CN1250100A - 超声波处理花粉介导植物基因转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种利用超声波处理的花粉介导植物基因转化方法。具体是将盛花期的新鲜花粉与质粒DNA混合,并附加超声波处理,然后辅以人工授粉的方法将外源基因导入到受体中。转化结果经DNA斑点杂交和PCR扩增检测得以证实。本发明转化方法简便、易操作,具有很强的实用性。

Description

超声波处理花粉介导植物基因转化方法

本发明涉及一种植物基因转化的方法，属于生物工程技术领域。

随着人口增长、环境污染、土地贫瘠造成的可耕地面积不断缩小及原材料的逐渐减少，人类对作物品质改良的要求也越来越紧迫。过去传统的杂交育种方式，主要从降低株高、缩短生长发育时间和利用杂种优势大幅度地提高产量。但是在现阶段，改良作物品质已经不能单纯依靠传统的杂交育种手段，以分子生物学为基础的生物技术近几年来进展迅速，成为农业、食品、化学材料、医药、环境等研究领域的重要发展动力。

自1983年第一例转基因植物问世以来，虽然只有16年的时间，但植物基因工程的发展却日新月异，硕果累累。植物基因工程使作物育种从杂交育种走向了基因育种，极大地拓宽了作物育种的深度和广度。人们已能够跨越物种间的界限，定向地改造作物性状，从而使作物育种的进度大大加快。迄今为止，利用植物转基因技术已在培育抗病、抗虫作物品种、改良作物品质、提高作物产量和抗逆性等方面取得了显著进展，已有一批转基因植物投入生产。

在农作物基因转化研究中，植物基因转化方法对遗传转化是至关重要的，它决定了如何高效地将外源基因导入植物细胞，并再生出转基因植株。农杆菌质粒载体介导转化方法是目前研究最多、理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化方法。但是该方法存在着宿主范围小、菌株特异性强等问题，其最大的缺点是仅适用于大多数的双子叶植物，对于单子叶植物，特别是禾本科植物不敏感，从而限制了它的适用范围。然而，由于主要的禾谷类粮食作物都属于单子叶植物，因此，单子叶植物的基因转化研究更具有重大的意义。

原生质体转化法，包括PEG介导法、电击法、微针注射法等的最大优点是无宿主范围，适用于各种作物，特别是能应用于单子叶植物。其另一个重要特点是通过原生质体转化获得的再生植物无嵌合体发生，有利于生产实践的应用。而且能够一次处理很多原生质体，是瞬间表达研究的较好系统。但是目前对于大多数的植物而言，原生质体培养仍然比较困难，再生频率低，重复性差，不易获得转化植株，特别是单子叶植物原生质体的培养更困难，因此，这种转化方法比以组织或器官为受体的转化方法要复杂得多，困难得多。

基因枪法是近年来迅速发展起来的转化方法，它克服了以原生质体为受体细胞的缺点，可适用于任何植物和材料。但是应该看到，这种转化方法设备复杂昂贵，耗资大，转化率低，不易得到稳定转化，而且该方法也是以组织培养为基础，实验周期较长。该项技术目前还不成熟，外源DNA整合的机理尚不清楚，整合的外源DNA结构变化复杂，拷贝数较多，遗传性较差等问题，尚需进一步的完善和深入研究。而且这种方法的关键取决于受体外植体的选择，所选择的轰击受体，一定要具有强的器官分化潜能。

许宁等进行了超声波诱导动植物细胞外源基因导入的实验，并且在WO专利91/00358研究的基础上，给出了一种超声波诱导植物组织基因转移的方法CN1180746A。该方法是将植物组织块经预处理后放入盛着适合于植物组织培养且含外源DNA的缓冲液的容器中，再将超声波探头置于容器壁上或直接伸入溶液中，开启超声波，在脉冲型超声波的作用下，将外源基因导入植物组织块中。这种基因导入的方法既适合双子叶植物，也适合于单子叶植物，特别是禾谷类作物的基因转化，具有设备便宜，转化效率高的优点。但是，该方法仍需要用组织培养的方法诱导产生愈伤组织，依然摆脱不了进行植物组织的离体培养这一复杂的操作过程。

德国专利DE 3724154公开了一种将基因转入植物的方法，该专利在否定了成熟的花粉粒能够作为外源基因导入的载体的前提下，提出了一种利用未成熟的花粉粒作为靶细胞的新的植物基因转移方法。该方法是：在营养溶液中从花药分离未成熟的花粉粒，并移除它们所附着的组织，在一种营养溶液中培养这些分离的未成熟的花粉粒，在体外培养和成熟过程中转移外源遗传物质至花粉粒，在体外使转化的花粉粒完全成熟，最后，用转化的花粉粒向受体植物传粉，并从受体植物得到种子。该方法由于细胞培养期大大缩短，与其他方法比较，步骤大大简化，特别是省去了伴有较麻烦的体细胞克隆变异现象的再生阶段。而且该方法采用来成熟的花粉粒，避免了花粉粒立即产生花粉管，使基因不能转化的缺点，延长了外源基因进入花粉粒的时间，使转化率得以提高。但是，该转化方法的实质只是利用花粉粒作为一种基因导入的中间体，外源基因的导入仍需使用诸如农杆菌共培养、电激法、微针注射法等转化方法进行，实验操作仍然复杂。

