CN114480477A - 一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法，该方法通过将ZmSWI3D基因的编码区转入到玉米基因组中，在玉米叶片中诱导表达ZmSWI3D基因，即然后利用Ubi启动子组成型表达ZmSWI3D基因，从而促进叶片气孔在干旱条件下快速闭合，有利于玉米植株保持水分，从而提高玉米的抗旱性，同时还不会影响玉米在正常水分条件下的生长发育，提高玉米的抗旱性。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法。
背景技术
玉米是重要的粮食作物和饲料作物，也是全世界总产量最高的农作物。随着饲料与工业需求的增加，玉米需求呈强劲地增长态势。
玉米在整个生长周期中的需水量（2500 mm）较大，不同时期需水量的变化很大，除苗期可适当干旱外，从拔节到成熟都应保证良好的水分供应，而不同程度的干旱易造成玉米的减产。因此，通过玉米抗旱的遗传和生理基础研究，挖掘抗旱相关基因资源，培育高抗旱性玉米品种，对玉米生产具有重要意义。
染色质重塑是在维持基因组稳定性、染色质结构和表达调控中起关键作用。Kim等通过染色质免疫共沉淀（ChIP）分析发现，干旱胁迫可诱导RD29A和RD29B基因启动子处核小体密度降低和H3K4me3与H3K9ac修饰的升高，而该区域包含一个关键的胁迫应答因子ABRE(ABA-responsive element)的结合位点，促使胁迫应答转录因子如DREB、ABRE等迅速招募到基因启动子处，激活RD29A和RD29B基因表达；在盐胁迫时，DREB2A、RD29A和RD29B基因的组蛋白H3K9me2水平降低、H3K4me3水平升高，在从而调节了这些基因的表达，以适应胁迫环境 (Kim et al., 2008; Kim et al., 2012)。相反的，在同样的条件下，这些相关位点的核小体定位(nucleosome occupancy)急剧下降(Kim et al., 2010)，说明染色质重塑和组蛋白修饰需要密切的协调，从而调控基因表达(tightly coordinated to regulate geneexpression)。
超声波处理玉米花粉转化法操作简单,不需要组织培养过程。主要理论基础是超声波处理过程中产生“声孔效应”，该效应使花粉壁产生瞬间穿透现象，使外源目的基因进入到花粉粒内部，经自然双受精过程整合到玉米基因组中并表达，此技术切实可行。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法，通过将ZmSWI3D基因的编码区转入到玉米基因组中，在玉米叶片中诱导表达ZmSWI3D基因，即然后利用Ubi启动子组成型表达ZmSWI3D基因，从而促进叶片气孔在干旱条件下快速闭合，有利于玉米植株保持水分，从而提高玉米的抗旱性，同时还不会影响玉米在正常水分条件下的生长发育，提高玉米的抗旱性。具体包括如下步骤：
S1、总RNA的提取：
S11、取3叶1心期玉米叶片剪碎液氮研磨成粉，转入1.5 ml离心管内，加入1mlTrizol，充分混匀，室温放置5-10 min后，加入RNAiso Plus的1/5体积量的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15 s（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开），待溶液充分乳化，无分相现象后，再室温静置5 min，12000g 4℃离心15 min；
S12、从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中，切忌吸出白色中间层；
S13、向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10 min，12000 g 4℃离心10 min，小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入1 ml 75％的乙醇（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4℃离心5 min后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）；
S14、室温干燥沉淀2～5 min，使酒精完全挥发后，用10-15μl DEPC-H2O溶解 RNA，用量视沉淀量而定；
S2、反转录操作：
S21、用DNaseI处理 RNA，10μl反应体系包含:
DNaseI 1μl；
DNaseI buffer 1μl；
RNA 10μg；
DEPC-H2O up to 10μl；
轻轻混匀后瞬时离心，室温放置15min后，加入1μl 25mM的EDTA，65℃处理10min，使DNaseI失活；
S22、在冰上于PCR管中加入以下试剂：
0.5μg/μl 的oligo dTnV 1μl；
10mM/each 的dNTPs 1μl；
去除DNA的RNA 5μg；
DEPC-H2Oupto 12μl；
轻轻混匀后，65℃处理5min后，迅速转移到冰上冷却2min；
S23、在上述体系中加入：
5×RT buffer 4μl
0.1M DTT 2μl
RNase Inhibitor 1μl
37℃预热2min，加入M-MLV RTase 1μl， 37℃温浴50min，70℃处理15min，使酶失活后，反应产物加入40μl 1×TE稀释，充分混匀，保存于-30℃备用；
S3、以反转录产物为模板，通过PCR方法扩增获得玉米ZmSWI3D基因，ZmSWI3D基因扩增所使用正向克隆引物：5' ATGTTCGAGGCCGTCCG 3'、反向克隆引物：5'TCAGCTGGTGGGCCGAGG 3'；所述克隆的ZmSWI3D基因CDS序列全长为2349 bp，编码782个氨基酸组成的蛋白，编码的蛋白带有SWIRM和SANT保守结构域，以及一个zinc-binding结构域；
S4、玉米染色质重塑蛋白基因ZmSWI3D的过表达载体构建
