CN1511951A - 减小植物中果实大小的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种非天然存在的植物细胞，其中与拟南芥属AGL8(SEQ ID No：2)具有至少65％的相同性的基因产物的表达受到抑制。本发明还提供了产生特征在于结出减小的种子和/或果实的植物的方法，所述的方法包含在所述的植物中抑制AGL8相关基因产物的表达。

Description

减小植物中果实大小的方法
本申请是申请日为1998年6月26日、申请号为98808590.9、发明名称为“增加植物中果实大小的方法”的中国专利申请的分案申请。
本申请要求1997年6月27日申请的美国临时申请号60/051,030的优先权，其全文内容在本文作为参考文献引用。
本发明由国家科学基金授予的DCB9018749和MCB9408042政府资助完成。政府在本发明中享有一定的权利。
技术领域
本发明一般涉及植物分子生物学和遗传工程，更具体地说涉及生产遗传修饰的种子植物，从该植物中可获得增大或减小的种子或果实。
背景技术
种子和果实生产是数十亿美元的商品产业，在美国的许多州和世界的许多国家它是收入的主要来源。具有商业价值的种子包括，例如，油菜籽，棉籽和向日葵籽，它们由于可从种子中榨取植物油而且有价值。诸如豌豆，蚕豆和小扁豆的豆科植物的种子也具有商业价值，因为它们富含蛋白质，例如，大豆含有40-45％的蛋白质和18％的脂肪及油脂。另外，咖啡是一种有价值的作物，它从小果咖啡(Coffea arabica)植物干燥并烘烤的种子制备，而巧克力则从可可树种子或“咖啡豆”制得。同样，许多果实是有商业价值的，例如，包括玉米，水稻、小麦、大麦和其它谷类，坚果、豆科植物，西红柿和柑桔属果实。
遗憾的是，种子和果实生产均受到内在因素的限制，例如，合适的生长季节和生长条件，包括有限的耕地资源。另外，种子和果实生产受到从植物获得的产量的限制，该产量是所产生的种子和果实平均大小的部分函数。因此，增加种子植物种子或果实产量的方法将有助于抵消特别是随着世界人口的持续膨胀而对食物需求的增加。因此，需要开发从载培植物中增加种子和果实产量的方法。本发明满足了这一需要并提供了有关的益处。
发明内容
本发明提供了一种非天然存在的种子植物，其特征在于由于异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子而产生增大的种子。AGL8-相关基因产物可以基本上具有例如AGL8定向进化同源物，如拟南芥属AGL8的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种转基因种子植物，其特征在于由于异位表达编码AGL8-相关基因产物的外源性核酸分子而产生增大的种子。编码AGL8-相关基因产物的核酸分子可与诸如组成型调节元件或种子选择性调节元件的外源性调节元件有效连接。另外，本发明提供了一种组织。例如种子，它来自本发明的非天然存在的种子植物。
本发明进一步提供了生产非天然存在的种子植物的方法，所述种子植物的特征在于产生增大的种子。经过在种子植物中异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子而实施该方法，其中由于异位表达该核酸分子而增大了种子。在另一个实施方案中，经过将编码AGL-8相关基因产物的外源性核酸分子导入种子植物而实施该方法。
本文还提供了用于产生转基因种子植物的试剂盒，该植物的特征在于产生增大的种子。本发明的试剂盒包括编码AGL8-相关基因产物的核酸分子和种子选择性调节元件。在本发明的试剂盒中，AGL8-相关基因产物基本上具有例如，AGL8定向进化同源物的氨基酸序列。如果需要，用于制备以产生增大种子为特征的转基因种子植物的试剂盒可包括含有可操作地连接到种子选择性调节元件上的编码AGL8-相关基因产物的核酸分子的植物表达载体。
本发明还提供了一种非天然存在的种子植物，其特征在于由于抑制AGLS-相关基因产物表达而产生减小的种子。AGL8-相关基因产物基本上具有，例如，AGL8定向进化同源物的氨基酸序列。在一个实施方案中，AGL8-相关基因产物的表达在种子组织中被选择性抑制。另外，本发明提供了一种组织，如种子，它来自非天然存在的种子植物，其特征在于由于AGL8-相关基因产物的表达受抑制而产生减小的种子。
本文进一步提供了一种非天然存在的种子植物，其特征在于由于异位表达编码AGL8-家族基因产物的核酸分子而产生增大的果实。AGL8-家族基因产物基本上具有AGL8定向进化同源物的氨基酸序列，例如，拟南芥属AGL8的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
在有关实施方案中，本发明提供了一种转基因种子植物，其特征在于由于异位表达编码AGL8-家族基因产物的外源性核酸分子而产生增大的果实。编码AGL8-家族基因产物的外源性的异位表达的核酸分子可有效连接到外源性调节元件上，该调节元件可以是，例如，组成性调节元件或壳瓣(valve)选择性调节元件。
本文提供了来自非天然存在的种子植物的组织，其特征在于该植物由于异位表达编码AGL8-家族基因产物的核酸分子而产生增大的果实。例如，本发明提供了来自非天然存在的种子植物的果实。
本发明还提供了生产非天然存在的种子植物的方法，该植物的特征在于产生增大的果实。该方法包括在该种子植物中异位表达编码AGL8-家族基因产物的核酸分子的步骤，其中由于异位表达该核酸分子而增大果实大小。在一个实施方案中，该方法包括向该种子植物中导入编码AGL8-家族基因产物的外源性核酸分子。
本发明进一步提供了产生其特征在于产生增大的果实的转基因种子植物的试剂盒。该试剂盒包括编码AGL8-家族基因产物的核酸分子以及心皮瓣选择性调节元件。例如，该AGL8-家族基因产物基本上具有AGL8定向进化同源物的氨基酸序列。如果需要，本发明的试剂盒可包括含有可操作连接到心皮瓣选择性调节元件上的编码AGL8-家族基因产物的核酸分子的植物表达载体。
本发明进一步提供了其特征在于产生减小的果实的非天然存在的种子植物，其中AGL8-家族基因产物的表达受抑制。在这种非天然存在的种子植物中，AGL8-家族基因产物基本上具有例如，AGL8定向进化同源物的氨基酸序列。在一个实施方案中，AGL8-家族基因产物的表达在心皮瓣组织中选择性地被抑制。本文还提供了一种组织，如果实，它来自非天然存在的种子植物，该植物的特征在于产生减小的果实，其中AGL8-家族基因产物的表达受到抑制。
附图说明
图1显示了拟南芥属AGL8的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
具体实施方式
本发明提供了非天然存在的种子植物，该植物的特征在于由于异位表达编码ALG8-相关基因产物的核酸分子而产生增大的种子。AGL8-相关基因产物基本上具有例如，AGL8定向进化同源物，如拟南芥属AGL8的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种转基因种子植物，其特征在于由于异位表达编码AGL8-相关基因产物的外源性核酸分子而产生增大的种子。编码AGL8-相关基因产物的核酸分子可被有效连接到外源性调节元件，如组成型调节元件或种子选择性调节元件上。
本发明涉及一种令人惊奇的发现，即AGL8转录因子调节植物中种子的大小。如本文所述，使用DsE增强子捕获(trap)转座元件和GUS报导基因(Sundaresan等，基因进展，9：1797-1810(1995))，本文作为参考文献引用)经过对拟南芥属的Ds转座子插入诱变产生AGL8功能丧失突变体。选择转座事件并筛选报导基因表达型和突变表型。突变影响心皮瓣的细胞分化，胎座框外表皮与两个心皮瓣融合产生锯齿形图案。突变植物的种子除了其形状较小外看起来正常，且与野生型一样保持4排排列。然而，在果实内种子高度致密，且每个果实内种子数目减少到野生型植物产生的种子数的大约75％。
正如本文进一步所公开的，拟南芥属AGL8的过度表达导致与野生型拟南芥属产生的种子相比产生增大的种子。如实施例I所述，在串联的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子控制下的AGL8(SEQ ID NO：2)的组成型表达导致产生异常大小的种子，其大小大约是野生型植物产生的种子大小的3倍。鉴于在玉米中AGL8定向进化同源物SaMADSB的存在和表达，以及AGL定向进化同源物的存在和表达，本领域的技术人员将认识到AGL8-相关基因产物，如AGL8定向进化同源物可在本发明的方法中用于产生，例如，具有本文公开的特征的转基因植物。因此，本发明提供了非天然存在的种子植物，如转基因种子植物，其特征在于由于异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子而产生增大的种子。
本文所用的术语“非天然存在的”用于指种子植物时，意思是经人工进行遗传修饰的种子植物。例如，本发明的转基因种子植物是非天然存在的种子植物，它含有外源性核酸分子，如编码AGL8-相关基因产物的核酸分子，因此，它是经人工遗传修饰的。另外，例如，在内源性AGL8相关基因产物调节元件或编码序列中由于适当接触诱变剂，如化学诱变剂或“插入诱变剂”，如转座子而含有突变的种子植物也认为是非天然存在的种子植物，因为它是经人工遗传修饰的。相反，仅含自发或天然存在的突变的种子植物不是本文定义的“非天然存在的种子植物”，因此不包含在本发明内。本领域的技术人员应明白，尽管非天然存在的种子植物一般是有与天然存在的种子植物相比被改变的核苷酸序列，但非天然存在的种子植物也可经人工进行遗传修饰而不改变其核苷酸序列，例如经过修饰其甲基化方式。
