CN107034230A - 一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法 - Google Patents

一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了植物转基因技术领域的一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法，该超声波辅助花粉介导植物转基因方法的具体步骤如下：S1：选择基础材料；S2：缓冲液中加入花粉；S3：提取质粒DNA；S4：在缓冲液中加入提取的质粒DNA；S5：收获代种子；S6：大田播种并筛选；S7：二次筛选、S8：扫面检测。本发明不需要费时费力的组织培养过程，转化方法简便易操作，且能够直接得到转化的种子，转化率较高，理论上适用于任何开花植物，是一种经济、高效、实用的基因转化技术，对于一些再生体系建立不完全的植物，具有尤其重要的意义。

Description

一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法
技术领域
本发明涉及植物转基因技术领域，具体为一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法。
背景技术
转基因技术能够使优良基因跨物种交流，从而实现对农作物的品质和产量等性状进行定向、精确的改良。转基因作物在产量、抗逆性和营养品质等方面较传统作物有显著改进，还能大大降低生产成本，减少农作物生产中的环境污染。但目前大面积应用到农业中的转基因作物只有玉米、油菜、大豆、棉花、和番茄等少数几种作物，对绝大多数植物而言，转基因技术只停留在实验室阶段。目前植物转基因研究主要采用的方法都需要经过繁复的植物组培过程，需要花费大量的人力、物力、财力和时间。一些植物种或品种的组织培养再生困难而使得这两种方法具有很大的基因依赖性，因而受到很大的局限性。同时由于植物组织培养过程中易造成细胞变异、再生苗移栽过程夭亡等，使得本已不高的转化率又大打折扣，这些缺陷都大大限制了植物转基因技术的广泛应用。为此，我们提出了一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法投入使用，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法，该超声波辅助花粉介导植物转基因方法的具体步骤如下：
S1：选用具有增产潜力的芝麻品种作为基础材料，早晨7-8点采集当天开放的芝麻花朵，然后用镊子取下雄蕊，置于洁净的纸上，轻压后收集花粉，将收集的新鲜花粉于冰箱4℃保存备用；
S2：用滴管在凹玻片上的凹穴内滴加配好的缓冲液，用棉棒挑少许花粉均匀撒于缓冲液上，让其自然散开悬浮于缓冲液表面，撒好后将玻片放入铺有湿滤纸的培养皿中加盖并将其置于30℃的人工气候箱中培养，6小时后，在光学显微镜下观察、记录花粉萌发及破碎情况；
S3：供试菌种LBA4404农杆菌保存于15％的甘油中，使用前提前两天用接种环挑取少许农杆菌菌种划线接种于附加有50mg/L卡那霉素(Km)的YP固体培养基上培养活化；从培养平板上挑取农杆菌菌落接种到YP和50mg/L卡那霉素(Km)的液体培养基中,并于28℃、210r/min下振荡培养至对数期，然后用碱裂解法提取质粒DNA；
S4：将步骤S3中的质粒DNA混入步骤S2中的缓冲液中，进行超声波处理，理后的花粉悬浮液分装于0.2mL的Eppendorf管中，每一株选取主茎上的1-2个在当天即将开放的花蕾，将其花冠取下，人工去雄，将柱头充分浸入处理后的花粉悬浮液中授粉，然后再将花冠戴上；
