CN101926365A - 苏云金芽孢杆菌cry1Ai在抗虫中的用途、改造的mcry1Ai基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“苏云金芽孢杆菌cry1Ai在抗虫中的用途、改造的mcry1Ai基因及应用”，属于生物技术领域。苏云金芽孢杆菌cry1Ai对鳞翅目害虫具有高毒力，根据Cry1Ai蛋白的杀虫活性区氨基酸序列设计合成了的改造基因mcry1Ai序列，更有利于植物表达，表达量最高可占总可溶蛋白的0.23％。

Description

苏云金芽孢杆菌cry1Ai在抗虫中的用途、改造的mcry1Ai基因及应用 

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及苏云金芽孢杆菌cry1Ai的用途，以及改造的mcry1Ai基因及应用。 

背景技术

虫害是造成农作物减产的重要原因之一，减少虫害的损失是增加粮食与饲料作物产量的重要途径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14％，直接给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水稻减产10％、小麦减产20％、棉花减产30％以上[夏启中，张明菊，抗植物虫害基因及其应用，鄂州大学学报，2005，(5)：56-60.]。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害，但化学农药造成环境污染，生物杀虫剂成本较高。长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生态平衡。因此，减少杀虫剂使用量，发展现代植物保护技术，已成为可持续发展农业中必须正视的课题之一。 

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E，Crickmore.N，Van Rie.J.，Lereclus.D，Baum.J，Feitelson.J，Zeigler.D.R.，Dean.D.H.Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev，1998，62(3)：775-806.]。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，截止2008年6月已发现和克隆了412种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cry1Ac。在接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1A基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2007年，全球转基因作物种植面积增长率达12％，即增加1230万hm2，达到1.143亿hm2(2.824亿英亩)。第一个12年，转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的 农民都带来了经济和环境效益。 

由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。 

因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。 

发明内容

本发明提供一种苏云金芽孢杆菌cry1Ai在抗虫中的用途，其对小菜蛾、玉米螟、棉铃虫、粉纹夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟等害虫具有高毒力；同时通过对苏云金芽孢杆菌cry1Ai改造，得到苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白mcry1Ai基因序列，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。 

苏云金芽孢杆菌cry1Ai基因在抗鳞翅目害虫中的应用。 

所述应用是将苏云金芽孢杆菌cry1Ai基因表达的晶体蛋白用于杀灭鳞翅目害虫。 

所述应用是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目害虫的毒性蛋白。 

一种改造的mcry1Ai基因，其具有如SEQ NO.3所述的核苷酸序列。 

改造的mcry1Ai基因在抗鳞翅目害虫中的应用。 

所述应用是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目害虫的毒性蛋白。 

本发明发现菌株BTS6(保藏号：CGMCC 3459)对鳞翅目害虫具有高毒力，从中克隆得到一个基因，经测序(其核苷酸序列为SEQ NO.1)发现，与公开的cry1Ai基因相似性为100％。经实验证明，该基因蛋白(其氨基酸序列为SEQ NO.2)对鳞翅目害虫具有高毒力，从而可将其转化植物或微生物，使之表达蛋白杀灭鳞翅目害虫。 

根据Cry1Ai蛋白的杀虫活性区氨基酸序列设计合成了可以用于转基因植物开发的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ NO3所示，该改造基因mcry1Ai用于转化玉米，Cry1Ai蛋白的含量最高可占总可溶蛋白的0.23％。 

保藏信息： 

分类命名：苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis 

保藏号：CGMCC 3459 

保藏日期：2009年11月23日 

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 

附图说明

图1，cry1类PCR-RFLP鉴定图谱 

1，引物k3un2/k5un2扩增酶切条带；2，引物k3un3/k5un3扩增酶切条带；M，100bp ladder图2，cry1Ax阳性克隆PCR鉴定 

1，3.6kb PCR产物；2，阴性对照；M，λ/Eco130I 

图3，Cry1Ax在大肠杆菌中的表达 

1，空白对照不可溶组分；2，表达菌株不可溶组分；3，空白对照可溶组分；4表达菌株可溶组分 

图4植物表达载体pU1Ai的构建 

图5植物表达载体pU1Ai的酶切鉴定 

M：Lamda DNA/Eco1301I 1：pU1Ai/Sac I+BamH I，2：pT8A/Sac I+BamH I 3：p3300-Ubi/Sac I+BamH I 

图6抗性植株PCR检测 

M：DM2000P：pU1Ai CK：阴性对照    1～15：部分转基因植株 

图7PCR阳性植株中cry1Ai蛋白占可溶性蛋白比例 

图8T0代转基因植株的玉米螟生物活性测定 

A，B：未转基因植株    C：转基因植株 

具体实施方式

实施例1Cry1Ai基因、蛋白功能 

1-1菌株BTS6杀虫活性测定 

将菌株接种到LB固体培养基上，培养72小时，至芽孢与晶体释放。将芽孢与晶体用灭菌水洗下来，悬浮起来，稀释到1亿芽孢每毫升的浓度用于杀虫活性测定。以小菜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾为例，测定对鳞翅目害虫的杀虫活性。结果显示该浓度的芽孢晶体混合物对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟具有高活性。四种试虫的死亡率都为100％。 

