CN101519662A - 棉花油菜素内酯合成酶基因的用途及含有其的表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4的新用途。在植物中表达GhDWF4基因可以促进植物下胚轴的伸长，增加植物叶片的面积和果实产量，促进植物生长。可用于农作物育种和林木育种，增加转基因植物的营养生长，提高植物的生物产量。本发明还提供包含GhDWF4基因的植物表达载体和其转化体；并提供制备含有该基因的转基因植物的方法。生产的转基因植株营养生长和生殖生长得到促进，植株高度增加，果实产量增加。

Description

棉花油菜素内酯合成酶基因的用途及含有其的表达载体

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及棉花油菜素内酯合成酶基因的用途，含有该基因的编码蛋白质及植物表达载体；本发明还涉及制备含有上述基因的转基因植物的方法。

背景技术

油菜素内酯类物质(brassinosteroids，BRs)是广泛存在于植物体中的一类具有类似于动物甾醇结构的激素。油菜素内酯类物质在植物生长发育的许多生理过程中都具有重要的作用，而且浓度极低(nmol·L^-1)的油菜素内酯类物质就能表现出极高的生理活性，因此油菜素内酯类物质被认为是继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯之后的第六大植物激素。

在模式植物拟南芥上的研究表明，BRs合成和信号传导途径的缺失突变体表现出极度矮化的表型，同时出现叶片变小、开花数少、结实率极低等表型。在拟南芥中超量表达油菜素内酯合成酶基因能有效提高植物体中油菜素内酯的含量，同时植株表现出叶片舒展、叶柄变长、花序轴变长、花序轴数量增多、果荚数增多、种子产量增加等表型。这些结果表明，BRs对植物生长发育有非常重要的作用，BRs的合成或者信号传导途径受阻会显著影响植物的正常生长发育，极大的降低植物的育性以及生物总量；反之，提高植物体中BRs的含量能有效提高植物生物总量，增加果实数和种子数。这说明BRs在提高植物的营养组织的生物产量和果实种子产量上有较大的潜力。

目前人工合成的油菜素内酯类似物已经一定程度上在生产中得到应用，其结果表明，油菜素内酯类物质能有效提高农作物的产量和品质性状。利用“天丰素”(一种人工合成的油菜素内酯)对水稻种子浸种，不但发芽率可以提高10％以上，而且出芽齐，芽后的秧苗壮，根系十分发达，不易感染病害；在生长期应用可促进光合作用，植株壮，平均每株分蘖多1.5～3个小枝；在花前喷施对提高花粉活性、促进授粉十分有利；灌浆期喷施可以促进籽粒饱满，明显提高千粒重，减少败育粒。用BR做10种蔬菜的增产试验，普遍都有增产，幅度在10％～30％之间；分析营养成分后发现，一些对人体健康有利的成分都有不同程度的增加，而对人体不利的有机酸类(破坏人体钙质)成分明显下降；而且应用BR后蔬菜、瓜果的表皮油亮光滑、外观亮丽，很少有畸型瓜果，大大提高了农产品的商品性能。(油菜素内酯在农业上的应用成效，广东农业科学，2006，5)。此外，BRs在棉花的栽培应用中已经得到推广，云大120(一种人工合成油菜素内酯类物质)可促进棉花营养生长和生殖生长，降低蕾铃脱落，增加伏桃、秋桃个数，为提高产量打下基础。在粮食作物如小麦、水稻、玉米的示范试验中施用BRs仍具有明显效果。这些在生产应用上的实例表明，油菜素内酯类物质对提高农作物的产量和品质性状有明显效果，这对于提高农作物产量，提高人们的生活品质有重要意义。

虽然外施BRs能够有效提高农作物的品质和产量，但是人工化学合成油菜素内酯类似物的过程非常复杂，在合成过程中存在对环境的污染。而且合成甾体母核所用的原材料豆甾醇、麦角甾醇和孕甾醇酮价格比较昂贵，在合成侧链时由于存在四个手性中心，所合成的甾醇产物也会存在一些非活性构型，从而进一步增加了油菜素内酯类物质的人工合成成本。另外，由于油菜素内酯类物质的生理活性极高，施用过程中浓度难以控制，由此也会导致施用效果不稳定，甚至因浓度过大对农作物产生危害。利用转基因技术提高植物体内高生理活性BRs的含量，在选择适宜的转基因株系后，能有效避免上述问题，同时也可以获得产量和品质提高的作物。