在通用双元载体pCAMBIA3301基础上改造获得的遗传转化载体，具体的，将序列表SEQ ID NO：4所示的玉米泛素基因启动子通过SacI和BamHI酶切位点插入pCAMBIA3301中，得到改造遗传转化载体p3301-Ubi；对得到的改造遗传转化载体p3301-Ubi用限制性内切酶SalI和NheI进行酶切，去掉CaMV 35S启动子和GUS基因；将上述克隆所得的玉米ZmSWI3D基因用SalI和NheI消化并回收包含完成ZmSWI3D阅读框的DNA片段，在把该片段连入上一步的酶切后p3301-Ubi载体，得到ZmSWI3D基因的过表达载体p3301-Ubi-ZmSWI3D；
S5、利用超声波进行花粉介导的转基因操作，具体步骤如下：
1）H99田间管理：将受体玉米自交系H99播于试验田，在抽丝期对雌穗进行严格的套袋隔离，转化的前1 d对雄穗进行严格的套袋隔离；
2）花粉处理：选择晴朗的天气收集新鲜的花粉，转化前收集盛花期的花粉以保证活力和花粉量；
3）蔗糖溶液配制：当天配制好15 %的蔗糖溶液，将蔗糖溶液置于4 ℃的冰盒中冷却，并保持通入新鲜空气；
4）超声波处理：称取2 g的玉米花粉倒入100 ml的烧杯内，加入80 ml的预冷蔗糖溶液，立即搅拌成悬浮液；将悬浮液经超声波细胞破碎仪处理后，加入含ZmSWI3D基因的载体质粒DNA，再次进行超声波处理，使外源基因ZmSWI3D进入花粉粒，超声波处理完毕后，将烧杯置于4 ℃冰盒中，自然沉降180-300 s，弃上清液，将沉淀花粉粒和5 mL左右剩余溶液转移到培养皿中；
5）田间授粉：选取严格套袋隔离的雌穗，将花粉和剩余溶液涂抹于套袋隔离的花丝上，为避免外来花粉混杂，涂抹过程应均匀、迅速完成，涂抹花粉完成后套袋并做好标记，授粉当代收获T0种子；
6)空载体玉米获得：将空载体pB7RWG采用步骤1）-5）所述的方法转入野生型玉米自交系H99中。
本发明具有以下有益效果：
通过将ZmSWI3D基因的编码区转入到玉米基因组中，可以在玉米叶片中诱导表达ZmSWI3D基因，从而促进叶片气孔在干旱条件下快速闭合，有利于玉米植株保持水分，从而提高玉米的抗旱性，同时还不会影响玉米在正常水分条件下的生长发育。
附图说明
图1为本发明实施例中 ZmSWI3D结构域。
图2为本发明实施例中p3301-Ubi图谱。
图3为本发明实施例中ZmSWI3D相对表达量。
图4为本发明实施例中干旱胁迫生存率。
图5为本发明实施例中叶片失水率。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
玉米染色质重塑蛋白基因ZmSWI3D的克隆
本实验室前期研究发现：玉米ZmSWI3D基因的表达在干旱环境下显著上升，因此，我们利用已公布的ZmSWI3D基因序列（ChromDB数据库，http://www.chromdb.org/）对现有玉米基因组公共数据库（https://www.maizegdb.org/；http://ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index?db=core）进行同源性搜索比对分析，未发现在这两个公共数据库中注释有ZmSWI3D基因。在ZmSWI3D基因开放阅读框（ORF）核苷酸长度为2382 bp（序列表SEQID NO：1），编码由793个氨基酸组成的SWI3类染色质重塑蛋白。
根据ZmSWI3D在ChromDB数据库中的CDS序列设计可以扩增全长ORF的一对引物ZmSWI3D-full-F（5' ATGTTCGAGGCCGTCCGA 3'）和ZmSWI3D-full-R（5' TCAGCTGGTGGGCCGAG3'）。为了用于ZmSWI3D基因的过表达载体构建，在上述引物两端分别加入限制性内切酶酶切位点（SalI和NheI）和保护性碱基，以获得载体构建用克隆引物ZmSWI3D-clone-F和ZmSWI3D-clone-R。
提取总RNA所用的试剂Trizol购自上海生工生物工程技术有限公司，具体操作如下：（1）取3叶1心期玉米叶片剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内，加入1ml Trizol，充分混匀，室温放置5－10 min。（2）向上述步骤1的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15 s（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5 min。（3）12,000 g 4℃离心15min。（4）从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。（5）向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10 min。（6）12,000 g 4℃离心10 min。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。（7）小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1 ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4℃离心5 min后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。（8）室温干燥沉淀2～5 min，使酒精完全挥发。用10-15μl DEPC-H2O溶解RNA，视沉淀量而定。
反转录试剂盒购自INVITROGEN公司，实验操作如下：
（1）用DNaseI处理RNA，10 μl反应体系:
DNaseI 1μl
DNaseI buffer 1μl
RNA 10μg
DEPC-H2O up to 10μl
轻轻混匀后瞬时离心，室温放置15 min，之后加1μl 25 mM EDTA，65℃处理10min，使DNaseI失活。
（2）在冰上于PCR管中加入以下试剂：
oligo dTnV (0.5μg/μl) 1μl
dNTPs (10mM/each) 1μl
去除DNA的RNA 5μg
DEPC-H2O up to 12μl
