CN103173469A - 苏云金芽胞杆菌新型vip3X基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“苏云金芽胞杆菌新型vip3X基因及其应用”属于生物技术领域。对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因蛋白Vip3X，表现出鳞翅目害虫的高毒力。该基因序列改造后SEQ ID NO3应用于转化微生物或植物，具有较高的表达量，且使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌的抗药性产生。

Description

苏云金芽胞杆菌新型vip3X基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及苏云金芽胞杆菌新型vip3X基因的克隆、表达与应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，在芽胞形成的过程中可以产生由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)组成的伴胞晶体，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf,E.,N.Crickmore,J.Van Rie,et al.,1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev.62(3):p.775-806]。这种伴胞晶体蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目等多种重要的害虫都有特异性的毒杀作用[Doss,V.A.,K.A.Kumar,R.Jayakumar,et al.,2002.Cloning and expression of the vegetative insecticidal protein(vip3V)gene of Bacillusthuringiensis in Escherichia coli.Protein Expr Purif.26(1):p.82-8.Raymond,B.,P.R.Johnston,C.Nielsen-LeRoux,et al.,2010.Bacillus thuringiensis:an impotent pathogen.Trends Microbiol.18(5):p.189-94]，而对高等动物和人无毒性。Bt是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂。

除了芽胞形成过程中产生的杀虫晶体蛋白之外，Bt在营养期还分泌一类营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,VIPs)，与Cry类杀虫晶体蛋白的氨基酸序列同源性极低[Estruch,J.J.,G.W.Warren,M.A.Mullins,et al.,1996.Vip3A,a novel Bacillus thuringiensisvegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects.ProcNatl Acad Sci U S A.93(11):p.5389-94]。Vips主要分为Vip1、Vip2、Vip3和Vip4。Vip3类蛋白包括Vip3Aa、Vip3Ab、Vip3Ac、Vip3Ad、Vip3Ae、Vip3Af、Vip3Ag、Vip3Ah、Vip3Ba和Vip3Bb。目前GenBank上登录的vip3类全长基因共有75个[http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/.Crickmore,N.,D.R.Zeigler,J.Feitelson,et al.,1998.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystalproteins.Microbiol Mol Biol Rev.62(3):p.807-13]，其中大部分为vip3Aa基因。Vip3蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、草地贪夜蛾(S.frugiperda)等一系列农业害虫具有较高的毒性[Estruch,J.J.,G.W.Warren,M.A.Mullins,et al.,1996.Vip3A,a novel Bacillus thuringiensisvegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects.ProcNatl Acad Sci U S A.93(11):p.5389-94]。一些昆虫对Bt杀虫晶体蛋白有很强的抗性，而Vip3蛋白可能对这些昆虫具有较好的活性。Vip3蛋白对某些昆虫的活性要比Cry蛋白高很多，如Vip3Aa蛋白对小地老虎的活性要比Cry1Ac蛋白高260倍[Selvapandiyan,A.,N.Arora,R.Rajagopal,et al.,2001.Toxicity analysis of N-and C-terminus-deleted vegetative insecticidalprotein from Bacillus thuringiensis.Appl Environ Microbiol.67(12):p.5855-8]。陈建武等人从苏云金芽胞杆菌菌株S184中克隆了2.3kb大小的vip3A基因，并插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP，经诱导表达得到的Vip3A-S184蛋白对夜蛾科害虫具有较高的活性[陈建武,唐丽霞,宋少云,等.2003.苏云金芽孢杆菌vip3A基因的检测及保守性分析.生物工程学报.19(5):538-543]。蔡启良等人选择苏云金芽胞杆菌李氏亚种（subsp.leesis）菌株YBT-833、鲇泽亚种（subsp.aizawai）菌株YBT-1416得到基因vip83和vip14，分别转化Bt受体菌BMB171和4Q7，获得了相应的工程菌。诱导表达的蛋白对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫有一定的杀虫活性，其中对小菜蛾的毒力是最高的[蔡启良,刘子铎,孙明,等.2002.苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析.生物工程学报.18(5):578-582]。

