CN112961843B

CN112961843B - 植物免疫调节相关蛋白及其应用

Info

Publication number: CN112961843B
Application number: CN202110425945.8A
Authority: CN
Inventors: 周雪平; 吴建祥; 傅帅; 王坤; 马婷婷
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-04-20
Filing date: 2021-04-20
Publication date: 2023-01-03
Anticipated expiration: 2041-04-20
Also published as: CN112961843A

Abstract

本发明公开了植物免疫调节相关蛋白MEL及其应用，涉及植物基因工程领域。本发明发现了一种调控植物免疫相关蛋白MEL，该蛋白编码一个保守的SWIM结构域，一个保守的RING结构域以及一个保守的底物识别序列YφNL。植物中调控MEL表达量能够显著提高植物对病原体的广谱抗病性，提供了一种作物抗病基因工程的方法。

Description

植物免疫调节相关蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及具有调节植物免疫提高植物抗病性的一类植物免疫调节相关蛋白、核酸及其应用。

背景技术

植物在自然生态系统中面临各种各样的病原体的侵染威胁，导致农业生产的产量和品质下降。植物病害主要包括真菌病害，细菌病害，病毒病害等，以重要单子叶粮食作物水稻病害为例：最具代表性的真菌病害如稻瘟病，由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起；细菌病害如白叶枯病，由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)侵染引起；病毒病害如水稻条纹病毒病，由水稻条纹病毒(Rice stripe virus)侵染引起；而侵染双子叶作物或蔬菜的常见真菌病害有灰霉菌(B.cinerea)侵染引起的腐烂病等；这些病害对作物或蔬菜产量和品质的影响最为严重，每年造成的减产就相当于总产量的10-30％，而农药的使用减轻了病害的影响，但存在农药残留以及对自然环境有负面影响等不利因素。因此，挖掘抗性资源、培育广谱抗病品种，是一种绿色、高效保障作物产量和品质的策略，对农业生产具有重要意义。

植物在感知到病原体入侵时，通过激活多层次的免疫反应，抵抗病原体的粘附、进入细胞组织、细胞内复制或细胞间移动。植物的多层次免疫系统包括病原体相关分子模式(PAMP)触发的免疫(PTI)、病原物效应子触发的免疫(ETI)、泛素/26S蛋白酶体(UPS)和自噬介导的病原体蛋白或免疫相关成分的表达调控，以及RNA沉默等。植物的这些多层次免疫反应存在一些核心组件或产物，比如激素信号水平调节、胼胝体积累、转录重编程、活性氧迸发以及迅速激活MAPK级联反应等，这些组件或产物参与调控植物应对不同类型病原物的侵染。而通过植物基因工程改造和利用这些植物免疫系统的中枢组件或核心免疫调节因子，是提高植物免疫力抵抗多种病原物侵染的一种有力方法，可用于提高植物免疫水平，改造植物以提高植物广谱抗病性。

发明内容

本发明的目的在于提供一类植物免疫相关蛋白及其编码基因，本发明提供了该免疫调节相关蛋白编码的三个关键结构域，本发明还提供了该植物免疫调节蛋白在调节植物免疫方面的应用。

为实现上述发明目的，本发明具体采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了植物免疫调节相关蛋白，所述蛋白为植物的MEL蛋白。

作为上述第一方面的优选，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物包括但不限于水稻、玉米、小麦、高梁、短柄草、大麦、燕麦、黑麦、小米；所述双子叶植物包括但不限于烟草、拟南芥、棉花、大豆、花生、油菜、棉花、蒺藜苜蓿、香蕉、香瓜、苹果、黄瓜、甜菜。

上述植物免疫调节相关蛋白可从各植物中分离获得。

作为上述第一方面的优选，所述蛋白为一个E3泛素连接酶，蛋白定位于细胞内的微管和细胞核，蛋白编码三个关键结构域，包括一个保守的SWIM结构域，一个保守的RING结构域以及一个保守的底物识别序列

SWIM结构域序列特征为CxCx_nCxH，RING结构域序列特征为Cx₂Cx_nCx₂Cx₄Hx₂Cx_nCx₂C，

序列特征为YxNL。

作为上述第一方面的优选，所述蛋白具有如SEQ ID NO.1～7任一所示的氨基酸序列，或者具有如SEQ ID NO.1～7任一所示的氨基酸序列经缺失、替换或添加一个或多个氨基酸得到的具有调控植物免疫相关功能的蛋白的氨基酸序列。

上述SEQ ID NO.1～7所示的氨基酸序列分别对应了7种不同的植物，其中：水稻MEL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本氏烟MEL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，拟南芥MEL的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，小麦MEL的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，玉米MEL的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,马铃薯MEL氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，番茄MEL的氨基酸序列如SEQ ID NO.7示。

需注意的是，本领域技术人员可通过对所述植物免疫调节相关蛋白的关键结构域以外的氨基酸序列进行替换、缺失或插入一个或多个氨基酸，获得具有相同功能的植物免疫调节相关蛋白。

