如图4b)。同时对关联群体中的82份玉米自交系幼穗组织对QTL区域的4个基因的表达进行检测，将表达量和穗长表型进行相关性分析，发现玉米穗长性状与ZmEL1在幼穗中的表达量呈显著正相关，ZmEL1基因的表达量越高，玉米穗长越长，这一结果与在玉米自交系YU87-1和BK中的结果是一致的。同时还发现，以最显著SNP(S4)分单倍型，表达量和穗长在C和T两种单倍型中存在显著性差异(图5)。因此，ZmEL1启动子的变异会显著影响基因表达量，进而影响玉米穗长。

表5 ZmEL1全长及上下游序列分段扩增引物

利用promega公司的双荧光素酶报告系统(Dual Luciferase Reporter AssaySystem)进一步分析启动子的变异对基因表达量和穗长性状的影响(该系统的表达载体示意图见图6a)。利用引物对8490LUC-2F：5’-tctgcgatctaagtaAAACACGACCACGAAACTACCA-3’和8490LUC-2R：5’-agtaccggaatgccaCTCTTCTGCCGGCACAACTG-3’，将自交系YU87-1和BK中基因启动子区域约1.4kb的序列扩增出来，再将两段启动子序列分别亚克隆到pGreen II0800-LUC载体中，进行表达活性分析。结果显示，两段启动子均能驱动报告基因Luc的表达，且表达量(以LUC/REN值衡量)差异显著，这说明ZmEL1^YU87-1和ZmEL1^BK启动子活性存在显著差异。为了确认是哪一个SNP造成了这种影响，进一步在ZmEL1^YU87-1启动子序列基础上，将其它4个SNP位点分别突变成其在ZmEL1^BK中对应的碱基，再利用上述双荧光素酶报告系统分析每段序列的表达活性。结果显示，SNP1(S1)不影响启动子活性；SNP2(S2)中C碱基提高启动子活性，T降低启动子活性；SNP3(S3)中C碱基降低活性，而G碱基增加活性；SNP4(S4)中C碱基增加活性，而T碱基降低活性(图6b)。S4对启动子活性的影响大于S2和S3。同时，将这3个影响启动子活性的SNP在关联群体中再次进行单倍型分析，发现单倍型1(Hap1：S2-S3-S4基因型C-C-C)的表达量和穗长表型都显著高于单倍型2(Hap2：S2-S3-S4基因型C-C-T)和单倍型3(Hap3：S2-S3-S4基因型T-G-T)。单倍型2和单倍型3之间无论表达量还是穗长都不存在显著性差异(图6c)。因此，ZmEL1启动子中S2，S3，S4这3个SNPs与穗长显著关联，它们通过影响启动子的活性，进而影响表达量，最终影响穗长。根据S2，S3，S4变异影响启动子活性的结果可知，Hap1(S2-S3-S4：C-C-C)；Hap3(S2-S3-S4：C-G-C)；Hap5(S2-S3-S4：T-G-C)这3种单倍型的启动子活性较好，其中，Hap3(S2-S3-S4：C-G-C)的活性最高。在玉米人工合成群体CUBIC群体中(群体构建方法参照Liu H J,Jian L,Xu J,et al.High-Throughput CRISPR/Cas9Mutagenesis Streamlines Trait Gene Identification in Maize[J].Plant Cell,2020,32(5):1397-1413.)中验证的结果也显示，具有这3种单倍型的材料表现出更长的穗长(图7)。高活性的启动子全长序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示。启动子突变时得到的C-G-T组合(完整序列如SEQ ID NO.7所示)也有很高的启动子活性，然而该启动子在检测的群体中是不存在的，可以通过人工合成的方式获得该启动子。

