CN110358778B

CN110358778B - SlDALR2基因在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用

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Publication number: CN110358778B
Application number: CN201910800535.XA
Authority: CN
Inventors: 师恺; 马巧梅; 付瑞双; 王娇; 胡璋健; 喻景权
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2039-08-28
Also published as: CN110358778A

Abstract

本发明公开了SlDALR2基因在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，该SlDALR2基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过在普通番茄中过表达和沉默SlDALR2基因，发现其能增强番茄细菌性叶斑病抗性的新用途，并为培育抗细菌性叶斑病的番茄品种提供了重要的基因资源。

Description

SlDALR2基因在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及SlDALR2基因在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum L.)是重要的园艺学作物，也是一种深受世界人民喜欢的蔬菜，2016年全球番茄总产量达1.77亿吨，是目前设施栽培面积最大的蔬菜之一。在设施番茄培育中，设施高湿、寡照环境非常利于病原菌入侵、繁殖以及病虫侵害，这严重影响了植株的生长以及农产品的产量和品质。其中丁香假单胞菌番茄变种(Pseudomonassyringaepv.tomato strain DC3000，Pst DC3000)所引发的番茄细菌性斑点病在我国辽宁、福建、内蒙古、新疆、广西、河北、甘肃、吉林、天津等省市区均有发生。该病主要危害番茄叶、茎、花、叶柄和果实，可造成5％-75％的产量损失(张冠群。“光呼吸在番茄防御Pseudomonas syringae中的作用与机制研究”浙江大学，2014。)，给人们生产和生活造成了很大的经济损失。目前对番茄细菌性叶斑病的防治仍以化学药剂为主，但是过多使用化学杀菌剂不仅会危及人类身体健康、破坏生态环境，还容易使病菌产生抗药性。实践证明，培育抗病品种一项经济有效的防止病害的措施。

传统育种是对表型直接进行选择，因此常常又被成为“经验育种”，一般存在周期长、效率低等缺点。近20年来，随着分子生物学和基因组学等新兴学科的飞速发展，使育种家对基因型进行直接选择成为可能，作物分子育种因此应运而生。分子育种是可以将表型和基因型选择结合起来的一种作物遗传改良理论和方法体系，可实现基因的直接选择和有效聚合，大幅度地提高了育种效率，缩短育种年限，成为现代作物育种的主要方向(黎裕等，“中国作物分子育种现状与发展前景”作物学报，2010，36(9)：1425-1430。)。而对其中的关键基因进行功能研究是开发利用这些基因的前提。

类受体蛋白激酶(Receptor-like protein kinase，RLK)是植物体内普遍存在的一类蛋白激酶，是许多信号识别传递途径中的关键组分。富亮氨酸类受体蛋白激酶(Leucine-rich repeats receptor-like protein kinase，LRR-RLK)是植物中已知的最大的一类跨膜类受体蛋白激酶。典型的LRR-RLK包含胞外LRR结构域、单次跨膜区及胞内激酶结构域(Couto D，Zipfel C.“Regulation of pattern recognitionreceptor signallingin plants”Nature Reviews Immunology，2016，6：537-552。)。此类蛋白胞外的富亮氨酸结构域识别外界及植物体自身的信号物质，如来自微生物的鞭毛蛋白、系统素等，从而介导和调控生长发育、环境感应和免疫反应等诸多过程(Ma Y Y.“Biological functions ofleucine-rich repeat class of receptor-like protein kinases in plants”Journalof Plant Physiology and Molecular Biology，2005，31(4)：331。)。

植物细胞膜上的LRR-RLK感知信号后，一般会引起质膜上离子通量快速改变，同时伴随着细胞溶质Ca²⁺水平的升高，细胞外活性氧(ROS)的大量产生。进而引发Ca²⁺依赖蛋白激酶(CDPK)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联的激活向细胞核内传递免疫信号，激发免疫相关基因的转录调控(Boller,T.&Felix,G.“Arenaissance of elicitors:perception ofmicrobe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors”Annual Review of Plant Biology，2009，60：379-406。)

目前，在模式植物拟南芥中已经报导过SlDALR2基因同源基因AT1G74360(TAIRhttps://www.arabidopsis.org/servlets/TairObjectid＝28523&type＝locus)，该基因被命名为GRACE(Germination repression and cell expansion receptor-like kinase，GRACE)，研究发现在拟南芥中过表达该基因后表现出子叶增大，莲座叶加粗、根系增长等特征(Zhen W等，“Functional and structural characterization of a receptor-likekinase involved in germination and cell expansion inArabidopsis”Frontiers inPlant Science，2017，8：1999-2012。)。而番茄的SlDALR2基因在抗病方面尚未见相关的研究报导。

发明内容

本发明提供了SlDALR2基因(即：Defense-Associated LRR-RLK2)在增强番茄细菌性叶斑病抗性的新用途，为培育抗细菌性叶斑病的番茄种质提供依据。

具体技术方案如下：

本发明提供了SlDALR2基因在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，所述SlDALR2基因的编号为Solyc03g115610，该基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白质编码区长度为3279bp，全基因序列如SEQ ID NO.10所示。

SlDALR2基因编码的蛋白为富亮氨酸类受体蛋白激酶，由1092个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该蛋白激酶包括胞外LRR结构域、单次跨膜域和胞内激酶域3部分，蛋白激酶结构见附图1。

本发明将SlDALR2基因作为目的基因导入普通番茄‘Condine Red’中得到SlDALR2基因的T₀代过表达植株，经过连续自交，获得纯合高表达的T₂代株系，命名为OE:SlDALR2-1和OE:SlDALR2-3。