在拟南芥中研究表明DWF4是一个BRs合成的关键限速酶，催化油菜素类固醇物质在C-22上的α-羟基化。研究发现DWF4的底物在植物体中大量累积但生理活性极低，而DWF4的直接产物在植物体中含量极低，却有很高的生理活性。这表明DWF4基因的表达可能受到了很严密的调控，从而维持植物体内有生理活性的BRs在一定的浓度水平。进一步对拟南芥dwf4突变体、野生型和超量表达DWF4基因的拟南芥植株中BRs的检测含量，发现在野生型中campestanol(DWF4的底物)比6-Deoxocathasterone(DWF4的产物)含量高150倍，突变体中几乎检测不到或只能检测到极少量的DWF4的下游产物，而超量表达DWF4基因的拟南芥中有生理活性的BRs总量明显增多。这一结果表明了DWF4基因可能是维持植物体内有生理活性的BRs的一个关键酶基因，能够决定植物体内有生理活性的BRs的总量。

因此，利用转基因技术，提高植物受体中DWF4基因的表达水平，能够有效提高植物体内源高生物活性BRs的水平，进而获得产量和品质性状得到改良的作物。

发明内容

本发明的一个目的在于提供棉花油菜素内酯合成酶基因(Gossypiumhirsutum.L brassinosteroids C22α-hydroxylase，下称GhDWF4基因)的用途，即在提高农作物产量和改善品质性状以及农作物或林木育种中的应用。本发明也提供GhDWF4基因在制备油菜素内酯类物质(BRs)中的应用。

本发明另一目的在于提供含有该GhDWF4基因的植物表达载体。

本发明又一目的在于提供制备基于本发明植物表达载体的转基因植物的方法。

本发明所述的编码棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4具有如下核苷酸序列之一：

1)如SEQ ID NO.1所述的cDNA序列；

2)如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的gDNA序列；

3)与上述1)或2)中所限定的DNA序列具有85％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

3)在高严谨条件下可以与上述1)或2)中所限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；其中所述的高严谨条件为在6×SSC(或6×SSPE)，0.1％SDS，2×Denhardt溶液中，65℃条件下杂交；在0.1×SSC，0.1％SDS溶液中，65℃条件下洗膜。

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为编码棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4的cDNA序列，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两个核苷酸序列gGhDWF4-1和gGhDWF4-2为gDNA(基因组)序列。cDNA序列为编码序列，gDNA序列除编码序列外还含有外显子和内含子序列。

由上述GhDWF4基因编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，本领域技术人员可以理解的是，将SEQ ID NO.4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.4的氨基酸残基序列相同生物活性的由SEQ ID NO.4衍生的蛋白质序列也同样属于上述范围。

根据本发明的另一方面，提供的植物或微生物表达载体，其至少含编码油菜素内酯合成酶基因GhDWF4的核苷酸和启动子序列，所述植物或微生物表达载体通过将编码油菜素内酯合成酶基因GhDWF4、启动子序列与植物表达载体可操作地连接而构建。为了筛选和表达的需要，还可选地在表达载体中包含筛选基因序列、报告基因序列以及其它的为基因工程操作的需要而插入的各种内切酶位点，筛选基因和报告基因可以从本领域常用的基因序列中选择，优选地，本发明的植物表达具有如图1所示的结构。例如，可以在所述表达载体中加入在植物或微生物中能表达的编码可发生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GUS基因、GFP基因、荧光素酶等；具有抗性的抗生素标记物，如抗庆大霉素标记物、抗卡拉霉素标记物等；抗化学试剂标记基因，如抗除草剂基因等。

用于构建本发明植物表达载体的启动子可以是任意一种启动子，包括增强型、组成型、组织特异型以及诱导型启动子。构建表达载体时，所述启动子可以单独使用，还可以和其它植物启动子或微生物启动子结合使用。用于构建本发明植物表达载体的启动子优选组成型启动子或组织特异性启动子，更优选来源于花椰菜花叶病毒的植物组成型启动子CaMV35S。通常，将GhDWF4基因构建在CaMV35S的下游。

