CN102399271B - 控制种子和器官大小的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制种子和器官大小的蛋白及其编码蛋白与应用。该蛋白，是具有序列表中SEQ ID №：3氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：3的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：3衍生的蛋白质。该蛋白具有调节植物器官大小或种子大小的作用，因而可很好地应用于作物品种的改良。

Description

控制种子和器官大小的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域中一种控制种子和器官大小的蛋白及其编码基因与应用，特别涉及拟南芥的一种控制种子和器官大小的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

器官和种子的大小是农学和园艺学的重要组成部分，不仅植物的生物产量是农业生产关注的首要目标，而且植物特定器官的增大也是园艺花卉等产业关注的重要性状。已有明确的证据显示器官和种子的大小主要是由内在的发育信号控制的(Mizukami，Y.and R.L.Fischer，(2000)Plant organ size control：AINTEGUMENTA regulates growth andcell numbers during organogenesis.Proc Natl Acad Sci USA，97(2)：p.942-7；Mizukami，Y.，(2001)A matter of size：developmental control of organ size in plants.Curr Opin PlantBiol，4(6)：p.533-9；Hu等，2003，Plant Cell，.15(9)：1951-61)。即使细胞分裂由于突变或转基因的影响发生混乱，器官的大小仍然可以通过补偿性效应，如随着细胞数目的减少相应地增大细胞的体积的方式使器官最终达到它既定的大小(Horiguchi，G.，A.Ferjani，U.Fujikura，et al.，Coordination of cell proliferation and cell expansion in thecontrol ofleafsize in Arabidopsis thaliana.J Plant Res，2006.119(1)：p.37-42；Tsukaya，H.，(2002)Interpretation of mutants in leaf morphology：genetic evidence for a compensatorysystem in leaf morphogenesis that provides a new link between cell and organismal theories.Int Rev Cytol，217：p.1-39)。虽然器官和种子的大小在农作物和园艺花卉育种方面起着重要的作用，但是对调控器官和种子大小的遗传学和分子生物学机制方面的研究还十分有限。

植物细胞的大小和数目对植物器官和种子大小有直接影响。在拟南芥中，利用获得型或缺失型突变体已经鉴定出一批通过调节细胞增殖或生长来影响器官大小的基因(Dewitte，W.，C.Riou-Khamlichi，S.Scofield，et al.，(2003)Altered cell cycledistribution，hyperplasia，and inhibited differentiation in Arabidopsis caused by the D-typecyclin CYCD3.Plant Cell，15(1)：p.79-92；Cho，H.T.and D.J.Cosgrove，(2000)Alteredexpression of expansin modulates leaf growth and pedicel abscission in Arabidopsis thaliana.Proc Natl Acad Sci USA，97(17)：p.9783-8；Kim，J.H.，D.Choi，and H.Kende，(2003)The AtGRF family of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growthin Arabidopsis.Plant J，36(1)：p.94-104；Disch，S.，E.Anastasiou，V.K.Sharma，et al.，(2006)The E3 ubiquitin ligase BIG BROTHER controls arabidopsis organ size in adosage-dependent manner.Curr Biol，16(3)：p.272-9；Horvath，B.M.，Z.Magyar，Y.Zhang，et al.，(2006)EBP1 regulates organ size through cell growth and proliferation inplants.EMBO J，25(20)：p.4909-20；Anastasiou，E.，S.Kenz，M.Gerstung，et al.，(2007)Control of plant organ size by KLUH/CYP78A5-dependent intercellular signaling.Dev Cell，13(6)：p.843-56；Deprost，D.，L.Yao，R.Sormani，et al.，(2007)The Arabidopsis TORkinase links plant growth，yield，stress resistance and mRNA translation.EMBO Rep，8(9)：p.864-70；Hemerly，A.，A.Engler Jde，C.Bergounioux，et al.，(1995)Dominant negativemutants of the Cdc2 kinase uncouple cell division from iterative plant development.EMBOJ，14(16)：p.3925-36；Wang，H.，Q.Qi，P.Schorr，et al.，(1998)ICK1，a cyclin-dependentprotein kinase inhibitor from Arabidopsis thaliana interacts with both Cdc2a and CycD3，and its expression is induced by abscisic acid.Plant J，15(4)：p.501-10；Verkest，A.，C.L.Manes，S.Vercruysse，et al.，(2005)The cyclin-dependent kinase inhibitor KRP2 controlsthe onset of the endoreduplication cycle during Arabidopsis leaf development throughinhibition of mitotic CDKA；1 kinase complexes.Plant Cell，17(6)：p.1723-36；Ito，T.，G.T.Kim，and K.Shinozaki，(2000)Disruption of an Arabidopsis cytoplasmic ribosomalprotein S13-homologous gene by transposon-mediated mutagenesis causes aberrant growthand development.Plant J，22(3)：p.257-64；Ullah，H.，J.G.Chen，J.C.Young，et al.，(2001)Modulation of cell proliferation by heterotrimeric G protein in Arabidopsis.Science，292(5524)：p.2066-9；Tsuge，T.，H.Tsukaya，and H.Uchimiya，(1996)Two independentand polarized processes of cell elongation regulate leaf blade expansion in Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.Development，122(5)：p.1589-600；Hanson，J.，H.Johannesson，andP.Engstrom，(2001)Sugar-dependent alterations in cotyledon and leaf development intransgenic plants expressing the HDZhdip gene ATHB 13.Plant Mol Biol，45(3)：p.247-62；Li，Y.，L.Zheng，F.Corke，et al.，(2008)Control of final seed and organ size by the DA1gene family in Arabidopsis thaliana.Genes Dev，22(10)：p.1331-6；De Veylder，L.，T.Beeckman，G.T.Beemster，et al.，(2001)Functional analysis of cyclin-dependent kinaseinhibitors of Arabidopsis.Plant Cell，13(7)：p.1653-68)。