S5：然后摘除附近的其它花蕾和分枝，并挂牌标注授粉时间和花蕾数，授粉全部结束之后打顶，并每周一次去除分枝和其它未经转化处理的花蕾和果实，直至秋季检查授粉结实情况，统计、收获代种子；
S6：将收获的代种子随大田试验播种，得到代植株，待代植株代苗龄达3、4片真叶时，用浓度为100mg/mL的卡那霉素第一次涂抹芝麻叶片(顶部的2片叶)进行筛选，将叶片上出现明显的大面积虫斑和死亡的植株去除；
S7：待苗龄到8、9片真叶时，用浓度为120mg/mL的卡那霉素进行第二次田间筛选，将叶片上不出现虫斑和仅出现不明显小面积零星虫斑的植株拴牌标记，并采集新鲜叶片保存于-70℃下，以备提取基因组DNA；
S8：对提取的基因组DNA做转化植株的分子鉴定、PCR特异性扩增、斑点杂交和Southern blot检测，并进行扫描照相、保存。
优选的，所述不步骤S2中，在将少许花粉撒于缓冲液上时不必搅拌，以防花粉混于液体中因缺氧而影响萌发。
优选的，所述步骤S2中，缓冲液为蔗糖溶液、硼酸溶液和氯化钙溶液的混合液。
优选的，所述步骤S3中，YP固体培养基中每升培养基含5g酵母提取物、10g蛋白胨、5g氯化纳和15g琼脂，调pH至6.8高压灭菌。
优选的，所述步骤S5中，人工授粉时间为上午的10:00-12:00。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明不需要费时费力的组织培养过程，转化方法简便易操作，且能够直接得到转化的种子，转化率较高，理论上适用于任何开花植物，是一种经济、高效、实用的基因转化技术，对于一些再生体系建立不完全的植物，具有尤其重要的意义。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法，该超声波辅助花粉介导植物转基因方法的具体步骤如下：
S1：选用具有增产潜力的芝麻品种作为基础材料，早晨7-8点采集当天开放的芝麻花朵，然后用镊子取下雄蕊，置于洁净的纸上，轻压后收集花粉，将收集的新鲜花粉于冰箱4℃保存备用；
S2：用滴管在凹玻片上的凹穴内滴加配好的缓冲液，用棉棒挑少许花粉均匀撒于缓冲液上，让其自然散开悬浮于缓冲液表面，撒好后将玻片放入铺有湿滤纸的培养皿中加盖并将其置于30℃的人工气候箱中培养，6小时后，在光学显微镜下观察、记录花粉萌发及破碎情况，在将少许花粉撒于缓冲液上时不必搅拌，以防花粉混于液体中因缺氧而影响萌发，缓冲液为蔗糖溶液、硼酸溶液和氯化钙溶液的混合液；
S3：供试菌种LBA4404农杆菌保存于15％的甘油中，使用前提前两天用接种环挑取少许农杆菌菌种划线接种于附加有50mg/L卡那霉素(Km)的YP固体培养基上培养活化；从培养平板上挑取农杆菌菌落接种到YP和50mg/L卡那霉素(Km)的液体培养基中,并于28℃、210r/min下振荡培养至对数期，然后用碱裂解法提取质粒DNA，YP固体培养基中每升培养基含5g酵母提取物、10g蛋白胨、5g氯化纳和15g琼脂，调pH至6.8高压灭菌；
S4：将步骤S3中的质粒DNA混入步骤S2中的缓冲液中，进行超声波处理，理后的花粉悬浮液分装于0.2mL的Eppendorf管中，每一株选取主茎上的1-2个在当天即将开放的花蕾，将其花冠取下，人工去雄，将柱头充分浸入处理后的花粉悬浮液中授粉，然后再将花冠戴上；
S5：然后摘除附近的其它花蕾和分枝，并挂牌标注授粉时间和花蕾数，授粉全部结束之后打顶，并每周一次去除分枝和其它未经转化处理的花蕾和果实，直至秋季检查授粉结实情况，统计、收获代种子，人工授粉时间为上午的10:00-12:00；
S6：将收获的代种子随大田试验播种，得到代植株，待代植株代苗龄达3、4片真叶时，用浓度为100mg/mL的卡那霉素第一次涂抹芝麻叶片(顶部的2片叶)进行筛选，将叶片上出现明显的大面积虫斑和死亡的植株去除；