用于构建本发明植物表达载体的出发载体可以是任意一种双元农杆菌载体或者可用于微弹轰击的载体。

在本发明的一种具体实施方案中，将GhDWF4基因正向插入植物表达载体pCambia-35S-NOS中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GhDWF4基因的植物表达载体pCambia-35S-GhDWF4-NOS，其具有如图3所示的结构，该表达载体同时包含了报告基因序列，筛选基因序列和用于基因操作的各内切酶位点，本领域技术人员可以理解的是，上述报告基因、筛选基因好各基因操作序列均是可以替换的，本发明并不对此进行限制。

根据本发明的另一方面，提供一种转化体，通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物或微生物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导或农杆菌介导等常规生物学方法，将含有本发明GhDWF4基因的表达载体转染植物或微生物宿主而获得转化体。被转化的植物宿主可以是水稻、小麦、大麦、大豆、玉米、油菜、烟草、高粱、棉花、苜蓿、杨树、番茄、麻等具有经济价值的植物。被转化的微生物宿主可以是酵母、大肠杆菌、农杆菌、各种丝状真菌以及其它有潜在经济利用价值的微生物。

根据本发明的又一方面，提供制备含有GhDWF4基因的转基因植物或微生物的方法。用GhDWF4基因与启动子构建植物或微生物表达载体，将所述植物或微生物表达载体转化宿主获得含GhDWF4基因的转化体，用所述转化体转化植物或微生物获得转基因材料。

本发明提供了GhDWF4基因的新用途，成功地构建了包含GhDWF4基因和启动子的植物表达载体，并以该表达载体转化植物获得转基因植物，在转基因植物中GhDWF4基因被超量表达。超量表达的GhDWF4基因明显提高了植物中的油菜素内酯类物质的含量，可以用于制备油菜素内酯类物质，该物质可用于农作物和林木育种，而目前通过人工合成的油菜素内酯类物质成本高，收率低，合成十分困难。

本发明获得GhDWF4组成型超量表达的转基因烟草，分别提取该转基因烟草和野生型烟草的叶片的油菜素内酯类物质，检测其生物活性，发现超量表达GhDWF4基因能够增加植株中内源高生物活性油菜素内酯类物质的含量，促进植物下胚轴的伸长，增加植物叶片的面积；同时该基因的超量表达能增加转基因烟草的果实大小和生物生长量，这对于培养优良的作物品种具有重要的理论和实际意义。

附图说明

图1：含GhDWF4基因的植物表达载体的结构图，其中

35S，代表CaMV35S启动子；GhDWF4：代表GhDWF4基因cDNA；term，代表终止子；LB，代表T-DNA左边界；RB，代表T-DNA右边界。

图2：组成型启动子CaMV35S调控下的棉花GhDWF4基因表达载体的构建流程图，其中

GRP-GusPlus-His6，代表GUSPlus报告基因，该基因在N端融合了GRP信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII，代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；Nosterm，Nos终止子；CaMV 35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界。pUC-GhDWF4载体为对GhDWF4基因进行TA克隆时获得的载体，植物表达载体为改造的pCambia载体(详见实施例二)。pUC-GhDWF4载体用KpnI和XbaI酶切后，回收GhDWF4片段。改造的pCambia载体用KpnI和XbaI酶切后回收载体。回收的载体片段和目的基因片段连接后转化大肠杆菌，获得超量表达GhDWF4基因的植物表达载体pCambia-35S-GhDWF4-NOS。

图3：本发明优选的植物表达载体pCambia-35S-GhDWF4-NOS结构图；

图4：转基因烟草中GhDWF4的表达分析

以野生型烟草和转基因烟草植株的叶片为材料，提取叶片总RNA，通过反转录合成单链cDNA。用Real-Time PCR方法分析转基因烟草中目的基因的表达，具体操作方法参照Bio-Rad Quantitative Real-Time PCR试剂盒。GhDWF4基因用引物D4-500(SEQ ID NO.9)和GhDWF4-2(SEQ ID NO.6)扩增，内标采用烟草ACTIN基因(登录号：AB158612)，引物为actin-1(SEQ ID NO.7)和actin-2(SEQ ID NO.8)。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；预设循环数为35。图中标示：OD4-1、OD4-5、OD4-6、OD4-7、OD4-8、OD4-21和OD4-23，为不同株系的超量表达GhDWF4的烟草材料；野生型，为没有进行遗传转化的野生型受体材料。