本文所用的术语“异位地”当指核酸分子的表达时，指的是其表达方式不同于野生型种子植物的表达方式。因此，本领域的技术人员应明白编码AGL8-相关基因产物的核酸分子的异位表达是指在正常表达该核酸分子的细胞类型之外的细胞类型中表达，或在正常表达该核酸分子的时期之外的时期表达，或与正常表达该核酸分子的水平不同的水平上表达。在野生型拟南芥属中，例如，AGL8的表达正常情况下局限于花发育晚期在心皮瓣内表达，在种子中看不到表达。然而，在组成型启动子，如花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下，AGL8在种子中表达，另外在心皮瓣组织中以高于正常水平的水平表达，因此是异位表达。
本文所用的术语“增大”当指由本发明的非天然存在的种子植物产生的种子时，意思是与缺乏异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子的相应种子植物，如野生型种子植物产生的种子的体积或干重相比，种子体积或干重明显更大。如本文实施例I所公开的，来自异位表达AGL8(SEQ ID NO：2)的转基因拟南芥属植物的种子产生更大体积和更大重量的种子，表现出比野生型拟南芥植物产生的种子干重几乎重3倍。例如，增大可由种子中细胞数的增加而产生。
应认识到由特定种子植物种类或品种产生的种子大小存在天然变化。然而，由使用本发明方法的种子植物产生的增大种子可经过对产生的种子群体取样并测定比缺乏异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子的相应种子植物品种产生的种子的正态分布平均更大的种子大小的正态分布来较容易地测定。因此，本发明非天然存在的种子植物的生产提供了偏离种子植物产生的种子大小的正态分布的方法，使种子体积或干重平均比不含异位表达编码ALG8-相关基因产物的核酸分子的相应种子植物种类至少增大大约5％，10％，20％，30％，50％，75％，100％，200％，300％，400％或500％。
本发明涉及使用编码特定“AGAMOUS-LIKE”或“AGL”基因产物的核酸分子。AGAMOUS(AG)是一种花器官特性的基因，是转录因子相关家族的一个基因，该因子以各种组合限定花器官：心皮瓣，萼片，雄蕊和心皮的特性(Bowman等， Devel.112：1-20(1991)；Weigel和Meyerowitz， Cell，78：203-209(1994)；Yanofsky，Annual Rev.PlantPhysiol.Mol.Biol.46：167-188(1995))。AGAMOUS基因产物是限定心皮和雄蕊特性所必需的(Bowman等， The Plant Cell，1：37-52(1989)；Yanofsky等， Nature 346：35-39(1990)。最近已鉴定了相关的基因并称为“AGAMOUS-LIKE”或“AGL”基因(Ma等，Genes Devel.5：484-495(1991)；Mandel和Yanofsky， The Plant Cell：1763-1771(1995)，本文作为参考文献引用)。
AGL8，象AGAMOUS和其它AGL基因一样，其部分特征在于它是植物MADS盒基因。植物MADS盒基因一般编码具有大约260个氨基酸的蛋白质，其中包括大约56个氨基酸的高度保守的MADS结构域(Riechmann和Meyerowitz，Bol.chem.378：1079-1101(1997)，本文作为参考文献引用)。首先在拟南芥属AGAMOUS基因和金鱼草DEFICIENS基因中被鉴定的MADS结构域在人类(血清反应因子；SRF)和酵母(MCM1；Norman等，Cell，55：989-1003(1988)；Passmore等，J.Mol.Biol.204：593-606(1988)中发现的转录因子中是保守的，且是MADS结构域蛋白质最高度保守的区域。MADS结构域是序列特异性DNA结合活性的主要决定簇且也可进行二聚体化和其它辅助功能(Huang等，The Plant Cell 8：81-94(1996)。MADS结构域通常位于N一端，尽管有些蛋白质在MADS结构域的N端还含有其它的残基。
位于MADS结构域相邻C端的“间插结构域”或“I-结构域”是保守性较低的结构域，具有大约30个氨基酸的可变长度(Puruggananff等，Genetics.140：345-356(1995))。在有些蛋白质中，I结构域在形成DNA结合二聚体中发挥作用。在植物MADS结构域蛋白质中存在的第三个结构域是中等保守的70个氨基酸的区域，称为“角蛋白样结构域”或“K-结构域”。因其相似于角蛋白分子的区域而得名，K结构域的结构似乎能形成两亲性螺旋并且可介导蛋白质-蛋白质相互作用(Ma等，Genes Devel.5：484-495(1991))。在序列和长度上可变性最大的结构域是MADS结构域蛋白质的羧基末端或“C-结构域”。该区域在某些MADS结构域蛋白质中对于DNA结合和蛋白质二聚体化是非必需的，这种C-结构域的功能仍是未知的。
拟南芥属AGL8是一个242个氨基酸的MADS盒蛋白质(SEQ IDNO：2；Mandel和Yanofsky，同处同上，1995)。AGL8 MADS结构域位于SEQ ID NO：2的氨基酸2至56。AGL8的K-结构域位于SEQID NO：2的氨基酸92至158。
在野生型拟南芥属中，在两个不同的时期积累AGL8 RNA，第一个出现在茎和茎生叶中花序发育期间，第二个出现在花发育的晚期(Mandel和Yanofsky，出处同上，1995)。特别是，AGL8 RNA在植物刚从营养发育转变为生殖发育时在花序分生组织中首先检测到。随着花序茎的伸长，AGL8 RNA在花序分生组织和茎中积累。其次，尽管在花发育的起始时期(1和2)不能检测到AGL8，推测在大约第3时期在相应于第4(心皮)轮区域的花冠中央有AGL8表达。在所有其它的原基和花梗中不进行AGL8表达。在第4心皮轮中AGL8表达的时间一般相应于器官特性基因APETALA3，PISTILLATA和AGAMOUS开始表达的时间(Yanofsky等，自然，346：35(1990)；Drews等，细胞，65：991-1002(1991)；Jack等，细胞68：683-697(1992)；Goto和Meyerowitz，Genes Devel.8：1548-1560(1994)。在晚期，AGL8表达开始位于心皮壁，在组成子房瓣的区域，而在心皮的几乎所有其它细胞类型中均无表达。在胚珠，柱头组织或分隔子房的隔膜中检测不到AGL8 RNA表达。因此，在自发状态下，花发育晚期AGL8表达局限于心皮瓣和花柱内的细胞中。
本文所用的术语“ALG8-相关基因产物”指与拟南芥属AGL8具有相同或相似功能的基因产物，当它在种子植物中异位表达时，改变正常发育，导致产生增大的种子。拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)是本文限定的AGL8-相关基因产物的一个例子。如实施例I中所公开的，在串连CaMV35S启动子控制下的拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)(其中内在启动子元件已被复制)的异位表达改变了正常植物发育，导致产生大约3倍正常大小的种子。
一般来说，AGL8-相关基因产物的部分特征在于含有MADS结构域。AGL8-相关基因产物的特征还在于一般具有与拟南芥属AGL8的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)有至少大约50％氨基酸相同性的氨基酸序列。例如，AGL8-相关基因产物具有与拟南芥属AGL8(SEQ IDNO：2)大于大约65％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列，优选与拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)具有大于大约75％的氨基酸相同性，更优选与拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)具有大于大约85％的氨基酸相同性，并可以是与拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)具有大于大约90％，95％或97％氨基酸相同性的序列。
优选的是，AGL8-相关基因产物与异位表达它的种子植物种类是定向进化同源的。例如，编码拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)的核酸分子可在拟南芥属植物中异位表达以产生其特征为产生增大种子的非天然存在的拟南芥属品种。同样，例如，编码canola AGL8的核酸分子可在canola植物中异位表达以产生出其特征为增大的canola种子的非天然存在的canola品种。