S7：待苗龄到8、9片真叶时，用浓度为120mg/mL的卡那霉素进行第二次田间筛选，将叶片上不出现虫斑和仅出现不明显小面积零星虫斑的植株拴牌标记，并采集新鲜叶片保存于-70℃下，以备提取基因组DNA；
S8：对提取的基因组DNA做转化植株的分子鉴定、PCR特异性扩增、斑点杂交和Southern blot检测，并进行扫描照相、保存。
表1 不同蔗糖浓度对花粉萌发的影响
请参阅表1，在最适缓冲液的选择过程中，直接将花粉与质粒DNA溶液混合，花粉在溶液中极易吸胀破裂，失去生活力，因此必须选择含有适当溶质的溶液，以维持花粉粒正常的膨压。一般认为蔗糖既能维持花粉内外环境的渗透压又能为花粉的萌发提供营养，因此选择蔗糖为花粉萌发缓冲液的基本成分。在芝麻初花期采集当天的花粉，分别悬浮于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％和50％的蔗糖溶液中(PH7.0)，静置6小时之后镜检、并做统计分析。缓冲液中不同的蔗糖浓度与芝麻花粉的萌发率有着直接的关系，起初随着蔗糖浓度的升高，花粉的萌发率也在升高,并在蔗糖浓度为35％时萌发率达到最高，此时萌发率在29％左右；之后随着蔗糖浓度的继续加大，花粉的萌发率却开始下降，在蔗糖浓度为50％时，花粉萌发率已不足10％，可见培养基中蔗糖浓度过高或过低都不利于芝麻花粉的离体萌发。因此，选择35％的蔗糖溶液作为用花粉介导芝麻转化缓冲液的基本成分。
表2 不同硼酸浓度对花粉萌发的影响
请参阅表2，将新鲜花粉悬浮于由35％的蔗糖和不同浓度的硼酸组成的缓冲液中，培养、镜检、并做统计分析。硼酸的浓度对芝麻花粉的萌发率有较明显的影响，在蔗糖浓度为35％时，培养基中加入20mg/L-40mg/L的硼酸时，随着硼酸浓度的增加，花粉萌发率显著提高，且观察发现花粉管长度也有比较明显的伸长，在花粉萌发的过程中花粉管还有分叉现象。当硼酸浓度达到40mg/L时，花粉萌发率达到最高，可达43.826％，随后继续加大硼酸浓度，则抑制花粉的萌发。由此可以看出,在离体条件下，在缓冲液里添加适宜浓度的硼酸可以有效改善花粉的萌发。
表3 不同氯化钙浓度对花粉萌发的影响
请参阅表3，将新鲜花粉悬浮于由35％的蔗糖、40mg/L的硼酸和不同浓度的氯化钙组成的缓冲液中，培养、镜检，并做统计分析。从表3和表4可以看出，在没有添加外源Ca2+的缓冲液中，芝麻花粉也能萌发，可见，外源Ca2+对芝麻花粉的萌发并不是必需的，但培养基中加入适量的Ca2+能够促进花粉萌发，在一定程度上提高花粉的萌发率。试验结果表明(表5)，当蔗糖浓度为35％，硼酸浓度为40mg/L时，100mg/L-200mg/L的低浓度的氯化钙可以促进花粉的萌发，氯化钙浓度为200mg/L时，花粉萌发率达到最高，继续加大浓度，则抑制花粉的萌发。综合上述三个实验，确定芝麻花粉介导芝麻转化的最适缓冲液由35％的蔗糖，40mg/L的硼酸，200mg/L的氯化钙组成。
本发明中在对芝麻基因组DNA的提取时，采用改良的CTAB法提取，其中CTAB提取液为1M/L Tris-HCI，0.5M/L Na2EDTA，2％PVP，2％(V/V)β-巯基乙醇，提取的DNA自然干燥后溶解于TE中，1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，于－20℃保存备用；
