CN114196660B

CN114196660B - 油菜fc2亚铁螯合酶基因在提高油菜产量中的应用

Info

Publication number: CN114196660B
Application number: CN202111538088.9A
Authority: CN
Inventors: 王汉中; 师家勤; 梁华兵; 王新发; 刘贵华; 詹杰鹏
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2041-12-15
Also published as: CN114196660A

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公开了油菜FC2亚铁螯合酶基因在提高油菜产量中的应用。所述的油菜BnaA9.FC2基因的全长核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白为SEQ ID NO:2所示。通过将该基因在油菜Westar中表达，发现此转基因株系的叶绿素含量、光合速率和千粒重显著增加，而每角粒数无显著变化，产量也显著提高，因此本发明在油菜等作物高产育种中有很好的应用前景。

Description

油菜FC2亚铁螯合酶基因在提高油菜产量中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，更具体涉及油菜FC2亚铁螯合酶在提高油菜产量中的应用。

背景技术

在植物生活史中，种子大小是一个重要的适应性特征。种子的散布、萌发、幼苗定居以及种群的分布格局皆与种子重量(大小)有关(Zhu et al.,2012；Zhao et al.,2013)。在植物的性状中，种子大小处于中心地位，是植物生活史的一个核心特征。而驯化作为一种特殊的选择方式，在很多作物的形成过程中发挥重要的作用。种子重量(大小)是作物驯化和人工育种的目标性状之一(Harlan et al.,1973)。

在相同的种植密度下，油菜单产取决于单株产量，而油菜单株产量决定于全株角果数、每角粒数和粒重。虽然油菜产单株产量的三个构成因子之间呈现不同程度的负相关，但其相关系数往往不大(Gupta et al.,2006)，这意味着可以通过提高单个产量构成因子(如粒重)来增加最终的产量。近20年中国冬油菜区试汇总资料显示，近年来产量的增加主要归功于粒重的增加，其次是每角粒数(祝利霞等，2010)。2000-2009年双低油菜产量的提高，主要归功于单株结角数和千粒重的增加(俞琦英等，2010)。2001到2010年油菜产量增幅达11.12％，产量构成因子之一千粒重的增幅最大，达到7.10％，表明粒重的增加是这些年产量提高的主要原因(王健胜等，2012；张芳等，2012)。综上所述，多年来油菜育种的实践也表明，粒重的提升确实能增加油菜单产。然而，目前油菜区试品种千粒重一般不超过4g，而在油菜种质资源中千粒重最大可稳定在7.5g左右(Li et al.,2014)，因此粒重还有较大的提升空间。

油菜粒重是典型的数量性状，表型连续分布且容易受到环境条件的影响，由众多数量性状位点(quantitative trait loci，QTL)控制。随着分子标记技术的发展，利用连锁或关联分析的方法已定位了一百多个油菜粒重的QTL(Bailey-Wilson et al.,2005；Quijada et al.,2006；Udall et al.,2006；易斌等,2006；Radoev et al.,2008；Shi etal.,2009；Basunanda et al.,2010a,b；Fan et al.,2010；王峰等,2010；Zhang et al.,2011；Yang et al.,2012；朱恒星等,2012；Li et al.,2014；Qi et al.,2014)。这些粒重QTL在甘蓝型油菜所有19个染色体上都有分布，将其中连锁标记序列信息已知的整合到基因组物理图谱上就有134个(Zhou et al.,2014)，而且只在A7(Basunanda et al.,2010；Fan et al.,2010；Shi et al.,2009)和A9(Li et al.,2014；Qi et al.,2014；Yang etal.,2012；朱恒星等,2012)染色体上检测到了少数几个主效QTL。这极有力地证明油菜粒重是多基因控制的数量性状，遗传基础十分复杂。