本发明利用病毒诱导基因沉默技术，在普通番茄‘Condine Red’中沉默SlDALR2基因，制备得到SlDALR2基因沉默植株sldalr2。

通过将T2代过表达纯合株系OE:SlDALR2-1、OE:SlDALR2-3和其对照普通番茄植株，SlDALR2基因沉默植株sldalr2和其对照植株pTRV(pTRV空载体转染番茄植株)接种番茄细菌性叶斑病病原菌。3天后统计发病率，发现SlDALR2过表达番茄发病率显著低于相比普通番茄，而SlDALR2基因沉默番茄sldalr2发病率显著高于对照植株。

通过将过表达纯合株系OE:SlDALR2-1、OE:SlDALR2-3和其对照普通番茄植株，SlDALR2基因沉默植株sldalr2和其对照植株pTRV取叶圆片，处理100nMflg22(flg22多肽是细菌鞭毛蛋白N端的一段保守性极高的区域，能够诱导植物天然的免疫反应)。结果表明SlDALR2过表达植株比普通番茄植株能够激发更高水平的活性氧，而SlDALR2基因沉默植株sldalr2激发的活性氧水平则显著降低。

综合上述实验证明：过表达SlDALR2基因能够提高番茄对细菌性叶斑病的抗性，沉默SlDALR2基因则降低了番茄对细菌性叶斑病的抗性。SlDALR2基因编码的类受体蛋白激酶能够促进活性氧的爆发，表明SlDALR2基因在植物抗细菌性叶斑病基因工程中具有十分重要的应用价值。

本发明还提供了一种培育抗细菌性叶斑病的番茄种质的方法，包括以下步骤：

(1)构建含SlDALR2基因的过表达载体；所述SlDALR2基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；

(2)将所述过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，构建含SlDALR2基因过表达载体的农杆菌工程菌A；

(3)将所述农杆菌工程菌A介导转化番茄子叶，培育得到过表达纯合株系。

进一步地，在步骤(1)过表达载体的制备过程中，采用的上游引物如SEQID NO.3所示，下游引物如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述农杆菌为根癌农杆菌菌株GV3101。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过在普通番茄‘Condine Red’中过表达和沉默SlDALR2基因，发现其增强番茄细菌性叶斑病抗性的新用途。并为培育抗细菌性叶斑病的番茄品种提供了重要的基因资源。

(2)本发明利用转基因技术提供一种抗细菌性叶斑病的番茄种质的选育方法，并获得了抗细菌性叶斑病的SlDALR2基因过表达纯合植株。

附图说明

图1为SlDALR2基因编码的富亮氨酸类受体蛋白激酶的结构示意图。

图2为实施例2中构建的SlDALR2基因T₂代过表达纯合株系OE:SlDALR2-1和OE:SlDALR2-3的验证；

其中，WT为普通番茄植株；OE:SlDALR2-1和OE:SlDALR2-3为SLDALR2基因过表达的两个纯合株系；

如图2所示，OE:SlDALR2-1和OE:SlDALR2-3均能检测到过表达株系所携带的FLAG标签蛋白，表明实施例1所构建的pAC007-35S::SlDALR2::FLAG载体已转入普通番茄中，并在植株中表达。

图3为实施例3中番茄SlDALR2基因过表达植株与普通番茄植株接种细菌性叶斑病病原菌3天后之后统计的病级指数；

其中，发病越严重，病级指数越高；SlDALR2过表达纯合株系病级指数显著低于普通番茄植株。

图4为实施例3中番茄SlDALR2基因过表达植株与普通番茄植株接种细菌性叶斑病病原菌后叶片表型；

其中，发病越严重，病斑越密集；SlDALR2过表达纯合株系病斑显著少于普通番茄植株。

图5为实施例3中番茄SlDALR2基因过表达植株与其对照普通番茄植株，处理flg22后活性氧爆发情况；

其中，RLU为相对光单位，数值越高，活性氧含量越高；活性氧爆发水平越高，植物免疫性越强；SlDALR2过表达植株比普通番茄植株能够激发更高水平的活性氧。

图6为实施例4中番茄SlDALR2基因沉默植株sldalr2与对照番茄植株pTRV接种细菌性叶斑病病原菌3天后之后统计的病级指数；

其中，发病越严重，病级指数越高；SlDALR2沉默植株病级指数显著高于对照番茄植株。

图7为实施例4中番茄SlDALR2基因沉默植株sldalr2与对照番茄植株pTRV，处理flg22后活性氧爆发情况；

其中，RLU为相对光单位，数值越高，活性氧含量越高；活性氧爆发水平越高，植物免疫性越强；SlDALR2基因沉默植株sldalr2与对照番茄植株pTRV相比激发活性氧水平显著降低。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。下述实施例中的实验方法，若未特别指明，实施例中的培养基及实验条件均为常规培养基和实验条件，如分子克隆实验手册(Green M R，Sambrook J.Molecular Cloning:A Laboratory Manual:Three-Volume Set.Cold SpringHarbor Laboratory Pr，2012。)，或按照相应实验试剂和仪器说明书建议的条件进行。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1番茄SlDALR2基因的克隆，基因过表达工程菌和基因沉默工程菌的构建

1、番茄总RNA提取

采用Tiangen Plant total RNAextraction kit提取番茄幼嫩叶片的总RNA，将所提取的RNA用Thermo Fisher公司的反转录试剂盒按说明书进行反转录得到cDNA，存于-20℃保存备用。

2、SlDALR2基因过表达工程菌A的构建

设计番茄SlDALR2基因编码区序列的特异性扩增引物，引物序列及所携带的酶切位点如下(带有下划线的为酶切位点序列)：

SlDALR2-OE-AscI-F：5’-TTGGCGCGCCATGTCAGAAGAGGAATCTGA-3’；(SEQ ID NO.3)