编码ALG8-相关基因产物的核酸分子也可在异源性种子植物中异位表达以产生其特征在于产生增大种子的非天然存在的种子植物。AGL8-相关基因是AGAMOUS一类基因，它存在于大多数(如果不是全部)被子植物中。例如，AGAMOUS在西红柿(TAG1)和玉米(ZAG1)中保守，表明AGAMOUS类基因产生在整个植物界中广泛保守(Pnueli等，The Plant Cell，6：163-173(1994)；Schmidt等，The PlantCell 5：729-737(1993))。AGL8相关基因产物，如AGL8定向进化同源物也可能是保守的，且可在物种间交叉发挥功能以产生增大的种子。因此，例如，在芸苔科，如蔓青(油菜子)或在豆科，如大豆属(大豆)中在异源性种子植物中异位表达编码拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)的核酸分子可改变正常发育并导致产生增大的种子。而且，例如，编码拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)的核酸分子可在亲缘关系更远的异源性种子植物，包括双子叶和单子叶被子植物和裸子植物中被异位表达，且异位表达时可改变正常发育，导致异源种子植物产生增大的种子。
本文所用的术语“AGL8-相关基因产物”包括AGL8-相关基因产物的活性片段，它是AGL8-相关基因产物的多肽部分，当被异位表达时，可改变正常发育，使产生增大的种子。例如，活性片段可以是拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)的氨基末端，内部的，或羧基末端片段，当在种子植物中被异位表达时，它可改变正常发育，使产生增大的种子。例如，AGL8-相关基因产物的活性片段可包括MADS结构域，且可具有特异性结合DNA的能力。本领域的技术人员将认识到编码AGL8-相关基因产物的活性片段的核酸分子可用于产生本发明的种子植物，该植物的特征在于产生增大的种子，该核酸分子也可用于下文进一步描述的本发明的有关方法和试剂盒。
使用实施例I中所述的方法或使用其它常规方法可鉴定AGL8-相关基因产物的活性片段。简单地说，诸如拟南芥属的种子植物用在诸如串联CaMV 35S启动子的组成型调节元件控制下的核酸分子转化。对种子植物的表型分析显示异位表达特定多肽部分的种子是否产生增大的种子。为了分析大量的AGL8-相关基因产物的多肽部分，可在分子库中测试编码多肽部分的核酸分子，随后进一步划分出活性分子库以鉴定活性核酸分子。
在一个实施方案中，本发明提供了非天然存在的种子植物，其特征在于由于异位表达编码基本上具有AGL8定向进化同源物的氨基酸序列的AGL8-相关基因产物的核酸分子而产生增大的种子。本文所用的术语“AGL8定向进化同源物”指拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)的定向进化同源物并包括在特定种子植物品种中与拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)在氨基酸水平上具有最高同源百分数。例如，AGL8定向进化同源物可以是芸苔属AGL8定向进化同源物，如蔓青AGL8定向进化同源物，或豆科AGL8定向进化同源物，如大豆、豌豆，小扁豆或蚕豆AGL8定向进化同源物。已描述了来自长日照植物欧白芥的AGL8定向进化同源物，命名为SaMADS B(Menzel等，PlantJ.9：399-408(1996)，本文作为参考文献引用)。使用核苷酸序列作为探针并用分子生物学领域熟知的方法可从其它种子植物种类中分离新的AGL8定向进化同源物的cDNA(Glick和Thompson(编辑)，植物分子生物学和生物技术方法，Boca Raton，FL：CRC出版社(1993)；Sambrook等(编)，分子克隆：实验手册(第二版)，Plainview，NY：冷泉港实验室出版社(1989)，本文分别作为参考文献引用)。
本文所用的术语“基本上具有氨基酸序列”，当用于指AGL8定向进化同源物时，意思是具有相同氨基酸序列的多肽或多肽片段，或具有相似，不相同的序列，被本领域的技术人员认为是功能上等价的氨基酸序列的多肽或多肽片段。例如，基本上具有拟南芥属AGLB氨基酸序列的AGL8-相关基因产物可具有与拟南芥属AGL8(SEQ IDNO：2)的序列相同的氨基酸序列或功能等价的相似但不相同的序列。具体地说，基本上具有AGL8定向进化同源物的氨基酸序列的基因产物可相对于SEQ ID NO：2的AGL8氨基酸序列具有一个或多个修饰，如氨基酸增加，缺失或取代，包括保守的或非保守的取代，例如，只要将修饰的多肽基本上保留改变正常发育的能力使在种子植物中异位表达该核酸分子时可产生增大的种子。在任意长度的2个序列间进行基本相似的序列比较，通常在大约6个到1200个残基间的序列上进行，优选大约10到100个残基之间，更优选大约25到35个残基之间。使用本领域的常规方法进行这种基本相似性的比较。
应明白对一级氨基酸序列的轻微修饰可产生AGL8-相关基因产物。与产生它的AGL8定向进化同源物相比基本上具有等价或增强的功能。另外，可将各种分子附着到AGL8定向进化同源物或其活性片段上，例如，其它多肽，抗原性或其它肽标记，糖类，脂类或化学基团。这种修饰包括在本文定义的术语AGL8定向进化同源物范围内。
可将一个或多个点突变导入编码AGL8定向进化同源物的核酸分子中以产生修饰的核酸分子，例如，可使用定点诱变法进行(参见Wu(编)，酶学方法，第217卷，San Diego：Academic Press(1993)；Higuchi，“重组PCR”，Innis等(编)，PCR方法，San Diego：Academic Press，Inc.(1990)，本文分别作为参考文献引用)。可使用这种诱变导入特定的，所需的氨基酸插入，缺失或取代；另外，可合成在一个或多个预定位置具有随机核苷酸的核酸序列以产生随机氨基酸取代。淘选诱变也可用于产生基本上编码AGL8定向进化同源物氨基酸序列的修饰的核酸分子。
可按常规测试修饰的核酸分子改变正常植物发育使产生增大的种子的能力。按实施例I所述相同的方式，可异位表达基本上编码AGL8定向进化同源物氨基酸序列的核酸分子，例如，使用组成型调节元件，如CaMV 35S启动子或使用组织特异性调节元件，如下文进一步描述的种子选择性调节元件。如果该异位表达导致种子植物产生增大的种子，这种修饰的多肽或片段就是本文所定义的“AGL8定向进化同源物”。
本发明的其特征在于产生增大种子的非天然存在的种子植物可以是种子植物中的一个品种，包括单子叶或双子叶被子植物或裸子植物。例如，本发明的有用的种子植物可以是芸苔科的一员，如油菜子，或是豆科的一员，如大豆，豌豆，小扁豆或蚕豆植物。
本文所用的术语“种子植物”指被子植物或裸子植物。被子植物是种子生于成熟的子房(果实)中的产种子的植物。被子植物通常被当作有花植物。被子植物根据子叶数目分成2大类，子叶一般是贮存或吸收营养的种子叶片。因此，单子叶被子植物是具有单片子叶的被子植物，而双子叶植物是具有两片子叶的被子植物。被子植物的品种是已知的，例如，包括油料种子植物，豆科植物，带果实的植物，观赏花卉，谷类植物和硬木树，其一般分类不需排除在外。本领域的技术人员将认识到可按需要用这些或其它被子植物实施本发明的方法。本发明也可用裸子植物来实施，该植物是种子不被子房包围的产种子的植物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的种子植物，其特征在于由于异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子而产生增大的种子，其中该种子植物是芸苔科的一个成员。芸苔科常称为“芸苔”，它是包括特别有价值的油料种子植物canola的作物植物的一个分支群体(例如，参见，Williams和Hill，科学，232：1385-1389)1986，本文作为参考文献引用)。芸苔科包括6个主要的种类，每种分别包含一类植物形式：蔓菁，花椰菜，油菜(芜菁)，芥菜；和Brassicacarinata。本领域的技术人员应明白芸苔科的任何成员可按本文所述进行修饰以产生其特征在于产生增大的种子的非天然存在的芸苔种子植物。
本发明还提供了非天然存在的种子植物，其特征在于由于异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子而产生增大的种子，而该种子植物是豆科的一个成员。豆科通常称为豆科的成员，它是产生称为豆荚的特征性干裂果实的种子植物。豆科的成员，如产生诸如大豆(黄豆)，豌豆，鹰嘴豆，蛾豆，蚕豆，菜豆，利马豆，小扁豆，豇豆，干豆，或花生的颗粒豆荚的植物可按本文所述进行修饰以产生非天然存在的品种，该品种的特征在于产生增大的种子。
本发明的其特征在于产生增大种子的非天然存在的种子植物也可以是油料种子植物，如萼距属(千屈菜科)植物的成员。萼距花属种子植物特别有价值，因为萼距花属油籽种子含有工业上和营养学上重要的中链脂肪酸，特别是月桂酸，通常仅能由椰子和棕榈核油提供。可按本文公开的方法进行修饰以产生增大的种子的其它油料种子植物包括，例如，栽培的向日葵(Helianthus annuus L.)和棉花植物，如栽培以获取棉籽的棉属植物。
本发明的其特征在于产生增大的种子的非天然存在的种子植物还可以是，例如，咖啡植物(小果咖啡)或可可植物(可可)。本领域的技术人员将认识到可按需要用这些或其它种子植物种类实施本发明以增加有商业价值的种子的产量。