1-2BTS6菌株的PCR-RFLP鉴定 

1.利用两对cry1类鉴定引物k3un2/k5un2，k3un3/k5un3(Kuo，W.S.and Chak，K.F.Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis ofrestriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA.Applied andEnvironmental Microbiology，1996，62：1369-1377.)，对BTS6菌株大质粒进行PCR-RFLP 

分析得到酶切图谱如图1。综合泳道1，2的酶切条带和已知基因的酶切图谱可以大体确定BTS6菌株中含有cry1A，cry1E，cry1K类基因，对鉴定PCR产物建立T-A克隆库，进行测序。得到其中cry1A类片断与cry1Ai相似性100％。 

1-3设计一对cry1类基因通用引物扩增从cry1Ai全长基因 

根据cry1类基因保守区设计了一对通用引物(Cry1Ai5/Cry1Ai3)，序列如下： 

Cry1Ai5-ATGGATAACAATCCGAACATCAATG 

Cry1Ai3-CTATTCCTCCATAAGGAGTAATTCC 

通过PCR扩增的方法，以BTS6的基因组为模版，克隆cry1Ai基因全长，见图2，连接PEB表达载体得到阳性克隆。获得的重组表达载体质粒命名为pEBS6。 

用pfuDNA聚合酶，用如下体系进行PCR扩增。。 

10×PCR  buffer	5μL
		dNTP(10mM)	1μL
引物对(10mM)	1μL/个
		模板	1uL
pfuDNA聚合酶(5U/μL)	0.5μL

超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。 

扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。 

1-4cry1Ai全长基因序列分析 

对阳性克隆进行测序，得到基因全长序列。 

连接方案： 

载体                    0.1-0.2μg 

目的片段DNA             0.5-1.0μg 

5×Ligation Buffer      2μL 

T4DNALigase             1μL 

用超纯水补足体积到10μL，充分混匀，16℃连接4h或4℃连接过夜。 

转化方案： 

1、挑取单菌落于5ml LB震荡培养过夜； 

2、按1％接种量接种于LB液体培养基中，37℃，230rpm培养2-2.5hr，(OD600＝0.5-0.6)；， 

3、4℃，4,000rpm离心10min； 

4、弃上清，加入预冷的0.1M CaCl250ml悬浮细胞，置于冰上30min以上； 

5、4℃，4,000rpm离心10min，回收细胞； 

6、用2-4ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬细胞，分装成200μl/0.5mL离心管中，于4℃保存(可保存一周)。 

7、取200μl感受态细胞与5μL连接产物充分混匀，冰浴30min。 

8、42℃热激1.5min，冰浴3min。 

9、加入800μl LB培养基37℃培养45min。 

10、取200μl涂板，加入相应的抗生素，及IPTG，X-gal，37℃培养。 

基因全长3.6kb，见SEQ NO.1，翻译蛋白共1187个氨基酸见SEQ NO.2。通过利用在线分析工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，使用蛋白保守结构域数据库比对(Conserved Domain Database)分析，该蛋白氨基酸序列SEQ NO.2的36至608位氨基酸是该蛋白的杀虫活性区域。该基因序列与已报道的cry1Ai基因序列完全一致。 

1-5cry1Ai的表达 

提取JM110阳性克隆质粒，转化Rosetta(λDE3)，IPTG诱导表达。 

诱导表达过程如下： 

1)活化菌种(37℃、12hr)； 

2)10％接种于LB培养基中(37℃、2hr)； 

3)加入诱导物IPTG，150rpm，18-22℃低温诱导4-20h； 

4)离心收集菌体，加入10mM Tris·Cl(pH 8.0)悬浮； 

5)破碎菌体(超声波破碎完全)； 

6)离心12,000rpm 10min 4℃； 

7)收集上清及沉淀各10-15μL，分别电泳检测。 

聚丙烯酰胺凝胶配置如下。 

上样：上样10-15μl，电泳：130-150V恒压。 

染色与脱色：电泳后取出凝胶，用蒸馏水冲洗后，放入染色液中，60rpm振荡染色1hr左右，脱色液中脱色2hr左右，脱色至凝胶背景透明，清水中漂洗至蛋白带清晰。cry1Ai基 因可以表达约134kD的蛋白(见图3)。 