轻轻混匀后，65℃处理5 min.，之后迅速转移到冰上冷却2 min。
（3）在上述体系中加入：
5×RT buffer 4μl
0.1M DTT 2μl
RNase Inhibitor 1μl
37℃预热2 min，加入M-MLV RTase 1μl， 37℃温浴50 min.后，70℃处理15 min.使酶失活。
（4）反应产物加入40 μl 1×TE稀释，充分混匀，保存于-30℃备用。
以反转录产物为模板，通过PCR方法扩增获得玉米ZmSWI3D基因，扩增条件：
对克隆的ZmSWI3D基因进行测序。通过与Chrom DB数据库提供的ZmSWI3D基因CDS序列进行比较，发现我们克隆的ZmSWI3D基因CDS序列缺少33 bp（即缺少序列表SEQ ID NO：1的1739-1771位置）。本发明中克隆的ZmSWI3D基因CDS序列全长为2349 bp（序列表SEQ IDNO：2），编码782个氨基酸组成的蛋白（序列表SEQ ID NO:3），编码的蛋白带有SWIRM和SANT保守结构域，以及一个zinc-binding结构域（如图1所示）。
实施例2
玉米染色质重塑蛋白基因ZmSWI3D的过表达载体构建
首先将玉米泛素基因（Ubiquitin）启动子（序列表SEQ ID NO：4）通过SacI和BamHI酶切位点插入pCAMBIA3301中，得到改造遗传转化载体p3301-Ubi（如图2所示）。对p3301-Ubi载体用限制性内切酶SalI和NheI进行酶切，去掉CaMV 35S启动子和GUS基因。将实施例1中克隆的玉米ZmSWI3D基因用SalI和NheI消化并回收包含完成ZmSWI3D阅读框的DNA片段，在把该片段连入上一步的酶切后p3301-Ubi载体，得到ZmSWI3D基因的过表达载体p3301-Ubi-ZmSWI3D。
实施例3
超声波介导的玉米遗传转化与鉴定
1、玉米遗传转化
利用超声波进行玉米花粉介导的转基因操作（H99，以下也称为野生型玉米），具体步骤如下：
1）H99田间管理：将受体玉米自交系H99播于试验田，在抽丝期对雌穗进行严格的套袋隔离，转化的前1 d对雄穗进行严格的套袋隔离。
2）花粉处理：选择晴朗的天气收集新鲜的花粉，转化前收集盛花期的花粉以保证活力和花粉量。
3）蔗糖溶液配制：当天配制好15 %的蔗糖溶液，将蔗糖溶液置于4℃的冰盒中冷却，并保持通入新鲜空气。
4）超声波处理：称取2g的玉米花粉倒入100 ml的烧杯内，加入80 ml的预冷蔗糖溶液，立即搅拌成悬浮液。超声波细胞破碎仪对悬浮液中的花粉进行超声波处理。超声波的处理程序具体如下：超声波声强150 W，处理时间为6 s，重复工作5次，间隔时间为5 s。处理后加入含ZmSWI3D基因的载体质粒DNA，再次经超声波处理，使外源基因ZmSWI3D进入花粉粒，超声波处理完毕后，将烧杯置于4℃冰盒中，自然沉降180-300 s，弃上清液，将沉淀花粉粒和5 mL左右剩余溶液转移到培养皿中。
5）田间授粉：选取严格套袋隔离的雌穗，将花粉和剩余溶液涂抹于套袋隔离的花丝上，为避免外来花粉混杂，涂抹过程应均匀、迅速完成，涂抹花粉完成后套袋并做好标记，授粉当代收获3130粒T0代转基因玉米种子。
6)空载体玉米获得：将空载体pB7RWG采用上述方法转入野生型玉米自交系H99中。
2、转基因玉米的鉴定
（1）除草剂筛选
为了初步检测转基因是否成功，将收获的3130粒T0代玉米种子播于试验田，田间株高为80cm时喷洒1‰浓度的Basta除草剂进行初步筛选，250株检测为除草剂抗性，抗性比例为8.0%。
（2）Bar检测试剂盒检测
为了进一步验证检测的可靠性，采用美国envirologix公司试剂盒QuickStix™Kit for LibertyLink® (bar) Cotton leaf & seed对Basta筛选的250株T0代转基因玉米进行检测：
a. 用试剂盒中Disposable Tissue Extractor tube的管盖和管帽夹住T0代转基因玉米的叶片，取下一个或两个圆形的叶片组织，用试剂盒中自带的研杵将叶片组织推入锥形管底部，装有样品的管用防水记号笔标记好；
b. 将研杵插入盛有组织的管内，通过旋转研杵研磨叶片组织，持续20至30 s，直至叶片组织磨的足够碎；
c. 向管内加入0.5 mL Extraction Buffer；
d. 继续用研杵棒捣碎叶片，使捣碎的叶片组织与Extraction Buffer充分混匀；
e. 拿出研杵棒，将试纸条插入混匀的Extraction Buffer和叶片组织中检测，等待1 min左右，观察反应结果。
应用试剂盒对经过Basta筛选的100株T0代转基因植株进行检测，两条带为阳性，只有一条带即为阴性；得到92株bar基因阳性T0代转基因玉米。
（2）转基因植株的bar基因PCR分析
为了进一步检测转基因是否成功，根据除草剂筛选标记bar基因设计了特异引物。引物序列为：上游引物P1：5'-GCACCATCGTCAACCACTACATC-3'
下游引物P2：5'-AGCTGCCAGAAACCCACGT-3'
选取12株bar基因阳性T0代转基因玉米基因组DNA为模板，用P1和P2为引物进行PCR扩增，得到433bp扩增产物为阳性，进一步证明得到12株bar基因阳性T0代转基因玉米。
3、实时荧光定量RT-PCR
将上述12个经鉴定Bar检测试剂盒和PCR检测后阳性的T0代转基因玉米的胚乳分别提取RNA，反转录得到cDNA作为模板，用如下引物对分别进行Real-Time PCR，检测ZmSWI3D基因表达情况。以转空载体玉米和野生型玉（H99）为对照。
ZmSWI3D基因的实时荧光定量RT-PCR的检测引物为5'-GGCACGCAACGCCTACGACT和5'-AGCCCGATGACAGCGACCAC；
内参基因使用玉米Actin1基因，引物为
5'- CCTGAAGATCACCCTGTGCT和5'- GCAGTCTCCAGCTCCTGTTC。
结果如图3所示，说明12株转基因阳性T0代玉米中（OE-1至OE-12），有6个ZmSWI3D基因表达超过野生型玉米（WT）的2倍以上，而转空载体玉米和野生型玉米无显著差异。
通过上述方法初步证明玉米ZmSWI3D基因表达盒已转入玉米基因组中，并超量表达。
