CN114317569B - 苹果基因MdBGLU40及在苹果树抗腐烂病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了苹果基因MdBGLU40，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；苹果基因MdBGLU40开放阅读框全长为1536bp，编码一种由511个氨基酸组成的beta‑glucosidase蛋白，包含Glycosyl hydrolases结构域，其序列如SEQ ID No.2所示。苹果组织在受到腐烂病菌侵染时，MdBGLU40基因可显著上调表达。本发明通过创制MdBGLU40过表达的转基因苹果愈伤组织及其抗病性分析，首次阐明了该基因对苹果组织抗腐烂病的作用。过表达MdBGLU40转基因苹果愈伤组织对苹果树腐烂病的抗性显著增强。

Description

苹果基因MdBGLU40及在苹果树抗腐烂病中的应用

技术领域

本发明属于基因功能培育抗病材料技术领域，具体涉及苹果基因MdBGLU40，还涉及该苹果基因MdBGLU40在苹果树抗腐烂病中的应用。

背景技术

苹果树腐烂病俗称“烂皮病”，是一种危害苹果枝干的病害，主要病原菌为苹果壳囊孢（Cytospora mali）。苹果树腐烂病可造成主要枝干大面积腐烂，整树枯死，甚至毁园，因此被称为“苹果树癌症”。苹果产量和质量与腐烂病的发生程度密切相关。当下流行的苹果树腐烂病防治主要以病斑刮除后涂抹农药。然而药物的残留会对果品及环境造成危害，最终危害人类健康。因此，鉴定植物抗病基因，创制抗病材料，对获得具有腐烂病抗性苹果树品种，有效防治腐烂病的发生具有重要意义。

目前，随着大量植物基因组测序的完成，基于基因组的基因克隆方法得到越来越广泛的应用，为基因工程抗病育种提供了充足的资源。通过基于获取携带外源基因的转基因植物，可有效研究植物基因的功能。目前，基因功能常通过比较基因的过表达与正常表达情况下的表型或功能发挥情况来明确。基因过表达主要通过连接一个强启动子来驱动目的基因高表达，构建基因过表达植株，比较其与野生型植株的表型和性状变化，可明确目的基因对该性状的功能。对于植物抗病性研究，主要通过观察转基因植株和野生型植株在接种病原菌后的发病率和病斑大小的差异，明确目的基因在植物抗病性中发挥的功能。相比较于传统抗病育种，基因工程抗病育种可有效克服天然遗传隔离现象，从而更充分的利用抗病资源，使植物获得对病原菌的抗性。同时，基因工程抗病育种操作简便，培育周期较短，无需大量人力物力，可有效便捷创制新型植物抗病材料，为培育新型抗病作物品种提供资源和基础。

发明内容

本发明的目的是提供苹果基因MdBGLU40，该基因可显著提高苹果组织对腐烂病的抗性。

本发明的另一目的是提供苹果基因MdBGLU40在增强苹果树对腐烂病抗性中的应用。

本发明所采用的技术方案是，苹果基因MdBGLU40，包含Glycosyl hydrolases结构域，其核苷酸序列如SEQ ID No .1所示；苹果基因MdBGLU40开放阅读框（ORF）全长为1536bp，编码一种由511个氨基酸组成的beta-glucosidase蛋白，包含Glycosylhydrolases结构域，其序列如SEQ ID No .2所示。

本发明所采用的另一技术方案是，苹果基因MdBGLU40在增强苹果树对腐烂病抗性中的应用，通过创制稳定过表达MdBGLU40转基因苹果愈伤组织来获取苹果树对腐烂病抗性。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的MdBGLU40基因是优质苹果抗腐烂病基因资源。苹果对腐烂病的抗性还没有主效的抗病基因被发现和鉴定，目前尚缺乏优质抗性材料和资源。本发明提供的MdBGLU40基因可显著提高苹果组织对腐烂病抗性，利用该基因获取的苹果转基因材料具有较强抗腐烂病的优点。因此，MdBGLU40基因适用于创制和选育对腐烂病具有高抗性的苹果材料和品种。

2、获取抗病材料周期短。获取抗病植物材料和品种主要通过传统杂交育种方法和利用抗病基因的基因工程育种方法。传统育种方法不仅受天然遗传隔离限制，还具有选育周期长和浪费人工物力等缺点。而基因工程育种方法则有效克服上述缺陷，可高效培育持久、高抗病性植物材料。本发明利用抗病基因MdBGLU40，采用基因工程方法，创制培育具有强腐烂病抗性的苹果愈伤组织，具有周期短，选育快速等特点。