1-6杀虫活性测定 

以小菜蛾、玉米螟、棉铃虫为例测定蛋白对鳞翅目的杀虫活性，见由表1、表2、表3，结果可知Cry1Ai蛋白对鳞翅目害虫有高毒力。 

敏感小菜蛾的生物活性测定结果如表1，各浓度重复4次，每重复接虫15头。 

表1，Cry1Ai对敏感小菜蛾的生物活性测定 

敏感小菜蛾的生物活性测定结果显示Cry1Ai对敏感小菜蛾有高毒力。 

对敏感亚洲玉米螟的生物活性测定见表2，各浓度重复3次，每重复接虫24头 

表2，Cry1Ai敏感亚洲玉米螟的生物活性测定 

对敏感亚洲玉米螟的生物活性测定结果显示Cry1Ai敏感亚洲玉米螟有高毒力。 

对敏感棉铃虫的生物活性测定见表3，各浓度重复3次，每重复接虫15头。活虫按发育等级分类。 

表3Cry1Ai敏感棉铃虫的生物活性测定结果 

对敏感棉铃虫的生物活性测定结果显示，Cry1Ai敏感棉铃虫的生物活性表现为高效抑制发育。 

实施例2Cry1Ai蛋白在转基因植物中的应用 

2-1改造基因mCry1Ai 

根据Cry1Ai蛋白的杀虫活性区氨基酸序列设计合成了可以用于转基因植物开发的DNA序列。去除了多聚腺苷酸化信号26个，GC含量提高了11.5％。该序列具有GC含量为48％的特征；含有利于植物表达的序列，命名为mCry1Ai具体见SEQ NO.3。在基因上游添加了Ω序列和Kozak序列，在基因3’端添加了内质网定位信号。 

该改造基因mCry1Ai合成序列由组成型Ubiquitin启动子驱动，导入到水稻中，对二化螟有较好的抗虫活性。 

序列中下划线为Ω序列，加粗的为Kozak序列，边框为KEDL内质网定位信号，上游添加了BamH I、HindIII、XbaI、XmaI、SmaI、NcoI，下游添加了SacI、EcoRI酶切位点，便于载体构建。 

合成序列与原有核苷酸序列有84％的相似性。以下是比对结果。 

Query：mCry1Ai序列如SEQ NO.3 

Sbjct：原有cry1Ai序列 

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Sbjct：1    atggataacaatccgaacatcaatgaatgcattccttataattgtttaagtaaccctgaa 60 

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Sbjct：1501  aatagtagtggaaataacattcagaatagagggtatattgaagttccaattcacttccca 1560 

Query：1675  tcgacctctaccaggtatcgagttcgtgtacggtatgcctctgtgaccccgattcacctc 1734 

              

Sbjct：1561  tcgacatctaccagatatcgagttcgtgtacggtatgcttctgtaaccccgattcacctc 1620 

Query：1735  aacgtcaattggggcaactcgtccattttctccaacacagtaccagccacagccacgtca 1794 

              

Sbjct：1621  aacgttaattggggtaattcatccattttttccaatacagtaccagctacagctacgtca 1680 

Query：1795  ctcgacaacctgcaatcgagcgacttcggctacttcgagagtgccaatgccttcacgtct 1854 

              

Sbjct：1681  ttagataatctacaatcaagtgattttggttattttgaaagtgccaatgcttttacatct 1740 

Query：1855  tccttaggtaacatcgtaggtgtcaggaacttcagtgggactgcaggcgtgatcatagac 1914 

              

Sbjct：1741  tcattaggtaatatagtaggtgttagaaattttagtgggactgcaggagtgataatagac 1800 

Query：1915  cgcttcgagtttattccggttactgcaacactcgaggctgagtacaatctggaaagagcg 1974 

              

Sbjct：1801  agatttgaatttattccagttactgcaacactcgaggctgaatataatctggaaagagcg 1860 

Query：1975  cagaaggcggtgaatgcgctgtttacgtcaacaaatcagctggggctgaaaacaaatgtg 2034 

              

Sbjct：1861  cagaaggcggtgaatgcgctgtttacgtctacaaaccaactagggctaaaaacaaatgta 1920 

Query：2035  acgga 2039 

              

Sbjct：1921  acgga 1925 

2-2植物表达载体构建 

用BamH I和Sac I双酶切中间载体p3300-Ubi，将回收的载体片段分别与用同样两个限制性内切酶消化的cry1Ai片段相连，构建流程见图4，酶切鉴定(图5)证明植物表达载体pU1Ai构建成功，该载体含有由组成型启动子Ubiquitin驱动的cry1Ai基因，筛选标记为bar基因。 