第二方面，本发明提供了编码第一方面中任一方案所述的植物免疫相关蛋白的核酸。

进一步的，若所述植物为水稻，所述蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，编码该蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.8所示；若所述植物为本氏烟，所述蛋白具有如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，编码该蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.9所示；若所述植物为拟南芥，所述蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，编码该蛋白的核酸序列如SEQ IDNO.10所示。

本发明的上述核酸可以从对应的植物中分离获得，包括但不限于水稻、本氏烟等。但以水稻为例，所述核酸具有如下任一核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)在严格条件下能够与(1)所述序列杂交的核酸序列；

(3)与(1)所述序列互补的核苷酸序列；

(4)在(1)所述序列的基础之上，经过一个或多个碱基的替换、插入或缺失得到的具有调节植物免疫功能的核酸的序列。

第三方面，本发明提供了含有上述第二方面所述核酸的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或转基因细胞系。

第四方面，本发明提供了提高植物广谱抗病性的方法，包括以下1)、2)两种方法中任意一种：

1)在植物中提高如上述第一方面中任一方案所述植物免疫调节相关蛋白的表达量；

2)在植物中提高如上述第二方面所述核酸的表达量。

第五方面，本发明提供了上述第一方面中任一方案所述的植物免疫调节相关蛋白或上述第二方面所述的核酸或上述第三方面所述的生物材料在调控植物免疫力中的应用。

第六方面，本发明提供了上述第一方面中任一方案所述的植物免疫调节相关蛋白或上述第二方面所述的核酸或上述第三方面所述的生物材料在抗病植物遗传育种中的应用。

第七方面，本发明提供一种抗病转基因植物的构建方法，其做法是提高植物中序列如SEQ ID NO.1～7任一所示的植物抗病相关蛋白的表达量。

第八方面，本发明提供一种上述第一方面中任一方案所述植物免疫调节相关蛋白的制备方法，其做法是：将所述植物免疫调节相关蛋白的编码基因导入宿主细胞中，表达所述植物免疫调节相关蛋白。

作为上述第八方面的优选，具体地，所述制备方法包括以下步骤：

(1)扩增所述植物免疫调节蛋白的编码基因；

(2)构建携带所述植物免疫调节蛋白的编码基因的表达载体；

(3)将所述表达载体转化到宿主细胞；

(4)培养宿主细胞，获得所述植物免疫调节蛋白。

本发明的有益效果在于：本发明发现了一种植物免疫调节蛋白MEL，在单子叶或双子叶植物中提高MEL蛋白的表达量能够显著提高植物对多种病原体(包括但不限于水稻条纹病毒、稻瘟菌、水稻黄单胞、灰霉菌等)的抵抗力，而将植物中的MEL基因敲除，则会导致植物抗病力的显著下降。本发明为植物抗病育种基因工程提供一种有效的抗病生物材料，能够提高作物的广谱抗病性。

附图说明

图1本发明实施例1中植物界MEL基因家族保守结构域分析结果图。其中：植物MEL基因包含有SWIM结构域，序列特征为CxCx_nCxH；植物MEL基因包含有C4HC3类型的RING结构域，序列特征为Cx₂Cx_nCx₂Cx₄Hx₂Cx_nCx₂C；植物MEL基因包含有

基序，序列特征为YxNL。

图2本发明实施例2中水稻MEL(OsMEL)亚细胞定位分析结果图。其中：激光共聚焦观察显示MEL主要定位于细胞微管和细胞核，OsMEL与微管标记蛋白MAP65呈现共定位，且微管破坏药剂Oryzalin处理后，OsMEL的微管定位消失，说明MEL定位于细胞的微管。

图3发明实施例3中MEL是E3泛素连接酶。其中：a图为OsMEL与E2(UbcH5b)在酵母中存在互作，当突变OsMEL蛋白位于RING结构域中第196位的组氨酸(H)为酪氨酸(Y)时，OsMEL与UbcH5b的互作消失；b图为OsMEL在体外自泛素化修饰分析，结果说明OsMEL能够发生自泛素化修饰，而突变OsMEL蛋白位于RING结构域中第196位的组氨酸(H)为酪氨酸(Y)时，OsMEL自泛素化修饰消失，说明OsMEL是一个基于RING结构域的E3泛素连接酶。

图4本发明实施例4中OsMEL转基因株系的获取及其生长表型分析结果图。其中：a图为使用CRISPR/Cas9方法对中花11品种水稻OsMEL基因敲除，获得纯合敲除突变体；b图为在中花11品种水稻中过表达OsMEL基因株系的OsMEL转录本分析，显示过表达株系中OsMEL转录本水平显著提高；c图为OsMEL敲除和过表达株系水稻的生长表型，说明过表达OsMEL会使水稻出现轻微矮化的生长表型。

