CN116064648B - OsGA1蛋白或与其相关的生物材料在调控植物稻瘟病抗性中的应用 - Google Patents
OsGA1蛋白或与其相关的生物材料在调控植物稻瘟病抗性中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及OsGA1蛋白或与其相关的生物材料在调控植物稻瘟病抗性中的应用。本发明研究发现所述OsGA1蛋白或与其相关的生物材料具有调控稻瘟病的抗性的作用，通过敲除OsGA1基因，降低OsGA1蛋白的表达量，可以提高水稻稻瘟病的抗性，而过表达OsGA1基因，提高OsGA1蛋白的表达量，可以降低水稻稻瘟病的抗性。通过对水稻稻瘟病抗性基因OsGA1的鉴定及应用，育种家可开发出适合各地不同水稻种植区域的抗稻瘟病水稻品种，这将为水稻粮食增产提供重要保障。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及OsGA1蛋白或与其相关的生物材料在调控植物稻瘟病抗性中的应用。
背景技术
水稻是世界上50％以上人口最宝贵的主要粮食作物，为了满足日益增长的粮食需求，到2030年，产量必须增加40％以上。这一挑战必须通过开发耐生物和非生物胁迫的高产水稻品种来克服[2]。在生物胁迫中，稻瘟病是对水稻高产最有害的威胁[3,4]。稻瘟病是危害水稻生产最严重的真菌病害之一，是水稻田间的一种常见病害，具有危害时间长、侵染部位多和症状多样等特点。稻瘟病在水稻的整个生育期均可发生，主要危害秧苗、叶片、穗、节等部位，根据被害部位的不同，可形成苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟等病害[5]。
Gadd45基因是在水稻中发现的全新的基因，在植物中没有被研究过，但是动物中的Gadd45基因却被广泛研究。动物中首次发现的Gadd45基因是在受到与生长停滞相关的各种应激后，在诱导的基础上鉴定的，因此被命名为生长抑制和DNA损伤诱导型(growtharrest and DNA-damage inducible)基因[[6]。gadd基因首次从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中克隆得到，作为在暴露于紫外线(UV)辐射后持续上调的转录因子的一个子集，在许多情况下，gadd基因作为生长阻滞和DNA损伤修复基因，与其他DNA损伤剂，包括甲基甲磺酸甲酯(MMS)、过氧化氢和N-乙酰氧基-2-乙酰氨基氟丁二烯都可行使生长停止信号作用[7]。Gadd45a是这100多个cDNA克隆集合中的第45个成员。Gadd45a对与DNA损伤、细胞凋亡、细胞周期检验点控制、细胞损伤和其他生长调节过程有关的多种药物有反应。Gadd45蛋白同样参与了多种细胞过程，通常与应激信号和其他生长调节途径相关[8]。Gadd45a被报道可以在人类细胞暴露于电离辐射(IR)后以TM依赖和蛋白激酶非依赖的方式诱导[9]。这种诱导受p53调控[10]，事实上，Gadd45a是发现的第一个受p53转录调控的应激基因[11]。Gadd45b最初克隆为IL-6诱导的M1D+髓系前体细胞终末分化和生长阻滞后表达的基因。Gadd45g最初是作为T细胞中早期IL-2响应基因克隆的。所有三个成员都对与生长控制相关的各种环境因素做出响应。这三种蛋白质在后生动物中高度保守，昆虫中只有一个Gadd45基因，与Gadd45g相似，表明Gadd45基因可能是祖先基因。这些蛋白质都很小(18kDa)，带很高的负电荷，并且定位于细胞核中[12]。
Gadd45基因作为应激相关基因在动物中具有多种功能，但Gadd45在水稻中的同源基因OsGA1并未报道其具有何种功能。
参考文献：
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[12]CretuA,Sha X,Tront J,Hoffman B,Liebermann DA(2009)Stress sensorGadd45 genes as thera-peutic targets in cancer.Cancer Ther 7:268–276.