2-3玉米遗传转化 

2-3-1玉米的控制授粉 

(1)玉米抽雄后，用大口袋套住雄穗，下面用别针别住，收集花粉； 

(2)雌穗花丝未抽出前，用小口袋将其套住，并用大头针别好； 

(3)在授粉的前一天，当花丝伸出约2cm长时，用剪刀剪去花丝的顶部，促进其伸长； 

(4)第二天，当花丝伸长后，依下列组合进行授粉(前为母本，后为父本)：齐31×综31； 

(5)授粉后系上小牌，写上授粉的品种和日期，10～12天后收获； 

2-3-2幼胚的剥离和培养 

(1)将新收获的玉米雌穗去掉苞叶、花丝，花丝一定要去干净，可用酒精灯将未除净的花丝烧去；用小刀去掉雌穗的头尾部分； 

(2)将雌穗浸在70％乙醇中灭菌30sec； 

(3)将雌穗取出，浸在2.5％的次氯酸纳中灭菌10～15min，可以在溶液中加几滴Tween20； 

(4)用灭菌水清洗3次，用滤纸擦去残留的水珠，置于无菌的环境中备用； 

(5)将一只枪式镊子从顶部插入雌穗，用左手持住镊子，右手用装有#21刀片的手术刀切去籽粒的上半部分； 

(6)换上#10刀片，将刀尖插入籽粒下部的果皮与胚乳之间，将胚乳挑出； 

(7)用刀尖将粘在胚乳顶部或顶部果皮内的幼胚转移到诱导培养基上，操作要小心，不要损伤幼胚。放置时注意胚轴(较平的一面)向下，盾片向上，每皿约放置20～30个； 

(8)27～28℃暗培养3～4周，使之开始脱分化，形成愈伤组织；此后，选择生长迅速、质地松脆、颜色鲜亮的愈伤组织继代培养，每2～3周继代一次，选择生长良好的愈伤准备基因枪转化； 

(9)在射击前4hr，将切成小块的愈伤转移到含0.4M甘露醇的高渗培养基上； 

(10)射击后，使愈伤在高渗培养基上继续培养过夜，然后转移到诱导培养基上，恢复培养一周。 

2-3-3用基因枪进行玉米转化 

(1)打开超净台，用70％乙醇擦拭超净台内部和基因枪的表面及内部； 

(2)打开紫外灯，灭菌30min； 

(3)按前述步骤准备微弹； 

(4)易裂片、微弹载体、阻拦网灭菌(置于70％乙醇中1.0min，放在滤纸上自然风干)； 

(5)打开气瓶，调节压力至2,000psi； 

(6)按前述方法安装微弹载体和微弹； 

(7)将易裂片、阻拦网和微弹载体安装进固定装置中；射击参数为：Gap distance：20mm；微弹载体飞行距离(Macroprojectile flight distance)：10mm；微弹飞行距离(Particle flightdistance)：7cm；压力：1,350psi；真空度：25inches Hg.； 

(8)把培养皿放在托盘上，使愈伤都集中在托盘中间的圆圈内，将托盘插入倒数第二档； 

(9)打开基因枪的电源； 

(10)打开真空泵； 

(11)关闭基因枪的门，按下“抽真空”键(Vac)，当真空表读数达到25inches Hg.时，使键置于“保持(Hold)”档； 

(12)按下“射击(Fire)”健直到射击结束； 

(13)按下“放气”健，使真空表读数归零； 

(14)打开基因枪门，取出培养皿，盖好盖子并用封口膜封好； 

(15)重复上述步骤，直至完成转化。 

2-3-4转化愈伤组织的筛选和植株的再生 

(1)将转化后的愈伤组织置于黑暗中，28℃培养过夜，然后转移到N6诱导培养基上培养5～7天； 

(2)将愈伤转移到筛选培养基上(含PPT20mg/L)，两周继代一次，选择色泽正常、分化良好的愈伤，弃去衰老死亡的愈伤。每皿的培养物不宜过多，愈伤块应尽量小些，并使愈伤紧贴培养基； 

(3)继代3～4次后，将愈伤移至N6分化培养基上，在光周期为亮/暗＝16/8，28℃条件下培养，每两周继代一次； 

(4)将发生绿芽的愈伤组织切分； 

(5)当小植株长到1～2cm高时，转移进三角瓶中(含MS生根培养基)继续培养； 

(6)3～4叶期且根系较发达时，将小苗移入小花盆中，移入温室培养；二周后移入大花盆，直至开花结实。 

2-4转基因植株的PCR检测 

2-4-1转基因植株基因组DNA的提取-SDS法 

1)称取0.2g的叶片放入1.5ml离心管，用液氮充分研磨成粉末。 

2)加入500μl SDS-Buffer(100mM Tris，50mM EDTA，500mM NaCl，pH 8.0)，混匀。3)再加入20μl 20％SDS，轻轻混匀后置于65℃水浴10分钟。 

4)加入250μl 5M KAC，混匀，冰上放置30分钟。 

5)4℃离心，12000rpm，10分钟。 

6)取上清，移入新的离心管中，加入等体积的异丙醇中，冰浴5分钟。 

7)4℃离心，12000rpm，10分钟。 

8)弃上清，70％乙醇洗涤两次，真空干燥DNA后，加入40μl无菌双蒸水溶解，-20℃保存备用。 

PCR检测： 

反应体系                     40μl 

10×PCR buffer               4μl 

dNTPs(2.5mM)                 3.2μl 

引物对(10μM)                各1.6μl 

模板                         1μl 

Taq聚合酶(5U/μl)            0.4μl 

                                          

超纯水补至40μl 

PCR反应条件 

94℃预变性5min 

72℃延伸10min 

16℃   1min   终止反应 

检测引物： 

Jc1AiF：GTTTCTGTTGAGCGAGTTTGTTCC 

Jc1AiR：CACAGCATAGTCGGTGTAGTTGCC 

经过抗性筛选得到15株抗性植株，提取抗性植株基因组，以其做模板，进行PCR检测，共得到6株PCR阳性植株(图6)。提取PCR阳性植株可溶性蛋白，1号植株Cry1Ai蛋白的含量最高可占总可溶蛋白的0.23％。(图7是改造mCry1Ai表达蛋白在可溶性蛋白中所占比例图) 