图5本发明实施例5中OsMEL转基因株系免疫相关应答水平分析结果图。其中：a图为OsMEL转基因株系水稻叶片活性氧染色，显示过表达OsMEL会增加水稻自发活性氧积累；b图为OsMEL转基因株系水稻叶片活性氧积累定量检测，显示过表达OsMEL的水稻叶片水稻自发活性氧积累水平显著提高；c图为OsMEL转基因水稻株系抗病相关基因表达水平分析，结果显示过表达OsMEL的水稻株系抗病相关基因表达水平显著提高，而敲除OsMEL水稻株系抗病相关基因表达水平显著下降；d图为PTI诱发因子flg22处理OsMEL转基因水稻株系叶片后瞬时爆发的活性氧分析，显示过表达OsMEL会显著提高水稻应答flg22刺激诱发的活性氧爆发，而敲除OsMEL会降低水稻应答flg22刺激诱发的活性氧爆发水平；e图为PTI诱发因子chitin处理OsMEL转基因水稻株系叶片后瞬时爆发的活性氧分析，显示过表达OsMEL会显著提高水稻应答chitin刺激诱发的活性氧爆发，而敲除OsMEL会降低水稻应答chitin刺激诱发的活性氧爆发水平。

图6本发明实施例6中OsMEL转基因株广谱抗病性分析结果图。其中：a图为OsMEL转基因株系的水稻条纹病毒(RSV)接种结果，结果显示相对于野生型中花11水稻，过表达OsMEL水稻RSV侵染症状减轻，敲除OsMEL水稻的RSV侵染症状加重；b图为OsMEL转基因水稻和对照的RSV发病症状统计；c图为OsMEL转基因水稻和对照的RSV外壳蛋白CP积累量分析，结果显示相对于野生型中花11水稻，过表达OsMEL水稻RSV病毒积累量减少，敲除OsMEL水稻的RSV病毒积累量增多；d图为OsMEL转基因株系水稻进行稻瘟菌接种结果，显示相对于野生型中花11水稻，过表达OsMEL的转基因水稻稻瘟菌侵染斑点减小，而敲除OsMEL的转基因水稻稻瘟菌侵染斑点长度增大；e图为OsMEL转基因水稻和对照的稻瘟菌侵染斑点长度统计；f图为OsMEL转基因株系水稻进行水稻白叶枯接种结果，显示相对于野生型中花11水稻，过表达OsMEL的转基因水稻白叶枯侵染斑长度减小，而敲除OsMEL的转基因水稻稻瘟菌侵染斑长度增大；g图为OsMEL转基因水稻和对照的白叶枯侵染斑长度统计。

图7本发明实施例7中NbMEL转基因本氏烟广谱抗病性分析结果图。其中：a图为NbMEL转基因本氏烟株系的灰霉菌(B.cinerea)接种结果，结果显示在双子叶本氏烟植物中过表达NbMEL显著抑制灰霉菌的侵染坏死斑点，伴随有活性氧积累量更高，而敲除本氏烟NbMEL的叶片灰霉菌的侵染坏死斑点面积更大。b图为灰霉菌侵染NbMEL转基因本氏烟株系叶片中活性氧积累量测定比较；c图为灰霉菌侵染NbMEL转基因本氏烟株系侵染斑点统计分析。结果显示提高本氏烟中NbMEL表达量可提高对灰霉菌的抗性，而敲除NbMEL增加本氏烟对灰霉菌的敏感性。d图为NbMEL转基因本氏烟株系的水稻条纹病毒接种结果，结果显示在双子叶本氏烟植物中过表达NbMEL显著抑制水稻条纹病毒的症状扩散，伴随活性氧积累量更高，而敲除本氏烟NbMEL的叶片水稻条纹病毒侵染症状更重，活性氧积累减少；e图为水稻条纹病毒侵染NbMEL转基因本氏烟株系系统叶片中活性氧积累量测定比较；f图为水稻条纹病毒侵染NbMEL转基因本氏烟株系系统叶片中病毒外壳蛋白积累量分析。结果显示提高本氏烟中NbMEL表达量可提高对水稻条纹病毒的抗性，而敲除NbMEL增加本氏烟对水稻条纹病毒的敏感性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1植物界MEL基因的保守性分析

本发明筛选了可能参与植物免疫调节的基因，选取17种单子叶植物，7种双子叶植物以及4种低等植物的MEL同源基因，通过序列比对，对MEL基因在植物界的保守性分析。结果显示，上述各植物MEL基因含有两个已知的保守结构域，即N端含有一个SWIM结构域，C端含有一个C4HC3类型的RING结构域，对其序列特征分析发现植物MEL基因包含的SWIM结构域序列特征为CxCx_nCxH；植物MEL基因包含的C4HC3类型RING结构域序列特征为Cx₂Cx_nCx₂Cx₄Hx₂Cx_nCx₂C；序列分析发现上述各植物MEL基因C末端还包含有一个新的基序，我们将其命名为