在对芝麻基因组DNA进行PCR特异性扩增时，使用pBI101-Chi-Bmk质粒特异性扩增引物对提取的芝麻总DNA进行PCR扩增，扩增过程中设立严格的阴性和阳性对照(非转基因植株为阴性对照，质粒DNA为阳性对照)，根据目的基因序列设计合成两对特异引物，Chi基因引物:5′-ATG CGA GCG ACA CTG GCG-3′和5′-TAG GGT TGT TGA CAT TCG CG-3′，两引物间的片段大小约为1800bp，扩增反应程序为94℃，5min；94℃，30s；62℃，45s；72℃，2min；30个循环。Bmk基因引物:5′-ATG AAA TTT TTC CTT ATA-3′和5′-TTA ACC AAT TAT TTG GAC-3′，两引物间的片段大小约为280bp。扩增反应程序为94℃，5min；94℃，30s；47℃，30s；72℃，45s；30个循环，取制备的总DNA稀释到50ng左右作为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为20μL，其中模板DNA(50ng/μL)2μL，PrimerⅠ(10μM)0.8μL，PrimerⅡ(10μM)0.8μL，10×PCRbuffer(含Mg2+)2μL，dNTP(10μM)0.4μL，Taq DNA聚合酶0.4μL，ddH2O 13.6μL，上覆3μL石蜡油。反应完成后,加2μL 5×上样缓冲液，采用1％的琼脂糖凝胶电泳，胶中加入0.5μL/mLEB。电泳结束后，凝胶成像分析系统检测、扫描照像、保存；
在斑点杂交检测过程中，待检样品为随机取样的PCR阳性植株基因组DNA(约10μg)、阴性对照(非转基因植株基因组DNA约10μg)和质粒DNA(约5μg)。将待检样品高温变性直接点样到尼龙膜上，紫外固定4min，然后再将膜夹在两层滤纸之间，80℃固定30min，然后预杂交2h，杂交过夜，几丁质酶基因探针和抗体的制备按试剂盒说明书进行，杂交后用CSPD(Roche)荧光染色观察并用X-光片自显影曝光；
在Southern blot检测过程中，待检样品为随机取样的PCR阳性植株基因组DNA总DNA(15μg)、阴性对照(非转基因植株基因组DNA约15μg)和质粒DNA(约10μg)，分别用HindⅢ和SalⅠ在37℃水浴中酶切过夜，酶切产物于0.8％琼脂糖凝胶上以4v/cm的低电压电泳分离。然后用常规方法在摇床上处理电泳胶，杂交后用CSPD(Roche)荧光染色观察并用X-光片自显影曝光。
在本发明中，利用花粉介导法获得转基因植株需要将花粉经过适宜的超声波处理，利用超声波在瞬间释放的高能和空化作用，使花粉处于感受态，从而在尽可能保持外源DNA完整性的前提下，使携带目的基因的质粒载体有效地进入花粉粒。超声波处理的程度不同,对花粉粒活性的影响也不同，若处理强度过大，则可能会破坏外源质粒的完整性，也会影响花粉的萌发率，进而直接影响转化率；若处理强度过小，则力度不够，质粒进入花粉的几率就会大大降低。因此，选择合适的超声波处理参数是十分重要的；
选择合适的花粉采集时间。芝麻每日从早晨4:00开始开花，到下午7:00停止，以上午6:00-8:00开花最多，10:00后明显减少。有研究表明：温度和湿度是影响花粉生活力的重要因素，低温和低湿有助于花粉维持较长时间的生活力；
选取合适的授粉时间。温度对于芝麻花粉的萌发有重要的影响，27-32℃为萌发的最适的温度。且据中国农科院油料作物研究所试验观察，芝麻的成蒴与日照和空气湿度显著相关，这就要求我们在转化过程中严格选择授粉时间，本实验中，选择在上午10：00-12：00以期达到最佳受精的试验结果；
提高人工授粉时增加涂抹的花粉量或在授粉时适当的重复授粉可以提高结实率。授粉涂抹时动作要柔和，尽量减少对柱头的机械损伤；
选择合适的授粉花蕾，芝麻为雌雄同体、自花授粉作物，在开花前即自行授粉，且同一花中的雌蕊比雄蕊早一天左右成熟。一般一朵花从幼蕾到开放大约需要7-9天，如果授粉的花蕾选择的较小，则雌蕊发育不成熟，如果选择的太大，则可能已经完成授粉，所以实验中一般选择尚未开放但是预计当天能够开放的花蕾为授粉对象，以此来提高芝麻的结蒴率和转化成功率；