本发明还提供了一种转基因种子植物，其特征在于由于异位表达编码AGL8-相关基因产物的外源性核酸分子而产生增大的种子。在本发明的转基因种子植物中，异位表达的编码AGL8-相关基因产物的外源性核酸分子可有效连接到外源性调节元件上。在一个实施方案中，本发明提供了一种转基因种子植物，其特征在于产生增大的种子，它具有异位表达的有效连接到组成型调节元件上的编码AGL8-相关基因产物的外源性核酸分子。例如，本发明提供了一种转基因种子植物，其特征在于由于异位表达有效连接到花椰菜花叶病毒35S启动子上的基本上编码AGL8定向进化同源物的氨基酸序列的外源性核酸分子而产生增大的种子。在另一实施方案中，本发明了一种转基因种子植物，其特征在于由于异位表达有效连接到种子选择性调节元件上的编码AGL8-相关性基因产物的外源性核酸分子而产生增大的种子。
本文所用的术语“转基因”指含有外源性核酸分子的种子植物，该核酸分子可来自相同的种子植物种类或来自异源性种子植物种类。
本文所用的术语“外源性”指核酸分子和转基因种子植物时，指来自该种子植物之外的核酸分子。外源性核酸分子可以具有天然存在的或非天然存在的核苷酸序列。本领域的技术人员应明白，外源性核酸分子可以是来自与导入该核酸分子的种子植物不同的种子植物种类的异源性核酸分子或可以是来自与被导入的种子植物相同的种子植物种类的核酸分子。
术语“有效连接”用于指调节元件和核酸分子，如编码AGL8-相关基因产物的核酸分子时，指调节元件对有效连接的核酸分子提供调节表达。因此，术语“有效连接”用于指诸如组成型调节元件的外源性调节元件和编码AGL8-相关基因产物的核酸分子时指组成型调节元件与编码AGL8-相关基因产物的核酸分子连接使组成型调节元件的表达方式提供给编码AGL8-相关基因产物的核酸分子。应认识到被有效连接的调节元件和核酸分子应最少具有用于转录所必需的所有元件，例如，包括TATA盒。
本文使用的术语“组成型调节元件”指给有效连接的核酸分子提供表达水平的调节元件，该核酸分子相对独立于表达组成型调节元件的细胞或组织类型。在种子植物中表达的组成型调节元件一般广泛地在细胞和组织类型中大量表达。
在本发明的转基因种子植物中异位表达有用的各种组成型调节元件是本领域熟知的。例如，花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子是被充分鉴定的组成型调节元件，它在所有植物组织中产生高水平的表达(Odell等，Nature 313：810-812(1985))。CaMV 35S启动子由于其在许多不同的种子植物种类中具有活性而特别有用(Benfey和China，科学，225：959-966(1990)；Futterer等，植物生理学，79：154(1990)；Odell等，出处同上，1985)。其中内部启动子元件已被复制的串联35S启动子与非修饰的35S启动子相比提供更高的表达水平(Kay，等，科学，236：1299(1987)。在本发明的转基因种子植物中异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子有用的其它组成型调节元件包括，例如，花椰菜花叶病毒19S启动子；玄参花叶病毒启动子；和胭脂氨酸合酶(nos)基因启动子(Singer等，植物分子生物学，14：433(1990)；An，植物生理学，81：86(1986))。
其它的组成型调节元件，包括那些在单子叶植物中有效异位表达的元件也是本领域已知的，例如pEmu启动子和水稻Actin-1 5’区为基础的启动子(Last等，Theor.Appl.Genet.81：581(1991)；Mcelroy等，Mol.Gen.Genet.231：150(1991)；Mcelroy等，Plant Cell 2：163(1990))。组成来自不同基因的元件得到的嵌合调节元件也可用于异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子(Comai等，PlantMol.Biol：15：373(1990)。本领域的技术人员应明白，具体组成型调节元件的选择部分以异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子的种子植物种类和以所需的表达水平为基础。
本文的术语“种子选择性调节元件”指当有效连接到核酸分子上时，给有效连接的核酸分子在有限数量的植物组织，包括一种或多种种子组织中提供选择性表达的核苷酸序列。种子选择性调节元件可专一性地在种子组织中提供特异性表达，或可在有限数量的植物组织，包括一种或多种组织中提供选择性表达。
例如，种子选择性调节元件可来自在种子植物的种子组织中选择性表达的各种基因，例如，在种皮、胚乳或种子胚中选择性表达的基因(例如，参见West和Harada，Plant Cell，5：1361-1369(1993)，和Goldberg等，科学，266：506-614(1994)，本文分别作为参考文献引用)。例如，AGL15基因是在种子中选择性表达的基因，其描述参见Helk等，Plant Cell，7：1271-1282(1995)和Perry等，Plant Cell 8：1977-1989(1996)，本文分别作为参考文献引用。因此，AGL15启动子或其活性片段可以是本文所定义的种子选择性调节元件。1511种皮基因也在种皮中选择性表达，因此，1511启动子或其活性片段，如可以GenBank登记号AC000375获得的基因组序列的片段可以是种子选择性调节元件。玉米醇溶蛋白贮存蛋白基因的启动子或活性片段也可以是有用的种子选择性调节元件，例如在种子胚乳中选择性表达的编码22Kda蛋白质的基因(Burr等，J.Mol.Biol.154：33-49(1982)；Aukerman等，Genes &Devel.5：310-320(1991)；和Schmidt等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，87：46-50(1990)，本文分别作为参考文献引用)。诸如SHOOTMERISTEMLESS的其它基因已知在种子胚中选择性表达；SHOOTMERISTEMLESS启动子或其活性片段，如可从GenBank登记号AC003113中获得的序列的片段也可以是在实施本发明中有用的种子选择性调节元件(Long等，Nature 379：66-69(1996)，本文作为参考文献引用)。本领域的技术人员应明白，在种子组织中选择性表达的任何这类基因的调节元件均可以是本文限定的种子选择性调节元件，只要该元件给有效连接的核酸分子在一种或多种种子组织中提供选择性表达。
使用常规方法可鉴定和分离其它的种子选择性调节元件。例如，使用从种皮，胚乳或种子胚制备的RNA和从非种子组织，如根或叶组织制备的RNA的不同筛选方案可用于分离在种子中选择性表达的cDNA；随后，使用cDNA序列作探针分离相应的基因。
也可使用增强子捕获或基因捕获方案鉴定和分离本发明的种子选择性调节元件(Sundaresan等，出处同上，1995；Springer等，Science268：877-880(1995)；Koncz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8467-8471(1989)；Kertbundit等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5212-5216(1991)；Topping等.Development 112：1009-1019(1991)，本文分别作为参考文献引用)。增强子捕获元件包括报导基因，如具有弱或最小启动子的GUS，而基因捕获元件缺乏启动子序列，依赖于从侧翼染色体基因进行转录而实现报道基因表达。包含在构建体中的可转座元件介导与内源性基因座的融合；选择性地在种子组织，如在种皮，胚乳或种子胚中表达的构建体以其表达方式被鉴定。用插入元件作为标记，使用例如，反向聚合酶链式反应方法克隆侧翼的种子选择性调节元件(例如，参见，Aarts等，Nature，363：715-717(1993)；也参见Ochman等，“以反向PCR扩增侧翼序列”，Innis等，Supra，1990)。Sundaresan等，出处同上，1995的AC/DS转座系统在鉴定和分离本发明的种子选择性调节元件中特别有用。
经过在无启动子的报道基因前插入随机基因组DNA片段的文库并筛选用种子选择性报道基因表达文库转化的转基因种子植物也可分离种子选择性调节元件。含有分别在最小35S启动子控制下的npt基因和GUS基因的无启动子载体pROA97也可用于这种筛选。基因组文库可以是，例如，拟南芥基因组DNA或来自，例如，另一芸苔科，豆科或感兴趣的油料种子植物的基因组DNA的Sau 3A片段(Ott等，Mol.Gen，Genet.223：169-179(1990)；Claes等，The Plant Journal1：15-26(1991)，在本文中分别作为参考文献引用)。