实施例4
过表达ZmSWI3D基因玉米的抗旱性分析
发明人依据ZmSWI3D基因表达水平，对于过表达ZmSWI3D成功的转基因玉米，选择ZmSWI3D基因表达最高的两个转基因系，即OE-2和OE-3进行自交繁殖，获得纯合株系（T2代除草剂筛选不再分离）。然后对T3代OE-2和OE-3转基因系进行抗旱能力检测。玉米种子用1%浓度的次氯酸钠浸泡消毒5 min，用去离子水洗3次，每次1 min。将种子放在湿润滤纸上28℃下促进发芽。3 d后将发芽的种子种到土（泥炭土：蛭石=1:1）中，温室内培养，16小时光照26 ℃，8小时黑暗20℃，相对湿度为70%。对于测量干旱胁迫下的生存率，生长至15d的玉米幼苗停止浇水15d，然后重新浇水，2d后测量生存率。结果发现相对于WT，OE-2和OE-3的生存率提高（如图4）。
为了检测过表达ZmSWI3D对玉米叶片失水的影响，我们取四叶期玉米的第4片叶放入洁净平皿中，将平皿置于干燥的人工气候箱中（25℃，相对湿度30%）进行脱水，在0 h，1h，2 h，3 h和8 h时分别测量叶片鲜重，计算相对失水率。结果发现相对于WT，OE-2和OE-3的失水率明显下降（如图5）。
上述结果表明，过表达玉米ZmSWI3D基因可以减少干旱条件下玉米叶片失水率，从而提高玉米的抗旱性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林农业科技学院
<120> 一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2382
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial Sequence (atgttcgagg ccgtccgatc ccgtggcgctggcgtccatg tggtccctac ctttgctgga 60 tggttttcgt ggaaagaaat ccacccagttgagaagcaga ccttgccttc tttttttaat 120 ggaaaatctg agaagcggac acctgaggtatatttggcgg ttagaaattc gatcatgatg 180 aaatttcatg ccaatcctca attgcagctggagtccaaag acctggctga gttgtcaatc 240 ggggagaccg atgctcggca ggaaatcttggaattcttgg atcactgggg cttgataaat 300 ttccaccctt tcccaccaga tggacatgaggagagtaagc cagaggagac ccaagacaat 360 tctaatgacg agaaagcttc tttgatcgagcaactgttta agtttgaatc agttcaatca 420 tatatgacgc ctttaccaat gaaagaagatgtgagagctc cgcctcctct gcctagcttg 480 attcctgaat ctgtactcat tcaagatgtggttgcagcag ctgagccttc tgttgagtac 540 cactgcaatt cctgttcagt tgattgctcacggaagcgct atcattgtcg gacccaggca 600 gattttgacc tctgttgtga ttgctataatgaagggaaat ttgatccagg catggccaaa 660 accgatttca tcctcatgga ttctgcaggagtttcaggtg ctagtggtac tagttggaca 720 gatgaggaaa cattacttct attagaaggtttggaaattt ttggtggaaa atgggctgag 780 attgctgaac atgttgctac taagacaaaagcacaatgca tgttgcactt tcttcatatg 840 ctgattgatt accgcttcca tgatggcaaatatattaatc aaaacatccc agtaagtaca 900 gatcaagcca caactgagaa agccattgctgaaacatatg agaaaatgaa gttggagata 960 aagcagaggg aagaggtatt gtggatgaaaaggcctcaga gaaaaacaga gggaaactgt 1020 gaagaaacaa aaactgaaaa tgccagtgttgttgtaaata aagatactca gaattcagat 1080 ggcagagatt caggtgcatc tccaagcactgaagagccaa agcaatcttc tgatgagcaa 1140 cctgtagtaa aggaaaattc tgcagatgtagatacttctg gtgaaaaact atcaaatgtt 1200 gctattgata tcttaaaatc tgcatttgaggctactggtc acagcccaga atatgaaggt 1260 tcatttgcgg atgcaggaaa tccagttatggcactagcag cgtatttagc tggtcttgtg 1320 gaagatgata acaccaccac ttcattccgtagttcactaa aatctgtatc tgatgtgtct 1380 cctgcactcc aattatcaag taggcactgttttattcttg aggatccgcc agatgaactc 1440 aaagacattt gtgctagtgt aagtaagaaaaatagagatg gtgatcaaaa acaagatgag 1500 gatatgattc aaaattcaat tgataccgagaaaaaagaga tcaatgagaa agaaggtaag 1560 tctttatctg tggaaaagaa aaacaattcatccatgtcac aaaatgacca ccaagaatca 1620 ggcattaaga gcgtctcaag