Vip3蛋白与已知的杀虫晶体蛋白没有同源性，杀虫机理也不相同[Cai,J.,L.Xiao,B.Yan,et al.,2006.Vip3A is responsible for the potency of Bacillus thuringiensis9816C culturesupernatant against Helicoverpa armigera and Spodoptera exigua.J Gen Appl Microbiol.52(2):p.83-9]。Vip3蛋白单独或者与Cry蛋白共同使用[Chilcott,C.N.and D.J.Ellar,1988.Comparativetoxicity of Bacillus thuringiensis var.israelensis crystal proteins in vivo and in vitro.J GenMicrobiol.134(9):p.2551-8.Angsuthanasombat,C.,N.Crickmore,and D.J.Ellar,1992.Comparison of Bacillus thuringiensis subsp.israelensis CryIVA and CryIVB cloned toxins revealssynergism in vivo.FEMS Microbiol Lett.73(1-2):p.63-8.Delecluse,A.,S.Poncet,A.Klier,et al.,1993.Expression of cryIVA and cryIVB genes,independently or in combination,in acrystal-negative strain of Bacillus thuringiensis subsp.israelensis.Appl Environ Microbiol.59(11):p.3922-7]，或者是组建融合基因构建工程菌，可以扩大Bt的杀虫谱，同时可以有效抑制害虫抗药性的产生。Vip3Aa蛋白间的氨基酸序列同源性都在95%以上，但其序列间个别氨基酸的差异也会导致对害虫毒力和杀虫谱的变化[Selvapandiyan,A.,N.Arora,R.Rajagopal,et al.,2001.Toxicity analysis of N-and C-terminus-deleted vegetative insecticidal protein from Bacillusthuringiensis.Appl Environ Microbiol.67(12):p.5855-8]，因此针对不同农业害虫分离新的vip3类基因可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。

发明内容

本发明提供一种新的苏云金芽胞杆菌晶体杀虫蛋白对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫的应用，以转化微生物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌的抗药性产生。

对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因vip3X，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

一种表达载体，其含有上述杀虫基因vip3X。

所述表达载体为pUS，其结构如图4中所示。

对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因vip3X在防治鳞翅目害虫中的应用。

所述鳞翅目害虫为小地老虎、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾。

所述应用为将杀虫基因蛋白Vip3X制成杀虫剂用于防治鳞翅目害虫，所述杀虫基因蛋白Vip3X的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或者将上述杀虫基因vip3X转入植物或微生物中表达抗鳞翅目害虫的特性。

所述杀虫基因vip3X具有如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，所述植物为玉米。

本发明是从菌株BTA5D1（保藏号：CGMCC No.6781），公众还可以从中国农业科学院植物保护研究所取得）克隆得到的一个新基因，全长为2370bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO1，其编码的氨基酸序列为790个见SEQ ID NO2所示。

经过杀虫活性测定，该基因蛋白对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾有高毒力。

针对上述杀虫活性区氨基酸序列，本发明设计合成了用于转基因植物开发的DNA序列，如SEQ ID NO3所示。该合成序列导入到玉米中，对小地老虎有较好的抗虫活性。

保藏信息：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2012年11月06日，保藏编号：CGMCC No.6781

分类命名：苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis

附图说明

图1vip3X基因小片段的PCR鉴定图谱

图2vip3X基因全长序列PCR扩增图

M:DNA marker DL10000；1:BTA5D1中vip3基因

图3vip3X基因在Rosetta(DE3)菌株中的表达

M:protein marker；1:pEB；2:pEB-Vip3X

图4表达载体pUS构建流程图

图5抗性植株PCR检测

M：Wide-range Marker；P：pUX；CK：阴性对照；1～10：部分转基因植株

图6PCR阳性植株中Vip3X蛋白占可溶性蛋白比例

图7T0代转基因植株的小地老虎生物活性测定

左为转Vip3X基因玉米，右为非转因玉米。

具体实施方式

1.大肠杆菌JM110和Rosetta(DE3)菌株热击感受态的制备及转化

挑取单菌落于5ml LB液体培养基，37℃震荡培养过夜；按1%接种量接种于100ml LB液体培养基中，37℃，220rpm培养2-2.5hr，（OD₆₀₀=0.5-0.6）；4℃，4000rpm离心10min；弃上清，向沉淀中加入50ml预冷的0.1mol/L CaCl₂悬浮细胞,置于冰上30min；4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；用2-4ml冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬细胞，分装成200μL/0.5mL离心管中，于4℃保存，一周内用完。将200μL感受态细胞与质粒混匀，冰浴30min，42℃热击1.5min，冰浴3min，加入800μL LB培养基，37℃培养60min，取200μL涂板，37℃培养。