实施例5玉米穗长显著相关的分子标记开法和检测方法

由于ZmEL1基因启动子区域的3个SNP(S2、S3、S4)会显著影响基因表达和玉米穗长性状，因此可以开发分子标记检测方法用于辅助筛选玉米穗长性状。

基于3个SNP处的序列，本发明开发了可用的竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)标记检测方法。KASP标记检测分别以S2、S3、S4所在碱基处上游20bp序列作为左引物S2f、S3f、S4f，S2、S3、S4的碱基分别作为左引物的第20个碱基，每个SNP位点获得2条左引物S2f1/S2f2、S3f1/S3f2、S4f1/S4f2。再使用引物设计网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在固定左引物f的情况下，通过primer blast获得右引物R，产物大小控制在60-80bp之间；各组左引物f1、f2前段分别需要加上接头序列A1、A2(A1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，A2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)序列获得扩增引物F1、F2。具体地，检测S2位点的F1、F2和R引物序列分别如SEQ ID NO.8-SEQ IDNO.10所示，检测S3位点的F1、F2和R引物序列分别如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.13所示，检测S4位点的F1、F2和R引物序列分别如SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.16所示。选用ULTRPAGE纯化方式对引物进行纯化。使用上述引物进行KASP标记检测的步骤如下：

(1)玉米基因组DNA提取：

1.取玉米叶片1.5g左右于液氮中研磨，转入2mL离心管中。

2.加预热至65℃的CTAB提取缓冲液750μl，迅速混匀。在65℃水浴锅内水浴30分钟左右，中途不时小心柔和摇动2-3次离心管。

3.取出离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，在摇床上摇动试管10分钟，直到溶液分层，下层为墨绿色，上层为浅黄色。

4.室温12000rpm离心10分钟，将上清转移到1.5mL离心管中。

5.向上清液中加入2/3体积预冷的异丙醇，小心混匀。放入-20度冰柜中放置30分钟。

6.然后4℃，12000rpm离心10分钟。

7.倒去上清液体，再加入1mL的75％乙醇，浸泡5分钟。再重复洗涤一次。然后将液体倒去，将离心管子放置30min，在常温吹干，加200μl水溶解DNA。

8.用1％琼脂糖检测DNA质量，并测定DNA浓度。DNA放置在-20℃冰箱备用。

(2)PCR反应：

将引物干粉溶解，F1、F2引物浓度为36μM，R引物浓度为90μM，将三种引物按体积比1:1:1混匀作为primer mix备用。PCR扩增体系：模板DNA 5μL，KASP PCR MIX 5μL，Primermix 0.14μL，补水至10μL。PCR扩增程序：94℃15min 1cycle；94℃20s；61-55℃60s(-0.6℃/cycle)10cycles；94℃20s 1cycle；55℃60s，30cycles。

(3)结果分析：

扩增结束后使用荧光定量仪读取信号，程序如下：25℃5s+Plate Read。条带读取完成后，选定荧光类型FAM、HEX、ROX，选择Allelic Discrimination进行分析，荧光信号值以FAM、HEX或者fr、hr来表示。

实施例6使用S2-KASP、S3-KASP和S4-KASP标记引物组合检测并筛选玉米材料

选择构建关联群体时使用的穗长有代表性的20份玉米自交系，使用S4-KASP标记引物(F1、F2和R引物序列分别如SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.16所示)，利用实施例5中的方法对这些自交系材料的最显著SNP位点S4进行检测，并检测每个材料的ZmEL1基因表达量。结果显示，S4位点的检测结果能够很好地区分这些材料的基因表达量和穗长性状(图8)。

再次使用S4-KASP标记，实施例5中的方法对人工构建的3个玉米F_2:3群体(分别为647×ZHENG58，647×Mo17，TY1×Mo17)中分离单株的S4位点进行检测，根据基因型结果将穗长表型分成3组，以CC和TT基因型对应的穗长数据进行单因素方差分析，发现在3个群体中，该KASP标记与穗长表型都显著相关，基因型为CC的材料穗长显著大于基因型为TT的玉米材料(图9)。