SlDALR2-OE-BamHI-R：5’-CGGGATCCAAATGAAGGAGAAGTGCTACG-3’；(SEQ ID NO.4)

以上述从普通番茄品种‘Condine Red’叶片总RNA反转录得到的cDNA(Complementary DNA)为模板，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增SlDALR2基因外显子的核苷酸序列，经AscI与BamHI双酶切后，用T4连接酶连接至载体pAC007，16℃连接过夜。42℃热击转化涂板，抗性为氯霉素。

挑单克隆菌落，用pAC007载体前引物(SEQ ID NO.5)：TCGCATCCACTATCCTTCGC和基因后引物(SEQ ID NO.4)：CGGGATCCAAATGAAGGAGAAGTGCTACG进行PCR验证。

将条带大小正确的菌液送至测序公司测序，测序结果显示载体包含SlDALR2基因外显子的核苷酸序列，用全式金公司质粒提取试剂盒提取质粒，将质粒电击入GV3101农杆菌感受态，28℃培养两天后挑斑进行PCR验证，即得到含有过表达载体pAC007-35S::SlDALR2::FLAG的农杆菌工程菌A。

3、SlDALR2基因沉默工程菌B的构建

利用Sol Genomic Nectwork网站(https://solgenomics.net/)设计番茄SlDALR2基因沉默靶标片段序列(SEQ ID NO.6)，设计其特异性的扩增引物。引物序列及所携带的酶切位点如下(下划线的为酶切位点序列)：

SlDALR2-TRV-EcoRI-F:5’-CCGGAATTCGGAGAAACCCTGGAGAAT-3’；(SEQ ID NO.7)

SlDALR2-TRV-BamHI-R:5’-GCGGGATCCAGCAACCACCAAACTATC-3’；(SEQ ID NO.8)

以上述从普通番茄品种‘Condine Red’叶片总RNA反转录得到的cDNA(Complementary DNA)为模板，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增SlDALR2基因沉默靶标片段序列，经EcoRI与BamHI双酶切后，用T4连接酶连接至载体pTRV2，16℃连接过夜。42℃热击转化涂板，抗性为卡那霉素。

挑单克隆菌落，用pTRV2载体前引物(SEQ ID NO.9)：GGTCAAGGTACGTAGTAGAG和基因后引物(SEQ ID NO.8)：GCGGGATCCAGCAACCACCAAACTATC进行PCR验证。将条带大小正确的菌液送至测序公司测序，测序结果显示载体包含SlDALR2基因沉默靶标片段序列，用全式金公司的质粒提取试剂盒提取质粒，将质粒电击入GV3101农杆菌感受态，28℃培养两天后挑斑进行PCR验证，即得到含有沉默载体pTRV2-SlDALR2的农杆菌工程菌B。

实施例2番茄SlDALR2基因的遗传转化与过表达纯合植株的获得

1、农杆菌介导的番茄基因遗传转化

利用含有pAC007-35S::SlDALR2::FLAG过表达载体的农杆菌工程菌A侵染番茄子叶并经过分化培养基和生根培养基的筛选后，对得到的植株用pAC007-35S的FLAG蛋白标签进行检测。

具体的步骤如下：

(1)挑选饱满的普通番茄品种‘Condine Red’种子于清水中，28℃、200转/分钟摇6-8小时，用75％酒精消毒种子30秒，再转入10％次氯酸钠溶液灭菌10-15分钟，最后用灭菌水清洗5-7遍。将灭菌后的种子点播于播种培养基，置于暗处生长3天左右，种子萌芽后，将其转移到光下，25℃培养4天，至子叶完全展开。

(2)切番茄子叶，子叶完全展开而真叶未长出时，用解剖刀将番茄幼苗切下叶尖及下胚轴，每片子叶切成2-3段，将灭菌滤纸放入看护培养基，用镊子小心夹取切好的子叶，轻置于看护培养基上，黑暗下看护过夜，次日用含上述构建好的含pAC007-35S::SlDALR2::FLAG载体的农杆菌工程菌侵染子叶，时间为2分钟30秒，期间不断摇晃侵染后用灭菌滤纸擦干残留菌液并将子叶放回培养基，暗培养2天。

(3)子叶与农杆菌在看护培养基共同培养2天后，将子叶转入2Z分化培养基中(潮霉素抗性，诱导愈伤组织)，筛选抗性愈伤组织，约15天后转入0.2Z分化培养基(潮霉素抗性，诱导发芽)，之后每隔15天左右转入新的0.2Z分化培养基。

(4)当愈伤组织上生出小苗后，转入生根培养基进行生根培养20-30天，直至根系发育完全，待根系发育良好，且长势较好时，打开培养瓶盖往瓶内稍稍倒入少量灭菌水保湿，套上一透明的塑料袋进行炼苗，得到T₀代过表达番茄幼苗。

2、过表达材料验证

(1)取上述T₀代过表达苗叶片少许，放入加有小钢珠的2mL离心管中，用液氮冷冻，研磨仪粉碎样品30秒后，分别向离心管中加入100μL蛋白上样缓冲液和2μL的巯基乙醇，颠倒混匀放入95℃水浴锅中变性5-10分钟，期间轻轻上下颠倒几次。

(2)将(1)中的变性蛋白质样品4℃，12000转每分钟离心10分钟，离心后取上清液15μL上样，200V电压下，待蛋白条带分开后，随即依次转膜、脱脂奶粉封闭、孵育一抗(Anti-FLAG)、二抗(Anti-mouse IgG，Antibody)。最后，用化学发光仪(仪器型号BIO-RADChemiDoc Imaging System)曝光，具有正确大小蛋白条带的植株即为T₀代SlDALR2基因过表达植株。