图5：超量表达GhDWF4的转基因烟草与野生型的株高比较

超量表达GhDWF4基因的转基因烟草和野生型烟草同时种植在培养钵中，在温室中按照常规管理方式进行管理。观察植株生长表型发现，植株进入盛花期后转基因烟草植株的株高高于野生型。图中标示：OD4，为超量表达GhDWF4的烟草材料；对照，为野生型烟草。

图6：超量表达GhDWF4的转基因烟草叶片表型

观察转基因烟草叶片表型发现，转基因烟草叶片形态发生较大变化，主要表现在烟草叶形变得狭长，叶片宽度没有明显变化，而叶片长度要长于野生型，最终表现为叶片面积比野生型大。图中叶片均为不同植株从下往上数的第12张叶片。图中标示：OD4，为超量表达GhDWF4的不同株系的烟草材料；对照，为野生型烟草材料。

图7：超量表达GhDWF4的转基因烟草叶片的长度和宽度统计

统计了转基因烟草部分株系以及野生型的叶片长度和宽度。测量的叶片为每一株从下往上数第8到第16张叶片。图中标示：OD4-1、OD4-7、OD4-8和OD4-21，为超量表达GhDWF4的烟草材料；对照，为野生型烟草。

图8：超量表达GhDWF4的转基因烟草叶柄长度统计

观察转基因烟草叶片表型时发现，超量表达GhDWF4的转基因烟草叶片的叶柄长度要长于野生型。图中标示：OD4-1、OD4-7、OD4-8和OD4-21，为超量表达GhDWF4的烟草材料；对照，为野生型烟草。

图9：转基因烟草T1代种子摇瓶培养结果

超量表达GhDWF4的转基因烟草T1代种子用摇瓶培养，观察T1代幼苗的表型变化，野生型烟草种子同时培养作为对照。在28℃，110rpm的条件下培养7天的烟草表型变化。图中标示：OD4-1、OD4-5、OD4-7、OD4-8、OD4-21和OD4-22，为超量表达GhDWF4的烟草材料；对照，为野生型烟草材料。

图10：转基因烟草T1代种子摇瓶培养下胚轴长度统计

超量表达GhDWF4的转基因烟草T1代种子用摇瓶培养，从第5天起开始测量下胚轴长度，连续测量4天。数据显示超量表达GhDWF4的转基因烟草T1代幼苗下胚轴生长速度要比野生型的快，表明GhDWF4表达水平的增加促进了烟草下胚轴的生长。图中标示：OD4-1、OD4-5、OD4-7、OD4-8、OD4-21和OD4-22，为超量表达GhDWF4的烟草材料；对照，为野生型烟草材料。

图11：转基因烟草和野生型烟草的果实比较

取转基因植株和野生型烟草相似部位的果枝，观察果实表型的变化。超量表达GhDWF4基因的转基因烟草的果实略大于野生型，转基因植株的果柄也比野生型的长。图中标示：OD4，为超量表达GhDWF4的烟草材料；对照，为野生型烟草。

图12：用转基因烟草和野生型烟草叶片BRs提取物处理野生型烟草的结果

以野生型烟草种子为材料，用从野生型和转基因烟草的叶片中提取的BRs来处理种子，观察提取物对烟草种子生长发育的影响。100nM的epi-BL作为阳性对照，提取过程中的溶剂作为阴性对照。结果显示从超量表达GhDWF4的转基因烟草叶片中提取的BRs活性要高于从野生型烟草叶片中提取的BRs，表明超量表达GhDWF4的材料中高生物活性的BRs含量比野生型的高。图中标示：阳性，为100nM的epi-BL处理；阴性，为用溶剂处理；OD4叶片提取物，为从超量表达GhDWF4的烟草叶片中提取的BRs处理；对照提取物，为从野生型烟草叶片中提取的BRs处理。