虽然油菜中已定位到一百多个粒重QTL，但目前仅有三个主效基因被克隆，包括BnaA 9.ARF18(Liu et al.,2015)，BnaA9.CYP78A9(Shi et al.,2019)和BnaUPL3.C03(Miller et al.,2019)。另外，利用反向遗传学手段在油菜中还鉴定到几个影响粒重的基因，包括BnW RI1(Liu et al,2010)，BnGRF2(Liu et al.,2012)，BnDA1(Wang et al.,2017)和BnR BCS(Wu et al.,2017)。然而，在主要农作物(主要是水稻)和模式植物(拟南芥)中已克隆到一百多个影响种子重量(大小)的基因(李娜,2015)，主要是通过突变体分析得到的，其次是图位克隆。

申请人发现增强油菜FC2亚铁螯合酶基因(本发明或称为BnaA9.FC2基因)在油菜中的表达能显著增加叶绿素含量、光合速率和粒重。目前该基因的功能尚未有报道，属于新的功能基因，可以将其应用到作物育种中，提高产量。

发明内容

本发明的主要目的在于提供了油菜FC2亚铁螯合酶基因在提高油菜产量中的应用，所述的油菜FC2亚铁螯合酶为SEQ ID NO.2所示，本发明的基因可用于油菜。通过转化Westar等油菜品系的实验证实，BnaA9.FC2主要通过增加叶绿素含量来提高光合速率和粒重，最终提高油菜产量。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

油菜BnaA9.FC2基因在提高油菜叶绿素含量、光合速率、粒重和产量中的应用，包括利用本领域的常规方式，将甘蓝型油菜73290中BnaA9.FC2基因全长在Westar中表达，可筛选得到种子和角果皮叶绿素含量提高，叶片光合速率增加、种子重量和产量提高的转基因植株，因此可用于提高植物的种子产量。所述的基因为SEQ ID NO.1所示。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次公开了油菜BnaA9.FC2基因在调控光合速率、种子大小、粒重和产量等功能中的应用。利用油菜为受体的转基因结果证实，BnaA9.FC2的增强表达增加了叶绿素含量、光合速率、种子大小、粒重和产量。本发明实验结果表明BnaA9.FC2基因的表达水平和粒重与对照组受体相比均有显著的提高。因此本发明提出可利用BnaA9.FC2的上调表达来增加粒重和产量。

附图说明

图1为A为BnaA9.FC2转基因株系及对照的表型测定结果示意图。

其中，A不同的转基因单株的中BnaA9.FC2的相对表达水平；B为不同的BnaA9.FC2转基因株系的花后四周种子的叶绿素含量；C为不同的BnaA9.FC2转基因株系的叶片的光合速率；D、E、F为各阳性转基因株系及阴性对照(Col)的千粒重、每角粒数和角果长度的表型数据；图中数据为至少3个生物学重复的均值±SD，*表示在P<0.05水平差异显著，**表示在<0.01水平差异显著，***表示在P<0.001水平差异显著。

图2为不同的BnaA9.FC2转基因株系的主序产量；

图中数据为至少3个生物学重复的均值±SD，*表示在P<0.05水平差异显著，***表示在P<0.001水平差异显著。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：油菜BnaA9.FC2基因全长的克隆

以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)No.73290的基因组DNA为模板对BnaA9.FC2基因的全长进行PCR扩增，BnaA9.FC2正向引物430D-FL-F2：5’-acggaattcgggccgaatcaactcagttgac-3’，反向引物430D-FL-R2：5’-cagggatcccctgatagatgaatgccgatgacg-3’，最终获得包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，编码SEQ ID NO:2所示的蛋白。

以上方案中，为了实现和载体的连接，在正向和反向引物的5’端分别加了Bam HⅠ酶切位点(5’-GGATCC-3’)和Eco RⅠ酶切位点(5’-GAATTC-3’)和相应的保护碱基。

实施例2：重组载体的构建

将克隆得到的油菜BnaA9.FC2基因的PCR产物和质粒表达载体pCAMBIA1302均进行双酶切，其反应体系如下：

BamHⅠ：2μL，Eco RⅠ：2μL，10*cut smart buffer：5μL，DNA：25μL，灭菌水：16μL；总计50μL。

37℃反应2h。

然后，双酶切质粒与PCR产物分别利用试剂盒按照说明书进行纯化回收，回收结果利用1％琼脂糖凝胶检测其浓度。

目标基因与表达质粒载体的连接与转化，具体步骤如下：

a.配置连接反应体系(10μL)