PCR阳性植株的生物活性测定 

将PCR阳性植株移栽，当植株生长到6～8叶时，将玉米螟初孵幼虫接于心叶中，以未转化植株作为阴性对照，接虫2周后调查食叶级别见表4。结果显示，人工接虫玉米螟后，转基因植株单株间的抗虫性表现有一定差异：转基因植株对玉米螟表现为抗性，没有或只有很小的玉米螟危害的虫孔(图8，未转化植株被玉米螟咬食严重，叶片虫孔大且虫孔数目多，已影 响到植株的正常生长。 

附录 

SEQUENCE LISTING 

<110>中国农业科学院植物保护研究所 

<120>苏云金芽孢杆菌cry1Ai在抗虫中的用途、改造的mcry1Ai基因及应用 

<130>P09478/ZWB 

<160>3 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>3546 

<212>DNA 

<213>cry1Ai全长基因 

<400>1 

atggataaca atccgaacat caatgaatgc attccttata attgtttaag taaccctgaa     60 

gtagaagtat taggtggaga aagaatagaa actggttaca ccccaatcga tatttccttg    120 

tcgctaacgc aatttctttt gagtgaattt gttcccggtg ctggatttgt gttaggacta    180 

gttgatataa tatggggaat ttttggtccc tctcaatggg acgcatttct tgtacaaatt    240 

gaacagttaa ttaaccaaag aatagaagaa ttcgctagga accaagccat ttctagatta    300 

gaaggactaa gcaatcttta tcaaatttac gcagaatctt ttagagagtg ggaagcagat    360 

cctactaatc cagcattaag agaagagatg cgtattcaat tcaatgacat gaacagtgcc    420 

cttacaaccg ctattcctct ttttgcagtt caaaattatc aagttcctct tttatcagta    480 

tatgttcaag ctgcaaattt acatttatca gttttgagag atgtttcagt gtttggacaa    540 

aggtggggat ttgatgccgc gactatcaat agtcgttata atgatttaac taggcttatt    600 

ggcaactata cagattatgc tgtgcgctgg tacaatacgg gattagagcg tgtatgggga    660 

ccggattcta gagattgggt aaggtataat caatttagaa gagagctaac acttactgta    720 

ttagatatcg ttgctctatt ctcaaattat gatagtcgaa ggtatccaat tcgaacagtt    780 

tcccaattaa caagagaaat ttatacgaac ccagtattag aaaattttga tggtagtttt    840 

cgtggaatgg ctcagagaat agaacagaat attaggcaac cacatcttat ggatatcctt    900 

aatagtataa ccatttatac tgatgtgcat agaggcttta attattggtc agggcatcaa    960 

ataacagctt ctcctgtagg gttttcagga ccagaattcg cattcccttt atttgggaat   1020 

gcggggaatg cagctccacc cgtacttgtc tcattaactg gtttggggat ttttagaaca   1080 

ttatcttcac ctttatatag aagaattata cttggttcag gcccaaataa tcaggaactg   1140 

tttgtccttg atggaacgga gttttctttt gcctccctaa cgaccaactt gccttccact   1200 

atatatagac aaaggggtac agtcgattca ctagatgtaa taccgccaca ggataatagt   1260 

gtaccacctc gtgcgggatt tagccatcga ttgagtcatg ttacaatgct gagccaagca   1320 

gctggagcag tttacacctt gagagctcca acgttttctt ggcagcatcg cagtgctgaa   1380 

tttaataata taattgcatc ggatagtatt actcaaatcc ctgcagtgaa gggaaacttt   1440 

ctttttaatg gttctgtaat ttcaggacca ggatttactg gtggggactt agttagatta   1500 

aatagtagtg gaaataacat tcagaataga gggtatattg aagttccaat tcacttccca   1560 

tcgacatcta ccagatatcg agttcgtgta cggtatgctt ctgtaacccc gattcacctc   1620 

aacgttaatt ggggtaattc atccattttt tccaatacag taccagctac agctacgtca   1680 

ttagataatc tacaatcaag tgattttggt tattttgaaa gtgccaatgc ttttacatct   1740 

tcattaggta atatagtagg tgttagaaat tttagtggga ctgcaggagt gataatagac   1800 

agatttgaat ttattccagt tactgcaaca ctcgaggctg aatataatct ggaaagagcg   1860 

cagaaggcgg tgaatgcgct gtttacgtct acaaaccaac tagggctaaa aacaaatgta   1920 

acggattatc atattgatca agtgtccaat ttagttacgt gtttatcgga tgaattttgt   1980 

ctggatgaaa agcgagaatt gtccgagaaa gtcaaacatg cgaagcgact cagtgatgaa   2040 

cgcaatttac tccaagattc aaatttcaaa gacattaata ggcaaccaga acgtgggtgg   2100 