基序，序列特征为YxNL。(图1)。

通过功能验证，发现各植物的MEL蛋白能够显著提高植物的广谱抗病性，该免疫调节相关蛋白编码的是上述三个关键结构域，而且这种免疫调节机制在单子叶植物和双子叶植物中具有普遍性。以重要单子叶粮食作物水稻为例，通过在水稻中调节MEL表达量，能够显著增强包括但不局限于对单子叶作物如水稻，对水稻条纹病毒、水稻稻瘟菌以及水稻白叶枯病菌的抗病性；以重要的双子叶本氏烟为例，通过在本氏烟中调节MEL表达量，能够显著增强包括但不局限于对双子叶作物如本氏烟，对水稻条纹病毒、对灰霉菌的抗病性。

下面以单子叶植物以水稻为例，通过实施例2～6来展示水稻的MEL(下称OsMEL)基因、蛋白在提高植物广谱抗病性上的原理和效果；另外双子叶植物以本氏烟为例，通过实施例7来展示本氏烟的MEL(下称NbMEL)基因、蛋白在提高植物广谱抗病性上的效果。

其中，实施例1～7中，水稻的OsMEL蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，编码该蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.8所示；本氏烟的NbMEL蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，编码该蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.9所示，下述各实施例中均不再具体赘述。

实施例2水稻MEL基因OsMEL亚细胞定位

选取水稻MEL基因OsMEL为代表，分析MEL基因的亚细胞定位。具体方法如下，将OsMEL蛋白C端融合GFP荧光标签，通过农杆菌浸润在本氏烟叶片下表皮，同时浸润微管标记蛋白MAP65-mCherry作为微管标记信号。使用激光共聚焦显微镜观察OsMEL-GFP蛋白亚细胞定位，结果显示OsMEL-GFP在细胞质内呈现丝状定位，且该丝状定位与微管标记蛋白MAP65-mCherry呈现共定位，说明OsMEL蛋白定位于细胞的微管。同时还观察到细胞的细胞核呈现绿色荧光的定位信号，说明OsMEL也能定位于细胞核。通过使用微管解聚药剂Oryzalin处理OsMEL-GFP和MAP65-mCherry共定位的细胞，观察到细胞质中丝状定位消失，进一步明确了OsMEL存在细胞微管定位的现象。

实施例3验证MEL是E3泛素连接酶

由于MEL含有RING结构域，说明其可能为一种E3泛素连接酶，为了验证这一推测，将OsMEL构建进酵母双杂交载体，验证与E2(UbcH5b)是否存在互作。具体方法为，将酵母感受态细胞中添加100mM LiAc，于30度孵育30分钟，离心去上清后于沉淀中加入350微升重悬缓冲液(30％PEG3350,100mM LiAc,250ng/mL Salmon DNA)与500ng互作质粒，至于42度孵育30分钟后，最高速离心取沉淀涂板至二缺平板(SC/-Leu-Trp)，待长出酵母菌落后转移至三/四缺平板(SC/-Leu-Trp-His or SC/-Leu-Trp-His-Ade)。结果显示OsMEL与UbcH5b共转酵母在三缺酵母平板能够生长，说明OsMEL与UbcH5b在酵母中存在互作，且突变OsMEL蛋白RING结构域中第196位的组氨酸(H)为酪氨酸(Y)时，OsMEL与UbcH5b的互作消失，说明OsMEL与E2的互作依赖于RING结构域。

为了进一步验证OsMEL是否为E3泛素连接酶，通过体外泛素化实验检测OsMEL是否发生自泛素化修饰。体外大肠杆菌表达纯化的GST-OsMEL及196位突变体分别与E1,E2(UbcH5b)及HA-Ubiquitin加入泛素化修饰缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4,2mM ATP,5mMMgCl2,2mM DTT)中，30度孵育1.5小时，通过Western Blot分析结果显示GST-OsMEL发生了多聚泛素化修饰，而GST-OsMEL(H196Y)突变体不能发生自泛素化修饰，说明OsMEL是一个基于C4HC3类型RING结构域的E3泛素连接酶

实施例4 OsMEL基因的过表达及敲除突变体水稻的构建

(1)植物组织总RNA的提取

利用Trizol法提取植物组织总RNA，具体方法如下：采取水稻植株的组织，用天平称取0.1g，加入液氮将植物的组织迅速研磨成粉末状,转移到2mL EP管中,加入1mLTrizol，利用振荡器将其充分混匀。向上述的溶液中加入200μL三氯甲烷，振荡20-30s,室温静置10min。4℃、12000rpm离心15min，将上清大约600μL转移到新的离心管中，加入600μL三氯甲烷，振荡混匀，室温静置10min。4℃、12000rpm离心15min，再次将上清大约500μL转移到新的离心管中，加入500μL异丙醇，混匀，室温放置30min。4℃、12000rpm离心20min，弃上清，所得的沉淀用70％冷乙醇和无水乙醇先后洗涤一次(4℃，12000rpm，5min)，沉淀晾干后，加入50μL DEPC-H2O进行溶解。提取过表达株系后使用F端引物AACGTGTACACGGTGACGC和R端引物CGACCACAGCTGGTGGAAC进行定量PCR分析OsMEL转基因株系的OsMEL过表达水平，选取高表达水稻株系(OE-OsMEL-25/OE-OsMEL-34)留种用于下游生物学分析。