本发明的调节元件的种子选择性表达可用常规技术证实，例如，使用报道基因和原位表达分析。GUS和萤火虫荧光素酶报道基因对于植物基因表达的原位定位特别有用(Jefferson等，EMBO J.6：3901(1987)；Ow等，Science，34：856(1986)，在本文中分别作为参考文献引用)；含有GUS表达盒的无启动子载体可作为商品获得，例如，来自Clontech(Palo Alto，CA)。为了鉴定种子选择性调节元件，使用酶或以PCR为基础的方法产生所需的核酸分子(Glick和Thompson，出处同上，1993)；Innis等，出处同上，1990)；所得的片段与报道基因如GUS融合，并按上述进行分析。
本发明的在转基因种子植物中有用的外源性调节元件也可以是可诱导的调节元件，它是一种对有效连接的核酸分子提供条件表达的调节元件，其中有效连接的核酸分子的表达在特定诱导剂或刺激剂存在的条件下与没有诱导剂或刺激剂时核酸分子的表达相比增加。特别有用的诱导调节元件包括铜诱导调节元件(Mett等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：4567-4571(1993)；Furst等，Cell 55：705-717(1988))；四环素和氯四环素诱导调节元件(Gatz等，Plant J.2：397-404(1992)；Roder等，Mol.Gen.Genet，243：32-38(1994)；Gatz，Meth.Cell Biol.50：411-424(1995))；蜕皮激素诱导调节元件(Christopherson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：6314-6318(1992)；Kreutzweiser等，Ecotoxicol.Environ.Safety 28：14-24(1994))；热休克诱导调节元件(Takahashi等，Plant Physiol.99：383-390(1992)；Yabe等，Plant CellPhysiol 35：1207-1219(1994)；Ueda等，Mol.Gen.Genet.250：533-539(1996))；和乳糖操纵子元件，它用于与组成型表达的乳糖抑制子组合以提供，例如，IPTG诱导的表达(Wilde等，EMBO J.11：1251-1259(1992))。
在本发明的转基因种子植物中有用的诱导调节元件也可以是，例如，来自菠菜亚硝酸还原酶基因的硝酸盐诱导启动子(Backt等，PlantMol.Biol.17：9(1991))或光诱导启动子，如与RuBP羧化酶的小亚基或LHCP基因家族相联的启动子(Feinbaum等，Mol.Gen.Genet.226：449(1991)；Lam和Chua，Science 248：471(1990))。其它诱导调节元件包括水杨酸诱导调节元件(Uknes等，Plant Cell5：159-169(1993)；Bi等，Plant J.8：235-245(1995)；植物激素诱导调节元件(Yamaguchi-Shinozaki等，Plant Mol.Biol.15：905(1990)；Kares等，Plant Mol.Biol.15：225(1990))；和人激素诱导调节元件，如人糖皮质激素反应元件(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421(1991))。
本发明进一步提供了来自非天然存在的种子植物的组织，该植物的特征在于由于异位表达编码AGL8相关基因产物的核酸分子而产生增大的种子。特别有价值的组织可以是，例如种子。
本文所用的术语“组织”指种子植物细胞的聚集体以及组织成一种结构和功能单位的细胞间物质。本发明的组织可以是，例如，种子，果实，叶，根或其部分。本发明特别有用的组织是种子或果实。本发明特别有用的组织也可以是营养或非营养繁殖的组织以便再生产生该组织的种子植物。
本文所用的术语“种子”指受精后种子植物的胚珠成熟形成的结构。从本发明的非天然存在的种子植物很容易收获这类种子。
应认识到含有异位表达的编码AGL8-相关基因产物的核酸分子的本发明的非天然存在的种子植物也可含有一个或多个其它的修饰，包括天然和非天然存在的突变，例如该突变可调节种子大小的增大。
本发明进一步提供了产生非天然存在的种子植物的方法，该植物的特征在于产生增大的种子。经过在种子植物中异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子，而由于该核酸分子的异位表达而增大种子大小来实施该方法。在一个实施方案中，经过将编码AGL8-相关基的的核酸分子导入种子植物来实施该方法。
如上文所讨论的，术语“异位”指编码AGL8-相关基因产物的核酸分子的表达在正常表达该核酸分子的细胞类型以外的细胞类型，在正常表达该核酸分子的时期以外的时期或以与正常表达该核酸分子的水平不同的表达水平进行。
AGL8-相关基因产物实际的异位表达取决于各种因素。异位表达可在大多数或所有植物组织中广泛进行或可局限于在少数植物组织中表达，且可经过各种常规技术实现。包括种子或花粉诱变的诱变可用于产生非天然存在的种子植物，其中异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子。乙基甲磺酸(EMS)诱变，转座子介导的诱变或T-DNA介导的诱变也可用于异位表达AGL8-相关基因产物以产生种子增大的种子植物(一般参见Glick和Thompson，出处同上，1993)。尽管不希望受任何具体机制的限制，但诱变植物中的异位表达可由一个或多个AGL8负调控物的失活引起，例如，由AGL1和AGL5一起失活引起。
AGL8-相关基因产物的异位表达由从异源调节元件或以其自身启动子的修饰变异体表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子来实现。异源性调节元件包括组成型调节元件和种子选择性调节元件，前者导致在种子以及各种其它细胞类型中表达AGL8-相关基因产物，后者在有限的植物组织，包括一种或多种种子组织中使AGL8-相关基因产物产生选择性表达。
使用内源性或外源性编码AGL8-相关基因产物的核酸分子可实现编码AGL8-相关基因产物的核酸分子的异位表达。重组外源性核酸分子可含有有效连接编码AGL8-相关基因产物的核酸序列的异源调节元件。产生在异源性调节元件控制下的所需重组核酸分子和产生本发明的非天然存在的种子植物的方法是本领域熟知的(一般参见，Sambrook等，出处同上，1989，Glick和Thompson，出处同上，1993)。
使用各种转化方法，包括土壤杆菌介导的转化和诸如电穿孔和微粒介导的转化的直接基因转移方法可将外源性核酸分子导入异位表达的种子植物中(一般参见，Wang等(编)，植物和土壤微生物的转化，Cambridge，UK：University Press(1995)，本文作为参考文献引用)。基于土壤细菌根癌土壤杆菌的转化方法对于将外源性核酸分子导入种子植物特别有用。土壤杆菌的野生型含有Ti(肿瘤诱导)质粒，它导致在宿主植物上产生致瘤的冠状菌瘿生长。将Ti质粒的肿瘤诱导T-DNA区域转移进植物基因组需要Ti质粒编码的毒性基因以及T-DNA边界，它是划定转移区域的一组直接DNA重复。以土壤杆菌为基础的载体是Ti质粒的修饰形式，其中肿瘤诱导功能被要导入植物宿主的感兴趣的核酸序列所取代。
土壤杆菌介导的转化一般采用共整合载体，或优选双重载体系统，其中Ti质粒的组份被分开在永久位于土壤杆菌宿主中并携带毒性基因的辅助载体和含有以下T-DNA序列为边界的目的基因的穿梭载体之间。各种双重载体是本领域所熟知的且是商业上可获得的，例如，来自Clontech(Palo Alto，CA)。例如共同培养土壤杆菌与培养的植物细胞或愈伤组织，如叶组织，根外植体，下胚轴，茎片或块茎的方法也是本领域熟知的(Glick和Thomson，出处同步，1993)。受土壤杆菌感染的植物组织内愈伤细胞在合适的条件下培养时可从头发育成器官；所得的转基因幼苗最终产生异位表达编码AGL8-相关基因产物的核酸分子的转基因植物。土壤杆菌也可用于转化整株种子植物，其描述参见Bechtold等，C.R.Acad.Sc.Paris，Life Sci.316：1194(1993)，本文作为参考文献引用)。土壤杆菌介导的转化用于产生各种转基因种子植物(Wang等，出处同上，1995)，包括芸苔科的转基因植物，如油菜子和亚麻，以及豆科的转基因植物，如大豆，豌豆，小扁豆和蚕豆。
微粒介导的转化也可用于产生异位表达AGL8-相关基因产物的转基因种子植物。首先由Klein等(Nture 327：70-73(1987)，本文作为参考文献引用)描述的这种方法依赖于诸如金或钨的微粒，该微粒经过与氯化钙，亚精胺或PEG沉淀用所需的核酸分子覆盖。使用诸如BIOLISTIC PD-1000(Biorad；Hercules CA)的装置将微粒以高速度加速进入被子植物组织。
微粒介导的转移或“粒子轰击”对于转化使用其它方法难以转化或再生的种子植物特别有用。例如，微粒介导的转化用于产生各种转基因植物种类，包括棉花，烟草，玉米，杂交杨和番木瓜(参见Glick和Thompson，出处同上，1993)以及谷类作物，如小麦，燕麦，大麦，蜀黍和水稻(Duan等，Nature Biotech.14：494-498(1996)；Shimamoto，Curr.Opin.Biotech.5：158-162(1994)，在本文中分别作为参考文献引用)。综上所述，本领域的技术人员将认识到本文公开的土壤杆菌介导的或微粒介导的转化或本领域已知的其它方法可用于产生本发明的转基因种子植物。