植物细胞的增殖和生长作用也受植物激素的调节，如生长素、赤霉素(GA)、乙烯以及油菜素甾体类化合物(BR)。这些信号分子能通过它们各自特异的或是相互作用交错的途径调控细胞的增长或是分化，以此来影响器官的生长(Mizukami，Y.，(2001)Amatter of size：developmental control of organ size in plants.Curr Opin Plant Biol，4(6)：p.533-9)。例如，生长素结合蛋白1(AUXIN-BINDING PROTEIN1，ABP1)对生长素调控的细胞增长起重要的作用(Chen，J.G.，H.Ullah，J.C.Young，et al.，(2001)ABP1 isrequired for organized cell elongation and division in Arabidopsis embryogenesis.GenesDev，15(7)：p.902-11；Jones，A.M.，K.H.Im，M.A.Savka，et al.，(1998)Auxin-dependentcell expansion mediated by overexpressed auxin-binding protein 1.Science，282(5391)：p.1114-7)。

此外，在调控植物种子大小的分子生物学机制研究方面(1)一些在胚胎、胚乳和种皮中发挥功能的基因已经被证实对种子的形态发育影响很大(Luo，M.，E.S.Dennis，F.Berger，et al.，(2005)MINISEED3(MINI3)，a WRKY family gene，andHAIKU2(IKU2)，a leucine-rich repeat(LRR)KINASE gene，are regulators of seed size inArabidopsis.Proc Natl Acad Sci USA，102(48)：p.17531-6；Kang，I.H.，J.G.Steffen，M.F.Portereiko，et al.，(2008)The AGL62 MADS domain protein regulates cellularizationduring endosperm development in Arabidopsis.Plant Cell，20(3)：p.635-47；Schruff，M.C.，M.Spielman，S.Tiwari，et al.，(2006)The AUXIN RESPONSE FACTOR 2 gene ofArabidopsis links auxin signalling，cell division，and the size of seeds and other organs.Development，133(2)：p.251-61)；(2)数量性状位点(QTL)对种子形态的影响也已经在很多作物中得到证实(Weber，H.，L.Borisjuk，U.Heim，et al.，(1997)A role for sugartransporters during seed development：molecular characterization of a hexose and a sucrosecarrier in fava bean seeds.Plant Cell，9(6)：p.895-908)；(3)种子的形态也受亲本效应的影响(Garcia，D.，J.N.Fitz Gerald，and F.Berger，(2005)Matemal control ofintegument cell elongation and zygotic control of endosperm growth are coordinated todetermine seed size in Arabidopsis.Plant Cell，17(1)：p.52-60；Xiao，W.，R.C.Brown，B.E.Lemmon，et al.，(2006)Regulation of seed size by hypomethylation of matemal andpatemal genomes.Plant Physiol，142(3)：p.1160-8；Jofuku，K.D.，P.K.omidyar，Z.Gee，et al.，(2005)Control of seed mass and seed yield by the floral homeotic gene APETALA2.Proc Natl Acad Sci USA，102(8)：p.3117-22；Ohto，M.A.，R.L.Fischer，R.B.Goldberg，et al.，(2005)Control of seed mass by APETALA2.Proc Natl Acad Sci USA，102(8)：p.3123-8)。