Van der Leede-plegt等和董云洲等曾用基因枪直接轰击花粉获得了转基因植株。但是基因枪直接轰击花粉时，花粉容易溅起，而很不易操作。而且由于未遭受基因枪轰击的花粉粒较基因枪轰击过的转化花粉在授粉时具有较强的竞争力，而容易受精，使得转化效率降低。

本发明的目的是提供一种新的植物基因转化方法，即利用超声波诱导，采用花粉介导，促使外源DNA导入到植物细胞中，进行植物基因转化的方法。

本发明的具体方案是：在植物盛花期，取当天开花的新鲜花粉，置于由5-15％蔗糖溶液组成的介质溶液中，与外源质粒DNA相混合，并辅以超声波处理，然后将处理过的花粉授于植物柱头上，套袋挂牌标记，并最终从受体上收获种子，在后代中筛选转化植株。

超声波处理的方法是：采用声强为200-300W的超声波处理溶液，每次处理5秒，间隔10秒，共处理5-8次。

由于花粉粒在溶液中极易吸胀破裂而失去生活能力，因此，不能直接将质粒DNA溶液与花粉混合，必须选择含一定溶质的溶液作为介质，使质粒DNA吸附于花粉粒上或进入到花粉粒中，并维持花粉粒正常的膨压。一定浓度的蔗糖溶液能够维持花粉粒内外的渗透压，防止花粉粒吸水膨胀而丧失生活力，而且能促进花粉粒萌发。然而随着溶液中蔗糖浓度的提高，花粉粒的受损率也会增加，因此，我们选择5％-15％的蔗糖溶液作为花粉介导转化的介质溶液。

为达到一定的基因转化效率，外源质粒DNA的浓度应不低于40ug/L。

研究发现，超声波的空化效应是造成外源基因进入细胞的重要机制。所谓空化效应，就是液体中存在的一些小气泡在超声波作用下表现出的空泡湮灭过程。空化效应发生时，在空化中心会产生局部的高温高压，甚至产生电离效应及放电，导致空泡周围的细胞壁产生局部的穿孔以及质膜产生破损或局部和暂时的结构改变。从而使溶液中的DNA分子籍此扩散进入细胞。超声波所特有的这种空化作用以及穿透力大，在液体和固体中传播时衰减小，界面反射使物质受超声波作用面积较大等特点，极可能是造成高效、瞬间表达和稳定转化的重要原因。这些特点使得超声波基因转化具有操作简单、设备便宜、不受宿主范围限制、转化率高等优势。因此，我们利用超声波的这种瞬间释放出的高能和空化作用，促使外源质粒DNA进入到花粉的细胞核中。但是我们发现，在花粉粒的表面有一些核酸酶，如果将花粉粒与外源DNA直接混合，花粉粒表面的核酸酶会在几分钟内将外源DNA降解掉而不能实现外源DNA的遗传转化。

进而我们又发现超声波处理不仅能够促进外源质粒DNA进入到花粉的细胞核内，而且超声波的高能作用还可以将花粉表面的核酸酶破坏掉，以防止核酸酶在介质溶液中降解外源DNA。有效地保护外源DNA进入植物细胞，实现外源基因转化。

本发明利用超声波的高能和空化作用，将外源质粒DNA成功地通过花粉导入到植物细胞中，成为一种利用花粉作为载体的新的外源基因导入方法。

利用花粉作为载体介导外源基因转化，既避免了传统的农杆菌共培养法所要求的组织培养技术，以及长期组织培养所带来的再生困难，幼苗早期夭亡、后代育性不正常、易产生变异等一系列问题，又避免了转化体细胞所带来的易形成嵌合体的问题，同时也避免了基因枪法转化所带来的耗资大、组织培养复杂、转化率低以及原生质体转化法原生质体分离困难等问题。因此，本发明的基因转化方法简便、有效、实用性强，所用仪器设备简单、易操作、耗资少，具有较好的应用前景。

我们采用本发明的基因转化方法，首先在玉米上进行遗传转化获得了成功。

玉米是重要的粮食作物，其遗传转化在国内外都非常重视。目前已用超声波法、基因枪法、农杆菌介导法、电激法等方法获得了转基因植株。但是这些方法都需要用愈伤组织甚至是原生质体作为受体进行基因转移，玉米从愈伤组织到分化出再生植株，常出现变异，而且转化植株在从试管移到田间(温室)的过程中也易受损失，如植株夭亡和产生不育株等，使这些方法的应用受到了很大限制。本发明提出的由花粉介导的、经超声波处理的转基因方法，给玉米的遗传转化提供了一种简便、有效的基因转化新技术。