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了OsGA1蛋白或与其相关的生物材料在调控植物稻瘟病抗性中的应用。本发明所述OsGA1蛋白或与其相关的生物材料具有调控稻瘟病的抗性的作用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了OsGA1蛋白或与其相关的生物材料在调控植物稻瘟病抗性中的应用，所述OsGA1蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质。
优选的，所述调控包括通过负调控OsGA1蛋白的表达量来提高植物稻瘟病抗性，或通过正调控OsGA1蛋白的表达量来降低植物稻瘟病抗性。
优选的，所述生物材料包括以下中的一种或多种：
1)编码所述OsGA1蛋白的OsGA1基因；
2)含有1)所述OsGA1基因的重组载体；
3)负调控1)所述OsGA1基因表达的sgRNA或重组载体。
优选的，所述OsGA1基因的CDS序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
优选的，所述sgRNA的靶序列包括SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示的靶序列。
优选的，3)中所述的重组载体包括靶序列和基础载体；所述靶序列包括SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示的靶序列。
优选的，所述基础载体包括pYLCRISPR-Cas9PUbi-H。
优选的，所述植物包括水稻。
本发明还提供了上述方案中所述的OsGA1蛋白或与其相关的生物材料在培育稻瘟病抗性提高的转基因植物中的应用。
优选的，所述转基因植物包括转基因水稻。
有益效果：
本发明提供了OsGA1蛋白或与其相关的生物材料在调控植物稻瘟病抗性中的应用，所述OsGA1蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质。本发明研究发现所述OsGA1蛋白或与其相关的生物材料具有调控稻瘟病的抗性的作用，通过敲除OsGA1基因，降低OsGA1蛋白的表达量，可以提高水稻稻瘟病的抗性，而过表达OsGA1基因，提高OsGA1蛋白的表达量，可以降低水稻稻瘟病的抗性。通过对水稻稻瘟病抗性基因OsGA1的鉴定及应用，育种家可开发出适合各地不同水稻种植区域的抗稻瘟病水稻品种，这将为水稻粮食增产提供重要保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为osga1突变体制备与Cas9 free植株的筛选，其中A表示OsGA1的基因模式图及两个靶点在OsGA1基因组序列中的位置示意图；B表示两种不同编辑形式的osga1纯合突变体中靶点附近的Sanger测序结果；C表示使用潮霉素筛选得到两种不含有CRISPR/Cas9载体的Cas9 free纯合突变体osga1-1和osga1-2；D表示利用FLAG抗体进行Westernblot检测回补系植株中OsGA1的蛋白表达水平；—60bp中的“—”为60bp基因标尺的长度；
图2为osga1突变体接种水稻稻瘟病S5(rice blast-S5)菌株的病变表型，其中A表示osga1突变体对水稻稻瘟病S5的抗性增强表型，B表示利用Adobe Photoshop CS6Extended 64bit软件进行病变面积的统计；
图3为OsGA1OE过表达植株的制备，其中A表示westernblot检测野生型(Kitaake)和三个独立的OsGA1过表达植株(OsGA1OE-1、OsGA1OE-2和OsGA1OE-3)中OsGA1的表达水平；B表示实时定量PCR(RT-qPCR)的方法鉴定OsGA1在野生型(Kitaake)和过表达植株(OsGA1OE-1、OsGA1OE-2和OsGA1OE-3)中的表达水平；
图4为OsGA1OE过表达植株接种水稻稻瘟病S5(rice blast-S5)菌株的病变表型，其中A表示OsGA1OE过表达植株对水稻稻瘟病S5的抗性减弱表型，B表示利用AdobePhotoshop CS6 Extended 64bit软件进行病变面积的统计。
具体实施方式
本发明提供了OsGA1蛋白或与其相关的生物材料在调控植物稻瘟病抗性中的应用，所述OsGA1蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具体如下：MAEETPVETPAAPVLGEPMDLMTALQLVMKKSSAHDGLVKGLREAAKAIEKHAAQLCVLAEDCDQPDYVKLVKALCAEHNVHLVTVPSAKTLGEWAGLCKIDSEGKARKVVGCSCVVVKDYGEESEGLNIVQDYVKSH。在本发明中，所述植物优选包括水稻。