图13：用转基因烟草和野生型烟草叶片BRs提取物处理野生型烟草的下胚轴长度统计

提取的BRs处理野生型烟草种子7天后，统计了烟草幼苗的下胚轴长度。与野生型相比，从相同质量的超量表达GhDWF4的转基因烟草叶片中提取的BRs，更能促进烟草幼苗下胚轴的生长，表明转基因材料中生物活性的BRs含量高于野生型烟草。图中标示：epi-BL阳性对照，为100nM的epi-BL处理；溶剂阴性对照，为用溶剂处理的结果；OD4叶片提取物，为从超量表达GhDWF4的烟草叶片中提取的BRs处理；对照提取物，为从野生型烟草叶片中提取的BRs处理。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

在本发明的下述实例中，所用的棉花实验材料为徐州142(Gossypiumhirsutum cv.Xuzhou142)，所用的烟草实验材料为Nicotiana tabacum。

【实施例一】GhDWF4基因序列的克隆

1、棉花RNA的提取

选取约3g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，加入15ml 65℃预热的RNA提取液(2％ CTAB(W/V)，2％ PVP(W/V)，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5g/L Spermidine，2.0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀。65℃水浴3～10min，期间混匀2～3次。氯仿:异戊醇(24:1)抽提2次(10,000r/min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积10mol/L LiCl溶液，4℃放置6h，以氯仿:异戊醇(25:24:1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加2倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用200μL的DEPC处理水溶解。酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加1/10体积3mol/L NaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用70％的酒精漂洗一次，风干。加200μL的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。

2、cDNA合成和GhDWF4基因cDNA序列的PCR扩增

利用拟南芥DWF4基因cDNA序列，在NCBI中查找棉花中同源性高的EST序列，根据EST序列设计引物进行染色体爬行获得GhDWF4的cDNA5’和3’端序列，设计5’端引物GhDWF4-1(SEQ ID NO.5)和3’引物GhDWF4-2(SEQ ID NO.6)。提取棉花10dpa的纤维总RNA，用试剂盒(Fermentas)合成cDNA一链后，利用PCR的方法获得GhDWF4的cDNA全长序列(SEQ IDNO.1)。具体方法如下：

(1)cDNA一链合成

取约10μg总RNA到DEPC-处理的扩增管中，加入1μL 2.5μmol/LOligo-dT，加DEPC处理的水至终体积12μL，70℃水浴5min使RNA变性后，立即冰浴3min。然后向扩增管中依次加入4μL 5×reaction buffer，2μL 10mmol/L dNTPs，1μL RNase inhibitor(20U)，37℃处理5min。加入1μL AMVRtase(5U)后，保温程序为42℃，60min；70℃，5min；5℃，5min。程序结束后，一链产物于-20℃冻存。

(2)扩增

25μL的cDNA扩增体系含2.5μL 10×Ex PCR buffer(Mg2+ free)，2μL2.5mmol/L dNTPs，2μL 25mmol/L MgCl₂，1μL特异引物GhDWF4-1(SEQ IDNO.5)(5μmol/L)，1μL GhDWF4-2(SEQ ID NO.6)(5μmol/L)，0.2μL ExTaq DNA聚合酶，1μLcDNA一链产物。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，30个循环；72℃延伸10min。

3、cDNA片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5a

(1)电泳

将cDNA扩增产物在1.0％(W/V)琼脂糖凝胶中进行电泳分离。

(2)回收

使用回收试剂盒：回收步骤按照试剂盒说明书进行，回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

(3)克隆和测序

回收的片段经琼脂糖凝胶电泳定量。按试剂盒说明书，通过回收片段与克隆载体的连接、连接产物的大肠杆菌转化、阳性菌落的培养和质粒酶切验证，将回收片段克隆到pUCm-T(上海Sangon)载体上。序列测定由英骏公司完成。

回收的片段与pUCm-T(上海生工)载体建立如下连接体系：

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a。

4、GhDWF4基因组DNA的克隆

通过southern杂交实验表明GhDWF4在棉花野生型中存在两个拷贝。在野生型陆地棉中存在A和D两个基因组，为了克隆A和D基因组中的GhDWF4基因，提取了陆地棉、中棉和雷蒙德氏棉的基因组DNA，用GhDWF4-1(SEQID NO.5)和GhDWF4-2(SEQ ID NO.6)扩增前面三种基因组DNA，获得的片段连接到T克隆载体上进行测序(其中陆地棉的基因组扩增后获得的片段用酶切表明存在两种不同的片段，将两种片段均进行了测序)。测序后把前面所克隆的cDNA与四条片段同时比对发现，四条片段的外显子区域几乎完全一致。陆地棉中克隆的两条片段(标记为gGhDWF4-1和gGhDWF4-2)存在内含子数量以及位置上的差异，而外显子上仅存在少数几个碱基的差异。gGhDWF4-1和gGhDWF4-2与中棉和雷蒙德氏棉中克隆的片段(分别标记为GaDWF4和GrDWF4)比较发现gGhDWF4-1(SEQ ID NO.2)和gGhDWF4-2(SEQ ID NO.3)分别与GrDWF4和GaDWF4的同源性更接近，表明两者分属D基因组和A基因组。