发明内容

本发明的目的是提供一种控制种子和器官大小的蛋白及其编码基因与应用。

本发明的第一方面，本发明提供的控制种子和器官大小的蛋白，名称为AtDuf4，来源于Col-0型的拟南芥，是下述1)或2)所述的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列；

2)将序列表中的SEQ ID №.3氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №.3的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。

序列表中SEQ ID №.3是由215个氨基酸残基组成。

本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白、优选的是重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明还包括AtDuf4蛋白的片段、衍生物和类似物。在本发明中，术语“AtDuf4蛋白”指具有AtDuf4蛋白活性的SEQ ID №.3序列的蛋白。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的AtDuf4蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(1)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，或(2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基因的蛋白，或(3)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(4)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明的第二方面，本发明还提供了编码本发明AtDuf4蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或是非编码链。编码成熟蛋白的编码区序列可以与SEQ ID №.2所述的编码区序列相同或是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID №.3的蛋白质，但与SEQ ID №.2所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。

编码SEQ ID №.3的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。应理解，虽然本发明的AtDuf4基因优选获自拟南芥，但是获自其它植物的与拟南芥AtDuf4基因高度同源(如具有60％以上多核苷酸序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。具体的，本发明控制种子和器官大小的蛋白的编码基因优选如下序列，其中，基因组基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №.1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №.3蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中序列SEQ ID №.1的DNA序列由719个碱基组成，其中开放阅读框(ORF)位于5′端第1-154，256-719位，全长cDNA(SEQ ID №.2)为618bp，编码一个含有205个氨基酸的蛋白质(SEQ ID №.3)。所述的AtDuf4基因可以为植物器官大小、种子等方面的改良提供新途径，因而具有巨大的应用前景。

上述控制种子和器官大小的蛋白的编码基因，其cDNA基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №.2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №.3蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №.2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №.2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID №.2编码序列表中序列3所示的蛋白序列。

上述高严谨条件是指本领域技术人员已知的，或者可以是分子生物学或基因工程实验指南，具体为在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；在0.5XSSC，0.1％SDS的溶液中，68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。

在本发明的第三方面，含有本发明基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

本发明中，AtDuf4蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本发明的多核苷酸在高度真核细胞中表达时，通过用强启动子驱动从而加强AtDuf4基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。本发明中，在一优选例中，所述表达载体中，强启动子与所述的多核苷酸可操作性连接。在一优选例中，所述的强启动子是35S启动子。在一优选例中，所述的强启动子是玉米的Ubi启动子。所述的多核苷酸位于所述启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp(优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。

此外，重组表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提高拥有选择转化的宿主细胞的表型状态，如用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

本发明的第四方面，提供含有本发明所述基因的重组工程菌、转基因细胞系或重组病毒。

本发明的第五方面，提供上述的蛋白或者其编码基因在调节植物的幼苗、花器官或种子大小中的应用，所述应用通过调节作物中控制种子和器官大小的基因的表达量来调节植物的幼苗、花器官或种子大小。

具体方法为通过提高作物中控制种子和器官大小的基因的表达或活性，将会增加作物花器官大小，增加种子大小。培育种子和器官增大的转基因植物，即将上述基因导入植物中表达，筛选得到种子和器官增大的转基因植物。所述基因通过上述的重组载体导入所述植物中。如本文所用，所述的“作物”包括但不限于：禾本科植物、十字花科植物、木本科植物等。更优选的，所述的禾本科植物包括但不限于：水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等；或所述的十字花科植物包括但不限于：拟南芥、油菜等。