ggcggaagta cagggattac catccaagga ggggatgacg tatttaaaga aaattacgtc   2160 

acactatcag gtacctttga tgagtgctat ccaacatatt tgtatcaaaa aatcgatgaa   2220 

tcaaaattaa aagcctttac ccgttatcaa ttaagagggt acatcgaaga tagtcaagat   2280 

ttagaagttt atttgatccg ttacaatgca aaacacgaaa cgttaaacgt gccaggtacg   2340 

ggttccttat ggccacttgc agttaaaagt ccaattggaa ggtgcggtga accgaatcga   2400 

tgtgcaccac ggattgagtg gaaacctgat gtagattgtt cctgcagaga cggagaaaaa   2460 

tgtgcgcatc attcccatca tttctccttg gacattgatg taggatgtac agacttaaat   2520 

gaggatttag gcgtatgggt gatattcaag attaagacac aagatggcca tgcgaaaata   2580 

ggaaatctag aatttctcga agagaagctt ttattaggag aagcattagc acgtgtgaag   2640 

aaagcggaga aaaaatggag agacaaacgc gaaaaattgg aatgggaaac aaatattgtt   2700 

tataaagagg caaaagaatc tgtagatgct ttattcgtag attctcaata taatagatta   2760 

caaacggata cgaacattgc gatgattcat gcggcagata aacgcgttca tcgaatccga   2820 

gaagcgtatt tgccagagtt atctgtgatt ccgggtgtca atgcggctat tttcgaagaa   2880 

ttagaaggtc ttattttcac cgcattctcc ctatatgatg cgagaaatgt cattaaaaac   2940 

ggagatttca attatggttt atcatgctgg aatgtgaaag ggcatgtaga tgtagaagaa   3000 

caaaacaacc accgttccgt ccttgttatc ccagaatggg aagcagaagt gtcccaagaa   3060 

gttcgtgtct gtccaggtcg tggctatatc cttcgtgtta cagcgtacaa agagggatat   3120 

ggagagggct gcgtaacgat ccatgagatc gaagacaata cagacgaact gaaattcagc   3180 

aactgtgtag aagaggaagt atatccaaac aacacggtaa cgtgtaatga ttatactgcg   3240 

actcaagaag aatatgaggg tacgtacact tctcgtaatc gaggatatga cggagcctat   3300 

gaaagcaatt cttctgtacc agctgattat gcatcagcct atgaagaaaa agcgtataca   3360 

gatggacgaa gagacaatcc ttgtgaatct aacagaggat atagggatta cacaccacta   3420 

ccagctggct atgtgacaaa agaattagag tacttcccag aaaccgataa ggtatggatt   3480 

gagatcggag aaacggaagg aacattcatt gtggatagcg tggaattact ccttatggag   3540 

gaatag                                                              3546 

<210>2 

<211>1181 

<212>PRT 

<213>cry1Ai全长基因编码的氨基酸序列 

<400>2 

1      METAspAsnAsnProAsnIleAsnGluCysIleProTyrAsnCysLeuSerAsnProGlu 

21     ValGluValLeuGlyGlyGluArgIleGluThrGlyTyrThrProIleAspIleSerLeu 

41     SerLeuThrGlnPheLeuLeuSerGluPheValProGlyAlaGlyPheValLeuGlyLeu 

61     ValAspIleIleTrpGlyIlePheGlyProSerGlnTrpAspAlaPheLeuValGlnIle 

81     GluGlnLeuIleAsnGlnArgIleGluGluPheAlaArgAsnGlnAlaIleSerArgLeu 

101    GluGlyLeuSerAsnLeuTyrGlnIleTyrAlaGluSerPheArgGluTrpGluAlaAsp 

121    ProThrAsnProAlaLeuArgGluGluMETArgIleGlnPheAsnAspMETAsnSerAla 

141    LeuThrThrAlaIleProLeuPheAlaValGlnAsnTyrGlnValProLeuLeuSerVal 

161    TyrValGlnAlaAlaAsnLeuHisLeuSerValLeuArgAspValSerValPheGlyGln 

181    ArgTrpGlyPheAspAlaAlaThrIleAsnSerArgTyrAsnAspLeuThrArgLeuIle 

201    GlyAsnTyrThrAspTyrAlaValArgTrpTyrAsnThrGlyLeuGluArgValTrpGly 

221    ProAspSerArgAspTrpValArgTyrAsnGlnPheArgArgGluLeuThrLeuThrVal 

241    LeuAspIleValAlaLeuPheSerAsnTyrAspSerArgArgTyrProIleArgThrVal 

261    SerGlnLeuThrArgGluIleTyrThrAsnProValLeuGluAsnPheAspGlySerPhe 

281    ArgGlyMETAlaGlnArgIleGluGlnAsnIleArgGlnProHisLeuMETAspIleLeu 

301    AsnSerIleThrIleTyrThrAspValHisArgGlyPheAsnTyrTrpSerGlyHisGln 