10×T4 DNA ligase Buffer：1μL；T4 DNA ligase：1μL；DNA片段(DNA片段的摩尔数控制在载体DNA的3-10倍载体DNA)；ddH₂O至10μL。

b.16℃培养箱反应＞12h；

c.以上连接产物全部加入100μL DH5α感受态细胞中，冰中放置25min；

d.42℃热激45s后，冰水浴放置3min；

e.加入400μL LB液体培养基，37℃，150rpm/min振荡培养60min；

f.在含有卡那霉素(Kan⁺，50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜；

g.挑取单菌落于划板的LB固体培养基(Kan⁺，50mg/L)培养12h左右，同时PCR菌落检测阳性克隆。

实施例3：根瘤农杆菌GV3101的转化

质粒的提取利用质粒提取试剂盒操作，具体参照说明书进行。进一步通过一代测序确认重组到载体中的目片段序列准确。随后将以上重组质粒转化入农杆菌GV3101中，方法步骤如下：

(1)将1μg纯化的质粒加入到100μL感受态农杆菌GV3101中，轻轻振荡混匀；

(2)冰上放置5min，立即置入液氮中5min；

(3)37℃水浴5min；

(4)加350μL的LB培养基，在28℃的摇床上200rpm/min振荡培养1h；

(5)离心去大部分上清，沉淀，用移液器轻轻吸吹混匀，取100μL菌液，涂于含50mg/L卡那霉素和12.5mg/L的利福平的LB平皿上；

(6)28℃培养48h，可见有抗性菌落长出。挑单菌落接种至2mL LB培养基(含卡那霉素和利福平)中，28℃振荡培养过夜；

(7)PCR鉴定阳性菌落。

实施例4：农杆菌介导的油菜遗传转化

1)50mL离心管装适量Westar种子，加入75％酒精，上下翻转，浸泡种子1min；

2)去除酒精溶液，加入0.15％的升汞10mL处理15min；回收升汞，加入适量的无菌水冲洗3-5遍。

3)用无菌钥匙将灭菌种子播到含有滤纸的平皿上，待干燥后转到含有M0的组织培养盒上，每盒49粒。置黑暗24℃环境下培养6d。

4)将油菜下胚轴剪成1cm左右长度的片段，使用OD₆₀₀为0.2的DM重悬农杆菌(含重组载体)菌液侵染15-20min。

5)将侵染后的下胚轴置于无菌滤纸上，干燥后转移至M1培养基上，培养36-48h，随后转接到M2筛选培养基上，光下培养14d。

6)将M2上的下胚轴转移至M3上，21d更换一次培养基，直至长出幼苗；

7)将幼苗转移到M4上直至生根，随后移栽到营养土中培养。

以上所使用的培养基配方见表1。

表1油菜组织培养培养基配方

实施例5：转基因阳性植株的PCR鉴定

将T₁代鉴定为阳性的株系继续种植，获得T₂代植株，T2代每个株系(共挑选了4个株系，分别命名为FC-W1、FC-W2、FC-W3、FC-W4)挑选至少8个单株，提取叶片全基因组DNA，然后对这些植株进行PCR阳性鉴定。

鉴定引物如下：载体正向引物1302-gfp5-F：5’–gtgaaggtgatgcaacatacg-3’，反向引物1302-gfp5-R:5’–gaagttggctttgatgccgttc-3’，扩增体系及方法如下：

20μL反应体系如表2：

表2阳性植株的PCR反应体系

PCR反应程序：

扩增反应程序如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃退火延伸1min(依据片段长短调整时间，约1min扩增1kb)，34个循环；72℃延伸10min，4℃保存备用。然后对以上PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示大部分所选的单株均为阳性。