【实施例二】超量表达载体的构建和烟草遗传转化

1、超量表达载体的构建

pUC-GhDWF4载体是在克隆GhDWF4基因时构建，其上的GhDWF4片段已测序。植物表达载体为改造的pCambia载体，该载体的HPT II基因用XhoI单酶切后替换为NPT II基因(设计引物从pBI121载体中扩增获得，引物设计两端带XhoI位点)，限制性酶切和测序结果验证了NPT II基因的方向。在pBI121载体中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，同时这两个元件两端也引入了相应的酶切位点，这两个元件最后分别导入pCambia的多克隆位点，形成CaMV35S::MCS::NOS单元。该植物表达载体含有1套2×CaMV35S启动子控制NPTII基因的植物表达元件、1套CaMV35S启动子控制报告基因GRP-GusPlus-His6的植物表达元件和一套CaMV35S启动子控制目标基因的植物表达元件，可实现Kan和GUS活性的双标记筛选。在多克隆位点(Multiplecloning site，MCS)插入外源基因，可以实现外源基因的超量表达。

为了在转基因植物中超量表达GhDWF4基因，需要将GhDWF4基因正向插入植物表达载体中，并用适当的启动子启动表达。为此根据pUC-GhDWF4载体上的酶切位点和GhDWF4的插入方向以及改造的pCambia植物表达载体上的多克隆位点和CaMV35S启动子的方向，设计了如图2所示的载体构建路线。根据这个植物表达载体构建路线，构建了超量表达GhDWF4基因的植物表达载体pCambia-35S-GhDWF4-NOS(图3)。

2、烟草遗传转化

用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

上述的植物表达载体通过农杆菌介导叶盘感染的方法导入烟草。具体方法如下：

烟草种子用1％的次氯酸钠消毒后，在MSB固体培养基上萌发，培养条件为25℃、16hr光照/8hr黑暗的光周期。约一个月后生长健壮的无菌苗即可用作转化外植体。

采用农杆菌介导的叶盘转化法：含植物表达载体的农杆菌菌株接种于液体YEB，28℃200rpm摇床培养过夜，从已摇好的菌液中重新吸取1～2ml于20～25ml液体YEB中再次活化。待菌液摇至OD600约为0.8时，取出用YEB稀释到0.05～0.2备用。

将无菌苗健壮叶片，切成约0.5cm×0.5cm大小叶盘，放入OD600值为0.05～0.2的农杆菌菌液中，轻轻振荡浸染5min后，立刻倾去菌液，将外植体接入表面铺有一层滤纸的共培养基上，24℃暗培养3d。

共培养完成后，外植体接入筛选培养基中进行分化培养，每2～3w继代一次。出现再生绿芽后，将其切下转入生根培养基中生根。

当抗性苗的根生长到2～3cm长时，洗净根部的琼脂，水培炼苗2～3d，移栽到营养钵，于自然条件下生长。

表1：根癌农杆菌介导的烟草遗传转化用培养基

MS：Murashige & Skoog，1962

B5：Gamborg，1986

Gelrite：Sigma，货号：G1910

3、转化植株的鉴定

组织化学鉴定：转化植株在生根培养基上生根并长到2～3cm时，将幼苗从培养瓶中取出洗净，转入三角瓶上水培炼苗2～3d。同时，取一小块叶片和一小段根进行GUS染色。GUS阳性的植株直接移栽到营养钵中。