3、过表达纯合株系的获得

将T₀代转基因过表达植株自交分别得到T₁代种子，从每个T₀代过表达植株所产生的T₁代中取6-9个阳性株继续自交产生T₂代并进行分离分析。当T₁代阳性株产生的T₂代幼苗经过检测全部为阳性株，则该T₁代植株为过表达纯合株；反之，则为杂合株。

实施例3SlDALR2基因过表达番茄对细菌性叶斑病抗性试验

对实施例2所得番茄SlDALR2过表达T2代纯合株系OE:SlDALR2-1、OE:SlDALR2-3与其对照普通番茄植株接种细菌性叶斑病病原菌。

1、番茄细菌性叶斑病病原菌的准备

将番茄细菌性叶斑病病原菌菌种涂布于含25mg/L利福平的固体KB(King’sB)培养基(蛋白胨10g，K₂HPO₄ 1.5g，甘油15mL，琼脂15g，无菌水1L)上于28℃培养箱中活化培养2天后，挑取单菌落于含有同样抗生素的液体KB培养基中28℃，以200转每分钟离心，扩大培养8-16小时，直至OD₆₀₀＝0.8-1.0，然后于2500转每分钟离心10分钟，收集菌体。将收集的菌体用10mM MgCl₂溶液重悬，并调节细菌浓度至OD₆₀₀＝0.1，按0.03％加入有机硅，准备对过表达与对照番茄植株进行喷施。

2、细菌性叶斑病病原菌接种

分别选取T₂代纯合株系OE:SlDALR2-1、OE:SlDALR2-3的植株各8株和普通番茄植株8株，进行病原菌接种实验，对过表达与普通番茄植株的叶背进行同样地喷施等量上述所准备的病原菌，至菌液浸润所有叶片背部。将植株置于25℃，95％空气相对湿度、12小时光照12小时黑暗，光强200μmol m^-2s^-1的环境下培养3天后，观察植株发病情况，统计发病率，并进行菌落计数。

3、病级指数统计

接种番茄细菌性叶斑病病原菌3天后观察发病症状，并统计叶片发病情况。发病症状按轻重程度依次为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ五个等级，分级标准为：0级，叶片正常；Ⅰ级，叶片下表皮可见少数病斑；Ⅱ级，叶片下表皮局部密集病斑；Ⅲ级，叶片下表皮多部位密集病斑，但未散布整片叶；Ⅳ级，叶片下表皮全片叶可见病斑分布。同时每个处理至少统计50片番茄叶片。病情指数的计算公式如下：

病级指数＝∑(各级叶片数×发病级别)×100/(总叶片数×最高发病级数)

统计结果如图3所示，两个过表达株系OE:SlDALR2-1、OE:SlDALR2-3的番茄植株相比于普通番茄植株发病症状明显减轻。

4、活性氧爆发

通过将过表达纯合株系OE:SlDALR2-1、OE:SlDALR2-3和普通番茄植株取叶圆片，处理100nM flg22(flg22多肽是细菌鞭毛蛋白N端的一段保守性极高的区域，能够诱导植物天然的免疫反应)，结果如图5所示，SlDALR2过表达植株比普通番茄植株能够激发更高水平的活性氧。

实施例4番茄SlDALR2基因沉默植株的构建及其对细菌性叶斑病抗性试验

1、病毒诱导的番茄基因沉默

(1)将培养好的沉默载体pTRV2-SlDALR2的农杆菌工程菌B，悬浮在侵染液(10mM氯化镁，10mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，pH＝5.7，用时加150μM乙酰丁香酮)中。

(2)将pTRV1：pTRV2-SlDALR2＝1:1混合侵染得番茄SlDALR2基因沉默植株sldalr2，pTRV1：pTRV2＝1:1混合作为pTRV空载体侵染得对照植株pTRV。

(3)当番茄幼苗两片子叶辗平时，以注射法进行侵染。侵染后的番茄置于22/19℃，16小时光照8小时黑暗，200μmolm^–2s^–1光强的人工气候室培养。

2、番茄SlDALR2基因沉默植株对细菌性叶斑病抗性试验

实验方法同实施例3。病级指数统计结果如图6所示，SlDALR2基因沉默植株sldalr2相比于对照植株，发病症状明显加重。活性氧爆发实验结果如图7所示，SlDALR2基因沉默植株sldalr2与对照植株相比，激发的活性氧水平显著降低。

综合实施例3和实施例4的上述实验，结果均说明在番茄植株中过表达SlDALR2基因后对番茄细菌性叶斑病的抗性显著增强，在番茄植株中沉默SlDALR2基因后对番茄细菌性叶斑病的抗性显著减弱。上述实验各设有三次重复，三次实验结果基本一致。