3、苹果树腐烂病为苹果的毁灭性病害，在生产上具有防治难、费人工、花费大等问题，利用抗病品种为最经济、最有效、最持久防治病害的措施，利用MdBGLU40将有望实现利用抗病品种防治苹果树腐烂病难题。

附图说明

图1为本发明实施例1中MdBGLU40的保守结构域分析结果图；

图2 为本发明实施例5中稳定过表达愈伤组织中MdBGLU40基因的表达水平；“**：P< 0.05”；

图3为本发明实施例6中MdBGLU40基因在苹果受到腐烂病菌侵染时的表达水平；“*： P < 0.05”；

图4 为本发明实施例7中苹果树腐烂病在MdBGLU40基因稳定过表达苹果愈伤组织上的发病程度；以野生型苹果愈伤组织为对照，病斑直径长度代表病斑大小，“**：P <0.05”；

图4A是腐烂病菌在野生型苹果愈伤组织上形成的菌落图；

图4B是稳定过表达MdBGLU40的转基因愈伤组织上腐烂病菌菌图；

图4C为稳定过表达MdBGLU40基因与野生型的苹果愈伤组织的病斑直径大小对比图。

具体实施方式

本发明克隆了一个苹果基因MdBGLU40，通过创制过表达转基因苹果愈伤组织，首次阐明了该基因增强苹果树对腐烂病抗性的功能。同时，本发明构建的稳定过表达MdBGLU40基因苹果愈伤组织对腐烂病具有较强抗性，因此，本发明提供了一套通过基因工程技术创制MdBGLU40基因过表达转基因愈伤组织、获取抗腐烂病菌(苹果壳囊孢，C. mali)苹果材料的技术体系。为了实现上述的发明目的，下面结合具体实施方式和附图对本发明做进一步的详细说明。

(1)MdBGLU40基因过表达载体的构建和获取

以苹果cDNA为模板，利用特异性引物，扩增获取MdBGLU40全长基因。将MdBGLU40基因全长序列连接至过表达载体pBIN-eGFP，获取MdBGLU40过表达载体pBIN-eGFP-MdBGLU40。

通过以下引物获取MdBGLU40基因全长并克隆连接至过表达载体（斜体序列为酶切位点/载体同源臂）：

MdBGLU40-F：acccccggggtcgacggatccATGAGGTCGGCAAGAGG；

MdBGLU40-R：tctagttcatctagaggatccTCATAGCCTTGTTTGAGTAGA。

(2)转化MdBGLU40基因过表达载体农杆菌的获取

将带有MdBGLU40基因的pBIN-eGFP过表达载体（pBIN-eGFP-MdBGLU40）通过热激方法转化对苹果愈伤组织具有侵染能力的农杆菌菌株。

(3)过表达MdBGLU40苹果愈伤组织的创制和获取

通过农杆菌介导法将带有MdBGLU40基因的pBIN-eGFP过表达载体导入苹果愈伤组织，获取过表达MdBGLU40基因的苹果愈伤组织。

(4)稳定过表达MdBGLU40基因苹果愈伤组织的获取

分别以抗生素抗性和MdBGLU40基因表达为检测指标，检测转基因苹果愈伤组织中MdBGLU40基因的表达水平，获取稳定过表达MdBGLU40基因的苹果愈伤组织。

(5)抗苹果树腐烂病的过表达MdBGLU40转基因苹果愈伤组织的筛选和获取

以阳性MdBGLU40基因稳定过表达的苹果愈伤组织为材料，检测其对苹果腐烂病的抗性，明确MdBGLU40基因在苹果抗腐烂病中的功能。

下述实验案例中所使用的实验方法在无特殊备注说明的情况下，均为常规实验方法。所用的仪器、试剂等，均可从商业途径获得。实验案例中的数据统计分析均通过SPSS22.0（美国芝加哥SPSS公司）完成。