tgatgattgctccttagtgg agccaaaaac caataatgct 1680 aaggagtcag gtgattcaac tgctattggggacaagagtg caaccgaaac tacaaaaggt 1740 tcaataagtt ccatgaaaga ttcagtttcctgtaatactg aacaagtgaa tgacttgcca 1800 agtgttgagg tggaggctcc tgatgattcatcttcaaaag gtaaggatga gctcaataag 1860 actaaagatg cagtggcgac accagctaccgtacaggaac agaaacacag ccaaacattg 1920 ggaaatgggg atagggaaga acctaacaacattgaaagtg tagttgtcgg tgaagagaag 1980 ggctctgtag tgactgccaa ccgacctgattccatagcta ggctcaaaag agcagcagct 2040 actgctgttt cagcagctgc tgtgaaagctaggtttctcg gtgatcagga ggaatatcaa 2100 attcgaaggc tgacagcact tgtaatcgaaaagctgttcc aaaaaataga agtgaagatg 2160 tcattgtttt cagagattga gcaggtggtctttcgaacga gagagtacac cgagaagacc 2220 agaaagaagc tcctgaagga acgaaatgcgattattgcag ctcggatggg cgcattgccg 2280 tctaggccaa accagacagg tgtagccggaaacaggttac cacctgggta tggcaaccct 2340 cctgtaaggc ctccaaacgc aatgcctcggcccaccagct ga 2382)
<400> 1
<210> 2
<211> 2349
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial Sequence(atgttcgagg ccgtccgatc ccgtggcgctggcgtccatg tggtccctac ctttgctgga 60 tggttttcgt ggaaagaaat ccacccagttgagaagcaga ccttgccttc tttttttaat 120 ggaaaatctg agaagcggac acctgaggtatatttggcgg ttagaaattc gatcatgatg 180 aaatttcatg ccaatcctca attgcagctggagtccaaag acctggctga gttgtcaatc 240 ggggagaccg atgctcggca ggaaatcttggaattcttgg atcactgggg cttgataaat 300 ttccaccctt tcccaccaga tggacatgaggagagtaagc cagaggagac ccaagacaat 360 tctaatgacg agaaagcttc tttgatcgagcaactgttta agtttgaatc agttcaatca 420 tatatgacgc ctttaccaat gaaagaagatgtgagagctc cgcctcctct gcctagcttg 480 attcctgaat ctgtactcat tcaagatgtggttgcagcag ctgagccttc tgttgagtac 540 cactgcaatt cctgttcagt tgattgctcacggaagcgct atcattgtcg gacccaggca 600 gattttgacc tctgttgtga ttgctataatgaagggaaat ttgatccagg catggccaaa 660 accgatttca tcctcatgga ttctgcaggagtttcaggtg ctagtggtac tagttggaca 720 gatgaggaaa cattacttct attagaaggtttggaaattt ttggtggaaa atgggctgag 780 attgctgaac atgttgctac taagacaaaagcacaatgca tgttgcactt tcttcatatg 840 ctgattgatt accgcttcca tgatggcaaatatattaatc aaaacatccc agtaagtaca 900 gatcaagcca caactgagaa agccattgctgaaacatatg agaaaatgaa gttggagata 960 aagcagaggg aagaggtatt gtggatgaaaaggcctcaga gaaaaacaga gggaaactgt 1020 gaagaaacaa aaactgaaaa tgccagtgttgttgtaaata aagatactca gaattcagat 1080 ggcagagatt caggtgcatc tccaagcactgaagagccaa agcaatcttc tgatgagcaa 1140 cctgtagtaa aggaaaattc tgcagatgtagatacttctg gtgaaaaact atcaaatgtt 1200 gctattgata tcttaaaatc tgcatttgaggctactggtc acagcccaga atatgaaggt 1260 tcatttgcgg atgcaggaaa tccagttatggcactagcag cgtatttagc tggtcttgtg 1320 gaagatgata acaccaccac ttcattccgtagttcactaa aatctgtatc tgatgtgtct 1380 cctgcactcc aattatcaag taggcactgttttattcttg aggatccgcc agatgaactc 1440 aaagacattt gtgctagtgt