本发明首次分裂得到一种新的植物器官大小调节基因，该基因具有调节植物器官大小或种子大小的作用，因而可很好地应用于作物品种的改良。种子体积的增大是高产品种育种的理想表型，本发明的基因转入植物中表达，将会增大作物种子的体积，优化育种；例如在十字花科作物上通过提高该基因的表达水平，将会提高其生物产量，增大作物种子体积，从而提高产量，具有非常重要的经济效益和社会效益。本发明的基因也可以用于转入观花植物中，增大花器官，提高观赏价值。本发明所提供的AtDuf4基因，它不仅为植物调控器官大小方面的理论研究提供了重要的分子生物学基础，还在提高作物产量，改良农作物的性状等基因工程育种方面提供了重要的实用价值。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1强启动子35S启动子驱动拟南芥AtDuf4基因(即p35S::AtDuf4融合基因)的植物表达载体图。

图2强启动子玉米Ubi启动子驱动拟南芥AtDuf4基因(即pUbi::AtDuf4融合基因)的植物表达载体图。

图3为野生型、转D35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株中AtDuf4的mRNA转录本的分析。Col-0中几乎没有全长的AtDuf4 mRNA的转录，转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株有全长的AtDuf4 mRNA的转录本，且转录水平很高。

图4为野生型、转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代种子百粒重量统计。

图5为野生型、转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代种子的大小。

图6为野生型、转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株幼苗和花的大小。野生型(A)，转p35S::AtDuf4植株T₂代(B)和转pUbi::AtDuf4植株T₂代(C)九天幼苗；野生型(D)，转p35S::AtDuf4植株T₂代(E)和转pUbi::AtDuf4植株T₂代(F)花。标尺：1mm。

图7为野生型、转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代九天幼苗胚轴和叶柄长度统计。

图8为野生型、转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代花器官参数统计。

图9为野生型和转pUbi::AtDuf4植株细胞的大小。野生型(A)和转pUbi::AtDuf4植株(B)子叶内表皮细胞；野生型(C)和转pUbi::AtDuf4植株(D)下胚轴表皮细胞。标尺：20μm。

图10为野生型、转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株可溶性碳水化合物含量。

图11为野生型、转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株种子储藏蛋白。凝胶右边表示为标准蛋白分子量大小。

图12为野生型、转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株平均每粒种子储藏蛋白含量。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量

实施例1、控制种子和器官大小的编码基因的获得

1、AtDuf4基因的克隆

采用Edwards法提取拟南芥(Arabidopsis thaliana)总DNA，拟南芥生态型为Columbia(Col-0)(购自拟南芥生物资源中心，Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)。

设计并合成如下三条基因特异引物(引物1、引物2和引物3)，为了方便以后的克隆和构建，在两条引物的5’端分别加入了限制性内切酶XbaI、Bam HI和SacI的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)

引物1：5’CAAGCTTGATGTTTCTTACAAATGGGT-3’-(XbaI)

引物2：5’CGAGCTCGTTATTTGGCCGTCTCCTTG-3’-(Sac I)

引物3：5’CGGATCCGATGTTTCTTACAAATGGGT-3’-(Bam HI)

PCR反应体系为：

模板DNA：                         800ng；

10X Exbuffer：                    2μL；

dNTP混合物(2.5mM)：               2μL；

ExTaq DNA Polymerase(5U/μL)：    0.5μL；

引物1或引物3(10μM)：             2μL；

引物2(10μM)：                    2μL；

无菌重蒸馏水(sddH₂O)：补足至      20μL。

PCR反应程序：先预变性94℃5min；再94℃30sec，50℃30sec，72℃1min30sec，35个循环，然后72℃10min。

PCR反应完成后，取15μL扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下快速用一次性刀片切下特异片段，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化(胶回收试剂盒购自上海申能博彩公司)，溶于50μl ddH₂O中，-20℃保存备用。

结果表明，引物1和引物2扩增得到719bp的片段，引物3和引物2扩增得到719bp的片段。

基因克隆：将回收的片段插入到质粒载体pMD18-T(TaKaRa公司)转化到大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素100mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，接入添加终浓度为100mg/L的氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃过夜培养。进行菌落PCR验证以及限制性酶切鉴定。将上述引物1和引物2扩增得到的片段插入质粒载体pMD18-T获得的重组载体命名为pMD18-T12，将上述引物3和引物2扩增得到的片段插入质粒载体pMD18-T获得的重组载体命名为pMD18-T32。