(2)利用CRISPR-Cas9技术对OsMEL的基因进行编辑敲除

利用CRISPR-Cas9技术对OsMEL的基因进行编辑。在http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/网站上查找OsMEL的靶点GCTGCGGCTGCTGCACCGCG(图4.a)，针对该靶点序列对OsMEL的基因进行编辑。通过提取DNA筛选以及测序验证(图4.a)筛选OsMEL基因敲除纯合突变水稻株系(Osmel)。

(3)OsMEL敲除和过表达水稻株系与野生型对照中花11品系共同种植于温室后观察生长表型，结果显示过表达OsMEL的水稻转基因株系呈现植株轻微矮化的表型，而敲除OsMEL的水稻株系与对照相比无明显生长差异。

实施例5 OsMEL转基因株系免疫相关应答水平分析

分析实施例4中构建的两种OsMEL转基因株系(OsMEL敲除水稻株系和OsMEL过表达水稻株系)免疫相关应答水平，具体方法如下：

(1)植物叶片活性氧染色

水稻叶片浸入DAB溶液(1mg/mL 3,3-diaminobenzidine,PH 3.8,Sigma)，至于黑暗中处理6-8小时，倒去DAB溶液加入无水乙醇，至于90度水浴锅对叶片进行褪色。

结果显示过表达OsMEL会增加水稻自发活性氧积累

(2)植物叶片活性氧染色测定

取100毫克水稻叶片液氮研磨成粉，加入500微升50mM的磷酸缓冲液(PH 7.4)至冰上孵育10分钟。1200g离心10分钟，取上清用Amplex Red Hydrogen Peroxide/PeroxidaseAssay kit(Invitrogen)试剂盒测定活性氧含量。

结果显示过表达OsMEL的水稻叶片水稻自发活性氧积累水平显著提高；

(3)植物叶片应答flg22/chitin质外体活性氧迸发测定

取剪切的0.5cm x 0.5cm大小水稻叶片至于96孔板，加入100微升无菌水过夜孵育，第二天每孔加入100微升反应液(0.5mM L-012solution,20mg/mL horseradishperoxidase(Jackson Immuno-Research),and 100nM flg22 or 100mg/mL chitin)，至于Photek camera HRPCS5(Photek)仪器观察活性氧信号的持续迸发并记录。

PTI诱发因子flg22处理OsMEL转基因水稻株系叶片后瞬时爆发的活性氧分析结果显示过表达OsMEL会显著提高水稻应答flg22刺激诱发的活性氧爆发，而敲除OsMEL会降低水稻应答flg22刺激诱发的活性氧爆发水平。PTI诱发因子chitin处理OsMEL转基因水稻株系叶片后瞬时爆发的活性氧分析结果显示过表达OsMEL会显著提高水稻应答chitin刺激诱发的活性氧爆发，而敲除OsMEL会降低水稻应答chitin刺激诱发的活性氧爆发水平。

实施例6 OsMEL转基因株广谱抗病性分析

分析实施例4中构建的两种OsMEL转基因株系(OsMEL敲除水稻株系和OsMEL过表达水稻株系)广谱抗病性，分析采用的具体方法如下：

(1)OsMEL转基因水稻株系水稻条纹病毒抗性分析

转基因过表达和敲除OsMEL基因的水稻作为供试材料，以野生型中花11品系水稻作为对照，同时播种，长到4叶期左右用来开展RSV带毒灰飞虱传毒接种。将4叶期不同处理水稻幼苗各15株，移植于接种板，模拟田间区块实验，将不同处理水稻间隔种植。将带毒的灰飞虱水稻放上饲喂，平均每棵水稻接虫数量为20只，饲喂72h后将灰飞虱取出(期间每日用毛笔驱赶灰飞虱使其均匀取食水稻)，水稻继续在温度26±1℃，湿度75％的光照培养箱中培养。将灰飞虱移除后将接毒水稻转移至温室大棚持续观察水稻发病症状，接毒后第40天及时拍照记录并取叶片检测RSV外壳蛋白积累情况。

结果显示相对于野生型中花11水稻，过表达OsMEL水稻RSV侵染症状减轻，敲除OsMEL水稻的RSV侵染症状加重(图6a,b)。OsMEL转基因水稻和对照的RSV外壳蛋白CP积累量分析结果显示，相对于野生型中花11水稻，过表达OsMEL水稻RSV病毒积累量减少，敲除OsMEL水稻的RSV病毒积累量增多(图6c)。