在本发明中，所述调控优选包括通过负调控OsGA1蛋白的表达量来提高植物稻瘟病抗性，或通过正调控OsGA1蛋白的表达量来降低植物稻瘟病抗性。
在本发明中，所述生物材料优选包括以下中的一种或多种：
1)编码所述OsGA1蛋白的OsGA1基因；
2)含有1)所述OsGA1基因的重组载体
3)负调控1)所述OsGA1基因表达的sgRNA或重组载体。
在本发明中，所述OsGA1基因的CDS序列优选包括SEQ ID NO.2所示的序列，所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具体如下：ATGGCGGAGGAGACCCCAGTTGAGACTCCAGCTGCCCCGGTTCTTGGGGAGCCCATGGATCTGATGACTGCTCTGCAGCTTGTGATGAAGAAGTCAAGTGCTCATGATGGGCTTGTGAAGGGTCTCCGTGAGGCTGCCAAGGCCATCGAGAAGCATGCTGCTCAGCTTTGTGTGCTTGCTGAGGACTGCGACCAACCTGATTATGTCAAGTTGGTTAAGGCTCTGTGTGCTGAGCACAACGTTCACCTTGTTACCGTGCCTAGTGCTAAGACTCTTGGCGAGTGGGCAGGGCTTTGCAAGATTGACTCTGAGGGCAAGGCAAGGAAGGTTGTGGGCTGCTCCTGCGTCGTTGTCAAGGACTATGGTGAAGAGTCTGAGGGCCTTAACATAGTGCAGGACTATGTCAAATCGCACTAG。
在本发明中，所述含有1)所述OsGA1基因的重组载体优选包括可以过表达OsGA1基因的重组载体，所述可以过表达OsGA1基因的重组载体优选包括基础载体和OsGA1蛋白的编码序列，所述基础载体优选包括pCsV1300-3×FLAG载体，所述OsGA1蛋白的编码序列优选位于pCsV1300-3×FLAG载体的XbaI和BamHI位点之间。本发明提供的可以过表达OsGA1基因的重组载体可以提高OsGA1蛋白的表达量，降低水稻稻瘟病的抗性。
本发明所述pCsV1300-3×FLAG载体优选为在pCsV1300载体的BamHI位点后连入3×FLAG序列构建得到，具体方法优选包括：根据FLAG标签序列(ATGGACTACAAAGACCATGATGGAGACTATAAGGATCACGACATCGATTACAAGGACGATGACGATAAG，SEQ ID NO.11)设计同源引物：FLAG-F：5′-ctcggtaccggatccATGGACTACAAAGACCATGATGGAGACTATAAGGATCACGACATCGATTACAAGGACGATGACGATAAG-3′，SEQ ID NO.12和FLAG-R：5′-gaacgatcgggaattCTTATCGTCATCGTCCTTGTAATCGATGTCGTGATCCTTATAGTCTCCATCATGGTCTTTGTAGTCCAT-3′，SEQ ID NO.13，其中，两条引物序列中的小写序列为同源臂。将引物FLAG-F和FLAG-R(两条引物的工作浓度均为100μM)各1μL置于48μL ddH2O中，混合后放于沸水中直至沸水慢慢冷却至室温，即单链引物退火成带同源臂的双链短DNA片段。将得到的双链短DNA片段与经过BamHI酶切得到的pCsV1300载体进行同源重组后得到pCsV1300-3×FLAG载体。本发明所述pCsV1300载体在现有技术中报道，具体参见(A DNA Methylation Reader–Chaperone Regulator–Transcription Factor Complex Activ ates OsHKT1；5 Expression during SalinityStress,2020.09)。
在本发明中，所述sgRNA的靶序列优选包括SEQ ID NO.3和/或SEQ IDNO.4所示的靶序列，所述SEQ ID NO.3所示的靶序列的核苷酸序列具体如下：AGTTGAGACTCCAGCTGCCCCGG(最后三个碱基为PAM位点)；所述SEQ ID NO.4所示的靶序列的核苷酸序列具体如下：GCTCATGATGGGCTTGTGAAGG(最后三个碱基为PAM位点)。
在本发明中，所述负调控OsGA1基因表达的重组载体优选包括靶序列和基础载体；所述靶序列优选包括SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的靶序列；所述基础载体优选包括pYLCRISPR-Cas9PUbi-H。