2-、AtDuf4基因的测序及多核苷酸序列分析

将含有上述质粒的DH5α送至北京诺赛基因公司测序。测序结果表明，引物1和引物2扩增得到的片段与引物3和引物2扩增得到的片段都具有序列表中SEQ ID №.1的核苷酸序列，其中开放阅读框(ORF)位于5′第1-154，256-719位，全长cDNA(SEQID №.2)为618bp，SEQ ID №.1和SEQ ID №.2所示的核苷酸均编码一个含有204个氨基酸的蛋白(SEQ ID №.3)。该蛋白含有一个高度保守的DUF724结构域。通过植物基因组序列的搜索和生物信息学的研究，在拟南芥中只有一个只含有一个DUF724结构域的AtDuf4蛋白，同时在水稻和白杨中也各含有一个只含有一个DUF724结构域的蛋白，它们都属于植物中的DUF724蛋白家族。

实施例2、控制种子和器官大小的编码基因的功能验证

1、拟南芥AtDuf4表达载体的构建

用XbaI和SacI两个限制性内切酶将用引物1和引物2扩增所得的AtDuf4基因从实施例1获得的重组载体pMD18-T12上切下，与相同酶酶切的pCAMBIA1300S(购自CAMBIA公司)连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析表明得到插入AtDuf4基因的重组载体。将该重组表达载体命名为p35S::AtDuf4，其结构示意图如图1所示。p35S::AtDuf4中，AtDuf4连接于35S启动子下游，由35S启动子启动AtDuf4表达；35S启动子的核苷酸序列为自GENBANK号为AM235741.1的5′端第157-979位核苷酸序列。

用Bam HI和SacI两个限制性内切酶将用引物2和引物3扩增所得的AtDuf4基因从pMD18-T32载体上切下，同时用Hind III和Bam HI将Ubi启动子从pBS-SK-Ubi载体上切下，与用Hind III和SacI酶切的pCAMBIA1300S载体连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。将该重组表达载体命名pUbi::AtDuf4，其表达结构示意图如图2所示。pUbi::AtDuf4中，AtDuf4连接于Ubi启动子下游，由Ubi启动子启动AtDuf4表达；Ubi启动子的核苷酸序列为自GENBANK号为S94464.1的5′端第1-1993位核苷酸序列。

2、转p35S::AtDuf4和pUbi::AtDuf4融合基因拟南芥的获得

将构建好的表达载体p35S::AtDuf4和pUbi::AtDuf4分别转化农杆菌，所用菌株为GV3101。将重组菌株提取质粒进行鉴定，将鉴定正确的转入p35S::AtDuf4的重组菌命名为GV-p35S::AtDuf4，将鉴定正确的转入pUbi::AtDuf4的重组菌命名为GV-pUbi::AtDuf4。

将2-3mL已培养好的GV-p35S::AtDuf4或GV-pUbi::AtDuf4农杆菌菌液加入到150mL三抗(含有60μg/ml RifmL Rif+15μg/ml mL Gen+50μg/ml mL Kan)液体LB培养基中，28℃、200rpm摇动过夜培养过夜至培养基颜色由红色转为黄色；将培养好的150mL农杆菌菌液倒入灭过菌的500mL离心瓶中，4℃、3,000rpm离心15min；弃上清液，加入50mL 1/2 MS培养液(取2.5mL MS(Murashige andSkoog basal medium)液体培养基)，加入到47.5mL水中，加入2.5mg蔗糖，使蔗糖终浓度为5％，混合均匀，最后加入一滴Triton X-100，玻璃棒混合均匀即可)，将离心瓶底的菌悬浮起来，室温下静置10分钟；所用的植物材料为约四周龄、正在开花的拟南芥植株，在侵染前摘除已结果的花朵角果，把上一步准备好的菌液倒入培养皿中，将整个花序浸入菌液10秒；将浸好的拟南芥植株平放在托盘上，黑暗环境下处理18-24h后恢复正常光照培养。分别获得T₀代转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株，收集种子。T₀代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T₁代，依此类推，T₂、T₃分别表示转基因植株第2代和第3代。

3、转基因植物的筛选和鉴定

把步骤2收集的转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株的种子消毒好，均匀铺在直径为20cm的含50μg/mL Hyg的MS(Murashige and Skoog basal medium，0.8％琼脂粉，pH 5.8)固体培养基上，将平板在4℃低温处理2-4天，再转移到培养箱或者温室中培养。培养条件为：22℃，16h光照/8h黑暗；挑取抗性植株，转移到土壤中生长繁殖。