321    IleThrAlaSerProValGlyPheSerGlyProGluPheAlaPheProLeuPheGlyAsn 

341    AlaGlyAsnAlaAlaProProValLeuValSerLeuThrGlyLeuGlyIlePheArgThr 

361    LeuSerSerProLeuTyrArgArgIleIleLeuGlySerGlyProAsnAsnGlnGluLeu 

381    PheValLeuAspGlyThrGluPheSerPheAlaSerLeuThrThrAsnLeuProSerThr 

401    IleTyrArgGlnArgGlyThrValAspSerLeuAspValIleProProGlnAspAsnSer 

421    ValProProArgAlaGlyPheSerHisArgLeuSerHisValThrMETLeuSerGlnAla 

441    AlaGlyAlaValTyrThrLeuArgAlaProThrPheSerTrpGlnHisArgSerAlaGlu 

461    PheAsnAsnIleIleAlaSerAspSerIleThrGlnIleProAlaValLysGlyAsnPhe 

481    LeuPheAsnGlySerValIleSerGlyProGlyPheThrGlyGlyAspLeuValArgLeu 

501    AsnSerSerGlyAsnAsnIleGlnAsnArgGlyTyrIleGluValProIleHisPhePro 

521    SerThrSerThrArgTyrArgValArgValArgTyrAlaSerValThrProIleHisLeu 

541    AsnValAsnTrpGlyAsnSerSerIlePheSerAsnThrValProAlaThrAlaThrSer 

561    LeuAspAsnLeuGlnSerSerAspPheGlyTyrPheGluSerAlaAsnAlaPheThrSer 

581    SerLeuGlyAsnIleValGlyValArgAsnPheSerGlyThrAlaGlyValIleIleAsp 

601    ArgPheGluPheIleProValThrAlaThrLeuGluAlaGluTyrAsnLeuGluArgAla 

621    GlnLysAlaValAsnAlaLeuPheThrSerThrAsnGlnLeuGlyLeuLysThrAsnVal 

641    ThrAspTyrHisIleAspGlnValSerAsnLeuValThrCysLeuSerAspGluPheCys 

661    LeuAspGluLysArgGluLeuSerGluLysValLysHisAlaLysArgLeuSerAspGlu 

681    ArgAsnLeuLeuGlnAspSerAsnPheLysAspIleAsnArgGlnProGluArgGlyTrp 

701    GlyGlySerThrGlyIleThrIleGlnGlyGlyAspAspValPheLysGluAsnTyrVal 

721    ThrLeuSerGlyThrPheAspGluCysTyrProThrTyrLeuTyrGlnLysIleAspGlu 

741    SerLysLeuLysAlaPheThrArgTyrGlnLeuArgGlyTyrIleGluAspSerGlnAsp 

761    LeuGluValTyrLeuIleArgTyrAsnAlaLysHisGluThrLeuAsnValProGlyThr 

781    GlySerLeuTrpProLeuAlaValLysSerProIleGlyArgCysGlyGluProAsnArg 

801    CysAlaProArgIleGluTrpLysProAspValAspCysSerCysArgAspGlyGluLys 

821    CysAlaHisHisSerHisHisPheSerLeuAspIleAspValGlyCysThrAspLeuAsn 

841    GluAspLeuGlyValTrpValIlePheLysIleLysThrGlnAspGlyHisAlaLysIle 

861    GlyAsnLeuGluPheLeuGluGluLysLeuLeuLeuGlyGluAlaLeuAlaArgValLys 

881    LysAlaGluLysLysTrpArgAspLysArgGluLysLeuGluTrpGluThrAsnIleVal 

901    TyrLysGluAlaLysGluSerValAspAlaLeuPheValAspSerGlnTyrAsnArgLeu 

921    GlnThrAspThrAsnIleAlaMETIleHisAlaAlaAspLysArgValHisArgIleArg 

941    GluAlaTyrLeuProGluLeuSerValIleProGlyValAsnAlaAlaIlePheGluGlu 

961    LeuGluGlyLeuIlePheThrAlaPheSerLeuTyrAspAlaArgAsnValIleLysAsn 

981    GlyAspPheAsnTyrGlyLeuSerCysTrpAsnValLysGlyHisValAspValGluGlu 

1001   GlnAsnAsnHisArgSerValLeuValIleProGluTrpGluAlaGluValSerGlnGlu 

1021   ValArgValCysProGlyArgGlyTyrIleLeuArgValThrAlaTyrLysGluGlyTyr 

1041   GlyGluGlyCysValThrIleHisGluIleGluAspAsnThrAspGluLeuLysPheSer 

1061   AsnCysValGluGluGluValTyrProAsnAsnThrValThrCysAsnAspTyrThrAla 

1081   ThrGlnGluGluTyrGluGlyThrTyrThrSerArgAsnArgGlyTyrAspGlyAlaTyr 

1101   GluSerAsnSerSerValProAlaAspTyrAlaSerAlaTyrGluGluLysAlaTyrThr 

1121   AspGlyArgArgAspAsnProCysGluSerAsnArgGlyTyrArgAspTyrThrProLeu 

1141   ProAlaGlyTyrValThrLysGluLeuGluTyrPheProGluThrAspLysValTrpIle 

1161   GluIleGlyGluThrGluGlyThrPheIleValAspSerValGluLeuLeuLeuMETGlu 

1181   Glu*** 

<210>3 

<211>2091 

<212>DNA 