利用S2-KASP、S3-KASP和S4-KASP标记组合筛选基因型为S2-S3-S4：CC-CC-CC，S2-S3-S4：CC-GG-CC，S2-S3-S4：TT-GG-CC，S2-S3-S4：CC-GG-TT的材料，能够更加精准地对玉米自交系材料的穗长性状进行辅助选择。利用这3个KASP标记对124份材料构成的关联群体中的玉米自交系进行基因型分型，结果显示3个标记都能够将基因型进行比较明显地区分(图10)，而且基因分型的结果与序列测序结果是吻合的。因此可以用这3个KASP标记辅助来对玉米穗长性状进行筛选(表6)。

表6部分材料的分子标记检测及筛选结果

实施例7通过超表达ZmEL1基因改良玉米穗长性状

由于ZmEL1基因表达量增加能够增加穗长，而穗长又是重要的产量因子，因此对实施例2中获得的2个超表达独立转化体材料的田间农艺性状及收获后的籽粒性状进行了考察。玉米抽雄、吐丝和散粉性状的调查以玉米雄穗完全裸露在外的时间为抽雄时间，以雌穗出现花丝为吐丝时间，以雄穗主轴花粉有三分之一散粉为散粉时间，记录抽雄、吐丝和散粉日期后，与播种日期计算抽雄、吐丝和散粉天数。玉米完全开花后用长尺对玉米株高、穗位高、雄穗主轴长、雄穗分支数进行测量，并记录数据。对收获的玉米进行了行粒数、穗行数的测量。用籽粒考种机对玉米籽粒长、籽粒宽、百粒重进行测量。用电子称对玉米轴重以及每穗粒重进行了测量。对每个性状进行单因素方差分析。结果显示，2个超表达独立转化体开花期、株型及籽粒性状都没有变化，而穗长(数据见表4)、行粒数和籽粒重(表7)显著增加。因此，超表达ZmEL1(基因使用SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列的核酸分子均可，本实施例使用SEQ ID NO.3所示序列的核酸分子；启动子使用高活性启动子驱动，例如SEQ IDNO.4-SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.17所示序列的任意一个启动子，本实施例使用SEQ IDNO.17所示序列的启动子)能够通过增加穗长和行粒数，提高玉米的产量。

表7 ZmEL1超表达材料农艺性状及产量性状

表7 ZmEL1超表达材料农艺性状及产量性状(续表)

OE1，OE2：2个超表达材料；NT：受体对照；N：材料数，阳性/阴性。表型值以平均值±标准差表示，显著性用单因素方差分析计算获得。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 玉米穗长基因和分子标记及其应用

<130> 1

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 567

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 1

Met Arg Thr Ser Glu Val Gly Leu Val Met Glu Gly Trp Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Glu Lys Ala Val Met Met Gly Asp Val Glu Val Glu Lys Lys Asp

20 25 30

Glu Ile Leu Val Val Gly Lys Glu Glu Glu Gly Arg Val Ser Val Cys

35 40 45

Ile Pro Pro Arg Asn Ala Leu Leu Leu Met Arg Cys Arg Ser Asp Pro

50 55 60

Val Arg Met Ala Ala Leu Ala Thr Arg Phe Trp Gly Ser Pro Ala Ala

65 70 75 80

Ala Thr Val Glu Gln Val Asp Asn Glu Val Ala Gly Cys Leu Asn Asp

85 90 95

Asn Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu Ala Glu Ala Glu Pro Leu