如本文所述，agl8突变体植物与野生型拟南芥属植物产生的种子相比具有较小的种子。因此，除了上述实施方案外，本发明还提供了一种非天然存在的种子植物，其特征在于由于AGL8-相关基因产物表达受抑制而产生减小的种子。例如，该AGL8-相关基因产物基本上具有AGL8定向进化同源物的氨基酸序列。在一个实施方案中，AGL8-相关基因产物的表达在种子组织中被选择性抑制。另外，本发明还提供了一种组织，如种子，它来自非天然存在的种子植物，该植物的特征在于由于AGL8-相关基因产物表达受抑制而产生减小的种子，可按本文所述修饰以产生减小的种子的特别有价值的种子植物种类包括，例如，产生棉籽的为布料生产而栽培的植物，黄瓜植物，西红柿植物，柑桔树和西瓜植物。
本文所用的术语“减小”当指由本发明的非天然存在的种子植物产生的种子时，意思是与AGL8-相关基因产物的表达未抑制的相应种子植物，如野生型种子植物产生的种子的体积或干重相比体积或干重明显减少。尺寸减小的种子可具有的体积或干重平均不超过相应野生型种子植物产生的种子体积或干重的大约9/10，8/10，7/10，5/10，3/10，2/10或1/10。
本文所用的术语“抑制”指AGL8-相关基因产物的表达时意思是在种子植物中的功能性AGL8-相关基因产物的量与在相应野生型种子植物中功能性AGL8-相关基因产物的量相比减少。因此，本文所用的术语“抑制”包含在种子植物中缺乏AGL8-相关基因产物，以及存在AGL8-相关基因产物的表达，但其水平与野生型种子植物中该基因产物的水平相比减少。而且，术语抑制指AGL8-相关基因产物的表达在AGL8相关基因产物表达的全部结构域中减少，或指在AGL8相关基因产物表达结构域的某部分中表达减少，只要所得的种子植物具有产生减小的种子的特征。
本文所用的术语“抑制”还包含AGL8-相关基因产物的量相当于相应野生型种子植物中AGL8-相关基因产物的量，但其中AGL8-相关基因产物的活性水平下降。如上所述，AGL8-相关基因产物可含有保守的MADS结构域，因此，例如，在MADS结构域内减少AGL8-相关基因产物的DNA结构活性的点突变或总体缺失会降低或破坏其活性，因而“抑制”本文所定义的AGL-相关基因产物的表达。本领域的技术人员将认识到，在一个实施方案中，AGL8相关基因产物表达基本上在种子植物中缺乏或AGL8相关基因产物基本上无功能。
可使用各种方法抑制种子植物中AGL8-相关基因产物表达。经过直接修饰AGL8-相关基因产物的基因组基因座，例如，经过修饰AGL8定向进化同源物的调节序列使从AGL8定向进化同源性基因座的转录或翻译减少，或经过修饰AGL8定向进化同源物的编码序列使产生无功能的AGL8相关基因产物可实现抑制。种子植物中AGL8-相关基因产物表达的抑制也可间接实现，例如，经过修饰调节AGL8相关基因产物表达的蛋白质的表达或活性实现。实现种子植物中的AGL8相关基因产物表达抑制的方法包括，例如，同源重组，化学和转座子介导的诱变，共抑制和基于反义核酸的技术以及显性失活方法。
AGL1或AGL5的同源重组可用于抑制种子植物中AGL8相关基因产物表达。植物中同源重组的使用已被描述，例如，参见Kempin等，自然，389：802-803(1997)，本文作为参考文献引用。
经过用Ds转座子或Stm转座子使用转座子介导的插入诱变产生功能丧失突变也可实现AGL8-相关基因产物表达的抑制(例如，参见Sundaresan等，Genes Devel，9：1979-1810(1995)，本文作为参考文献引用)。转座子插入AGL8相关基因产物靶基因中的鉴定可使用，例如，限制性图谱法，它可鉴定基因启动子或编码区域中插入的存在，插入导致功能性基因产物的表达受抑制。经过检测靶基因编码的mRNA的缺乏或经过检测基因产物的不存在也可鉴定转座子的插入，抑制AGL8相关基因产物的表达也可经过使用T-DNA介导的插入诱变产生功能丧失突变来实现(例如，参见，Krysan等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA93：8145-8150(1996))。
种子植物中AGL8相关基因产物表达的抑制也可使用共抑制实现，共抑制是熟知的方法，它依赖于有义方向的核酸分子表达以产生导入的核酸分子和同源的内源性基因的协同沉默(参见，例如，Flavell，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：3490-3496(1994)；Kooter和Mol，Current Opin.Biol，4：166-171(1993)，本文分别作为参考文献引用)。用经过大量的转基因拷贝或经过过度表达转基因RNA可最强烈地诱导共抑制，经过修饰转基因使其不能翻译可增强共抑制。
编码AGL8相关基因产物的反义核酸分子或其片段也可用于抑制种子植物中AGL8-相关基因产物的表达。反义核酸分子减少mRNA翻译或增加mRNA降解，从而抑制基因表达(例如，参见，Kooter和Mol，出处同上，1993；Pnueli等，The Plant Cell，Vol.6.175-186(1994)，本文作为参考文献引用)。
为了产生AGL8相关基因产物表达受抑制的非天然存在的种子植物，可在强调节元件，如组成型调节元件或上文所述的种子选择性调节元件的控制下表达一个或多个有义或反义核酸分子。
本领域的技术人员将认识到有效抑制内源性AGL8相关基因产物表达依赖于与相应内源性基因座具有高同源百分数的一个或多个导入的核酸分子。本文提供了编码拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)的核酸分子。编码拟南芥属AGL8的核酸分子可用于本发明的方法或用于分离定向进化同源的AGL8序列。
使用同源重组，共抑制或反义方法进行有效抑制所需的同源性可凭经验测定。一般来说，有效抑制AGL8相关基因产物表达优选最小具有大约80-90％的核酸序列相同性。因此，优选来自导入该核酸分子的种子植物科或属的编码基因定向进化同源物的核酸分子用于使用同源重组，共抑制或反义技术产生本发明的非天然存在的种子植物。更优选的是，使用来自相同种子植物种类的编码基因定向进化同源物的核酸分子在本发明的种子植物中抑制AGL8-相关基因产物的表达。例如，编码canola AGL8相关基因产物，如canola AGL8的核酸分子优选被用于在cannola植物中抑制AGL8相关基因产物的表达。
尽管在本发明的方法中优选使用高度同源的核酸分子，但用于同源重组，共抑制或反义抑制的核酸分子不必含有完整的被抑制的AGL8-相关基因产物序列。因此，例如，仅编码拟南芥AGL8(SEQ ID NO：2)一部分的有义或反义核酸分子可用于产生AGL8相关基因产物表达受抑制的本发明的非天然存在的种子植物。
同源重组的部分核酸分子一般至少含有与靶基因同源的大约1kb的序列，优选含至少大约2kb，更优选至少大约3kb且可含有与靶基因同源的至少大约5kb的序列。用于共抑制或反义抑制的编码AGL8相关基因产物的部分核酸分子一般含有至少大约50个碱基对到编码AGL8相关基因产物全长的核酸分子。与本文定义的活性片段相反，用于同源重组，共抑制或反义抑制的部分核酸分子不必编码基因产物的功能部分。
也可使用显性失活构建体以抑制种子植物中AGL8相关基因产物的表达。本发明有用的显性失活构建体一般含有编码完整AGL8相关基因产物的序列的一部分，例如，该部分足以具备DNA结合或蛋白质-蛋白质间相互作用，如同型二聚体或异型二聚体蛋白质-蛋白质间相互作用，但缺乏野生型蛋白质的转录活性。例如，AGAMOUS羧基末端缺失突变体用作显性失活构建体以抑制MADS盒基因AGAMOUS的表达(Mizukami等，Plant Cell，8：831-844(1996)，该文作为参考文献引用)。本领域的技术人员应明白，同样，显性失活AGL8相关基因产物构建体，如显性失活AGL8定向进化同源物构建体可用于抑制种子植物中AGL8相关基因产的的表达，从而导致产生减小的种子。有用的显性失活构建体可以是缺失突变体，例如，编码单独的MADS序列盒结构域(“M”)，MADS序列盒结构域和“间插”区(“MI”)；MADS序列盒，“间插”区和“K”结构域(“MIK”)或“间插”，“K”和羧基末端结构域(“IKC”)。
以产生减小的种子为特征的种子植物可经过操纵AGL1和AGL5的表达来产生。经过抑制种子植物中AGL1和AGL5的表达可间接实现抑制AGL8-相关基因产物表达。AGL8相关基因产物表达受抑制的非天然存在的种子植物可以是，例如，agl1 agl5双重突变体。本文所用的术语“agl1 agl5双重突变体”指具有AGL1基因座功能丧失突变和AGL5基因座功能丧失突变的种子植物。功能丧失突变包括点突变，其中包括取代，缺失和插入，还包括AGL1和AGL5基因座的总体修饰，且突变可位于编码或非编码序列中。本领域的技术人员应明白，在AGL基因座的任何这种功能丧失突变可与在AGL5基因座的任意这种突变组合以产生本发明的agl1和agl5双重突变体。已描述了在芸苔科种子植物拟南芥属中产生举例性的agl1 alg5双重突变体，参见Kempin等，Nature 389：802-803(1997)，本文作为参考文献引用。