实施例6：实时荧光定量RCR检测转化基因的表达情况

实施例5中4个T₂代株系的所有单株经过阳性鉴定后，每个株系选取阳性单株的叶片进行RNA的提取并进行反转录及实时荧光定量PCR来检测该基因的表达情况。

油菜的基因Bna.actin作为内参基因，引物序列如下，Bna.actin7-F：ccctggaattgctgaccgta，Bna.actin7-R：tggaaagtgctgagggatgc为内参基因。BnaA9.FC2基因正向引物为5’–ctcaacgtttcgtcctcgtccg-3’，反向引物为5’–ctcaaaggcaacgaatgtttcccg-3’。

油菜叶片RNA提取、反转录cDNA第一链、荧光定量PCR均利用试剂盒参照说明书进行。其结果如图1中A所示，BnaA9.FC2在这些转基因株系中均有表达且表达水平比对照组高。

实施例7：转基因株系及阴性对照的种子叶绿素含量测定

1.取转基因株系及阴性对照花后四周的角果，每个生物学重复取同一行材料中标记花期的一个角果，每行标记10株，低温条件下分离出种子，液氮充分研磨后分装于2mL离心管中称量并记录每个样品的重量。

2.在含有样品的离心管中加入95％乙醇，充分剧烈震荡，静置3-5min，收集上清，重复该步骤直到离心管中的粉末变白。

3.将所有滤液用0.2μm滤膜过滤，收集滤液至25mL棕色容量瓶中并定容到25mL。

4.把滤液加入到96孔酶标板中，每孔加入0.1mL。并以95％乙醇为空白对照，使用酶标仪在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光值。

5.将上述测量结果处理后使用以下对应的公式进行计算：

C_a＝13.95A₆₆₅-6.88A₆₄₉；

C_b＝24.96A₆₄₉-7.32A₆₆₅；

C_c＝(1000A₄₇₀-2.05C_a-114.8C_b)/245；

A＝n·C·N·W^-1(mg·g^-1)。

(A－叶绿体色素的含量；C－色素的浓度；n－提取液体积；N－稀释倍数；W－样品鲜重。)检测结果显示，有2个株系花后4W种子的叶绿素含量相比于对照组显著提高(图1中B)。

实施例8：转基因株系及阴性对照的光合速率测定

在现蕾期每个株系选择5个长势一致的植株，并对从下到上的第5片叶进行光合速率的测定，光合测定仪主要参数设定参照李书宇博士论文(李书宇,2019)进行，其他参数参照说明书进行。每片叶子测三次，然后进行数据的统计和分析。结果如图1中C所示，其T₂代有2个阳性株系现蕾期叶片的光合速率显著高于对照组。

实施例9：T₂代转基因株系及阴性对照的表型鉴定

每个阳性株系选7-10个单株，每个单株的主序上取至少15-20个角果测量其长度并脱粒，使用SC-G型考种仪(万深)进行数粒并称重，最后计算出千粒重和每角粒数。

结果如图1和图2所示：FC-W1、FC-W2、FC-W3、FC-W4的转基因株系粒重显著增加(图1中D)，而每角粒数没有显著变化(图1中E)。此外，所有阳性株系的角果长度均增加，其中两个株系角果长度显著增加(图1中F)，同时以上阳性株系的主序产量均提高，其中两个株系表现出显著性提高(图2)。说明该基因的导入能使叶绿素含量提高，进而导致光合速率提高，角果皮合成的光合产物增多，导致种子重量增加，最终导致产量增加。

序列表

<110> 中国农业科学研究院油料作物研究所

<120> 油菜FC2亚铁螯合酶基因在提高油菜产量中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6553