2.vip3基因的鉴定

参照GenBank公布的vip3类基因编码区的N-端和C-端的序列同源性，设计并合成了一对特异性引物VIP-F/VIP-R，序列如下：

VIP-F:5‘-TCTATGTTGAGTGATGTA-3’

VIP-R:5‘-TTGATANGCAGGTGTAA-3’

以标准菌株BTA5D1的总DNA为模板，进行PCR扩增。50μL的PCR反应体系为：

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min；50℃退火30s；72℃延伸30s,30个循环；最后72℃延伸10min。结果表明（图1），菌株BTA5D1进行vip3基因鉴定获得阳性产物。

3.vip3X基因的克隆及序列分析

设计并合成了一对vip3X基因全长引物VIP3F/VIP3R，序列如下：

VIP3F:5‘-ATGAATATGAATAATACTAAATT-3’

VIP3R:5‘-TTACTTAATTGAGACATCG-3’

以苏云金芽胞杆菌菌株BTA5D1的总DNA为模板，利用2×Primer Star mix进行PCR扩增得到vip3X全长基因。50μL的PCR反应体系为：

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min；50℃退火30s；72℃延伸30s,30个循环；最后72℃延伸10min。结果表明，经过PCR扩增，得到2.37kb的全长片段（图2）。将回收纯化的vip3X全长基因与载体pEB连接，转化受体菌E.coli JM110，鉴定正确后，测序得到vip3X全长基因序列（SEQ ID NO1、SEQ ID NO2），提取质粒DNA转化E.coliRosetta(DE3)菌株。

4.vip3X基因在Rosetta(DE3)菌株中的表达

将扩增到的vip3X全长基因插入到pEB的表达框的Ecl136II位点，得到了基因的表达载体，pEB-Vip3X含有vip3X基因。转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，筛选方向正确的阳性克隆，测序确定阳性克隆。将表达菌株在LB培养基中37℃、220r/min，培养至对数生长期，加入终浓度1mmol/L IPTG、20℃、150r/min培养，诱导表达18h，取菌液离心弃上清，加入0.5mol/LTris-HCl(pH=8.0)超声破碎，取上清用于SDS-PAGE检测，结果如图3所示，说明vip3X基因在大肠杆菌中表达，分子量约为88kDa，定量后用于生物活性的测定。

5.Vip3X蛋白杀虫活性测定

杀虫活性的测定采用饲喂法。将Vip3X蛋白以不同的浓度与人工饲料混合，充分混匀，将小地老虎、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾幼虫分别接于饲料上培养48小时（小地老虎、小菜蛾）和7天（棉铃虫、甜菜夜蛾）后，调查死、活虫数，统计死亡率，并用POLO软件分析数据，计算LC₅₀。用vip3X基因表达产物分别进行了对小地老虎（Agrotis ipsilon）、小菜蛾（Plutellaxylostella）、棉铃虫（Helicoverpa armigera）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）四种鳞翅目昆虫的生物活性测定。Vip3X对四种昆虫均有较高的活性：Vip3X对小地老虎的LC₅₀为5μg/mL；对小菜蛾的LC₅₀为141μg/mL；对棉铃虫的LC₅₀为287μg/mL；对甜菜夜蛾的LC₅₀为2μg/mL。

6.vip3X基因核苷酸序列的改造

根据Vip3X蛋白的杀虫活性区氨基酸序列设计合成了可以用于转基因植物开发的DNA序列，如SEQ ID NO3。去除了多聚腺苷酸化信号37个，GC含量提高了10%。该序列具有GC含量为41%的特征；含有利于植物表达的序列，具体见SEQ ID NO3。在基因上游添加了Ω序列，在基因3’端添加了内质网定位信号。该合成序列由组成型Ubiquitin启动子驱动，导入到玉米中，对小地老虎有较好的抗虫活性。