AGL1和AGL5是具有相对新近趋异的近亲基因。尽管不受下面描述的限制，一些植物可能仅含有AGL1或仅含有AGL5，或者可含有与AGL1和AGL5相关的单一祖先基因。在这些植物中，其特征为产生减小种子的种子植物可经过仅抑制AGL1的表达，或AGL5的表达，或与AGL1和AGL5相关的单个祖先基因的表达来产生。因此，在有些植物种类中，由于抑制AGL8相关基因产物表达而产生减小种子的非天然存在的种子植物可以是AGL1表达受抑制的植物。这种由于抑制AGL8相关基因产物表达而产生减小种子的非天然存在的种子植物可以是，例如agl1单一突变体。同样，在某些植物种类中，由于抑制AGL8相关基因产物表达而产生减小种子的非天然存在的种子植物可以是AGL5表达受抑制的植物。例如，该植物可以是agl5单一突变体。
本文还提供了用于产生其特征在于产生增大的种子的转基因种子植物的试剂盒。本发明的试剂盒包括编码AGL8-相关基因产物的核酸分子和种子选择性调节元件。在本发明的试剂盒中，AGL8相关基因产物可基本上具有，例如，AGL8定向进化同源物的氨基酸序列。如果需要，产生其特征在于产生增大种子的转基因种子植物的试剂盒可包括含有有效连接到种子选择性调节元件上的编码AGL8相关基因产物的核酸分子的植物表达载体。
上文已描述了编码AGL8相关基因产物的核酸分子，如基本上具有AGL8定向进化同源物氨基酸序列的那些分子。本发明的一种试剂盒可含有一种编码AGL8相关基因产物的核酸分子和任意一种种子选择性调节元件，如上文所述的元件。
如果需要，本发明的试剂盒也可含有植物表达载体。本文所用的术语“植物表达载体”指自我复制的核酸分子，它提供将外源性核酸分子转移进种子植物宿主细胞并在其中表达该分子的工具。植物表达载体包括适合于土壤杆菌介导的转化的载体，包括双重和共整合载体，以及用于物理转化的载体。
植物表达载体可用于瞬时表达外源性核酸分子，或可整合并稳定表达外源性序列。本领域的技术人员应明白，植物表达载体可含有转移和表达外源性核酸分子所需的所有功能；另外，双重载体系统中可反式提供一种或多种用于土壤杆菌介导的转化的功能。
除了含有有效连接种子选择性调节元件上的编码AGL8相关基因产物的核酸分子外，如果需要，本发明的植物表达载体可含有其它元件。用于土壤杆菌介导的转化的双重载体也可含有例如，下面的一种或多种成份；宽宿主范围复制子，用于从大肠杆菌有效转移给土壤杆菌的ori T，细菌选择标记，如氨苄青霉素，和含有多个克隆位点的多接头。
如果需要，用于物理转化的植物表达载体可具有植物选择标记并以一种载体为基础，如pBR322，pUC，pGEM和M13，它们可作为商品获得，例如，从Pharmacia(Piscatawa，NJ)或Promega(Madison，WI)获得。在用于物理转化种子植物的表达载体中，可任选包括T-DNA边界或ori T区域，但无益处。
如本文所述，拟南芥属中AGL8的过度表达导致产生的果实大小比野生型拟南芥属产生的果实更大(参见实施例II)。尽管野生型拟南芥属产生的果实为大约3/4”长和大约1/8”宽，而组成型表达AGL8的转化拟南芥产生的果实平均大约1-1/8”长。尽管不希望受到下面描述的限制，35S：：AGL8转基因植物中的花柱组织转变为子房组织，导致使用花柱延长了果实。根据在组成型表达AGL8的种子植物中观察到的果实增大，本发明提供了一种非天然存在的种子植物，其特征在于由于异位表达编码AGL8家族基因产物的核酸分子而产生增大的果实。AGL8家族基因产物可以基本上具有AGL8定向进化同源物的氨基酸序列。例如，拟南芥属AGL8的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
在有关实施方案中，本发明提供了一种转基因种子植物，其特征在于由于异位表达编码AGL8家族基因产物的外源性核酸分子而产生增大的果实。外源异位表达的编码AGL8家族基因产物的核酸分子可有效连接到外源性调节元件上，例如，该元件可以是组成型调节元件或心皮瓣选择调节元件。
本文还提供了来自非天然存在的种子植物的组织，该植物的特征在于由于异位表达编码AGL8家族基因产物的核酸分子而产生增大的果实。例如，本发明提供了来自其特征为产生增大的果实的本发明的非天然存在的种子植物的果实。
本发明还提供了产生非天然存在的种子植物的方法，该植物的特征在于产生增大的果实。该方法包括在该种子植物中异位表达编码AGL8家族基因产物的核酸分子的步骤，其中由于异位表达该核酸分子而产生增大的果实。在一个实施方案中，该方法包括将编码AGL8家族基因产物的外源性核酸分子导入种子植物的步骤。
其特征在于产生增大的果实的本发明的非天然存在的种子植物可以是任何带果实的种子植物，例如，芸苔科的成员，豆科的成员，或谷类植物，如玉米植物，水稻植物或小粒谷类植物，如大麦，小麦，燕麦或黑麦植物。
其特征在于产生增大果实的本发明的非天然存在的种子植物的其它例子包括柑橘属树，如橙子树、葡萄柚树、柠檬树和酸橙树。其特征在于产生增大果实的本发明的非天然存在的种子植物可以是例如结出葡萄、苹果、梨、桃、李、樱桃、香蕉、黑莓、乌饭树果、木莓、草莓、凤梨、海枣、鳄梨、橄榄、椰子、西红柿、黄瓜或茄子的植物，该果实与相应的野生型植物产生的果实相比具有增大的大小。根据上述观察到的花柱转变为子房组织，本领域的技术人员应明白；本发明产生非天然存在的种子植物的方法特别适用于结出的果实具有相当大花柱的种子植物。技术人员应认识到，按需要用这些或其它结果实的种子植物可实施本发明。
本文所用的术语“增大”当指本发明的非天然存在的种子植物产生的果实时，意思是与没有异位表达编码AGL8家族基因产物的核酸分子的相应种子植物，如野生型种子植物产生的果实的体积或干重相比具有明显更大的果实体积或干重。
应认识到由具体种子植物种类或品种产生的果实大小存在天然的差异。然而，经过对产生的果实群体取样并测量果实大小的正态分布平均比没有异位表达编码AGL8家族基因产物的核酸分子的相应种子植物品种或种类产生的果实的正态分布更大可容易地鉴定用本发明方法的种子植物产生的增大果实。因此，本发明的非天然存在的种子植物的生产提供了偏离种子植物产生的果实大小的正态分布的方法，使果实体积或干重平均比不含异位表达编码AGL8家族基因产物的核酸分子的相应种子植物种类至少大大约5％、大10％、大20％、大30％、大50％、大75％、大100％、大200％、大300％、大400％或大500％。
本文使用的术语“AGL8家族基因产物”指与拟南芥属AGL8具有相同或相似功能的基因产物，当它在种子植物中被异位表达时，可改变正常发育使产生增大的果实。拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)是本文定义的AGL8家族基因产物的一个例子。如实施例II中所述，在内部启动子元件被复制的串联CaMV 35S启动子控制下的拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)的异位表达改变了正常的植物发育，使产生的果实与野生型植物产生的果实相比增大大约50％。
一般来说，AGL8家族基因产物的部分特征在于含有MADS结构域。AGL8家族基因产物一般特征在于具有一个氨基酸序列，该序列与拟南芥属AGL8的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)具有至少大约50％的氨基酸相同性。例如，AGL8家族基因产物的氨基酸序列与拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)具有大于大约75％的氨基酸的相同性，更优选与拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)具有大于大约85％的氨基酸相同性，且可以是与拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)具有大于大约90％、95％或97％氨基酸相同性的序列。
编码AGL8家族基因产物的核酸分子可在异源性种子植物中异位表达以产生非天然存在的种子植物，该植物的特征在于由于AGL8家族基因产物，如AGL8定向进化同源物充分保守且在种类界限间交叉发挥功能而产生增大的果实。因此，编码拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)的核酸分子在芸苔科内异源性种子植物中的异位表达可改变正常发育且导致产生增大的果实。同样，例如，编码拟南芥属AGL8(SEQ IDNO：2)核酸分子可在亲缘关系更远的异源性种子植物，包括双子叶和单子叶被子植物和裸子植物中异位表达，且异位表达时，可改变正常发育，使异源种子植物产生增大的果实。
本文所用的术语“AGL8家族基因产物”包括AGL8家族基因产物的活性片段，它是AGL8家族基因产物的多肽部分，当异位表达时，改变正常发育使产生增大的果实。例如，活性片段可以是拟南芥属AGL8(SEQ ID NO：2)的氨基末端片段，内部片段或羟基末端片段，当在种子植物中异位表达时，改变正常发育使产生增大的果实。AGL8家族基因产物的活性片段可包括，例如，MADS结构域，且可具有特异性结合DNA的能力。本领域的技术人员将认识到，编码AGL8家族基因产物活性片段的核酸分子可用于本发明的其特征在于产生增大的果实的种子植物的生产中和用于本发明的有关方法和试剂盒中。使用实施例II所述的方法或使用其它常规方法可鉴定AGL8家族基因产物的活性片段。简单地说，诸如拟南芥属的种子植物可用在组成型调节元件，如串联CaMV 35S启动子控制下的核酸分子转化。对种子植物的表型分析显示异位表达特定多肽部分的种子植物是否产生增大果实。