以上实施例仅用于说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求书范围当中。

序列表

<110> 浙江大学

<120> SlDALR2基因在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3279

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 1

atgtcagaag aggaatctga tattcttctt cttcctgttg cattattcca tttgttgctt 60

ctaatcacta ctgtttgtgg agaaaccctg gagaatgaca agcaagtgtt actgagttac 120

aaggattttc ttgaactgca aaatccggtt aataaaggat acagacatac aaaatggaat 180

gcttctgatt cctctccatg tagttggagt ggagtttctt gtgatgttga tcgtgttact 240

cgaattgatc tctctggtga tggtttagct gggaatatgt ttaacaactt ctcagctatg 300

acagagttga catatattga cctgtctatg aatacaattg gagggtctat tcctgcagac 360

ttaggccaat gtaaaaacct gaggttcttg aatttgtctc ataatattat tgatggtgag 420

cttaatttga ctggtttgaa caatttgcaa gttcttgatt tgaccatgaa caggattcat 480

ggtgagatca gtctaacttt ccctggaatt tgtgatagtt tggtggttgc taacatttcg 540

aataacaatt ttactggtga gattggaact acttttgatc agtgctggaa tcttaggtat 600

cttgatctga gctacaataa cttgactgga ggattgtcat ttggttttga taagcttaag 660

gagttttcgg tgtctaaaaa caagtgtaat ggctctctgc tttcgtcgtt tttcactcca 720

aactgcacct tgcaggtgtt ggatttatca gaaaatggat ttgttggagg agtgcctaaa 780

gagatatcga attgtaagac gttggaggac ttgaatttgt ctggaaatga cttttcaggg 840

ccaattcctg aggaaattgg atcagttacg agtcttcaag cactttactt gggaagcaac 900

aatttttcaa gggatattcc agagagtcta ttaagtttaa gtaacttagt gtttcttgat 960

cttagtagga acaacttcag aggagaaata caagaaattt tcaggcaatt tacacaggta 1020

aagtttcttc tgttgcatgg taattcttat actggaggta tagttacctc tggaattcca 1080

aacttagtga acctttctcg attggacttg agcgataacc aattctccgg tccattgcca 1140

gttgaacttt ctaagatgaa agggttgaag tttctgattc ttgcatacaa ccactttaat 1200

ggaagtatac catcagtata cggagacatt ccgacacttc aggcccttga tctttcatct 1260

aataagttaa ctggctcaat accaccaagt ttaggtaagc taagctcact tttgtggttg 1320

atgcttgcta acaattcact caccggtgga atcccacccg agttgggaaa ttgcagtagc 1380

ttattgtggt tgaatcttgc taacaatcaa ctttctggtt caataccacc tcagttagca 1440

agaattggct cgaatcctat gcctactttc ttgtcgaata gggctaagga taaggtgact 1500

gctggctcag gggaatgctt tgctatgaag agatggatac cagctgatta tcctccattt 1560

agctttgtat atcctctcct taccaggaag aattgtagaa gcctatggga taagttgctc 1620

aaagggtatg gtttatttcc agtgtgtgaa ccgggtagta atgttcgttc aaatcagata 1680

tcaggctatc ttcaacttag tatgaacaaa ttttctggtg ggatccctcc tgaaattggc 1740

agcatgcaga atttcagtat gcttcatttg ggtgtaaatg aattcggtgg cacgttccct 1800

tcagagattg gaaaaatgca gctagtagtc cttaatgttt cacaaaacag aatatctggt 1860

gagattccaa gccagattgg caacattaag tgcttattga atcttgatct gtccagcaac 1920

aatttctctg gtctgttccc agctagtttt agtaacttga ctgatctaag caagttcaat 1980

atctcttaca acgcgcacat ctatggtact ataccagaaa atgggcagtt agccacattt 2040

gagaagtcat catatcttgg cgtaccattg ctgcaccttc cacctttcat tgataacact 2100

acgaataatg ctataaacaa gggtggaagt ttcaaaaggc caacaaaggt tggtactgtt 2160

ttggtattca tggctttgct actggctttc ctagtttgtg gacttatgtc acttgttgtc 2220

tgcctcgttc taaaatctcc gatagataca ccaggatacc tactggagga ctcaaagggc 2280

cgacatgatc ttgcatcgag ttcaggtgca tcctccccat ggttgtctaa tgatgttaag 2340

gttatccgtt tggacagaac aagcttcaca cattctgaca tattgaaggc cacaggcaga 2400

ttctcgaatg acagaattat agggaaggga ggatttggga cagtgtatcg cggagtcttg 2460

cctgatggaa ggcaagtggc agtgaaaaag ctacaaagag agggaattga aggggaaaga 2520

gagtttagag ctgaaatgga agtactaagt ggaaatgact ttggttggca tccgaatctt 2580

gtaacacttt acggttggtg ccttaatgga tcagagaaat tgttagtcta tgaatacatg 2640

ggaggtggaa gcttagatga gatcatcaca gatagatcca aattcacatg gaagaaacga 2700

atcaacgtgg caattgatgt tgcacgtgct ttggtcttct tacaccacga gtgctaccct 2760

tgtatagtcc acagagacgt caaggctagc aacgtgctac tagacaaaga cggaagggca 2820

agagtcacag attttggcct agctagggtc atggatgctg gagatagtca tgttagcaca 2880

atggttgctg gtacagtcgg gtacgttgca ccagaatatg gacagacatg gcaagccaca 2940

acaaaaggcg atgtctacag ttatggtgtg ctagcaatgg agctagccac aggaagacgc 3000

gctgttgatg gtggcgagga atgtctagtt gaatgggcga gacgtgtgat gggagacgga 3060

aggcaaggat tcaccagagc cataatacca gtttctcttt tggtatcagg cctagcagaa 3120

ggagcagagg aattatgtga attgcttaga ataggaataa ggtgcattgc tgatattcct 3180

catgctaggc ctaacatgaa ggaagtattg gatatgttaa tcgcgatttc gcgcagccaa 3240

agatcaggat ccagtcgtag cacttctcct tcattttga 3279

<210> 2

<211> 1092

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 2

Met Ser Glu Glu Glu Ser Asp Ile Leu Leu Leu Pro Val Ala Leu Phe

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Leu Ile Thr Thr Val Cys Gly Glu Thr Leu Glu Asn