SEQ ID NO3

GGATCCTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTAC AATTACAACCATGAACATGAACAACACCAAGTTGAACGCAAGGGCCCTACCGTCCTTCATTGACTACTTCAATGGCATCTACGGCTTTGCCACTGGTATCAAAGACATCATGAACATGATCTTCAAGACGGATACAGGTGGTAATCTAACCTTAGACGAGATCCTAAAGAATCAGCAGTTACTGAATGAGATCTCTGGTAAGTTGGATGGGGTCAATGGGAGCTTGAATGATCTTATCGCACAGGGTAACTTGAATACCGAGTTGTCTAAGGAGATCTTGAAGATAGCAAATGAACAGAACCAGGTCTTGAATGATGTTAACAACAAACTCGATGCCATCAACACGATGCTTCACATCTACCTACCCAAGATCACCTCTATGCTGAGTGATGTTATGAAGCAGAACTACGCGTTGAGTCTGCAGATAGAGTACCTGTCCAAGCAATTGCAAGAGATCTCTGACAAGTTGGACATCATCAACGTTAATGTCCTTATCAACTCTACACTTACTGAGATCACACCTGCATATCAACGGATCAAGTACGTGAATGAGAAGTTCGAAGAGTTGACCTTTGCTACAGAAACCACTTTGAAAGTCAAGAAGGATAGCTCGCCTGCTGACATCCTTGATGAGTTAACTGAGTTGACTGAACTAGCCAAATCCGTTACTAAGAACGACGTTGATGGTTTTGAGTTCTACCTTAACACCTTCCACGATGTTATGGTTGGTAACAACTTGTTCGGGCGTTCAGCTTTGAAAACTGCTTCAGAGTTGATTGCTAAAGAGAACGTGAAAACAAGTGGCAGTGAAGTTGGCAATGTTTACAACTTCCTGATTGTACTTACAGCTTTGCAAGCCAAGGCTTTCCTTACTCTTACAACATGCCGAAAACTTCTTGGCTTAGCAGACATCGATTATACTAGCATCATGAATGAACATCTTAACAAGGAGAAAGAGGAGTTCCGTGTTAACATCCTTCCTACCCTTTCAAACACCTTCAGCAATCCTAACTACGCAAAAGTTAAGGGTTCCGATGAAGATGCAAAGATGATAGTGGAAGCTAAACCAGGACATGCATTGGTTGGGTTTGAAATGAGCAATGATTCAATCACAGTTCTTAAGGTCTACGAGGCTAAGCTGAAACAGAACTACCAGGTTGATAAGGATTCCTTATCGGAGGTTATTTACGGTGATATGGACAAACTTTTGTGTCCAGATCAATCTGAACAGATCTACTACACGAACAACATAGTCTTCCCAAATGAATACGTCATTACCAAGATTGACTTCACTAAGAAGATGAAGACGCTTCGTTATGAGGTAACAGCTAACTCGTATGATTCGTCTACAGGAGAGATTGACCTTAACAAGAAGAAAGTAGAGTCATCCGAAGCGGAGTATAGGACGTTAAGTGCTAAGGATGATGGAGTGTACATGCCCTTAGGTGTCATCTCCGAAACCTTCTTGACTCCCATTAACGGGTTTGGCCTCCAAGCTGATGAGAACTCAAGACTTATTACTCTTACATGTAAGTCATATCTTAGAGAACTACTGTTAGCAACAGACTTAAGCAATAAGGAAACCAAGTTGATCGTCCCACCAAGTGGTTTCATTTCCAACATTGTAGAGAATGGGAACTTAGAGGGAGAAAACTTAGAGCCGTGGATAGCCAACAACAAGAATGCGTATGTAGATCATACAGGCGGAGTGAATGGTACTAGAGCACTCTATGTTCATAAGGACGGAGGATTCTCACAATTCATAGGAGATAAGCTCAAACCGAAAACTGAGTATGTGATCCAATATACTGTTAAGGGTAAACCTTCTATTCATCTCAAAAATGAGAATACTGGCTATATTCATTATGAAGATACCAACAACAATCTCGAAGACTATCAAACCATTACGAAACGTTTCACTACAGGAACTGATCTCAAGGGAGTGTATCTCATTCTCAAAAGTCAAAATGGAGATGAAGCCTGGGGAGATAACTTTACCATCTTGGAGATTAGTCCTTCTGAAAAGCTCCTCAGTCCAGAACTCATCAATGTGAATAATTGGATACGCACTGGATCAACTCACATTAGCGGTAATACCCTCACTCTCTATCAGGGAGGAGGTGGCAATCTGAAACAAAACCTTCAACTGGACTCCTTTTCAACCTATAGAGTGAACTTCTCTGTGACCGGAGATGCTAATGTAAGGATTCGCAATTCTAGGGAAGTGCTGTTTGAGAAACGATATATGAGCGGTGCTAAAGATGTTTCTGAGATCTTCACTACCAAGTTGGGGAAAGATAACTTCTACATAGAGCTTTCTCAAGGGAACAATCTGTATGGTGGTCCTCTTGTGAAGTTCAACGATGTCTCAATCAAG