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccgaatcaa ctcagttgac attccaaaga ccggacgctt ctctttttcc tttcaaagaa 60

acttataatc gtttgtgaaa gctcccttgg tctagtgatt taaccaatgg ttcattaatg 120

tttctaacac caaaaagtct agatttcaat ttctggaaag gtgaattatg cagaatattg 180

gagagaatgc tgctagagat cttcggcata acgcaaggag taccgtcaga aatagatctt 240

atatggcggt tcagaatgat gcaatcagac gtgaatcttc atcggctata gtatcatcta 300

tataatattt ctcgtagttt gtaataacat aaattttcaa tgttaaaaaa aacttataat 360

cgttttaatc attaatttaa ctagaccaaa ccacaaaact cttctattat ttgcaatccc 420

ctacatacaa ttggtttatt ctatttatcg ttctcgtgat tagatttatt cataccacaa 480

actaaaccat aaataaatat atgttatgat tatgaacaaa gaaaaaaata ccttggagaa 540

ttgtgttttc tttattccat agataaacaa atatatatat atatatatga tgttaaagag 600

cggtcaattt ttttttaaaa aaaaaactac acatagatat atatatgtaa aaaggagatt 660

ggggaaggtc ttcatgtgga ccctggggag agtcatctat ggtctaaacc tcctgtctca 720

tgggtcaaat gtaacattgg atcgtcatgg gactcttctt ctctgtttgg tggagcaggt 780

tggattatcc gggatgctca tggtaaagct ctgttacata gcagacgatc tttcaattgt 840

gtttcatcag cggttcaaat ggacttaatg gctttagctt gggcgacatc agctgtggtt 900

gacttgaaac agaagaatgt gatttttgag ttttcctcgg ctgaagcggc aatggttatt 960

cagaaccccc tgctgtctcc tttcaactac aaaaattgct atgaaatctt acgtagtgtg 1020

caggctatag tgagaagcaa gctccagttg gtctctgtaa cgagtaacaa tgcagcttca 1080

gcaattgcag taagcgtcac aagagatttg cgtcatcatt cgtacgtggc cagtaatgag 1140

cctcaatggt tagctcccct attatcagca gaggcagctc cacgttgatt tctttccaga 1200

aaccttgacg tgtggaaggg cttctccaga tgatgttctt tccttatttc ccaacttttg 1260

ggtttttcgt ttgaggtcta ctggttctct tgttgttgtt ttcttttcct tttcttcgtt 1320

cttcatatcc aagctttgcc ttgtgaacaa tatttgatgc tactcaatga caaaaaaaag 1380

atatatgtaa aaagaaaaaa ttgatagtat gttttttaca tttttaattc ttgttatata 1440

gctcatagta tggttgagat gtaaatatta tttttttaca gattaataaa tttaaaattt 1500

catctaaaaa aaaactttaa aaatcgttgc gatcgaagct tatagttttc ttgagccagc 1560

tctaacattc gatattgttg ataaatttag aattataatt taaaaattag gatgacacta 1620

caaatttaga attataattt aaaaattagg atgacactac aaaattaaac aatacgtctc 1680

tcgttaactt aaacagagaa aatttggtgt atatggaaag caaatacata tataacaaaa 1740

tatagatttc taagaagaaa atgaaaagta tatataaaga ttttaaatca taaataagat 1800

atttctcttt tttttttttg gtcaagagat atttatcaaa ttattccttt aaaccaatct 1860

ggtcgaaaaa aacttatcag ccttgtgtcg acgcgtgtgg tcatccgtcc tcaagccatt 1920

cattttatca gaactgtatc actccaggca aagaaaaaaa tctggaaaat aagagaacgc 1980

tctcttcctt tcccccccac agtggtggag acgaaactat ccatgagaat ccattagttt 2040

gctttctcta ctttttcaaa tcctttctcc tttcttcaag ttcaatcgca atgaactgcc 2100

cagccatgag tgcatctgct tcgtcttccc gctcctactc aacgtttcgt cctcgtccgt 2160

aagccccccc ccctccctcc cttcaactag gaatcaaata cttcttgtta gaaccgttag 2220