20 25 30

Asp Lys Gln Val Leu Leu Ser Tyr Lys Asp Phe Leu Glu Leu Gln Asn

35 40 45

Pro Val Asn Lys Gly Tyr Arg His Thr Lys Trp Asn Ala Ser Asp Ser

50 55 60

Ser Pro Cys Ser Trp Ser Gly Val Ser Cys Asp Val Asp Arg Val Thr

65 70 75 80

Arg Ile Asp Leu Ser Gly Asp Gly Leu Ala Gly Asn Met Phe Asn Asn

85 90 95

Phe Ser Ala Met Thr Glu Leu Thr Tyr Ile Asp Leu Ser Met Asn Thr

100 105 110

Ile Gly Gly Ser Ile Pro Ala Asp Leu Gly Gln Cys Lys Asn Leu Arg

115 120 125

Phe Leu Asn Leu Ser His Asn Ile Ile Asp Gly Glu Leu Asn Leu Thr

130 135 140

Gly Leu Asn Asn Leu Gln Val Leu Asp Leu Thr Met Asn Arg Ile His

145 150 155 160

Gly Glu Ile Ser Leu Thr Phe Pro Gly Ile Cys Asp Ser Leu Val Val

165 170 175

Ala Asn Ile Ser Asn Asn Asn Phe Thr Gly Glu Ile Gly Thr Thr Phe

180 185 190

Asp Gln Cys Trp Asn Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Asn Leu

195 200 205

Thr Gly Gly Leu Ser Phe Gly Phe Asp Lys Leu Lys Glu Phe Ser Val

210 215 220

Ser Lys Asn Lys Cys Asn Gly Ser Leu Leu Ser Ser Phe Phe Thr Pro

225 230 235 240

Asn Cys Thr Leu Gln Val Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gly Phe Val Gly