本发明提供的负调控OsGA1基因表达的sgRNA或重组载体，可以降低OsGA1基因的表达，降低OsGA1蛋白的表达量，从而提高水稻稻瘟病抗性。通过对水稻稻瘟病抗性基因OsGA1的鉴定及应用，育种家可开发出适合各地不同水稻种植区域的抗稻瘟病水稻品种，这将为水稻粮食增产提供重要保障。
本发明还提供了上述方案中所述的OsGA1蛋白或与其相关的生物材料在培育稻瘟病抗性提高的转基因植物中的应用。
在本发明中，所述转基因植物优选包括转基因水稻。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的OsGA1蛋白或与其相关的生物材料在调控植物稻瘟病抗性中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OsGA1基因突变体
利用http://skl.scau.edu.cn/网站，通过靶基因OsGA1序列选择两个不同的靶点，靶点位置如图1中的A所示，其中靶点1(target 1)核苷酸序列为：AGTTGAGACTCCAGCTGCCCCGG(SEQ ID NO.3，最后三个碱基为PAM位点)；靶点2(target 2)核苷酸序列为：GCTCATGATGGGCTTGTGAAGG(SEQ ID NO.4，最后三个碱基为PAM位点)。
将候选靶点序列target 1和target 2分别插入中间载体pYLsgRNA-LacZ-OsU6a中，随后通过Golden Gate克隆方式，利用BsaI酶切位点将片段插入到最终载体pYLCRISPR-Cas9PUbi-H中(具体构建步骤参考文献：Ma X,Zhang Q,Zhu Q,et al.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing inmonocot and dicot plants.Molecular Plant,2015,8:1274-1284.)。
构建成功的CRISPR/Cas9载体转化至野生型水稻Kitaake愈伤组织中，通过潮霉素筛选获得阳性转基因植株，具体为：能够在含有潮霉素的培养基上生长的植株则为阳性转基因植株(转化方法及筛选过程参考文献：Toki S,HaraN,Ono K,et al.Early infectionof scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation ofrice.Plant Journal,2006,47:969-976.)。
2、对上述获得的阳性转基因植株编辑形式进行分子鉴定
以水稻叶片的基因组DNA为模板，用如下鉴定引物进行PCR扩增，对扩增产物进行Sanger测序，解析突变体编辑形式。
osga1突变体鉴定引物为：OsGA1-crispr-Check-F(SEQ ID NO.5)：GCATCTCGGTCTTTGAAACATTG；OsGA1-crispr-Check-R(SEQ ID NO.6)：CTGACTCCGCCACTGAT。
PCR扩增体系根据2×Es TaqMasterMix(Dye)使用说明书配制，具体为：2×Es TaqMasterMix(Dye)10μL，OsGA1-crispr-Check-F(工作浓度为10μM)0.8μL，OsGA1-crispr-Check-R(工作浓度为10μM)0.8μL，DNA模板1μg，ddH2O补至20μL。
PCR反应体系为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，循环35次；72℃延伸2min。
结果如图1中的B所示，共获得两个独立的osga1的CRISPR纯合突变体株系，分别命名为osga1-1和osga1-2。在osga1-1中，OsGA1基因起始密码子ATG下游35bp处插入1个碱基T，产生移码突变，导致在106～108bp处提前形成终止密码子。在osga1-2中，OsGA1基因起始密码子ATG下游115bp处缺失1个碱基G，产生移码突变，导致在115～117bp处提前形成终止密码子。
为了排除Cas9基因在后代植株中的影响，将纯合突变体植株的种子在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上进行筛选，不能在该培养基上生长的种子(无法发芽的种子)则为不含有CRISPR/Cas9载体的Cas9 free纯合突变体作为后续实验材料，如图1中的C所示。
3、构建osga1突变体背景的回补系植株Com#1-1和Com#1-2