atgaataggc taatcttgat gttttggttt gatgcaggct gttgccacaa acgagtcacg 2280

attcacagag atctgtgctg cactactcaa gattacctag tgaggtgttt gctacttcgc 2340

cactccggct gctcgggaaa cattcgttgc ctttgagagc ggtggtgacc tcaaaaaaca 2400

tttcatcatc ctcagcggtg atcagtggtg atgagaaaat aggagtgctg ttattgaacc 2460

ttggaggccc cgagactttg gacgatgtgc aacccttctt gtttaacctc tttgcagacc 2520

cggtatcatc tttatactca actgaactct gatgtatatt gtatttgagt aatgccaata 2580

gctgattcag tttctatcgg caggatatta taagattgcc gcccttgttc cagtttcttc 2640

agaagccgtt ggcacagttc atatccgttg caagggctcc taaaagcaag gaaggttacg 2700

cgtcaattgg tggtggttct cctcttcgcc acatcactga tgcacaggtg aagtttgtct 2760

ttgttgactg cagtcaattg atgattctat ccaacgaata tggctatttt ggccttacag 2820

agtttttcga ttttccttta catttgtaac tctcttgcct tgtgtgggag atctaaattt 2880

taaagagtag aaggttatcg agattatgca tagtgtataa gtgatccctg cgcatataca 2940

atttctttta tgattccatc tttgttcttg gttctgttac gtatttagct tgctcctttt 3000

gttcatcagg ctgaagaaat aagcaaatgc ctttcggaaa aaaacgtccc agcaaaggta 3060

tatgttggca tgcgttattg gcatccattc actgaggaag ctattgaaca ggtatcttca 3120

atatgttcct aggtatcttg atcctttcaa acccaatttg ttttctttgc gtttgtattt 3180

gtcctttttt tatcaaacat tatttggact aatcaaatcc cttgctgctc ctccctatgt 3240

gtatttgtct attccttaaa caatctcgtt tgatcctgag cttgcaccat gcgattctta 3300

ctcattatta ttatttttct atctcttctt gcagataaaa acagatggaa ttacaaaact 3360

tgttgtctta ccactctatc cccaattttc gatatcgact agtggttcaa gcctaagact 3420

cttggagaga atattccggt gagactacac atcttacatg ggtttaacat gccatgacca 3480

tatcttactg attatttacc ctttttttac tcactatgta cattagagag gacgagtatc 3540

ttgtgaacat gcagcatact gttataccat cctggtatca gcgggaggga tatataaagg 3600

caatggcaaa cttaatccaa aacgagctgg gaaaatttga ttcccctagt caggtcgaaa 3660

atctttccac ttctagtcat tatctttttt ttttccaatt cgctatgcta ttttcacaat 3720

ccgttgcaaa cattttttcc tgaatttttc ttgtgtttat ctcttttctt agatctgtgc 3780

ctgttcccta tgtgttgaat ttttttctct agtagaagaa agaattttca aatcttgtgt 3840

agctctctgg ttactgccaa tttattcaac tatcctaaga cgtccttcaa accaaaaata 3900

tatgttacag gttgtaatat ttttcagtgc acatggcgtg cctcttgcat atgttgaaga 3960

agctggtgat ccgtacaagg cagagatgga agaatgcgtc gatctgataa tggaagaatt 4020

agacaagaga aatataacca acgcttacac gctcgcttat caggtctttt tcagttactg 4080

tttgttttat cagtgttaag ctatttattt gatgtctgaa taatacaaat tttttttggt 4140

aagctatctt gtaaaacttt ctcattaata ctgtcactgg tttttgttct atatgaatta 4200

ttggctgcgt tttgaaagta tagctgtttg ttcaaatttc acctgttatg ctgtcttatt 4260

attttgcata acattccaac agagcagagt tggacctgtg gaatggctga aaccatacac 4320

ggaggaagcc atcactgaac ttggtaaaaa aggtgttgaa aatcttcttg ctgtacccat 4380

aaggtaaaaa ggggtatttc ttgtgcaaat cctgtcactt tttattattc gttcctttcg 4440