(2)OsMEL转基因水稻株系稻瘟菌抗性分析

将稻瘟病小种Guy11进行活化，25℃培养大约10天左右，用灭菌水冲洗培养基，洗下孢子液。用40um滤膜过滤后，检测孢子浓度，调至1×10⁵孢子/ml。

离体叶片接种：取4周的幼苗叶片，剪取约5-8cm长叶片，两端注意保湿，防止叶片失水。注射器针头轻轻划破叶片表层。将5μL滴孢子液至伤口处，注意保湿保温，5-7天后观察表型，并测量病斑长度。

结果显示相对于野生型中花11水稻，过表达OsMEL的转基因水稻稻瘟菌侵染斑点减小，而敲除OsMEL的转基因水稻稻瘟菌侵染斑点长度增大(图6d,e)

(3)OsMEL转基因水稻株系白叶枯抗性分析

利用白叶枯病小种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，PXO99A)，于马铃薯培养基上，斜面28℃下培养2-3天，用无菌水稀释至约1×10⁸个/mL的浓度备用，采用剪叶法对OsMEL转基因水稻孕穗期进行接种。20天后，调查接种叶片的病斑长度。以此为标准来评估植株抗性的强弱。

结果显示相对于野生型中花11水稻，过表达OsMEL的转基因水稻白叶枯侵染斑长度减小，说明OsMEL过表达植株显示对白叶枯病明显的抗性，而敲除OsMEL的转基因水稻稻瘟菌侵染斑长度增大，说明敲除株系Osmel株系表现出对白叶枯明显的感病性(图6f,g)。

实施例7 NbMEL转基因本氏烟株系广谱抗病性分析

分析NbMEL转基因本氏烟株系广谱抗病性分析具体方法如下：

(1)NbMEL转基因本氏烟株系灰霉菌抗性分析

使用PDA培养基(200g/L Potato,20g/L Glucose,15g/L Agar)培养灰霉菌B05.10菌株，至于24℃、12/12小时白光/黑暗培养箱。待长出孢子后收集孢子并稀释孢子浓度至5×10⁶spores/mL，点滴5μL孢子液于5-6叶期本氏烟的叶片上，将接种后叶片保湿并放回培养箱观察并记录病斑形成。

(2)NbMEL转基因本氏烟株系水稻条纹病毒抗性分析

将侵染RSV的水稻叶片在0.1M浓度磷酸缓冲液中研磨成汁液，选取5-6叶期本氏烟，选取不同株系相近位置的三片叶片，将带毒汁液摩擦至本氏烟叶片，2分钟后喷水洗去带毒水稻汁液，并将接过毒的本氏烟株系至于黑暗中恢复生长12小时。于第二天将接种过RSV的本氏烟至于28度植物培养箱，观察并记录RSV症状的形成。

使用PDA培养基(200g/L Potato,20g/L Glucose,15g/L Agar)培养灰霉菌B05.10菌株，至于24℃、12/12小时白光/黑暗培养箱。待长出孢子后收集孢子并稀释孢子浓度至5×10⁶spores/mL，点滴5微升孢子叶于5-6叶期本氏烟的叶片上，将接种后叶片保湿并放回培养箱观察并记录病斑形成。

(3)本氏烟叶片活性氧染色

本氏烟叶片浸入DAB溶液(1mg/mL 3,3-diaminobenzidine,PH 3.8,Sigma)，至于黑暗中处理6-8小时，倒去DAB溶液加入无水乙醇，至于90℃水浴锅对叶片进行褪色。

结果显示过表达NbMEL会增加本氏烟自发活性氧积累

(4)本氏烟叶片活性氧染色测定

取100毫克叶片液氮研磨成粉，加入500μL、50mM的磷酸缓冲液(PH 7.4)至冰上孵育10分钟。1200g离心10分钟，取上清用Amplex Red Hydrogen Peroxide/PeroxidaseAssay kit(Invitrogen)试剂盒测定活性氧含量。

本实施例中NbMEL转基因本氏烟广谱抗病性分析结果图如图7所示。其中如图7a,b,c所示，双子叶本氏烟植物中过表达NbMEL显著抑制灰霉菌的侵染坏死斑点，伴随有活性氧积累量更高，而敲除本氏烟NbMEL的叶片灰霉菌的侵染坏死斑点面积更大。由此显示提高本氏烟中NbMEL表达量可提高对灰霉菌的抗性，而敲除NbMEL增加本氏烟对灰霉菌的敏感性。如图7d,e,f所示，双子叶本氏烟植物中过表达NbMEL显著抑制水稻条纹病毒的症状扩散，伴随活性氧积累量更高和病毒外壳蛋白积累量减少，而敲除本氏烟NbMEL的叶片水稻条纹病毒侵染症状更重，活性氧积累减少而且病毒外壳蛋白积累量增加。由此显示提高本氏烟中NbMEL表达量可提高对水稻条纹病毒的抗性，而敲除NbMEL增加本氏烟对水稻条纹病毒的敏感性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 植物免疫调节相关蛋白及其应用