100 105 110

Glu Cys Lys Asp Gly Ala Arg Cys Ser Ala Val Ser Val Lys Asp Leu

115 120 125

Lys Cys Glu Glu Cys Gly Ser Asp Glu Asn Asp Gly Ala Glu Ala Gly

130 135 140

Glu Ile Asn Gln Glu Lys Ala Glu Ala Glu Glu Ser Ser Lys Cys Gly

145 150 155 160

Asp Leu Val Glu Glu Lys Glu Gly Ala Ser Cys Arg Val Gly Val Glu

165 170 175

Glu Ala Gln Ile Val Arg Lys Asp Ala Glu Leu Glu Val Pro Leu Gly

180 185 190

Glu Val Thr Glu Met Glu Asn Gln Gly Pro Asp Met Val Glu Leu Val

195 200 205

Val Ser Glu Glu Glu Val Pro Gly His Glu Lys Val Asp Glu Glu Met

210 215 220

Met Gly Arg Arg Ser Ile Asn Ser Tyr Ser Pro Ser Ala Thr Leu Lys

225 230 235 240

Glu Asp Arg Thr Lys Leu Arg Arg Leu Ser Ser Arg Met Cys Val Ser

245 250 255

Thr Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ser Ser Asp Arg Val Gly Arg Arg His