半定量RT-PCR检测野生型(Col-0)(购自拟南芥生物资源中心，ArabidopsisBiological Resource Center，ABRC)、转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株在转录水平上AtDuf4的表达量。具体方法如下所示：

采用CTAB法提取拟南芥Columbia野生型(Col-0)(购自拟南芥生物资源中心，Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)、转p35S::AtDuf4 T₂代植株和转pUbi::AtDuf4 T₂代植株总RNA。在用DEPC处理过的无菌的0.2mL离心管中混合或者在PCR管中混合，在PCR仪上合成cDNA第一条链，反应体系为20μL(或按比例做10μL)，依次加入下列组分：Oligo dT 1μL，dNTPs(10mM)1μL，RNA 5μg，DEPC-H₂O至13μL；65℃变性5min，迅速在冰上冷却至少1min，稍微离心，然后加入：5×First-Strand buffer 4μL，0.1M DTT 1μL，RNase OUT^TM Recombinant RNaseinhibitor 1μL，SuperScript^TM II RT 1μL。轻微混合均匀，42℃反应60min后，70℃处理15min使酶失活，-20℃保存备用。

设计并合成如下二条AtDuf4基因全长特异引物：

引物4：5’--ATGTTTCTTACAAATGGGT-3’

引物5：5’--TTATTTGGCCGTCTCCTTG-3’

PCR反应体系为：

模板DNA：                     800ng；

10X Exbuffer：                2μL；

dNTP混合物(2.5mM)：           2μL；

ExTaq DNA Polymerase(5U/μL)：0.5μL；

引物4(10μM)：                2μL；

引物5(10μM)：                  2μL；

无菌重蒸馏水(sddH₂O)：补足至    20μL。

PCR反应程序：先预变性94℃5min；再94℃30sec，50℃30sec，72℃1min30sec，35个循环，然后72℃10min。

以tublin8为内参对照，其引物序列为：

引物6：5’-CTTCGTATTTGGTCAATCCGGTGC-3’

引物7：5’-GAACATGGCTGAGGCTGTCAAGTA-3’

其扩增体系和程序同上述引物4和引物5的扩增方法。

PCR反应完成后，取15μL扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，图3中Col-0表示野生型，p35S::AtDuf4-5、p35S::AtDuf4-7表示转p35S::AtDuf4植株不同株系T₂代植株，pUbi::AtDuf4-3、pUbi::AtDuf4-24表示转pUbi::AtDuf4植株不同株系T₂代植株，结果显示：野生型样品中几乎检测不到完整的AtDuf4的转录本，而超表达植株里AtDuf4的表达量很高，说明转基因植株中AtDuf4的表达的确是加强了。T₂植株被用于做进一步的表型分析。

4、分析超表达AtDuf4拟南芥植株种子大小

观察超表达AtDuf4的转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代植株的表型时发现，超表达AtDuf4的转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代植株的种子较野生型有明显的增大。为了量化超表达种子相对野生型种子增大的幅度，我们分别统计了野生型Col-0、转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代植株不同株系的五个单株的种子的百粒重。统计结果如图4所示，野生型种子的百粒重在2mg左右，而两种超表达突变体的种子百粒重都在2.6mg左右，具体如图4所示，转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株的种子比野生型的种子平均增重了30％左右。图4中，Col-0表示野生型，p35S::AtDuf4表示转p35S::AtDuf4植株T₂代植株，pUbi::AtDuf4表示转pUbi::AtDuf4植株T₂代植株。

本发明人进一步观察了种子内部结构的变化，把种子剖开，发现种子内基本结构与野生型相比没有明显差异。进一步观察里面成熟胚胎的大小，结果发现成熟胚胎相对野生型的也有大幅度的增大。从图5中可以看出，未受精的胚囊相对野生型也有很大程度的增大。图5中为野生型(A)，转p35S::AtDuf4植株T₂代(B)和转pUbi::AtDuf4植株T₂代(C)干种子；野生型(D)，转p35S::AtDuf4植株T₂代(E)和转pUbi::AtDuf4植株T₂代(F)成熟胚；野生型(G)，转p35S::AtDuf4植株T₂代(H)和转pUbi::AtDuf4植株T₂代(I)胚。标尺：A，B，C，0.5mm；D，E，F，G，H，I，100μm。