为了进一步确认osga1突变体表型是否因OsGA1基因缺失导致。根据网站https://phytozome-next.jgi.doe.gov/查询OsGA1基因组信息，选取OsGA1基因(OsKitaake07g034300.1)起始密码子ATG上游1～2000bp区域作为启动子，驱动表达融合了FLAG标签的OsGA1基因的CDS序列，构建以pCAMBIA1302为载体骨架的OsGA1pro::2×FLAG-OsGA1重组质粒(OsGA1pro表示选取的启动子)，并转化至Cas9 free的纯合突变体osga1-1愈伤组织中，能够在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上生长的，则为转化成功的愈伤组织，再分化成以osga1突变体为背景的回补系植株，编号分别为Com#1-1和Com#1-2。随后利用FLAG抗体进行Westernblot检测回补系植株中OsGA1的蛋白表达水平，以α-H3为对照。
结果如图1中的D所示，实验结果发现在回补系植株Com#1-1和Com#1-2中，可以检测到FLAG-OsGA1的目的条带。
4、野生型(Kitaake)、突变体(osga1-1和osga1-2)和回补系(Com#1-1和Com#1-2)接种水稻稻瘟病S5菌株的发病表型
将水稻稻瘟病S5(rice blast-S5)的菌液分别接种在水稻野生型Kitaake、突变体osga1-1和osga1-2、回补系Com#1-1和Com#1-2材料中，每种材料每个叶片上用无菌镊子划伤3个伤口，在每个伤口滴加10μL菌液，所述菌液的活菌数为2×105个孢子/mL，每种材料3株，接种后7天观察稻瘟病的发病症状(所述水稻稻瘟病S5参见文献：Lu F,Wang H,Wang S,et al.Enhancement of innate immune system in monocot rice by transferring thedicotyledonous elongation factor Tu receptor EFR.Journal of Integrative PlantBiology.2015,57,641–652.)。
结果如图2中的A所示，接种水稻稻瘟病S5的野生型Kitaake的叶片出现小面积发黄的病斑，突变体osga1-1和osga1-2的叶片在接菌处几乎没有发黄病斑，回补系Com#1-1和Com#1-2材料的叶片在接菌处也出现小面积发黄的病斑。接种实验在使用两个独立的突变系的两个独立接种实验中获得了相同的结果，图片展示的是结果中随机选取的几个叶片。
5、野生型(Kitaake)、突变体(osga1-1和osga1-2)和回补系(Com#1-1和Com#1-2)接种水稻稻瘟病S5菌株的病变面积的统计
将野生型(Kitaake)、突变体(osga1-1和osga1-2)和回补系(Com#1-1和Com#1-2)接种稻瘟病S5的菌株后出现发黄病斑的水稻叶片图片用Adobe Photoshop CS6 Extended64bit软件打开，选择磁性套索工具选出发黄病斑的位置，在窗口中打开直方图面板，找到像素得出所选区域的像素，根据公式：1平方英寸＝72*72像素＝5184像素，1平方英寸＝0.00064516平方米，最终计算出所选发黄病斑区域的面积。病变面积比例统计结果为每种材料的3个叶片的数据统计，数据为实验平均值±SD，3次生物学重复，t检验，**代表P值＜0.01。统计结果如图2中的B和表1所示。
表1不同材料的病变面积比例(％)
| 组别 | 叶片1 | 叶片2 | 叶片3 |
| Kitaake | 15.61 | 14.35 | 15.33 |
| osga1-1 | 4.03 | 3.23 | 3.87 |
| osga1-2 | 3.93 | 3.15 | 3.67 |
| Com#1-1 | 15.20 | 14.91 | 15.89 |
| Com#1-2 | 14.85 | 15.13 | 15.66 |
由图2中的B和表1可知，，突变体osga1-1和osga1-2的叶片的病变面积显著小于野生型Kitaake以及回补系材料Com#1-1和Com#1-2的叶片的病变面积。
实施例2
构建OsGA1基因过表达植株OsGA1OE
提取水稻品种Kitaake的叶片RNA，反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以SEQ IDNO.7(5′-ATGGCGGAGGAGACCC-3′)和SEQ ID NO.8(5′-GTGCGATTTGACATAGTCCTGCA-3′)为引物进行扩增，PCR扩增体系根据2×Planta Master Mix使用说明书配制，具体为：2×PlantaMaster Mix 25μL，上游引物(10μM)2μL，下游引物(10μM)2μL，cDNA模板400ng，ddH2O补至50μL。PCR反应体系为：95℃预变性3min；95℃变性15s，72℃延伸60s，循环32次；72℃充分延伸5min，得到414bp的PCR产物。该PCR产物具有SEQ ID NO.2所示序列的1至414位核苷酸。