260 265 270

Ser Phe Ser Ala Glu Met Glu Ala Arg Arg Ser Ser Phe Ser Ser Leu

275 280 285

Lys Asp Ser Arg Arg Ala Ser Phe Ser Ile Asp Arg Asp Gly Arg Arg

290 295 300

Trp Ser Phe Ser Ile Glu Gln Glu His Leu Val Ala Gln Pro Lys Val

305 310 315 320

Leu Met Ala Ser Arg Lys Gly Lys Lys Thr Ser Ser Glu Ala Glu Ser

325 330 335

Glu Lys Asp Cys Asp Val Val Ala Pro Asn Ser Ala Glu Glu Gly Gln

340 345 350

Glu Ser Tyr Asp Asp Gly Lys Glu Glu Asp Thr Thr Glu Asn Val Ala

355 360 365

Glu Glu Gly Lys Thr Lys Ser Ala Glu Ala Asn Gln Glu Val Glu Lys

370 375 380

Val Glu Thr Arg Ala Glu Glu Cys Glu Gly Gly Thr Val Pro Val Ile

385 390 395 400

His Arg Arg Lys Lys Ser Gly Glu Leu Pro Asp Cys Leu Leu Leu Met

405 410 415

Met Tyr Glu Pro Lys Leu Ser Met Glu Val Ser Lys Glu Thr Trp Val

420 425 430

Cys Ser Thr Asp Phe Val His Trp Lys Ser Tyr Gln Gly Lys Asn Asn

435 440 445

Arg Asn His Trp Gln Gln Lys Ala Ser Ala Ala Gly Thr Val Glu Thr

450 455 460

Lys Glu Lys Glu Asn Ala Glu Gly Thr Thr Ile Ala Asn Asp Val Gln

465 470 475 480

Glu Ser Lys Asp Pro Ser Thr Val Asn Ser Ala Val Pro Met Pro Cys

485 490 495

Pro Val Val Gln Lys Thr Pro Pro Leu Lys Pro Ala Thr Thr Glu Gln

500 505 510

Lys Leu Lys Leu Glu Leu Pro Pro Val Thr Asn Ala Ala Ala Tyr Ala

515 520 525

Pro Phe Val Leu Lys Arg Cys Lys Ser Glu Pro Met Arg Ser Ser Ala

530 535 540

Arg Leu Ala Pro Asp Ala Cys Phe Trp Lys Asp Arg His Arg Pro Leu

545 550 555 560

Asn Ala Ala Gly Val Gly Phe

565

<210> 2

<211> 3797

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 2

gcggagagcg gacgcgagcg gcggtgagag cggagggagg atcgataatc tagtagtgct 60

acaaagttcc ttaacaaaac acgaccacga aactaccact cctatacaag ggatggcctg 120

tagatccgtt atatcaagac ttgagcttgg ttgctcgagc gaatagcttt tgaatggaca 180

tgaagcgttc aaactctttt aacaaaacga agattttttt tctgaaatta tttcttttcc 240

gagaatactg cagagaaaac aaaatttctt ttattgcttc gaatgatcaa tctttttttt 300

tggaaagaag gaccaatcaa atgataatca tgctcgtaac ataatagcag agagtaggag 360

tgacaaaata gcaattttcc ctgataattt ggaccctgca acctccccta tccacagctc 420

acactcagag tcacagtcac caacaaactg ccagcgcacc accaacaaac cctaattatt 480

ccattcccca ccggcgaccg catctagcgg tccagtgtag cccaagcggc agccggcagg 540

cgcccagcag cagcattgca ggttgcagca aagcgagcga gagtgagaca gagctcacaa 600

gcctaacacc ctctctcctt cacctcccac atgcgctgat gcgccgcaag aagcacttgg 660

accggggtgg cggcggacgc ggcggtggca cggagctctt catctgcttc acctcccggc 720

cctccgccgc ctccgccgct cctgtcgccg gcggcagcgc gcagtcttcc ctccgcccct 780

ccagctcctc caagctcctc agccccggcc gcggtagtgc cagcgcaagc ggagctgaga 840

cagtgccggc cccccctctg cacccctcac tcagccgccg cctccgcaac agcggcagcc 900

tcaagggcgg ccagtcccca atgttcccgt ccgggtccac cggcggtggc cgccgcagcc 960

ggggtggatt cgaacctgcc gagccgtcct ctcccaaggt cacctgcatc ggccaagtcc 1020

gcgtcaaggg cggtaagcgc aagcccaagc acacctcagc cgccactctg cactcctgct 1080

ccagacgcgg cggagtcggg agcgcagagg tcagctttcg ccgcgccggc gacgaccggg 1140

acggacccca gagcaagaac cagggctggg tgtaccagat cccggtcaac atctgcgagg 1200

cactcaagac atttggctcc tgcggtggcc gctcgctctg ctcgccgtct cggcatggcg 1260

gagccggcga gcggggcgca ctccccaccg atgcaaactg tggcaagaag cggcggcagg 1320

gcgctcctgc tgggggtagc tggctgtgcg gtgctgccgt ggcgaggtgc cttctggcga 1380

tccaggagga ggacgacgac gaggtcggca acggcaaggg agctgcagtt gtgccggcag 1440

aagagatgag gacatcggaa gtggggctcg tcatggaagg gtgggatgtc gaggaggaga 1500

aggctgtgat gatgggggat gtggaggtgg agaagaaaga tgagatcttg gtagtgggga 1560

aggaagaaga ggggagagta agtgtctgca tccccccgag gaatgcactg ctgctaatgc 1620

gctgccggtc agacccagtt cgcatggctg ctcttgccac ccgcttctgg gggtctccag 1680

ctgcagctac cgtggagcag gtggacaatg aggtggctgg gtgcctcaac gacaatgagg 1740

aagaagaaga aaaggaagag gaggctgagg ctgagccact ggagtgcaaa gatggagctc 1800

gctgttcagc tgtttctgtc aaagacttga aatgtgaaga gtgtggttct gatgaaaatg 1860

atggcgctga agcaggggag ataaatcaag aaaaggcaga agctgaagag agttctaaat 1920

gtggagatct agtggaagaa aaggagggtg catcatgcag agtaggggtg gaggaagcac 1980

aaattgttcg gaaagatgcc gagttggagg ttcctttggg agaagttaca gagatggaaa 2040

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aagttgacga agagatgatg gggaggagat caatcaacag ctattctccc tcggcaactc 2160

tgaaagagga ccgcaccaaa ttgcgacggt tgagtagcag gatgtgtgtt agcactagta 2220

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attgtgatgt tgttgctcca aacagtgcag aggaaggtca agaatcctat gacgatggaa 2520