下面是本发明应用于玉米基因转化的具体应用实例。

供体质粒DNA的制备

以质粒pGLII-RC-1为基因供体材料。该质粒携带有几丁质酶(chitinase)基因和潮霉素的抗性(hph)基因，其中hph基因为选择标记基因，它赋予植物以对潮霉素的抗性。几丁质酶基因片段大小为1.1kb。其物理图谱如图1所示。质粒DNA的制备采用裂解法。

受体材料

太9101，E28，太早9505，5003，太早921，黄早4，海921，422，综31，太411，自330等玉米(Zea may L.)自交系。

转化方法

供试玉米自交系在5月上旬播种，7月上、中旬抽穗、开花。抽丝前套袋隔离。在盛花期选取当天开花的玉米花粉，于5％蔗糖溶液中与质粒DNA混合，并采用宁波新芝科器研究所的JY92-II型超声波细胞粉碎仪；以300W声强的超声波处理溶液8次，每次处理时间5秒，间隔10秒。之后将处理过的花粉授于剪短的玉米花丝上，并套袋挂牌标记。

转化结果

按上述转化方法，对供试材料进行了遗传转化处理。共处理155穗，结实21穗，每穗结实粒数1-20粒不等，共收获种子56粒，见表1。

表1转化处理及结实情况

品  种	转化处理穗数	结实穗数	结实粒数
				太9101E28太早95055003太早921黄早4海921422综31太411自330	2017916118171617159	32111124321	222215336921
合计	155	21	56

转化处理后的种子第二年春天播种，出苗54株(T₁代)。在植株长到五、六片叶时取幼嫩叶片，提取总DNA，进行分子检测以确定转化率。DNA斑点杂交

转化处理后第一代植株，采用Pich和Schubert的方法，提取单株叶片的总DNA，用地高辛标记几丁质酶基因，用BamHI和HindIII双酶切pGLII-RC-1质粒，并回收1.1kb的几丁质酶基因片段，采用德国宝灵曼公司的Dig DNA Labeling and Detection Kit进行几丁质酶基因的探针标记和斑点杂交。用10ug的总DNA点于尼龙膜上，80℃烘烤2小时，68℃杂交。对28个转化单株总DNA以及未转化的对照株进行DNA斑点杂交，结果有14株呈阳性，未转化的对照株均为阴性。DNA斑点杂交结果见表2。

表2 DNA斑点杂交结果

品    种	总株数	检测株数	阳性粒数
				E28太早9505太早921综31海921422太9101自330太411黄早45003	225736221231	114622111100	102311600--
合  计	54	29	14

图2是其中13个转化单株和未转化的对照株进行DNA斑点杂交的结果。其中1A为太9101未转化株；2A-3C分别为太9101不同的转化单株，其中阳性斑点分别是太9101-11、太9101-18、太9101-3；4C-2D为综31不同的转化单株，分别是综31-2、综31-4、综31-1；3D为综31未转化单株；4D为阳性对照(质粒)。

PCR扩增结果

根据几丁质酶基因的核苷酸序列，分别取5′端和3′端20bp的核苷酸对设计引物，进行PCR扩增。引物合成由上海生工生物工程公司完成。两引物间的基因片段大小为923bp。PCR扩增用大连宝生物公司的TaKaRa Taq^TM试剂盒和PTC-200型PCR仪完成。对DNA斑点杂交呈阳性的太9101-3、太9101-11、太9101-18、综31-4、综31-2、综31-1等单株，用100-150ng总DNA进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃：5分钟，94℃：30秒，50℃：30秒，72℃：1分30秒，扩增30个循环，然后72℃延伸10分钟。PCR的检测结果均为阳性，而未转化对照单株为阴性，说明几丁质酶基因确实已导入到玉米植株中。PCR扩增试验结果见图3。

图3为PCR扩增产物的电泳分析(1.5％琼脂糖凝胶)图，其中1为分子量标记；2为综31未转基因株；3、4、5分别为综31转基因株综31-2、综31-4、综31-1；6为太9101未转基因株；7、8、9分别为太9101转基因株太9101-11、太9101-18、太9101-3；10为阳性对照(质粒)。

利用本发明方法对玉米11个自交系进行遗传转化，根据DNA斑点杂交试验和PCR扩增试验结果证明，外源基因的确已导入到受体植物上，而且转化率达到了48.28‰。

Claims (1)

1、一种超声波处理花粉介导植物基因转化方法，其特征在于该方法是取盛花期的植物新鲜花粉，于介质溶液中与外源DNA混合，并对此溶液进行超声波处理，将处理后的花粉授于植物柱头上，并从受体上收获种子，在后代中筛选转化植株。

Images