aagtaagaaaaatagagatg gtgatcaaaa acaagatgag 1500 gatatgattc aaaattcaat tgataccgagaaaaaagaga tcaatgagaa agaaggtaag 1560 tctttatctg tggaaaagaa aaacaattcatccatgtcac aaaatgacca ccaagaatca 1620 ggcattaaga gcgtctcaag tgatgattgctccttagtgg agccaaaaac caataatgct 1680 aaggagtcag gtgattcaac tgctattggggacaagagtg caaccgaaac tacaaaaggt 1740 aatactgaac aagtgaatga cttgccaagtgttgaggtgg aggctcctga tgattcatct 1800 tcaaaaggta aggatgagct caataagactaaagatgcag tggcgacacc agctaccgta 1860 caggaacaga aacacagcca aacattgggaaatggggata gggaagaacc taacaacatt 1920 gaaagtgtag ttgtcggtga agagaagggctctgtagtga ctgccaaccg acctgattcc 1980 atagctaggc tcaaaagagc agcagctactgctgtttcag cagctgctgt gaaagctagg 2040 tttctcggtg atcaggagga atatcaaattcgaaggctga cagcacttgt aatcgaaaag 2100 ctgttccaaa aaatagaagt gaagatgtcattgttttcag agattgagca ggtggtcttt 2160 cgaacgagag agtacaccga gaagaccagaaagaagctcc tgaaggaacg aaatgcgatt 2220 attgcagctc ggatgggcgc attgccgtctaggccaaacc agacaggtgt agccggaaac 2280 aggttaccac ctgggtatgg caaccctcctgtaaggcctc caaacgcaat gcctcggccc 2340 accagctga 2349)
<400> 2
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<400> 3
<210> 4
<211> 1992
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial Sequence(ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccctctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60 agttataaaa aattaccaca tattttttttgtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120 tctttataca tatatttaaa ctttactctacgaataatat aatctatagt actacaataa 180 tatcagtgtt ttagagaatc atataaatgaacagttagac atggtctaaa ggacaattga 240 gtattttgac aacaggactc tacagttttatctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300 ttttgcaaat agcttcacct atataatacttcatccattt tattagtaca tccatttagg 360 gtttagggtt aatggttttt atagactaatttttttagta catctatttt attctatttt 420 agcctctaaa ttaagaaaac taaaactctattttagtttt tttatttaat aatttagata 480 taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaattaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540 aactaaggaa acatttttct tgtttcgagtagataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600 cgagtctaac ggacaccaac cagcgaaccagcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660 cggcacggca tctctgtcgc tgcctctggacccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720 acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattgcgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780 ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggcacggcagctac gggggattcc tttcccaccg 840 ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgtaataaataga caccccctcc acaccctctt 900 tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcacacacacacaac cagatctccc ccaaatccac 960 ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccgctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct 1020 tctctagatc ggcgttccgg tccatggttagggcccggta gttctacttc tgttcatgtt 1080 tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccgtgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc 1140 tgtacgtcag acacgttctg attgctaacttgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg 1200 atggctctag ccgttccgca gacgggatcgatttcatgat tttttttgtt tcgttgcata 1260 gggtttggtt tgcccttttc ctttatttcaatatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca 1320 tcttttcatg cttttttttg tcttggttgtgatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct 1380 agatcggagt agaattctgt ttcaaactacctggtggatt tattaatttt ggatctgtat 1440 gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaattgaagatga tggatggaaa tatcgatcta 1500 ggataggtat acatgttgat gcgggttttactgatgcata tacagagatg ctttttgttc 1560 gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttgggcggtcgttca ttcgttctag atcggagtag 1620 aatactgttt caaactacct ggtgtatttattaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata 1680 catcttcata gttacgagtt taagatggatggaaatatcg atctaggata ggtatacatg 1740 ttgatgtggg ttttactgat gcatatacatgatggcatat gcagcatcta ttcatatgct 1800 ctaaccttga gtacctatct attataataaacaagtatgt tttataatta ttttgatctt 1860 gatatacttg gatgatggca tatgcagcagctatatgtgg atttttttag ccctgccttc 1920 atacgctatt tatttgcttg gtactgtttcttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg 1980 ttacttctgc ag 1992)
<400> 4
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial Sequence(GCACCATCGT CAACCACTAC ATC 23)
<400> 5
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial Sequence(AGCTGCCAGA AACCCACGT 19)
<400> 6
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial Sequence(GGCACGCAAC GCCTACGACT 20)
<400> 7
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial Sequence(AGCCCGATGA CAGCGACCAC 20)
<400> 8
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial Sequence(CCTGAAGATC ACCCTGTGCT 20)
<400> 9
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial Sequence(GCAGTCTCCA GCTCCTGTTC 20)
<400> 10
Claims (3)
1.一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，基于花粉介导技术将ZmSWI3D基因的编码区转入到玉米基因组中，然后利用Ubi启动子组成型表达ZmSWI3D基因，从而提高玉米植株的抗旱性。
2.如权利要求1所述的一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、总RNA的提取：
S11、取3叶1心期玉米叶片剪碎液氮研磨成粉，转入1.5 ml离心管内，加入1ml Trizol，充分混匀，室温放置5-10 min后，加入RNAiso Plus的1/5体积量的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15 s，待溶液充分乳化，无分相现象后，再室温静置5 min，12000g 4℃离心15min；
S12、从离心机中取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中，切忌吸出白色中间层；