在加强授粉期间及授粉结束之后的田间管理，例如及时的去除未经转化处理的蒴果，去除分支，以及授粉结束后及时打顶，都有利于养分集中供给人工授粉的蒴果，对提高结实率，进而提高转化率有利。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法，其特征在于：该超声波辅助花粉介导植物转基因方法的具体步骤如下：
S1：选用具有增产潜力的芝麻品种作为基础材料，早晨7-8点采集当天开放的芝麻花朵，然后用镊子取下雄蕊，置于洁净的纸上，轻压后收集花粉，将收集的新鲜花粉于冰箱4℃保存备用；
S2：用滴管在凹玻片上的凹穴内滴加配好的缓冲液，用棉棒挑少许花粉均匀撒于缓冲液上，让其自然散开悬浮于缓冲液表面，撒好后将玻片放入铺有湿滤纸的培养皿中加盖并将其置于30℃的人工气候箱中培养，6小时后，在光学显微镜下观察、记录花粉萌发及破碎情况；
S3：供试菌种LBA4404农杆菌保存于15％的甘油中，使用前提前两天用接种环挑取少许农杆菌菌种划线接种于附加有50mg/L卡那霉素(Km)的YP固体培养基上培养活化；从培养平板上挑取农杆菌菌落接种到YP和50mg/L卡那霉素(Km)的液体培养基中,并于28℃、210r/min下振荡培养至对数期，然后用碱裂解法提取质粒DNA；
S4：将步骤S3中的质粒DNA混入步骤S2中的缓冲液中，进行超声波处理，理后的花粉悬浮液分装于0.2mL的Eppendorf管中，每一株选取主茎上的1-2个在当天即将开放的花蕾，将其花冠取下，人工去雄，将柱头充分浸入处理后的花粉悬浮液中授粉，然后再将花冠戴上；
S5：然后摘除附近的其它花蕾和分枝，并挂牌标注授粉时间和花蕾数，授粉全部结束之后打顶，并每周一次去除分枝和其它未经转化处理的花蕾和果实，直至秋季检查授粉结实情况，统计、收获代种子；
S6：将收获的代种子随大田试验播种，得到代植株，待代植株代苗龄达3、4片真叶时，用浓度为100mg/mL的卡那霉素第一次涂抹芝麻叶片(顶部的2片叶)进行筛选，将叶片上出现明显的大面积虫斑和死亡的植株去除；
S7：待苗龄到8、9片真叶时，用浓度为120mg/mL的卡那霉素进行第二次田间筛选，将叶片上不出现虫斑和仅出现不明显小面积零星虫斑的植株拴牌标记，并采集新鲜叶片保存于-70℃下，以备提取基因组DNA；
S8：对提取的基因组DNA做转化植株的分子鉴定、PCR特异性扩增、斑点杂交和Southernblot检测，并进行扫描照相、保存。
2.根据权利要求1所述的一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法，其特征在于：所述不步骤S2中，在将少许花粉撒于缓冲液上时不必搅拌，以防花粉混于液体中因缺氧而影响萌发。
3.根据权利要求1所述的一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法，其特征在于：所述步骤S2中，缓冲液为蔗糖溶液、硼酸溶液和氯化钙溶液的混合液。
4.根据权利要求1所述的一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法，其特征在于：所述步骤S3中，YP固体培养基中每升培养基含5g酵母提取物、10g蛋白胨、5g氯化纳和15g琼脂，调pH至6.8高压灭菌。
5.根据权利要求1所述的一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法，其特征在于：所述步骤S5中，人工授粉时间为上午的10:00-12:00。
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