PCR鉴定：待烟草植株移栽成活并生长到一定大小，取0.5g叶片提取烟草基因组DNA，以GhDWF4-1(SEQ ID NO.5)和GhDWF4-2(SEQ ID NO.6)进行扩增。25μL的扩增体系含2.5μL 10×PCR buffer，2μL 2.5mmol/L dNTPs，1.5μL 25mmol/L MgCl2，各1μL引物GhDWF4-1(SEQ ID NO.5)和GhDWF4-2(SEQ ID NO.6)(5μmol/L)，1U Taq DNA聚合酶，1μL烟草基因组DNA(50ng)。扩增程序为：94℃，5mn；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。用P6-GhDWF4载体质粒作阳性对照，以水和野生型烟草基因组DNA作阴性对照。

【实施例三】检测GhDWF4基因在转基因烟草中的表达水平

按照实施例一中提取棉花RNA的方法，提取转基因烟草和野生型烟草叶片的总RNA，并合成cDNA一链。用Real-Time PCR方法分析转基因烟草中目的基因的表达，PCR在quantitative real-time PCR仪上进行，在25μL的反应体系中包括12.5μL MIX buffer(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2，quantitative real-time PCR试剂盒提供，Bio-Rad)。GhDWF4基因用引物D4-500(SEQ ID NO.9)和GhDWF4-2(SEQ ID NO.6)扩增，内标采用烟草ACTIN基因(登录号：AB158612)，引物为actin-1(SEQ ID NO.7)和actin-2(SEQ ID NO.8)。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；预设循环数为35。在运行quantitative real-time PCR前，用相同引物和模板在相同的温度变化程序中扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩增产物是单带。定量PCR分析的结果表明GhDWF4基因已在检测的转基因烟草中表达，不同植株之间在表达量上有一定差异。

【实施例四】转基因烟草与野生型烟草的表型比较

1、转基因烟草与野生型烟草株高和叶片的比较

超量表达GhDWF4基因的转基因烟草和野生型烟草同时种植在培养钵中，经过正常的栽培管理，植株进入成熟期后，观测转基因烟草和野生型烟草的生长状况。观察结果表明，在盛花期转基因烟草株高明显高于野生型植株，转基因烟草叶片形态发生较大变化，主要表现在烟草叶形变得狭长，叶片宽度没有明显变化，而叶片长度要长于野生型，最终表现为叶片面积比野生型大。从植株形态上来看，超量表达GhDWF4的转基因烟草显得较舒展，叶柄比野生型的长，株高和节间长均长于野生型。

2、转基因烟草与野生型烟草果实发育的比较

超量表达GhDWF4基因能够促进转基因烟草的营养生长。为了弄清GhDWF4对烟草生殖器官发育的影响，观测了超量表达GhDWF4基因的转基因烟草的果实大小。取转基因烟草相似部位的果枝，观察果枝上的果实大小，发现转基因烟草果实比野生型的大，果柄也比野生型的长。

3、超量表达GhDWF4的转基因烟草与野生型烟草幼苗的比较

超量表达GhDWF4的转基因烟草T0代植株收获种子后，用摇瓶培养T1代烟草种子，观察T1代幼苗的表型变化，野生型烟草种子同时培养作为对照。在28℃，110rpm的条件下培养5天后开始观察烟草表型变化，发现超量表达GhDWF4的转基因烟草T1代幼苗下胚轴生长速度要比野生型的快。数据统计也表明GhDWF4表达水平的增加促进了烟草下胚轴的生长。

【实施例五】转基因烟草叶片中BRs的提取和活性测定

GhDWF4基因是一个合成高生理活性油菜素内酯类物质的关键酶。为了了解在超量表达GhDWF4的转基因烟草中，高生理活性BRs的含量是否提高，提取了转基因烟草和野生型烟草叶片中的BRs，检测提取物的生理活性。结果表明，转基因烟草叶片中BRs的生理活性明显高于野生型，说明GhDWF4表达水平的提高增加了烟草叶片中高生理活性BRs的含量。具体实施方案如下：

1)烟草叶片中高生理活性BRs的提取

烟草叶片中BRs的提取参照已报道的标准程序进行：取烟草叶片材料，液氮速冻，研磨成粉末，用提取液(甲醇：氯仿＝4：1)在4℃浸泡过夜。过滤，残渣再次用提取液抽提三次。合并浸提液，10000rpm，5℃离心10min，取上清35℃真空浓缩。用水和氯仿抽提三次，直至水相中杂质很少，取氯仿相过滤真空蒸干。提取物再次用正己烷和80％甲醇萃取三次，取甲醇相浓缩蒸干。最后的提取物用甲醇溶解保存于-20℃备用。