5、分析超表达AtDuf4拟南芥植株小苗

将野生型(Col-0)、转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代植株种子播种在MS(Murashige and Skoog basal medium，0.8％琼脂粉，pH 5.8)固体培养基上，先在4℃低温处理3天，再转移到培养箱或者温室中在22℃培养。观察萌发9天后的小苗的生长情况。如图6(A，B，C)所示：与野生型相比，转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代植株子叶的大小和下胚轴的长度都相对增大。图6中为野生型(A)，转p35S::AtDuf4植株T₂代(B)和转pUbi::AtDuf4植株T₂代(C)九天幼苗。标尺：1mm。

本发明人对子叶叶柄和下胚轴长度做了进一步统计，如图7显示，增大的幅度在30％左右，这与种子重量增加的幅度基本相同。

6、分析超表达AtDuf4拟南芥植株花器官

本发明人将步骤5中野生型(Col-0)、转p35S::AtDuf4T₂代植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代植株继续培养，观察植物的花器官，如图6(D，E，F)所示，转p35S::AtDuf4植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代植株的花器官(花瓣，花丝，花萼)与野生型的相比也存在明显增大的现象。图6(D，E，F)为野生型(D)，转p35S::AtDuf4植株T₂代(E)和转pUbi::AtDuf4植株T₂代(F)花。标尺：1mm。

同时对花瓣的长度和最宽的位置的宽度，四个长的花丝和两个短的花丝的长度，以及花萼的长度做了系统的统计，结果如图8所示，各个参数增大的幅度都在30％左右。

7、分析超表达AtDuf4拟南芥植株细胞大小

本发明人利用扫描电镜(SEM)观察了野生型和Ubi启动子驱动超表达AtDuf4得到的超表达植株(转pUbi::AtDuf4植株T₂代)的成熟胚。将野生型和转pUbi::AtDuf4植株T₂代的成熟胚在体式显微镜下从种子中挤出来；放在固定液(5％(体积百分浓度)戊二醛水溶液)中抽气10min；脱水的梯度：80％(体积百分浓度)乙醇水溶液，90％(体积百分浓度)乙醇水溶液，100％乙醇，每个梯度30min；100％乙醇重复一次；液态干冰CO₂的临界点干燥法；用解剖针小心的将成熟胚粘在载物台上；金属镀膜；SEM观察(在电镜室进行)。

结果如图9所示：A、B为子叶内侧表皮细胞，C、D为下胚轴表皮细胞。初步观察可见，超表达植株的细胞较野生型的细胞有一定程度的增大，且子叶内侧表皮细胞较野生型在形态上有一点改变。利用ImagJ软件处理扫描电镜结果，如下表所示，子叶的表面积由0.094±0.008(mm²)增大到0.110±0.008(mm²)，胚轴的表面积由0.074±0.005(mm²)增大到0.096±0.013(mm²)。超表达AtDuf4植株(转pUbi::AtDuf4植株T₂代)与野生型相比，子叶和胚轴表面积分别增加了1.18倍和1.29倍(表1所示)。而子叶中单个细胞的面积由98.52±17(μm²)增大到166.76±28(μm²)，胚轴中单个细胞的面积由127.33±27(μm²)增大到227.39±31.15(μm²)。超表达植株与野生型相比，子叶和胚轴单个细胞面积分别增加了1.69倍和1.79倍(表1所示)。

从以上结果可以看出，超表达AtDuf4引起突变体植株表面积增加的幅度(1.18-1.29倍)没有单个细胞面积增加的幅度大(1.69-1.79倍)，由此推测，过表达AtDuf4植株种子的增大主要是由细胞体积增大引起，同时存在一定程度细胞数目的减少。

表1.超表达AtDuf4拟南芥植株细胞大小分析结果

8、分析超表达AtDuf4拟南芥种子碳水化合物含量

本发明人运用蒽酮法测定了野生型、转p35S::AtDuf4T₂代植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代种子中碳水化合物的含量。具体方法如下所述：

本发明人从100粒野生型和转p35S::AtDuf4T₂代植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代植株的种子中提取糖溶液，将成熟拟南芥种子放在1.5mL离心管中，研磨成匀浆，加入500μL 80％乙醇；70℃温浴90min，常温下12,000rpm离心10min；吸取上清于新的离心管；加入500μL 80％乙醇洗涤沉淀，常温下12,000rpm离心10min，取上清与之前上清混合；室温下真空泵抽气至乙醇完全蒸发，50μL蒸馏水溶解可溶性糖。