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accaggaagt agagaaagta gaaactagag cagaagagtg tgaaggtggg acagtaccag 2640

tgatacatag gaggaagaag agtggtgagt taccagattg cctcctgttg atgatgtatg 2700

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attggaagtc ttaccagggc aagaataacc gcaatcactg gcaacagaag gcttctgctg 2820

ctggaacagt ggagactaag gaaaaggaga atgctgaagg caccaccatt gcgaatgatg 2880

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tccagaagac accaccactc aaaccagcta ccacagaaca gaagctgaag ctggagttgc 3000

cgccagttac caatgcggca gcctatgctc catttgttct gaaaaggtgc aagtcagagc 3060

cgatgcgatc atcggcgcgt ttggcacccg atgcttgctt ctggaaggac cgccatcggc 3120

cgctgaatgc ggctggagtt gggttctgat ccgtgccaga cagctgctgg aatgtgacat 3180

ttagttaggt agtgagtgag tttgcgagcc tgttgtgtaa tagtagcgag tggttctttg 3240

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ttactatatg ggagaggttc tttgatcctg ctttgtgctg ttatgtgatg cttaccatct 3360

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catctgttta aatatgctta aattggtaaa ttattgctgg tggttgctaa tgccacagct 3480

tacccgatcc acttcccttc acagtgtttg tccaactatg ttatatgcat agctgaagga 3540

ggtaaagatg tgtaatattt aatggagttg tgccatgctt aagcttggta tttgatatat 3600

ttcaaccacc ctgcagcttt cacttggtaa tttcagcagt ataacatgca agttgcaaaa 3660

ctgaaggggc tgagtttcct gaaactgtag ttcccagtaa attgcacata aactaaaaaa 3720

tcgtaattgt agctgaaaaa aacttcatat tttccatgtc ccataaaatc atttccaaga 3780

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<210> 3

<211> 1704

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 3

atgaggacat cggaagtggg gctcgtcatg gaagggtggg atgtcgagga ggagaaggct 60

gtgatgatgg gggatgtgga ggtggagaag aaagatgaga tcttggtagt ggggaaggaa 120

gaagagggga gagtaagtgt ctgcatcccc ccgaggaatg cactgctgct aatgcgctgc 180

cggtcagacc cagttcgcat ggctgctctt gccacccgct tctgggggtc tccagctgca 240

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gaagaaaagg aagaggaggc tgaggctgag ccactggagt gcaaagatgg agctcgctgt 360

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gatctagtgg aagaaaagga gggtgcatca tgcagagtag gggtggagga agcacaaatt 540

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gatgttgttg ctccaaacag tgcagaggaa ggtcaagaat cctatgacga tggaaaggaa 1080

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cataggagga agaagagtgg tgagttacca gattgcctcc tgttgatgat gtatgagccg 1260

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acagtggaga ctaaggaaaa ggagaatgct gaaggcacca ccattgcgaa tgatgtacaa 1440

gagagcaaag atccatcaac ggtgaactca gctgtgccca tgccatgtcc agttgtccag 1500

aagacaccac cactcaaacc agctaccaca gaacagaagc tgaagctgga gttgccgcca 1560

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cgatcatcgg cgcgtttggc acccgatgct tgcttctgga aggaccgcca tcggccgctg 1680

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<212> DNA

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aaacacgacc acgaaactac cactcctata caagggatgg cctgtagatc cgttatatca 60

agacttgagc ttggttgctc gagcgaatag cttttgaatg gacatgaagc gttcaaactc 120

ttttaacaaa acgaagattt tttttctgaa attatttctt ttccgagaat actgcagaga 180

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tcaaatgata atcatgctcg taacataata gcagagagta ggagtgacaa aatagcaatt 300

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gaccgcatct agcggtccag tgtagcccaa gcggcagccg gcaggcgccc agcagcagca 480

ttgcaggttg cagcaaagcg agcgagagtg agacagagct cacaagccta acaccctctc 540

tccttcacct cccacatgcg ctgatgcgcc gcaagaagca cttggaccgg ggtggcggcg 600

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tcctcagccc cggccgcggt agtgccagcg caagcggagc tgagacagtg ccggcccccc 780