2)提取物中活性BRs的含量比较

为了比较单位重量的烟草材料中活性BRs的含量，先将前面的提取物按照取材时所称的重量进行稀释后备用，例如取材为80g溶解的最终体积为800μL，取材为100g溶解的最终体积为1000μL。将稀释后的提取物取10μL再次稀释到1mL，此时的稀释液用来进行下面的实验。

将野生型烟草种子摇瓶萌发，每瓶加入40ml蒸馏水，同时加入4μL提取物。同时以甲醇作为阴性对照和100nM的epi-BL作为阳性对照。120rpm，28℃摇瓶培养7天后，观察统计烟草下胚轴长度。

09P103581_ST25.txt

SEQUENCE LISTING

<110>西南大学

<120>棉花油菜素内酯合成酶基因的用途及含有其的表达载体

<130>09P103581

<160>9

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1657

<212>DNA

<213>Gossypium hirsutum

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1657)

<223>棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4的核苷酸序列(cDNA)

<400>1

<210>2

<211>3278

<212>DNA

<213>Gossvpium hirsutum

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3278)

<223>棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4的核苷酸序列(gGhDWF4-1)

<400>2

<210>3

<211>3440

<212>DNA

<213>Gossypium hirsutum

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3440)

<223>棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4的核苷酸序列(gGhDWF4-2)

<400>3

<210>4

<211>485

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(485)

<223>GhDWF4基因编码的蛋白质序列

<400>4

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>扩增GhDWF的引物GhDWF4-1

<400>5

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>扩增GhDWF4的引物GhDWF4-2

<400>6

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>扩增GhDWF4的引物actin-1

<400>7

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>扩增GhDWF4的引物actin-2

<400>8

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>扩增GhDWF4的引物D4-500

<400>9

Claims (9)

1、棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4在提高农作物产量和改善农作物品质性状中的应用，其中所述棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4具有下述核苷酸序列之一：

1)如SEQ ID NO.1所示的cDNA序列；

2)如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的gDNA序列；

3)与1)或2)所述的核苷酸序列具有85％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；或

4)在高严谨条件下能与1)或2)所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；其中所述高严谨条件为在6×SSC或6×SSPE，0.1％SDS，2×Denhardt溶液于65℃条件下杂交；在0.1×SSC，0.1％SDS溶液于5℃条件下洗膜。

2、棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4在农作物育种或林木育种中的应用，其中所述棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4具有下述核苷酸序列之一：

1)如SEQ ID NO.1所示的cDNA序列；

2)如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的gDNA序列；

3)与1)或2)所述的核苷酸序列具有85％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；或

4)在高严谨条件下能与1)或2)所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其中所述高严谨条件为在6×SSC或6×SSPE，0.1％SDS，2×Denhardt溶液于65℃条件下杂交；在0.1×SSC，0.1％SDS溶液于5℃条件下洗膜。

3、棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4在制备油菜素内酯类物质中的应用，其中所述棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4具有下述核苷酸序列之一：

1)如SEQ ID NO.1所示的cDNA序列；

2)如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的gDNA序列；

3)与1)或2)所述的核苷酸序列具有85％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；或

4)在高严谨条件下能与1)或2)所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其中所述高严谨条件为在6×SSC或6×SSPE，0.1％SDS，2×Denhardt溶液于65℃条件下杂交；在0.1×SSC，0.1％SDS溶液于5℃条件下洗膜。

4、根据权利要求1、2或3所述的应用，其中所述棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4具有与1)或2)所述的核苷酸序列具有85％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

5、含有棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4和启动子的植物表达载体，其中所述启动子为增强型、组成型、组织特异型和/或诱导型启动子。

6、根据权利要求5所述的植物表达载体，其具有如图1所示的结构。

7、根据权利要求5所述的植物表达载体，其具有如图3所示的结构。

8、一种转化体，以权利要求5所述的植物表达载体转化宿主获得。

9、一种含有棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4的转基因植物的制备方法，包含下述步骤：

1)将GhDWF4基因与启动子可操作地连接；

2)构建含有GhDWF4基因与启动子的植物表达载体；

3)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；

4)用所述转化体转化植物，获得转基因植物。

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