实施例1 苹果MdBGLU40基因保守结构域分析

1、将苹果基因组中鉴定到的苹果MdBGLU40基因CDS序列翻译后获得MdBGLU40蛋白序列。

2、如图1所示，NCBI保守结构域分析，获得MdBGLU40蛋白序列的保守结构域。

实施例2苹果MdBGLU40基因的克隆及过表达载体的构建

1、本发明提供的苹果MdBGLU40基因通过以下步骤克隆获得。先根据苹果基因组中MdBGLU40基因序列设计了引物MdBGLU40-F （5’- acccccggggtcgacggatccATGAGGTCGGCAAGAGG-3’），以及MdBGLU40-R （5’- tctagttcatctagaggatccTCATAGCCTTGTTTGAGTAGA-3’ ，斜体部分为酶切位点）。采用Omega Plant RNA Kit试剂盒提取苹果叶片总RNA，反转录获取cDNA后扩增获取MdBGLU40，通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物，获取MdBGLU40基因CDS全长序列。测序正确后保存于-80℃冰箱。MdBGLU40基因核苷酸序列如Seq1所示，该基因的开放阅读框（ORF）全长1536bp，编码一种由511个氨基酸组成beta-glucosidase蛋白，包含Glycosyl hydrolases结构域，其序列如SEQ ID No .2所示。

2、将MdBGLU40基因通过Bam HI单酶切、连接、转化、卡那霉素培养基平板筛选、测序等步骤获取pBIN-eGFP-MdBGLU40过表达载体，热激转化大肠杆菌DH5α，测序后获取携带MdBGLU40基因的阳性质粒。将载有苹果MdBGLU40基因的阳性质粒保存于-80℃冰箱。

实施例3转化过表达载体pBIN-eGFP-MdBGLU40农杆菌的获取

将MdBGLU40基因过表达载体pBIN-eGFP-MdBGLU40通过热激方法转化可侵染苹果愈伤组织的农杆菌菌株GV3101，在含利福平和卡那霉素的LB培养基上筛选转化子，再通过PCR扩增测序，获取携带过表达载体pBIN-eGFP-MdBGLU40的农杆菌。用于下一步苹果愈伤组织的遗传转化。

实施例4转MdBGLU40基因过表达载体pBIN-eGFP-MdBGLU40苹果愈伤组织的创制和获取

1、以“王林”苹果愈伤组织为材料，通过农杆菌介导法将过表达载体pBIN-eGFP-MdBGLU40导入苹果愈伤组织。将携带有过表达载体pBIN-eGFP-MdBGLU40的农杆菌GV3101，在含利福平和卡那霉素的LB液体培养基中28℃恒温摇床（200rpm）培养约48h至OD₆₀₀为0.5～0.8，转入无菌离心管中，室温条件下5000×g离心10min，去掉上清液。菌体用30 mL 无菌水培养液重新悬浮清洗后，再在相同的条件下离心一次，最后用约40 mL 无菌水培养液重新悬浮菌体到OD ₆₀₀为0.6～0.8，即可用于苹果愈伤组织的转化。

2、选择生长健康的愈伤组织，放入重悬好的农杆菌液中，尽量使菌液浸没所有愈伤组织，保持浸泡约30min，28℃恒温摇床（180rpm）避光培养。之后用灭菌的胶头滴管将菌液尽可能多地吸出。

3、将侵染过的愈伤组织放入MS培养基上22℃黑暗共培养3d。共培养后，将带菌的愈伤组织集中放到500mL无菌瓶中，用灭菌的蒸馏水清洗愈伤组织8～10次直到液体透明，最后将清洗干净的愈伤平铺在含头孢霉素和卡那霉素的MS抗性培养基上，在28℃黑暗下培养20 d后用于抗性筛选阳性转基因愈伤组织。

4、将阳性转基因愈伤组织继代培养在含头孢霉素和卡那霉素的MS筛选培养基上，在28℃黑暗下培养，进行进一步的抗生素抗性筛选；随后将抗性MS培养基上筛选获得的再生愈伤组织，进一步转入含抗生素头孢霉素和卡那霉素的MS筛选培养基上，在28℃黑暗下继代培养一次，培养时间大约2周。最终获得过表达MdBGLU40基因的转基因苹果愈伤组织

实施例5稳定过表达MdBGLU40基因的苹果愈伤组织的鉴定和获取

1、提取转基因苹果愈伤组织总RNA用于RT-PCR，利用Quantitec逆转录试剂盒（Takara）将RNA生成第一链cDNA （按照产品说明书进行），将cDNA在-20℃下储存。RT-PCR扩增反应为25μL体系；RT-PCR反应条件包括：1）25℃孵育10分钟后；2）42℃孵育15min；3）85℃加热5s，最终获得基因组cDNA。