245 250 255

Gly Val Pro Lys Glu Ile Ser Asn Cys Lys Thr Leu Glu Asp Leu Asn

260 265 270

Leu Ser Gly Asn Asp Phe Ser Gly Pro Ile Pro Glu Glu Ile Gly Ser

275 280 285

Val Thr Ser Leu Gln Ala Leu Tyr Leu Gly Ser Asn Asn Phe Ser Arg

290 295 300

Asp Ile Pro Glu Ser Leu Leu Ser Leu Ser Asn Leu Val Phe Leu Asp

305 310 315 320

Leu Ser Arg Asn Asn Phe Arg Gly Glu Ile Gln Glu Ile Phe Arg Gln

325 330 335

Phe Thr Gln Val Lys Phe Leu Leu Leu His Gly Asn Ser Tyr Thr Gly

340 345 350

Gly Ile Val Thr Ser Gly Ile Pro Asn Leu Val Asn Leu Ser Arg Leu

355 360 365

Asp Leu Ser Asp Asn Gln Phe Ser Gly Pro Leu Pro Val Glu Leu Ser

370 375 380

Lys Met Lys Gly Leu Lys Phe Leu Ile Leu Ala Tyr Asn His Phe Asn

385 390 395 400

Gly Ser Ile Pro Ser Val Tyr Gly Asp Ile Pro Thr Leu Gln Ala Leu

405 410 415

Asp Leu Ser Ser Asn Lys Leu Thr Gly Ser Ile Pro Pro Ser Leu Gly

420 425 430

Lys Leu Ser Ser Leu Leu Trp Leu Met Leu Ala Asn Asn Ser Leu Thr

435 440 445

Gly Gly Ile Pro Pro Glu Leu Gly Asn Cys Ser Ser Leu Leu Trp Leu

450 455 460

Asn Leu Ala Asn Asn Gln Leu Ser Gly Ser Ile Pro Pro Gln Leu Ala

465 470 475 480

Arg Ile Gly Ser Asn Pro Met Pro Thr Phe Leu Ser Asn Arg Ala Lys

485 490 495

Asp Lys Val Thr Ala Gly Ser Gly Glu Cys Phe Ala Met Lys Arg Trp

500 505 510

Ile Pro Ala Asp Tyr Pro Pro Phe Ser Phe Val Tyr Pro Leu Leu Thr

515 520 525

Arg Lys Asn Cys Arg Ser Leu Trp Asp Lys Leu Leu Lys Gly Tyr Gly

530 535 540

Leu Phe Pro Val Cys Glu Pro Gly Ser Asn Val Arg Ser Asn Gln Ile

545 550 555 560

Ser Gly Tyr Leu Gln Leu Ser Met Asn Lys Phe Ser Gly Gly Ile Pro

565 570 575

Pro Glu Ile Gly Ser Met Gln Asn Phe Ser Met Leu His Leu Gly Val

580 585 590

Asn Glu Phe Gly Gly Thr Phe Pro Ser Glu Ile Gly Lys Met Gln Leu

595 600 605

Val Val Leu Asn Val Ser Gln Asn Arg Ile Ser Gly Glu Ile Pro Ser

610 615 620

Gln Ile Gly Asn Ile Lys Cys Leu Leu Asn Leu Asp Leu Ser Ser Asn

625 630 635 640

Asn Phe Ser Gly Leu Phe Pro Ala Ser Phe Ser Asn Leu Thr Asp Leu

645 650 655

Ser Lys Phe Asn Ile Ser Tyr Asn Ala His Ile Tyr Gly Thr Ile Pro

660 665 670

Glu Asn Gly Gln Leu Ala Thr Phe Glu Lys Ser Ser Tyr Leu Gly Val

675 680 685

Pro Leu Leu His Leu Pro Pro Phe Ile Asp Asn Thr Thr Asn Asn Ala

690 695 700

Ile Asn Lys Gly Gly Ser Phe Lys Arg Pro Thr Lys Val Gly Thr Val

705 710 715 720

Leu Val Phe Met Ala Leu Leu Leu Ala Phe Leu Val Cys Gly Leu Met

725 730 735

Ser Leu Val Val Cys Leu Val Leu Lys Ser Pro Ile Asp Thr Pro Gly

740 745 750

Tyr Leu Leu Glu Asp Ser Lys Gly Arg His Asp Leu Ala Ser Ser Ser

755 760 765

Gly Ala Ser Ser Pro Trp Leu Ser Asn Asp Val Lys Val Ile Arg Leu

770 775 780

Asp Arg Thr Ser Phe Thr His Ser Asp Ile Leu Lys Ala Thr Gly Arg

785 790 795 800

Phe Ser Asn Asp Arg Ile Ile Gly Lys Gly Gly Phe Gly Thr Val Tyr

805 810 815

Arg Gly Val Leu Pro Asp Gly Arg Gln Val Ala Val Lys Lys Leu Gln

820 825 830

Arg Glu Gly Ile Glu Gly Glu Arg Glu Phe Arg Ala Glu Met Glu Val

835 840 845

Leu Ser Gly Asn Asp Phe Gly Trp His Pro Asn Leu Val Thr Leu Tyr

850 855 860

Gly Trp Cys Leu Asn Gly Ser Glu Lys Leu Leu Val Tyr Glu Tyr Met

865 870 875 880

Gly Gly Gly Ser Leu Asp Glu Ile Ile Thr Asp Arg Ser Lys Phe Thr

885 890 895

Trp Lys Lys Arg Ile Asn Val Ala Ile Asp Val Ala Arg Ala Leu Val

900 905 910

Phe Leu His His Glu Cys Tyr Pro Cys Ile Val His Arg Asp Val Lys

915 920 925

Ala Ser Asn Val Leu Leu Asp Lys Asp Gly Arg Ala Arg Val Thr Asp

930 935 940

Phe Gly Leu Ala Arg Val Met Asp Ala Gly Asp Ser His Val Ser Thr

945 950 955 960

Met Val Ala Gly Thr Val Gly Tyr Val Ala Pro Glu Tyr Gly Gln Thr

965 970 975

Trp Gln Ala Thr Thr Lys Gly Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Val Leu Ala

980 985 990

Met Glu Leu Ala Thr Gly Arg Arg Ala Val Asp Gly Gly Glu Glu Cys

995 1000 1005

Leu Val Glu Trp Ala Arg Arg Val Met Gly Asp Gly Arg Gln Gly Phe

1010 1015 1020

Thr Arg Ala Ile Ile Pro Val Ser Leu Leu Val Ser Gly Leu Ala Glu

1025 1030 1035 1040

Gly Ala Glu Glu Leu Cys Glu Leu Leu Arg Ile Gly Ile Arg Cys Ile

1045 1050 1055

Ala Asp Ile Pro His Ala Arg Pro Asn Met Lys Glu Val Leu Asp Met

1060 1065 1070

Leu Ile Ala Ile Ser Arg Ser Gln Arg Ser Gly Ser Ser Arg Ser Thr

1075 1080 1085

Ser Pro Ser Phe

1090

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttggcgcgcc atgtcagaag aggaatctga 30

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggatccaa atgaaggaga agtgctacg 29

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcgcatccac tatccttcgc 20

<210> 6

<211> 486

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 6

ggagaaaccc tggagaatga caagcaagtg ttactgagtt acaaggattt tcttgaactg 60

caaaatccgg ttaataaagg atacagacat acaaaatgga atgcttctga ttcctctcca 120

tgtagttgga gtggagtttc ttgtgatgtt gatcgtgtta ctcgaattga tctctctggt 180

gatggtttag ctgggaatat gtttaacaac ttctcagcta tgacagagtt gacatatatt 240

gacctgtcta tgaatacaat tggagggtct attcctgcag acttaggcca atgtaaaaac 300

ctgaggttct tgaatttgtc tcataatatt attgatggtg agcttaattt gactggtttg 360

aacaatttgc aagttcttga tttgaccatg aacaggattc atggtgagat cagtctaact 420

ttccctggaa tttgtgatag tttggtggtt gctgatcata agagtttaaa tgtgaatcaa 480

cttttc 486

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccggaattcg gagaaaccct ggagaat 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgggatcca gcaaccacca aactatc 27