AGL8家族基因产物可基本上具有AGL8定向进化同源物的氨基酸序列，它包含具有相同氨基酸序列的多肽或多肽片段或具有相似而不同的序列且本领域的技术人员认为是功能等价的氨基酸序列的多肽或多肽片段。基本上具有AGL8定向进化同源物的氨基酸序列的AGL8相关基因产物可相对于SEQ ID No：2的AGL8氨基酸序列具有一种或多种修饰，如氨基酸添加，缺失或取代，只要该修饰的多肽基本上保留改变正常发育的能力使核酸分子在种子植物异位表达时产生增大的果实。
本发明进一步提供了产生其特征在于产生增大的果实的转基因种子植物的试剂盒，该试剂盒包括编码AGL8家族基因产物的核酸分子以及心皮瓣选择性调节元件。例如，AGL8家族基因产物基本上具有AGL8定向进化同源物的氨基酸序列。
如果需要，本发明的试剂盒可包括含有有效连接到心皮瓣选择性调节元件上的编码AGL8家族基因产物的核酸分子的植物表达载体。
本文所用的本语“心皮瓣选择性调节元件”指一种核酸序列，当有效连接到核酸分子上时，使有效连接的核酸分子在有限的植物组织，包括心皮瓣组织中选择性表达。本文所用的术语心皮瓣选择调节元件指该元件能专一性地在心皮瓣组织中提供特异性表达，或能在有限的植物组织，包括心皮瓣组织中提供选择性表达。
例如，心皮瓣选择性调节元件可来自选择性地在种子植物的心皮瓣组织中选择性表达的基因。例如，在种子植物心皮瓣组织中选择性表达的基因包括在拟南芥转座品系GT142中提供选择性GUS表达的基因(Sundaresam等，Genes Devel.9：1797-1819(1995)，本文作为参考文献引用)。其它的子房瓣选择性调节元件可使用常规方法鉴定和分离。例如，使用从心皮瓣组织制备的RNA和从非心皮瓣组织，如根或叶组织制备的RNA的不同筛选方案可用于分离在心皮瓣组织中选择性表达的cDNA。按上文对于种子选择性调节元件的分离所述，也可使用增强子捕获或基因捕获方案和文库的表达筛选来鉴定其它的心皮瓣选择性调节元件。
本发明进一步提供了非天然存在的种子植物，其特征在于产生减小的果实，其中AGL8家族基因产物的表达受到抑制。这种非天然存在的种子植物对于产生，例如：小黄瓜有价值，它在某些类型的泡菜制品中有用。在本发明的这种非天然存在的种子植物中，AGL8家族基因产物可基本上具有，例如，AGL8定向进化同源物的氨基酸序列。在一个实施方案中，AGL8家族基因产物的表达在心皮瓣组织中选择性地受到抑制。本文还提供了一种组织，如果实，它来自其特征在于产生减小的果实的非天然存在的种子植物，其中AGL8家族基因产物的表达受到抑制。
本文所用的术语“减小”指由本发明的非天然存在的种子植物产生的果实时，意思是与没有异位表达编码AGL8家族基因产物的相应种子植物，如野生型种子植物产生的果实的体积或干重相比果实的体积或干重明显减小。减小的果实可具有体积或干重平均不超过相应野生型种子植物产生的果实体积或干重的大约9/10，8/10，7/10，5/10，3/10，2/10或1/10。
下面实施例打算说明但并非限制本发明。
实施例I
产生增大种子的35S：AGL8转基因拟南芥属植物的制备
本实施例描述了用于制备改变发育使产生增加大小和重量的种子的转基因拟南芥属植物。
用引物AGL8-γ(SEQ ID NO：9；5’-CCGTCGACGATGGGAAGAGGTAGGGTT-3’)和引物OAM14(SEQ ID NO：10；5’-AATCATTACCAAGATATGAA-3’)经聚合酶链式反应扩增制备全长AGL8，并随后克隆进表达载体pBIN-JIT的SalI和BamHI位点，pBIN-JIT以pBIN19修饰而成，它含有串联CaMV 35S启动子，多克隆位点和CaMV PolyA信号。使用在植物中的土壤杆菌介导的转化方法转化拟南芥属，该方法基本上按Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris316：1194(1998)所述，本文作为参考文献引用。使用35S启动子特异性引物和AGL8 cDNA特异性引物进行PCR，这些引物在35S-AGL8转基因植物中产生850和550bp的2个片段，以此分析卡那霉素抗性品系中是否存在35S-AGL8构建体。这两个片段在未被35S：：AGL8构建体转化的植物中不存在。
分析两种代表性和具有独立的插入事件的35S：：AGL8品系的表型。在两种转基因品系中，转基因果实保鲜时间更长的事实表明似乎老化被延迟。具体地说，转基因果实在变黄大约14天后干燥，而野生型果实在变黄大约2天后干燥。
对35S：：AGL8转基因种子植物的进一步鉴定揭示种子表现出增大的体积和重量。转基因种子体积显著增加，与对照的非转化拟南芥属植物相比每维增加大约30％。而且，该种子平均比对照植物的种子大约重3倍。野生型植物的200粒干种子重7.6mg，35S：：AGL8品系#2的200粒干种子重7.7mg。
上述数据表明异位表达AGL8可在种子植物延迟老化，果实保鲜时间更长。而且，异位表达AGL8可导致产生增加大小和重量的种子。
实施例II
产生增大果实的35S：：AGL8转基因拟南芥属植物的制备
本实施例描述了用于制备产生增大果实的转基因拟南芥属植物的方法。
使用在串联CaMV 35S启动子控制下的全长AGL8制备如上所述的35S：：AGL8转基因拟南芥植物。对35S：：AGL8转基因拟南芥品系的鉴定表明：转基因果实与来自野生型植物的果实相比增大。其中野生型拟南芥属产生的果实大约3/4”长和大约1/8”宽，组成型表达AGL8的转化拟南芥属产生的果实平均长1-1/8”。果实长度的增加可能由于花柱组织转变为子房组织。
上述结果表明，AGL8的异位表达，如组成型AGL8表达可导致与野生型植物产生的果实相比产生明显更大的果实。
实施例III
酵母中AGL8与AGL5的相互作用
本实施例证实，在酵母双杂交系统中，AGL8基因产物与AGL5相互作用。
Finley和Brent(基因探针：实验方法(1994)；也参见Gyuris等，细胞75：791-803(1993))的“相互作用捕获”是Fields和Song，自然，340：245-246(1989)的酵母双杂交系统的变形。在该系统中，第一个蛋白质与DNA结合结构域融合，第二个蛋白质与转录激活结构域融合。经过激活lacZ报道基因分析拟南芥属AGL5和AGL8基因产物之间的相互作用。
基本上按Chevray和Nathans，美国科学院学报，89：5789-5793(1992)所述，分别在各含有组成型ADH1启动子的单拷贝着丝粒质粒pBI-880和pBI-771中制备“诱饵”和“捕获”构建体。诱饵构建体含有融合到全长AGL8编码序列上的GAL4 DNA结合结构域(氨基酸1到147)。捕获构建体具有在核定位序列后融合到GAL4转录激活结构域(氨基酸768-881)上的AGL5全长编码序列。在GAL4和GAL8缺陷型且含有在GAL1启动子元件控制下的整合lacZ报道基因的啤酒糖酵母YPB2菌株中测定诱饵和捕获构建体(Feilotter等，核酸研究22：1502-1502(1994))。
经过YPB2菌株在含X-GAL的培养基中形成蓝色菌落证实AGL8“诱饵”和AGL5“捕获”间的相互作用。仅包含GAL4(1-147)DNA结合结构域和GAL4转录激活结构域的对照“诱饵”-“捕获”组合仅产生白色菌落。这些结果证实在酵母中AGL8可与AGL5相互作用并表明AGL8和AGL5植物MADS盒基因产物也在种子植物中相互作用。
上面在括号中或以其它方式提供的所有杂志文章，参考文献和专利文献不论前面是否注明均在本文中作为参考文献引用。
尽管参考上面实施例描述了本发明，但应明白在不偏离本发明实质的前提下可做出各种修改。因此，本发明仅受下面权利要求书的限制。

Claims (13)

1、一种非天然存在的植物细胞，其中与拟南芥属AGL8(SEQ IDNo：2)具有至少65％的相同性的基因产物的表达受到抑制。
2、权利要求1的非天然存在的植物细胞，其中所述的基因产物具有AGL8定向进化同源物的氨基酸序列。
3、权利要求1的非天然存在的植物细胞，其中所述的基因产物的表达受到选择性抑制。
4、产生特征在于结出减小的种子的植物的方法，所述的方法包含在所述的植物中抑制AGL8相关基因产物的表达。
5、权利要求4的方法，其中所述的AGL8相关基因产物与拟南芥属AGL8(SEQ ID No：2)具有至少65％的相同性。
6、权利要求4的方法，其中所述的AGL8相关基因产物具有AGL8定向进化同源物的氨基酸序列。
7、权利要求4的方法，其中所述的AGL8相关基因产物的表达在种子组织中受到选择性抑制。
8、产生特征在于结出减小的果实的植物的方法，所述的方法包含在所述的植物中抑制AGL8相关基因产物的表达。
9、权利要求8的方法，其中所述的AGL8相关基因产物与拟南芥属AGL8(SEQ ID No：2)具有至少65％的相同性。
10、权利要求8的方法，其中所述的AGL8相关基因产物具有AGL8定向进化同源物的氨基酸序列。
11、权利要求8的方法，其中所述的AGL8相关基因产物的表达在心皮瓣组织中被选择性地抑制。
12、来自用权利要求8的方法产生的植物的组织。
13、权利要求12的组织，其是果实。
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