以上述回收产物为模板，用同源重组引物(SEQ ID NO.9：5′-tctatcgattctagaATGGCGGAGGAGACCC-3′和SEQ ID NO.10：5′-gtagtccatggatccGTGCGATTTGACATAGTCCTGCA-3′)进行第二次PCR扩增，第二轮PCR扩增体系根据2×Planta Master Mix使用说明书配制，具体为：2×Planta MasterMix 12.5μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，模板10ng，ddH2O补至25μL。第二轮PCR反应体系为：95℃预变性3min；95℃变性15s，72℃延伸60s(如引物Tm值≥72℃，可删除退火步骤，直接进行延伸步骤)，循环32次；72℃充分延伸5min。
将第二轮PCR产物回收后与经过XbaI和BamHI酶切得到的pCsV1300-3×FLAG载体骨架进行同源重组。其中pCsV1300-3×FLAG载体是基于pCsV1300载体骨架经改造在原有BamHI位点后连入3×FLAG序列得到的，具体方法如下：根据FLAG标签序列(SEQ ID NO.11)设计同源引物：FLAG-F：SEQ ID NO.12所示和FLAG-R：SEQ ID NO.13所示。将引物FLAG-F和FLAG-R(两条引物的工作浓度均为100μM)各1μL置于48μL ddH2O中，混合后放于沸水中直至沸水慢慢冷却至室温，即单链引物退火成带同源臂的双链短DNA片段。将得到的双链短DNA片段与经过BamHI酶切得到的pCsV1300载体进行同源重组后得到pCsV1300-3×FLAG载体。本发明所述pCsV1300载体在现有技术中报道，具体参见(A DNA Methylation Reader–Chaperone Regulator–Transcription Fact or Complex Activates OsHKT1；5Expression during Salinity Stress,2020.09)。
在获得第二轮PCR回收产物后，使用2×ClonExpress Mix重组酶将该PCR产物插入线性化pCsV1300-3×FLAG载体的XbaI和BamHI位点间，得到终载体pCsV1300-OsGA1-3×FLAG。
同源重组反应体系为：第二次PCR回收产物18ng，线性化pCsV1300-3×FLAG载体60ng(第二次PCR回收产物与线性化pCsV1300-3×FLAG载体的摩尔比为3:1)，2×ClonExpress Mix 5μL，ddH2O补至10μL。
经过测序，该重组载体为将SEQ ID NO.2所述序列自第1位至414位核苷酸插入pCsV1300-3×FLAG载体的XbaI和BamHI酶切位点间，为OsGA1过表达载体。
将构建成功的pCsV1300-OsGA1-3×FLAG过表达载体转化至野生型水稻Kitaake愈伤组织中，通过潮霉素筛选获得阳性转基因植株，具体为：能够在含有潮霉素的培养基上生长的植株则为阳性转基因植株(转化方法及筛选过程参考文献：Toki S,Hara N,Ono K,etal.Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speedtransformation of rice.Plant Journal,2006,47:969-976.)。
2、对上述获得的阳性转基因植株进行分子鉴定
剪取植株顶部往下数第三片植物新鲜幼嫩叶片，置于预冷的装有钢珠的2mL离心管中，迅速放置到液氮中冷冻，利用磨样机充分研磨至粉末状。然后将上述研磨好的样品加入200μL IPbuffer裂解液，样品充分裂解后离心，煮样。利用α-FLAG抗体进行Western blot检测野生型(Kitaake)和过表达植株(OsGA1OE)中OsGA1的蛋白表达水平，以α-H3为对照。
结果如图3中的A所示，以野生型(Kitaake)为负对照，筛选了三个过表达株系(OsGA1OE)中OsGA1的蛋白表达水平较高的三个过表达系(OsOsGA1OE-1、OsOsGA1OE-2和OsOsGA1OE-3)。并且通过实时定量PCR(RT-qPCR)的方法鉴定OsGA1在转基因植株中的表达水平，如图3中的B所示，与野生型Kitaake相比，三个转基因系的OsGA1的表达水平均显著升高。
表2不同株系OsGA1的表达水平
| 组别 | 植株1 | 植株2 | 植株3 |
| Kitaake | 0.998 | 1.015 | 1.053 |
| OsGA1OE-1 | 21.352 | 20.984 | 21.1347 |
| OsGA1OE-2 | 42.598 | 42.052 | 42.695 |
| OsGA1OE-3 | 16.628 | 16.968 | 17.992 |
3、观察OsGA1过表达株系接种水稻稻瘟病S5菌株的发病表型