2、以反转录后获得的cDNA样品为模板，通过SYBR@Green方法测定稳定过表达转基因苹果愈伤组织中MdBGLU40基因的表达水平，以Actin基因作为内参基因。所用引物序列信息为MdBGLU40-qRTF：TTGGAAGACAGATACAACGG；MdBGLU40- qRTR：CAGAAAATGTATGTGGCTCG。

实验结果表明，相较于野生型苹果愈伤组织，所得稳定转基因苹果愈伤组织中MdBGLU40基因的表达水平的提高了近30倍，如图2所示，表明成功获得稳定过表达MdBGLU40基因的转基因苹果愈伤组织。

实施例6 MdBGLU40基因在苹果组织受腐烂病菌侵染时的表达分析

1、提取接种腐烂病菌2d后的苹果愈伤组织总RNA，利用Quantitec逆转录试剂盒（Takara）反转录后获取cDNA， -20℃储存。RT-PCR扩增反应为25μL体系同实施例5。

2、以反转录后获得的cDNA样品为模板，通过SYBR@Green方法测定接种腐烂病菌2d后的苹果愈伤组织中MdBGLU40基因的表达水平，以Actin基因作为内参基因。将未接种腐烂病菌的苹果愈伤组织设为对照，用引物MdBGLU40-qRTF和MdBGLU40-qRTR检测MdBGLU40在腐烂病菌侵染的苹果愈伤组织中的表达水平。

实验结果表明，腐烂病菌的侵染可显著诱导苹果愈伤组织中MdBGLU40基因的表达水平，如图3所示，相较于对照组，受腐烂病菌侵染后的苹果组织中MdBGLU40上调近20倍。

实施例7 抗腐烂病菌的MdBGLU40稳定过表达苹果愈伤组织的鉴定和获取

以稳定过表达MdBGLU40基因的苹果愈伤组织为材料，检测分析转基因苹果愈伤组织对腐烂病菌所致苹果腐烂病的抗性，获取抗苹果腐烂病的MdBGLU40过表达转基因苹果愈伤组织。

1、所选菌种为苹果壳囊孢（Cytospora mali），由西北农林科技大学植物保护学院真菌实验室提供。在马铃薯固体培养基活化腐烂病菌，以作备用。

2、用5mm打孔器将活化好的腐烂病菌制成大小均匀的菌饼，并接种于MdBGLU40过表达转基因苹果愈伤组织上，以野生型苹果愈伤组织为对照。接种3d后，观察腐烂病菌在苹果愈伤组织上引起的病斑大小。接种结果显示，MdBGLU40过表达可显著降低腐烂病菌在愈伤组织表面引起的病斑大小，有效增强苹果组织对腐烂病菌的抗性。表明通过构建MdBGLU40稳定过表达转基因苹果愈伤组织可创制获取高抗腐烂病的苹果材料和品种。

图4A显示腐烂病菌在野生型苹果愈伤组织上形成较大菌落。而图4B显示稳定过表达MdBGLU40的转基因愈伤组织上腐烂病菌菌落显著减小。如图4C所示，结果表明，与野生型苹果愈伤组织相比，稳定过表达MdBGLU40基因的苹果愈伤组织上，腐烂病菌引起的溃疡病斑显著减小。表明MdBGLU40基因的过表达显著提高了苹果愈伤组织对腐烂病的抗性，明确MdBGLU40基因增强苹果组织抗腐烂病菌侵染的作用。