准备七个离心管，分别按表2加入以下组分，加入蒽酮试剂4.0mL，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸10min取出，用冰浴冷却至室温，在620nm波长迅速测各管吸光值。以标准葡萄糖含量(μg)为横坐标，以吸光值为纵坐标，作出葡萄糖标准曲线；

表2.蒽酮法葡萄糖标准曲线测定加入试剂

管号	1	2	3	4	5	6	7
								葡萄糖标准液(mL)	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.6	0.8
蒸馏水(mL)	1	0.9	0.8	0.7	0.6	0.4	0.2
								葡萄糖含量(μg)	0	10	20	30	40	60	80

吸取1mL已稀释的提取液于试管中，加入4.0mL蒽酮试剂，平行三份；空白管以等量蒸馏水取代提取液。以下操作同标准曲线制作。根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量(μg)。

用蒽酮法检测溶液中全部可溶性碳水化合物含量，结果如图10所示：p35S::AtDuf4和pUbi::AtDuf4两种超表达植株中每100粒种子所含的可溶性碳水化合物总量在210μg左右，大约是野生型总量的1.5倍左右。

9、分析超表达AtDuf4拟南芥植株蛋白含量

本发明人分别从野生型、转p35S::AtDuf4植株2个株系的T₂代和转pUbi::AtDuf4植株2个株系的T₂代收集100粒成熟拟南芥种子放在1.5ml离心管中，研磨成匀浆，加入200μL种子蛋白提取液(63mM Tris-HCl(pH 7.5)，500mM NaCl，0.07％(g/ml)β-巯基乙醇，1mM PMSF)，4℃，12,000rpm，离心15min，吸取上清于新的离心管，即得到种子中总蛋白。

将得到的蛋白经过SDS-PAGE电泳分离，如图11所示，可以清楚地看到拟南芥种子中所有水平的蛋白，这其中包括种子中两个主要的贮藏蛋白12S-A亚基蛋白和12S-B亚基蛋白。同时可以看到，超表达的植株的种子中所含的蛋白种类情况与野生型基本是一致的。由于蛋白都是从相同数量的种子中提取的，SDS-PAGE分离时上样的体积相同，所以从图上可以大致比较出超表达和野生型相同数量的种子中蛋白的含量，显然超表达的比野生型所含蛋白的浓度要大一些。p35S::AtDuf4-8、p35S::AtDuf4-7表示转p35S::AtDuf4植株不同株系T₂代植株，pUbi::AtDuf4-19、pUbi::AtDuf4-20表示转pUbi::AtDuf4植株不同株系T₂代植株。

为了更准确的测定成熟种子中蛋白的含量，本发明人采用考马斯亮蓝法测定了野生型、转p35S::AtDuf4T₂代植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代植株相同数量种子中蛋白的浓度。如图12所示，p35S::AtDuf4和pUbi::AtDuf4两种超表达植株(转p35S::AtDuf4T₂代植株和转pUbi::AtDuf4植株T₂代植株)中每粒种子所含的蛋白量在6μg左右，大约是野生型种子所含蛋白量的1.3-1.5倍左右。

Claims (3)

1.由序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列组成的蛋白质或者其编码基因在调节植物幼苗、花器官或种子大小中的应用； 

所述植物为拟南芥。 

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调节植物幼苗、花器官或种子大小的方法是培育种子和器官增大的转基因植物，即将序列表中SEQ ID №.1的DNA序列或者序列表中SEQ ID №.2的DNA序列导入植物中表达，筛选得到种子和器官增大的转基因植物。 

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述序列表中SEQ ID №.1的DNA序列或者序列表中SEQ ID №.2的DNA序列通过如下的重组载体导入所述植物中； 

所述重组载体中，序列表中SEQ ID №.1的DNA序列或者序列表中SEQ ID №.2的DNA序列位于强启动子下游；所述强启动子是35s启动子或玉米的Ubi启动子；所述35s启动子的核苷酸序列为自GENBANK号为AM235741.1的5′端第157-979位核苷酸序列，所述Ubi启动子的核苷酸序列为自GENBANK号为S94464.1的5′端第1-1993位核苷酸序列；所述基因与所述强启动子的间隔小于2000bp。 

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