将同一年份同一地点收获的野生型(Kitaake)和过表达(OsGA1OE)的干燥种子置于灭菌后的锥形瓶中，加入适量次氯酸钠溶液(有效氯≥8％)，浸泡10min后，用蒸馏水冲洗4～5次，将洗干净的种子放置于培养箱内装有湿滤纸的玻璃培养皿中(实验全程保证滤纸湿润)。培养条件为：28℃，相对湿度65％，10h光照，14h黑暗，光照强度为200μM·photons·m-2·s-1。
为了进一步探究OsGA1在稻瘟病抗性中的功能，将筛选到的三个独立的过表达株系OsGA1 overexpress(OsOsGA1OE-1、OsOsGA1OE-2和OsOsGA1OE-3)培养至三叶一心期，将水稻稻瘟病S5(rice blast-S5)的菌液接种在水稻野生型Kitaake和过表达株系的叶片上表面(接种方法和用量参照实施例1中的步骤4)，接种后7天观察稻瘟病的发病症状。
如图4中的A所示，接种水稻稻瘟病S5的野生型Kitaake的叶片出现小面积发黄的病斑，过表达株系(OsOsGA1OE-1、OsOsGA1OE-2和OsOsGA1OE-3)的叶片在接菌处出现大面积的发黄病斑。接种实验在使用三个独立的过表达系的两个独立接种实验中获得了相同的结果，图片展示的是结果中随机选取的几个叶片。
4、OsGA1过表达株系接种水稻稻瘟病S5菌株的病变面积的统计
将OsGA1过表达株系接种稻瘟病S5的菌株后出现发黄病斑的水稻叶片图片用Adobe Photoshop CS6 Extended 64bit软件打开，选择磁性套索工具选出发黄病斑的位置，在窗口中打开直方图面板，找到像素得出所选区域的像素，根据公式：1平方英寸＝72*72像素＝5184像素，1平方英寸＝0.00064516平方米，最终计算出所选发黄病斑区域的面积。病变面积比例统计结果为每种材料的3个叶片的数据统计，数据为实验平均值±SD，3次生物学重复，t检验，**代表P值＜0.01。统计结果如图4中的B和表3所示。
表3不同材料的病变面积比例(％)
| 组别 | 叶片1 | 叶片2 | 叶片3 |
| Kitaake | 14.8 | 15.6 | 15..3 |
| OsGA1OE-1 | 92.5 | 93.2 | 92.8 |
| OsGA1OE-2 | 89.3 | 90.8 | 90.5 |
| OsGA1OE-3 | 88.6 | 90.3 | 89.4 |
统计结果如图4中的B所示，OsGA1过表达株系(OsOsGA1OE-1、OsOsGA1OE-2和OsOsGA1OE-3)的叶片的病变面积显著大于野生型Kitaake材料的叶片的病变面积。
综上所述，本发明证明了所述OsGA1蛋白或与其相关的生物材料具有调控稻瘟病的抗性的作用，通过敲除OsGA1基因，降低OsGA1蛋白的表达量，可以提高水稻稻瘟病的抗性，而过表达OsGA1基因，提高OsGA1蛋白的表达量，可以降低水稻稻瘟病的抗性。通过对水稻稻瘟病抗性基因OsGA1的鉴定及应用，育种家可开发出适合各地不同水稻种植区域的抗稻瘟病水稻品种，这将为水稻粮食增产提供重要保障。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.提高OsGA1蛋白表达量的生物材料或降低OsGA1蛋白表达量的生物材料在调控水稻稻瘟病抗性中的应用，所述OsGA1蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；
所述提高OsGA1蛋白表达量的生物材料包括：过表达OsGA1基因的重组载体；
降低OsGA1蛋白表达量的生物材料包括：敲除OsGA1基因的重组载体；所述OsGA1基因为所述OsGA1蛋白的编码基因。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsGA1基因的CDS序列包括SEQ IDNO.2所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述敲除OsGA1基因的重组载体包括靶序列和CRISPR/Cas9载体；所述靶序列包括SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的靶序列。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体包括pYLCRISPR-Cas9PUbi-H。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过表达OsGA1基因的重组载体包括基础载体和OsGA1蛋白的编码序列。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基础载体包括pCsV1300-3×FLAG载体。
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