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggtcaaggta cgtagtagag 20

<210> 10

<211> 3873

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 10

cttcatataa cctatagtat taaattattc ttgcgtacgt gcatttttgt attaaaaagt 60

ttggtttggt ccatttttgc aggccctccc cttctgaaat tcaactccat tttcccatgt 120

ttattctttg ccacagagat attgtttctg aactaccaaa accccttttc ttaaacttat 180

tagtaaaaat accctttctt tcttgttttg cacaaatttc tataacaaca acaattcatc 240

tgtcgcacaa cagcaaaata aaataatata taacaaatag tactggaaga aatcaagatt 300

caagattgag ttatgtcaga agaggaatct gatattcttc ttcttcctgt tgcattattc 360

catttgttgc ttctaatcac tactggtaat tctgagtttt ttctcgactc ttcaagtctg 420

ttggttattt tatgtgtttt ttttttatag ataatttgta atactaaagt tttcgatttt 480

tattttatag tttgtggaga aaccctggag aatgacaagc aagtgttact gagttacaag 540

gattttcttg aactgcaaaa tccggttaat aaaggataca gacatacaaa atggaatgct 600

tctgattcct ctccatgtag ttggagtgga gtttcttgtg atgttgatcg tgttactcga 660

attgatctct ctggtgatgg tttagctggg aatatgttta acaacttctc agctatgaca 720

gagttgacat atattgacct gtctatgaat acaattggag ggtctattcc tgcagactta 780

ggccaatgta aaaacctgag gttcttgaat ttgtctcata atattattga tggtgagctt 840

aatttgactg gtttgaacaa tttgcaagtt cttgatttga ccatgaacag gattcatggt 900

gagatcagtc taactttccc tggaatttgt gatagtttgg tggttgctaa catttcgaat 960

aacaatttta ctggtgagat tggaactact tttgatcagt gctggaatct taggtatctt 1020

gatctgagct acaataactt gactggagga ttgtcatttg gttttgataa gcttaaggag 1080

ttttcggtgt ctaaaaacaa gtgtaatggc tctctgcttt cgtcgttttt cactccaaac 1140

tgcaccttgc aggtgttgga tttatcagaa aatggatttg ttggaggagt gcctaaagag 1200

atatcgaatt gtaagacgtt ggaggacttg aatttgtctg gaaatgactt ttcagggcca 1260

attcctgagg aaattggatc agttacgagt cttcaagcac tttacttggg aagcaacaat 1320

ttttcaaggg atattccaga gagtctatta agtttaagta acttagtgtt tcttgatctt 1380

agtaggaaca acttcagagg agaaatacaa gaaattttca ggcaatttac acaggtaaag 1440

tttcttctgt tgcatggtaa ttcttatact ggaggtatag ttacctctgg aattccaaac 1500

ttagtgaacc tttctcgatt ggacttgagc gataaccaat tctccggtcc attgccagtt 1560

gaactttcta agatgaaagg gttgaagttt ctgattcttg catacaacca ctttaatgga 1620

agtataccat cagtatacgg agacattccg acacttcagg cccttgatct ttcatctaat 1680

aagttaactg gctcaatacc accaagttta ggtaagctaa gctcactttt gtggttgatg 1740

cttgctaaca attcactcac cggtggaatc ccacccgagt tgggaaattg cagtagctta 1800

ttgtggttga atcttgctaa caatcaactt tctggttcaa taccacctca gttagcaaga 1860

attggctcga atcctatgcc tactttcttg tcgaataggg ctaaggataa ggtgactgct 1920

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tttgtatatc ctctccttac caggaagaat tgtagaagcc tatgggataa gttgctcaaa 2040

gggtatggtt tatttccagt gtgtgaaccg ggtagtaatg ttcgttcaaa tcagatatca 2100

ggctatcttc aacttagtat gaacaaattt tctggtggga tccctcctga aattggcagc 2160

atgcagaatt tcagtatgct tcatttgggt gtaaatgaat tcggtggcac gttcccttca 2220

gagattggaa aaatgcagct agtagtcctt aatgtttcac aaaacagaat atctggtgag 2280

attccaagcc agattggcaa cattaagtgc ttattgaatc ttgatctgtc cagcaacaat 2340

ttctctggtc tgttcccagc tagttttagt aacttgactg atctaagcaa gttcaatatc 2400

tcttacaacg cgcacatcta tggtactata ccagaaaatg ggcagttagc cacatttgag 2460

aagtcatcat atcttggcgt accattgctg caccttccac ctttcattga taacactacg 2520

aataatgcta taaacaaggg tggaagtttc aaaaggccaa caaaggttgg tactgttttg 2580

gtattcatgg ctttgctact ggctttccta gtttgtggac ttatgtcact tgttgtctgc 2640

ctcgttctaa aatctccgat agatacacca ggatacctac tggaggactc aaagggccga 2700

catgatcttg catcgagttc aggtgcatcc tccccatggt tgtctaatga tgttaaggtt 2760

atccgtttgg acagaacaag cttcacacat tctgacatat tgaaggccac aggcagattc 2820

tcgaatgaca gaattatagg gaagggagga tttgggacag tgtatcgcgg agtcttgcct 2880

gatggaaggc aagtggcagt gaaaaagcta caaagagagg gaattgaagg ggaaagagag 2940

tttagagctg aaatggaagt actaagtgga aatgactttg gttggcatcc gaatcttgta 3000

acactttacg gttggtgcct taatggatca gagaaattgt tagtctatga atacatggga 3060

ggtggaagct tagatgagat catcacagat agatccaaat tcacatggaa gaaacgaatc 3120

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gttgctggta cagtcgggta cgttgcacca gaatatggac agacatggca agccacaaca 3360

aaaggcgatg tctacagtta tggtgtgcta gcaatggagc tagccacagg aagacgcgct 3420

gttgatggtg gcgaggaatg tctagttgaa tgggcgagac gtgtgatggg agacggaagg 3480

caaggattca ccagagccat aataccagtt tctcttttgg tatcaggcct agcagaagga 3540

gcagaggaat tatgtgaatt gcttagaata ggaataaggt gcattgctga tattcctcat 3600

gctaggccta acatgaagga agtattggat atgttaatcg cgatttcgcg cagccaaaga 3660

tcaggatcca gtcgtagcac ttctccttca ttttgatcaa tttttgttac aaatttacac 3720

agcaaagtgt caatagtttt tttgttcttt tttacacatt tgtaacatac acacatatta 3780

cattcttctt gtaaacagtt cttttttaga ttctttgttt tggcactctt gttttgttag 3840

gatcataaga gtttaaatgt gaatcaactt ttc 3873

Claims

1.SlDALR2基因在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，其特征在于，所述SlDALR2基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.SlDALR2基因编码的类受体蛋白激酶在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，其特征在于，所述类受体蛋白激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述类受体蛋白激酶通过促进活性氧的爆发，增强番茄对细菌性叶斑病的抗性。