S13、向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10 min，12000 g 4℃离心10 min，弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入1 ml 75％的乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4℃离心5 min后，弃去乙醇；
S14、室温干燥沉淀2～5 min，使酒精完全挥发后，用10-15μl DEPC-H2O溶解 RNA；
S2、反转录操作：
S21、用DNaseI处理 RNA，10μl反应体系包含:
DNaseI 1μl；
DNaseI buffer 1μl；
RNA 10μg；
DEPC-H2O up to 10μl；
混匀后瞬时离心，室温放置15min后，加入1μl 25mM的EDTA，65℃处理10min，使DNaseI失活；
S22、在冰上于PCR管中加入以下试剂：
0.5μg/μl 的oligo dTnV 1μl；
10mM/each 的dNTPs 1μl；
去除DNA的RNA 5μg；
DEPC-H2Oupto 12μl；
轻轻混匀后，65℃处理5min后，迅速转移到冰上冷却2min；
S23、在上述体系中加入：
5×RT buffer 4μl
0.1M DTT 2μl
RNase Inhibitor 1μl
37℃预热2min，加入M-MLV RTase 1μl， 37℃温浴50min，70℃处理15min，使酶失活后，反应产物加入40μl 1×TE稀释，充分混匀，保存于-30℃备用；
S3、以反转录产物为模板，通过PCR方法扩增获得玉米ZmSWI3D基因，ZmSWI3D基因扩增所使用正向克隆引物：5' ATGTTCGAGGCCGTCCG 3'、反向克隆引物：5' TCAGCTGGTGGGCCGAGG3'；所述克隆的ZmSWI3D基因CDS序列全长为2349 bp，编码782个氨基酸组成的蛋白，编码的蛋白带有SWIRM和SANT保守结构域，以及一个zinc-binding结构域；
S4、玉米染色质重塑蛋白基因ZmSWI3D的过表达载体构建
将序列表SEQ ID NO：4所示的玉米泛素基因启动子通过SacI和BamHI酶切位点插入pCAMBIA3301中，得到改造遗传转化载体p3301-Ubi；对得到的改造遗传转化载体p3301-Ubi用限制性内切酶SalI和NheI进行酶切，去掉CaMV 35S启动子和GUS基因；将上述克隆所得的玉米ZmSWI3D基因用SalI和NheI消化并回收包含完成ZmSWI3D阅读框的DNA片段，在把该片段连入上一步的酶切后p3301-Ubi载体，得到ZmSWI3D基因的过表达载体p3301-Ubi-ZmSWI3D；
S5、利用超声波进行花粉介导的转基因操作，具体步骤如下：
1）H99田间管理：将受体玉米自交系H99播于试验田，在抽丝期对雌穗进行严格的套袋隔离，转化的前1 d对雄穗进行严格的套袋隔离；
2）花粉处理：选择晴朗的天气收集新鲜的花粉，转化前收集盛花期的花粉以保证活力和花粉量；
3）蔗糖溶液配制：当天配制好15 %的蔗糖溶液，将蔗糖溶液置于4 ℃的冰盒中冷却，并保持通入新鲜空气；
4）超声波处理：称取2 g的玉米花粉倒入100 ml的烧杯内，加入80 ml的预冷蔗糖溶液，立即搅拌成悬浮液；将悬浮液经超声波细胞破碎仪处理后，加入含ZmSWI3D基因的载体质粒DNA，再次进行超声波处理，使外源基因ZmSWI3D进入花粉粒，超声波处理完毕后，将烧杯置于4 ℃冰盒中，自然沉降180-300 s，弃上清液，将沉淀花粉粒和5 mL剩余溶液转移到培养皿中；
5）田间授粉：选取严格套袋隔离的雌穗，将花粉和剩余溶液涂抹于套袋隔离的花丝上，涂抹花粉完成后套袋并做好标记，授粉当代收获T0种子；
6)空载体玉米获得：将空载体pB7RWG采用步骤1）-5）所述的方法转入野生型玉米自交系H99中。
3.如权利要求2所述的一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，所述的超声波处理的参数如下：超声波声强150 W，处理时间为6 s，重复工作5次，间隔时间为5 s。
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| CN202210165438.XA CN114480477A (zh) | 2022-02-23 | 2022-02-23 | 一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114621973A (zh) * | 2022-05-17 | 2022-06-14 | 北京市农林科学院 | 一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1250100A (zh) * | 1999-10-19 | 2000-04-12 | 山西省农业生物技术研究中心 | 超声波处理花粉介导植物基因转化方法 |
| CN102127567A (zh) * | 2011-02-18 | 2011-07-20 | 山西省农业科学院生物技术研究中心 | 超声波辅助花粉介导植物转基因方法 |
| CN107937412A (zh) * | 2017-11-06 | 2018-04-20 | 吉林农业大学 | 一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法 |
-
2022
- 2022-02-23 CN CN202210165438.XA patent/CN114480477A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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| WO2023221402A1 (zh) * | 2022-05-17 | 2023-11-23 | 北京市农林科学院 | 一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒 |
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