gttaattgaa actttaaata taacagcttt gtgagcgagc acattgaaac tctagaagag 4500

atagatgttg agtataaaga gttggctttg aaatctggta tcaaaaattg gggccgagtg 4560

cctgcgctag gaacagagcc tctgtttata tctgacttag cagatgctgt tgtggaaagt 4620

cttccatatg ttggagctat ggcagtctca aaccttgaag ctcgacaggt aacactcttc 4680

gtctttttat gtactctagc tcaacaaaag aagctgttat ctacacttca tttggttcat 4740

gggtccccaa actccttagc gggaagtatt ttctcagcca tatatagcat tagttgagca 4800

tcggtaggct taaaatgggg ttgactgtta ttttgccatg acgacgttat attaaactac 4860

cgtattatgt ttgggatgaa acaacaaagt tttaatgttc tataaacatt ttttgtaatc 4920

aaaaacataa attgcaactc caggagaact tttgtgtgcg ctttttgtat atgtatagcc 4980

gacacattga agtgtatggt gtggtttatt gtgcagtcgt tagtaccgct ggggagtgtt 5040

gaagaactat tggcgacata tgattcacag aggagggaat tgccagctcc agtgacgatg 5100

tgggaatggg gatggacaag aagcgcagaa acatggaacg gaagagcagc aatgttggca 5160

gtgctcgcac tcttggtact agaagtaacc accggaaaag ggtttctgca tcagtggggc 5220

attctgcctt catcttagta aagaacagac aatcttctta tatattacaa agctatccaa 5280

gagtctaaga ctgtgatttc acttgcggaa taaggcctac tgtgttatta aaactctctt 5340

tttctgtctt aaaatgttga ctttaagtac ttgatatctt cttacagtct ttgcagataa 5400

tcagatttgt tgaatttgtc taataattat gacatgcatg gcatcttcat aaaaccattt 5460

tggataagca tatgtgtaat gatcctggat agcttttgga ctaagaatta tcctaagatc 5520

agttcgaagt tagttttgtt taaagtttac tttaaactaa aaaaaactag taaatcctag 5580

tggcctgttt tcttgttctg atttaaatta gggcatgtca actgtctgct ggccaggata 5640

tttgtgagtg cagtcgacat atctgattag ggctgggcat aaattccgta acttgaatcc 5700

atacccaaaa atccgatccg tacctgatcc gaaatgcaaa aaatacttca atggagtttg 5760

tagggtgtta taaaaaatat ccaaactgaa gtgttattag ccgaatccga atggataact 5820

cgaaaaaccc aaaaacttga aaaaatatcc gaagaaactg atccgacaaa ttaatataca 5880

ataaaaatat ttgaaacata aatatctatt tcaattattc aattttatat ttatttggat 5940

atgatatcta acaataagta tttaaaattt aaataaatac tttaaatatt cctttatata 6000

caaagaaata tatatttctt gtgttctgct ttaaaatttt agattttatt ttggatacat 6060

ctgaaccgat ccgatattaa cctgaatcca aatgatatat ggttacttaa gatatatcga 6120

accgattcaa aattggagta ttatatccga atccgatccg aacttgtaaa tttactagaa 6180

aacctaagaa gtgttacaaa atagaaccga tatctgaaaa ccctgatccg aatccgaaca 6240

gtacccaaat gtccaggcct atatctgatc agctgcggta agaacttgac ctagagttac 6300

cgcaagcttt tgattttatt cgatgtgttt ggagataaat aaaatatgga tcaaataaaa 6360

tgagaaagga aaataaaaat gagaaaaaat gaataaaaat tgagatagtt taggaataga 6420

tatacacttg aaattattat aaatagatat agtaatatac aaagatgtat tgcatatttt 6480

ttttacaaag atggatatag cttagatata tatatatata tatttttttc gtcatcggca 6540

ttcatctatc agg 6553

<210> 2

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asn Cys Pro Ala Met Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser Arg Ser Tyr