<213>Cry1Ai蛋白的杀虫活性区 

<400>3 

ggatccaagc tttctagacc cgggcctatt tttacaacaa ttaccaacaa caacaaacaa     60 

caaacaacat tacaattact atttacaatt acaaccatgg cgatttcgcg ggagatggac    120 

aacaatccga acattaacga gtgcataccc tacaactgtc tcagcaaccc tgaggtggaa    180 

gtgctcggtg gagagaggat agagactggt tacaccccaa tcgacatctc cttgtcgcta    240 

acgcagtttc tgttgagcga gtttgttccc ggtgccggct ttgtgttagg cctagttgac    300 

atcatatggg gaatctttgg tccctctcaa tgggacgcgt ttcttgtcca gatagaacaa    360 

ctcatcaatc agcgcatcga agagttcgcc aggaatcagg ccatttccag actcgaagga    420 

ctaagcaatc tgtatcagat ctacgctgag tccttccggg agtgggaagc cgatcccacc    480 

aatccagcgc tccgggaaga gatgcgcata cagttcaatg acatgaacag tgcccttaca    540 

accgccattc ccctgtttgc ggttcagaac taccaagttc ctctgctctc ggtctacgtt    600 

caagctgcga atctccatct ctcagtcttg cgggatgtat cggtgtttgg acaaaggtgg    660 

ggctttgatg ccgcgaccat caacagccgt tacaatgatc tcaccaggct cattggcaac    720 

tacaccgact atgctgtgcg ctggtacaac acgggcttag agcgtgtgtg gggaccggac    780 

tccagagatt gggtgaggta caatcagttc agacgagagc taacacttac tgtgctcgac    840 

atcgttgctc tgttctcgaa ctatgatagt cgaaggtatc cgattcgaac agtctcccag    900 

ttgaccagag agatctatac gaacccagtg ctcgagaact tcgatggcag ctttcgtggc    960 

atggcacaac gcatagaaca gaatatcagg caaccgcacc ttatggacat ccttaacagc   1020 

ataaccatct atactgatgt gcatagaggc ttcaactact ggtcagggca ccagatcaca   1080 

gcctctcctg tagggttctc tggaccggag ttcgcgttcc ctctatttgg gaatgcgggg   1140 

aatgcagctc cacccgtgct tgtctcactc actggcttgg ggatcttccg cacactctct   1200 

tcacctctct atcgcagaat catacttggt tcaggcccaa acaaccagga actgtttgtc   1260 

cttgatggca cggagttctc ctttgcctcc ctgacgacca acttgccttc cactatctac   1320 

cggcagaggg gtacagtcga ttcgctagat gtcatcccgc cacaagacaa cagcgtaccg   1380 

cctcgtgcgg gattcagcca ccgattgagc catgtcacca tgctgagcca agcagctgga   1440 

gcagtctaca ccttgagagc acccacgttc tcttggcaac atcgcagtgc cgagttcaat   1500 

aacataatcg cgtcggatag catcactcag atccctgcag tgaagggcaa ctttcttttc   1560 

aatggctctg tcatctcagg accaggcttc actggtgggg acttagttcg gctcaattcg   1620 

agtggcaaca acattcagaa ccgggggtac attgaggttc ccattcactt cccgtcgacc   1680 

tctaccaggt atcgagttcg tgtacggtat gcctctgtga ccccgattca cctcaacgtc   1740 

aattggggca actcgtccat tttctccaac acagtaccag ccacagccac gtcactcgac   1800 

aacctgcaat cgagcgactt cggctacttc gagagtgcca atgccttcac gtcttcctta   1860 

ggtaacatcg taggtgtcag gaacttcagt gggactgcag gcgtgatcat agaccgcttc   1920 

gagtttattc cggttactgc aacactcgag gctgagtaca atctggaaag agcgcagaag    1980 

gcggtgaatg cgctgtttac gtcaacaaat cagctggggc tgaaaacaaa tgtgacggac    2040 

taccataagg atgaactttg ataaggtacc ctcgaggagc tctccgaatt c             2091 

Claims (6)

1.苏云金芽孢杆菌cry1Ai基因在抗鳞翅目害虫中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，是将苏云金芽孢杆菌cry1Ai基因表达的晶体蛋白用于杀灭鳞翅目害虫。

3.根据权利要求1所述应用，是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目害虫的毒性蛋白。

4.一种改造的mcry1Ai基因，其具有如SEQ NO.3所述的核苷酸序列。

5.权利要求4所述的改造的mcry1Ai基因在抗鳞翅目害虫中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目害虫的毒性蛋白。

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