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tgccgagccg tcctctccca aggtcacctg catcggccaa gtccgcgtca agggcggtaa 960

gcgcaagccc aagcacacct cagccgccac tctgcactcc tgctccagac gcggcggagt 1020

cgggagcgca gaggtcagct ttcgccgcgc cggcgacgac cgggacggac cccagagcaa 1080

gaaccagggc tgggtgtacc agatcccggt caacatctgc gaggcactca agacatttgg 1140

ctcctgcggt ggccgctcgc tctgctcgcc gtctcggcat ggcggagccg gcgagcgggg 1200

cgcactcccc accgacgcaa actgtggcaa gaaacggcgg cagggcgctc ctgctggggg 1260

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<212> DNA

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tttaacaaaa cgaagatttt tttctgaaat tatttctttt cattatttct tttccgagaa 180

tactgcagag aaacaaaatt tcttttattg cttcgaagga tgaatctttt ttttaggaaa 240

gaaggaccaa tcaaatgata atcatgctcg taacataata gcagccaaac taggagtgac 300

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gcccagcagc agcattgcag gttgcagcaa agcgagcgag agtgagacag agctcacaag 540

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<211> 1384

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tactgcagag aaacaaaatt tcttttattg cttcgaagga tgaatctttt ttttaggaaa 240

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<400> 14

gaaggtgacc aagttcatgc tctcgccgtc tcggcatggt 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 15

gaaggtcgga gtcaacggat tctcgccgtc tcggcatggc 40

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 16

ccgcttcttg ccacagtttg c 21

<210> 17

<211> 1997

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 17

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840

gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900

ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960

cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc tctctacctt 1020

ctctagatcg gcgttccggt ccatggttag ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt 1080

gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg gatgcgacct 1140

gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg aatcctggga 1200

tggctctagc cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag 1260

ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat 1320

cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta 1380

gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg gatctgtatg 1440

tgtgtgccat acatattcat agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag 1500

gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg 1560

cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga 1620

atactgtttc aaactacctg gtgtatttat taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac 1680

atcttcatag ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt 1740

tgatgtgggt tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc 1800

taaccttgag tacctatcta ttataataaa caagtatgtt ttataattat tttgatcttg 1860

atatacttgg atgatggcat atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc cctgccttca 1920

tacgctattt atttgcttgg tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt 1980

tacttctgca ggtcgac 1997

Claims

1.启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.权利要求1所述的启动子在玉米穗长育种中的应用。

3.分子标记，其特征在于，所述标记包括S2、S3、S4标记任意一个，其中S2标记位于SEQID NO.4所示序列第452位碱基，呈C[T]多态性；S3标记位于SEQ ID NO.4所示序列第919位碱基，呈C[G]多态性；S4标记位于SEQ ID NO.4所示序列第1183位碱基，呈C[T]多态性。

4.权利要求3所述的分子标记在玉米穗长育种中的应用。

5.权利要求3所述分子标记的检测方法，其特征在于，所述的分子标记的检测方法采用竞争性等位基因特异性PCR方法；所述竞争性等位基因特异性PCR扩增采用的引物对由引物F1、F2和引物R组成，其中检测S2标记的引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；检测S3标记的引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；检测S4标记的引物F1的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示，引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，引物R的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示。

6.权利要求5所述的检测方法在玉米穗长育种中的应用。

7.一种鉴定或辅助鉴定玉米穗长性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)依次检测待测材料的权利要求5所述的S2-S3-S4分子标记；(2)如果检测结果为T-G-C或C-C-C或C-G-C或C-G-T，待测材料将表现长穗性状；否则，待测材料将表现短穗性状。

8.权利要求7所述的鉴定或辅助鉴定玉米穗长性状的方法在玉米穗长育种中的应用。

9.增加玉米穗长的方法，其特征在于，在待改良玉米材料中使用SEQ ID NO.7所示的启动子提高SEQ ID NO.1所示蛋白的表达和/或活性，选择玉米穗长增加的植株。

10.权利要求9所述的增加玉米穗长的方法在玉米穗长育种中的应用。