<141> 2021-04-20

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 263

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Glu Pro Val Thr Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ser Glu Glu

1 5 10 15

Gln Val Thr Arg Arg Val Ala Ser Arg Ile Ile Arg Ala Leu Gln His

20 25 30

Gln Leu Arg Leu Leu His Arg Ala Gly Pro Glu Phe Phe Val Leu Gly

35 40 45

Ala Thr Gly Asn Val Tyr Thr Val Thr Leu Ala Ala Ala Pro Ala Cys

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Leu Arg Val Leu Gly Leu Ser Leu Asp Glu Ala Cys Val Trp Arg Gln

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Ser Leu Arg Pro Cys Gln Val Ala Arg Leu Val Ala Ala Pro Thr Cys

100 105 110

Ala Glu Ala Asp Val Val Ala Gly Pro Arg Ala Arg Glu Arg Phe His

115 120 125

Gln Leu Trp Ser Ala Arg Ala Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ser Arg Arg

130 135 140

Arg Arg Arg Arg Asp Asp Gln Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ser Gly Arg

145 150 155 160

Leu Asp Gly Ala Ala Cys Pro Val Cys Leu Glu Glu Met Ser Pro Pro

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Asp Gly Gly Leu Cys Ala Gly

260

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> Nicotiana benthamiana

<400> 2

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1 5 10 15

Arg Leu Arg Arg His Leu Met Pro Thr Gln Pro Phe Ala Asp Arg Ile

20 25 30

Ile Arg Ala Val Thr His His Leu His Leu Leu His His Ser Gly Thr

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100 105 110

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Leu Arg Ile Glu Ile Glu Asp Gly Val Thr Cys Pro Val Cys Leu Glu

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Glu Met Asn Lys Gly Glu Arg Val Ala Ala Cys Arg Lys Cys Arg Asn

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Arg Ser Ile Ser Cys Val Ile Cys Arg Ala Arg Trp Arg Asp Met Arg

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Gly Asn

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<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

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Cys

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<211> 252

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 4

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Gly Val Thr Gly Asn Val Tyr Thr Val Thr Leu Ser Thr Thr Pro Ala

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100 105 110

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115 120 125

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<210> 5

<211> 269

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 5

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Leu Val Ala Ala Pro Thr Tyr Pro Glu Val Leu Ala Gly Pro Arg Ala

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Arg Glu Arg Phe His Gln Leu Trp Ala Ala His Val Ala Ala Ala Ala

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Ala Lys Ala Ala Asp Gln Arg Arg Gln Asp Ser Ala Gly Pro Ser Ser

145 150 155 160

Gly Arg Leu Asp Gly Ala Ala Cys Pro Val Cys Leu Glu Glu Met Ala

165 170 175

Pro Ser Ala Glu Ala Gln Gly Gly Ala Ala Ala Thr Gly Pro Ala Pro

180 185 190

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Ala Arg Trp Lys Arg Ser Arg Ala Arg Arg Ala Ala Thr Cys Val Val

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Cys Arg Ala Arg Trp Arg Lys Pro Ser Arg Asp Arg Glu Gln Asp Gln

225 230 235 240

Gln Gln Tyr Met Asn Leu Ser Ala Tyr Met His Glu Glu Asn Asp Ala

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<210> 6

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<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

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180 185 190

Arg Ser Ile Lys Cys Val Ile Cys Arg Ala Arg Trp Arg Asp Val Arg

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210 215 220

Asp Met Gln Val Glu Asp Arg Gln Ser His Cys Gly Ser

225 230 235

<210> 7

<211> 239

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum

<400> 7

Met Glu Ser Ile Gly Ser Ser Ser Thr Ala Ser Asn Asn His His His

1 5 10 15

His Pro His Arg Arg His Leu Met Pro Thr Gln Pro Leu Ala Asp Arg

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Ile Ile Arg Ala Val Ser His His Leu Arg Leu Leu His His Tyr Asp