<110>西北农林科技大学

<120>苹果基因MdBGLU40及在苹果树抗腐烂病中的应用

<130>beta-glucosidase 40

<160> 1

<170> PatentIn version 3 .3

<210> 1

<211>1536bp

<212> DNA

<213> 苹果

<400> 1

ATGAGGTCGGCAAGAGGAGGCGTTGCTATGGTGGTTACAGCATTTCTATTGGCTGTTGGGTTTCCAACATGTTTGTCAGCTTCGGATATCAACAGGGTTAGCTTTCCCAAAGATTTCGTTTTCGGGACTGCCTCTTCTGCTTTCCAGTACGAAGGTGCGGTTAAAGAGGATGGAAGGGGGCCTTCGATCTGGGACACATTTTCACATACTTTTGGTAAGATAGCTGATTTCAGCAATGCAGATGTTGCTTTGGATCAGTATCACCGTTATAAGGAAGATGTGCAACTTATGAAGGATATGGGACTAGATGCTTACAGATTTTCGATATCCTGGACTCGGATTTTTCCCAATGGAACCGGGCAAATTAATCAGGCGGGTGTTGATTACTACAATCGTCTCATTGATGCATTACTAGCCAAAGGAATTGAACCGTATGTGACCCTCTATCACTGGGACCTCCCTCAAGCCTTGGAAGACAGATACAACGGGTGGCTCAACCCTCAAATCATAAAGGACTTTGCAACGTACGCGGACACATGCTTTCAACATTTTGGTGACAGGGTGAAGCACTGGATCACATTCAACGAGCCACATACATTTTCTGTACATGGATATGCTTCGGGCCTCCAGGCACCGGGAAGGTGCTCTATCATGCGTCCGCTCTTATGCAGGTCCGGAAACTCTTCAACTGAGCCTTACATGGTTGCTCACAATGTCATCCTGTCTCACGGAACTGTGGCTGATATTTACAAGAGAAAGTATAAGTCAAAACAGCGGGGATCGGTTGGGGCATCATTTGATGTTATCTGGTACGAACCAGAAACAAACTCAACAGAAGACGTCATTGCAACTGACATAGCCCAAGAATTTCAGCTTGGCTGGTTTCTTGATCCATTTATTTTCGGGGATTATCCAAGCTCTATGAGAAGAAGGGTTGGGAGCCGGCTGCCAACCTTTTCCAAATCCGAGTCTACTCTAATTAAAGGGTCCTTGGATTTTGTCGGCATTAATCACTACACTACCTTCTATGGTAAAAACGATACCAGGGATTTAATCGGAGGTCTACTTAACGGCAGCCTTTCAGACTCTGGTGCCATTACCCTTCCATTCAAAAACTGGAAACCTATTGGAGATAGGGCGAATTCTATATGGTTATACATAGTCCCAGAGGGGATGAGAAAATTAATGAACTACATTAAGCAAAAGTACGGCAATCCTCCAGTGATTATCACCGAAAATGGCATGGATGACCCAAATAGCCAGTTCATTTCCCTCAAGGACGCTCTAAGGGATACAAAAAGGATTAAATACCACCATGACTATCTTGCAAATTTGCTAGCTTCAATCAAGCAAGACGGCTGCAATGTGATAGGCTATTTTGCCTGGTCTCTACTGGATAATTGGGAATGGACGGCTGGATTCACTTCTCGATTTGGTCTCTACTTTGTGGATTATAAGGACAAGCTCAAGAGATACCCGAAGGACTCCGTTCAATGGTTCACGAATTTCTTGAATTCTACTCAAACAAGGCTATGA

<210> 2

<211>511

<212> PRT

<213> 苹果

<400> 2

MRSARGGVAMVVTAFLLAVGFPTCLSASDINRVSFPKDFVFGTASSAFQYEGAVKEDGRGPSIWDTFSHTFGKIADFSNADVALDQYHRYKEDVQLMKDMGLDAYRFSISWTRIFPNGTGQINQAGVDYYNRLIDALLAKGIEPYVTLYHWDLPQALEDRYNGWLNPQIIKDFATYADTCFQHFGDRVKHWITFNEPHTFSVHGYASGLQAPGRCSIMRPLLCRSGNSSTEPYMVAHNVILSHGTVADIYKRKYKSKQRGSVGASFDVIWYEPETNSTEDVIATDIAQEFQLGWFLDPFIFGDYPSSMRRRVGSRLPTFSKSESTLIKGSLDFVGINHYTTFYGKNDTRDLIGGLLNGSLSDSGAITLPFKNWKPIGDRANSIWLYIVPEGMRKLMNYIKQKYGNPPVIITENGMDDPNSQFISLKDALRDTKRIKYHHDYLANLLASIKQDGCNVIGYFAWSLLDNWEWTAGFTSRFGLYFVDYKDKLKRYPKDSVQWFTNFLNSTQTRL

Claims (2)

1.苹果基因MdBGLU40在增强苹果树对苹果壳囊孢引起的腐烂病抗性中的应用，其特征在于，所述苹果基因MdBGLU40核苷酸序列包含Glycosyl hydrolases结构域，其核苷酸序列如SEQ ID No .1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过创制稳定过表达MdBGLU40转基因苹果愈伤组织来获取苹果树对腐烂病抗性。

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