1 5 10 15

Ser Thr Phe Arg Pro Arg Pro Leu Leu Pro Gln Thr Ser His Asp Ser

20 25 30

Gln Arg Ser Val Leu His Tyr Ser Arg Leu Pro Ser Glu Val Phe Ala

35 40 45

Thr Ser Pro Leu Arg Leu Leu Gly Lys His Ser Leu Pro Leu Arg Ala

50 55 60

Val Val Thr Ser Lys Asn Ile Ser Ser Ser Ser Ala Val Ile Ser Gly

65 70 75 80

Asp Glu Lys Ile Gly Val Leu Leu Leu Asn Leu Gly Gly Pro Glu Thr

85 90 95

Leu Asp Asp Val Gln Pro Phe Leu Phe Asn Leu Phe Ala Asp Pro Asp

100 105 110

Ile Ile Arg Leu Pro Pro Leu Phe Gln Phe Leu Gln Lys Pro Leu Ala

115 120 125

Gln Phe Ile Ser Val Ala Arg Ala Pro Lys Ser Lys Glu Gly Tyr Ala

130 135 140

Ser Ile Gly Gly Gly Ser Pro Leu Arg His Ile Thr Asp Ala Gln Ala

145 150 155 160

Glu Glu Ile Ser Lys Cys Leu Ser Glu Lys Asn Val Pro Ala Lys Val

165 170 175

Tyr Val Gly Met Arg Tyr Trp His Pro Phe Thr Glu Glu Ala Ile Glu

180 185 190

Gln Ile Lys Thr Asp Gly Ile Thr Lys Leu Val Val Leu Pro Leu Tyr

195 200 205

Pro Gln Phe Ser Ile Ser Thr Ser Gly Ser Ser Leu Arg Leu Leu Glu

210 215 220

Arg Ile Phe Arg Glu Asp Glu Tyr Leu Val Asn Met Gln His Thr Val

225 230 235 240

Ile Pro Ser Trp Tyr Gln Arg Glu Gly Tyr Ile Lys Ala Met Ala Asn

245 250 255

Leu Ile Gln Asn Glu Leu Gly Lys Phe Asp Ser Pro Ser Gln Val Val

260 265 270

Ile Phe Phe Ser Ala His Gly Val Pro Leu Ala Tyr Val Glu Glu Ala

275 280 285

Gly Asp Pro Tyr Lys Ala Glu Met Glu Glu Cys Val Asp Leu Ile Met

290 295 300

Glu Glu Leu Asp Lys Arg Asn Ile Thr Asn Ala Tyr Thr Leu Ala Tyr

305 310 315 320

Gln Ser Arg Val Gly Pro Val Glu Trp Leu Lys Pro Tyr Thr Glu Glu

325 330 335

Ala Ile Thr Glu Leu Gly Lys Lys Gly Val Glu Asn Leu Leu Ala Val

340 345 350

Pro Ile Ser Phe Val Ser Glu His Ile Glu Thr Leu Glu Glu Ile Asp

355 360 365

Val Glu Tyr Lys Glu Leu Ala Leu Lys Ser Gly Ile Lys Asn Trp Gly

370 375 380

Arg Val Pro Ala Leu Gly Thr Glu Pro Leu Phe Ile Ser Asp Leu Ala

385 390 395 400

Asp Ala Val Val Glu Ser Leu Pro Tyr Val Gly Ala Met Ala Val Ser

405 410 415

Asn Leu Glu Ala Arg Gln Ser Leu Val Pro Leu Gly Ser Val Glu Glu

420 425 430

Leu Leu Ala Thr Tyr Asp Ser Gln Arg Arg Glu Leu Pro Ala Pro Val

435 440 445

Thr Met Trp Glu Trp Gly Trp Thr Arg Ser Ala Glu Thr Trp Asn Gly

450 455 460

Arg Ala Ala Met Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Val Leu Glu Val Thr

465 470 475 480

Thr Gly Lys Gly Phe Leu His Gln Trp Gly Ile Leu Pro Ser Ser

485 490 495

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgaaggtga tgcaacatac g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<210> 8

<211> 20

<212> DNA

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<400> 8

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<210> 9

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<212> DNA

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<400> 9

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<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctcaaaggca acgaatgttt cccg 24

Claims

1.SEQ ID NO.2所示的蛋白或编码该蛋白的基因在提高甘蓝型油菜产量中的应用。