35 40 45

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180 185 190

Arg Arg Ser Met Lys Cys Val Ile Cys Arg Ala Lys Trp Arg Asp Leu

195 200 205

Arg Ala Asn Cys Glu Gln Gln Asp Lys Tyr Leu Asn Leu Ser Ala Tyr

210 215 220

Asp Asp Asp Met Gln Val Glu Asp Arg Gln Ser His Cys Gly Ser

225 230 235

<210> 8

<211> 792

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 8

atggagcccg tgacggcggc gtcggcggcg gcggcggcga gcgaggagca ggtgacgcgg 60

cgcgtggcga gccggatcat ccgggcgctg cagcaccagc tgcggctgct gcaccgcgcg 120

gggcccgagt tcttcgtgct gggcgcgacg gggaacgtgt acacggtgac gctggcggcg 180

gcgccggcgt gcacgtgccc ggacccgtcc gtgccgtgca agcacatcct cttcgtcctc 240

ctccgcgtgc tcggcctctc gctcgacgag gcctgcgtgt ggcggcagtc gctccgcccg 300

tgccaggtgg cgcggctcgt cgccgcgccg acgtgcgccg aggcggacgt cgtggcgggg 360

ccccgcgcgc gggagaggtt ccaccagctg tggtcggcga gggccgccgc caaggccgag 420

gagagccgcc gccgccgacg acgcgacgac caggccgccg cagccggcgc gtcggggagg 480

ctcgacggcg cggcctgccc ggtgtgcctg gaggagatgt cgccgcctgg ggcggcggcg 540

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gcgcggtgga agcggagccg ggggaggcgg gcggcgacgt gcgtggtgtg ccgggcgcgg 660

tggcggcagc cgagccggga gcaggagaag gagccgtaca tcaacctgtc cgcgtacatg 720

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tgcgccgggt ag 792

<210> 9

<211> 729

<212> DNA

<213> Nicotiana benthamiana

<400> 9

atggaatcca tcgcatctag ttccaccccg tccgaccacc agcaccaccg tctccgccgc 60

catctaatgc caacacagcc attcgccgac agaatcatcc gtgccgtgac ccaccatctc 120

cacctcctcc accactccgg gaccactttc tttatcttag gcgcaaccgg aaatgtatat 180

attgttaacc tctccacaac cccatcatgc agctgccctg atcgaaccac cccatgcaaa 240

cacatcctct tcgtcctcat tcgcgttttg ggtgtctcca tcgacgacac gtgtcttctc 300

cggcgaactc tccggccatg cgagctccaa cgctttctca gcttacccat ctcaactgaa 360

tcactagcaa aacctaacgt tcgagaaaga tttcacgaga cgttttttaa ggaacgacca 420

aaaagttcgc cgttgagaat agagatagag gacggtgtta catgtccggt gtgtttggaa 480

gagatgaata agggagaaag agttgcagca tgtcggaaat gtagaaatcc attacatgaa 540

gaatgtttga tgcaatggaa gagaagtaac agaagaagat caattagttg tgtgatatgc 600

agggcaaggt ggagagatat gagagctgag caagaagctg agaggtattt gaatttgtct 660

gcttatatgg gcggcgataa tgacatgcat attaatttgg aggatcagca cagctactgt 720

gggaattag 729

<210> 10

<211> 822

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 10

atggaatctg tcggatccaa tcaaatatcc ccgtacgtaa gtaaccgtga ccaacggcat 60

ttcttggctc aaccggtggc agataggata cttcgagctc tccgtcaccg gatccgtctt 120

ctccaccgtc ctaatgcagg aacttttcac gttcttggtg caacgtgtaa cgtctacaca 180

gtgacgctaa tggccacacc tacttgcact tgtcccgacc gtaagaagcc gtgcaaacac 240

atcttgtttg tcttaatccg agttcttgga attcctctcg acgataagtg tctcaggcaa 300

cggagactcc ggacatgcct cctcttccac ctcttctctg ccccgacacg gcctgactgc 360

ctcgccagtt tccgcctcca acaacggttt cttcagcttt tcccagccac cacttctcaa 420

cccggctata ctactaactc atcctcctcc accagtaaaa tggaaaatga ggtggatgaa 480

gagccggcaa catgtccaat atgtctagac gatattatcg caatagaaaa cgtagacggt 540

ggaaatggtg gagggaagga gaaggaaacc gcggtggtga agtgcagagt atgcaagaac 600

aaggttcatg atgaatgcat gctggcgtgg agaaagagtc gtggacggcg gccggccatc 660

tgtgtggtat gccgtgcacg gtggccagca aatagatcga gtaagaatcc taatgttggt 720

gataataacg agaactgcca cggtaattgt tatttgaatt tagctcctta cgttgatgag 780

gaagtggagg atggggttgg cacgagccaa cggccatgtt ga 822

Claims

1.一种提高水稻活性氧积累水平和爆发水平以及提高水稻对水稻条纹病毒、稻瘟菌和白叶枯病抗性的方法，其特征在于：在水稻中提高如SEQ ID NO.1所示植物免疫调节相关蛋白的表达量。

2.一种提高水稻活性氧积累水平和爆发水平以及提高水稻对水稻条纹病毒、稻瘟菌和白叶枯病抗性的方法，其特征在于：在水稻中提高如SEQ ID NO.8所示核酸的表达量。

3.一种提高本氏烟活性氧积累水平以及提高本氏烟对灰霉病和水稻条纹病毒抗性的方法，其特征在于：在本氏烟中提高如SEQ ID NO.2所示植物免疫调节相关蛋白的表达量。

4.一种提高本氏烟活性氧积累水平以及提高本氏烟对灰霉病和水稻条纹病毒抗性的方法，其特征在于：在本氏烟中提高如SEQ ID NO.9所示核酸的表达量。