TGATAAGAGCTC

单下划线为Ω序列，双下划线为KEDL内质网定位信号，上游添加了BamH Ⅰ，下游添加了Sac I酶切位点，便于载体构建。合成序列与原有核苷酸序列有86%的相似性。

7．植物表达载体构建

用BamHⅠ和SacⅠ双酶切中间载体p3300-Ubi，将回收的载体片段分别与用同样两个限制性内切酶消化的vip3X片段（包括优化序列和作为对照的未优化序列）相连，得到两个载体，构建流程见图4，该载体含有由组成型启动子Ubiquitin驱动的vip3X基因，筛选标记为bar基因。

8．玉米遗传转化

玉米的控制授粉

(1)玉米抽雄后，用大口袋套住雄穗，下面用别针别住，收集花粉；

(2)雌穗花丝未抽出前，用小口袋将其套住，并用大头针别好；

(3)在授粉的前一天，当花丝伸出约2cm长时，用剪刀剪去花丝的顶部，促进其伸长；

(4)第二天，当花丝伸长后，依下列组合进行授粉（前为母本，后为父本）：齐31×综31；

(5)授粉后系上小牌，写上授粉的品种和日期，10～12天后收获；

幼胚的剥离和培养

(1)将新收获的玉米雌穗去掉苞叶、花丝，花丝一定要去干净，可用酒精灯将未除净的花丝烧去；用小刀去掉雌穗的头尾部分；

(2)将雌穗浸在70%乙醇中灭菌30sec；

(3)将雌穗取出，浸在2.5%的次氯酸纳中灭菌10～15min，可以在溶液中加几滴Tween20；

(4)用灭菌水清洗3次，用滤纸擦去残留的水珠，置于无菌的环境中备用；

(5)将一只枪式镊子从顶部插入雌穗，用左手持住镊子，右手用装有#21刀片的手术刀切去籽粒的上半部分；

(6)换上#10刀片，将刀尖插入籽粒下部的果皮与胚乳之间，将胚乳挑出；

(7)用刀尖将粘在胚乳顶部或顶部果皮内的幼胚转移到诱导培养基上，操作要小心，不要损伤幼胚。放置时注意胚轴（较平的一面）向下，盾片向上，每皿约放置20～30个；

(8)27～28℃暗培养3～4周，使之开始脱分化，形成愈伤组织；此后，选择生长迅速、质地松脆、颜色鲜亮的愈伤组织继代培养，每2～3周继代一次，选择生长良好的愈伤准备基因枪转化；

(9)在射击前4hr，将切成小块的愈伤转移到含0.4M甘露醇的高渗培养基上；

(10)射击后，使愈伤在高渗培养基上继续培养过夜，然后转移到诱导培养基上，恢复培养一周。

用基因枪进行玉米转化

(1)打开超净台，用70%乙醇擦拭超净台内部和基因枪的表面及内部；

(2)打开紫外灯，灭菌30min；

(3)按前述步骤准备微弹；

(4)易裂片、微弹载体、阻拦网灭菌（置于70%乙醇中1.0min，放在滤纸上自然风干）；

(5)打开气瓶，调节压力至2,000psi；

(6)按前述方法安装微弹载体和微弹；

(7)将易裂片、阻拦网和微弹载体安装进固定装置中；射击参数为：Gap distance:20mm；微弹载体飞行距离(Macroprojectile flight distance)：10mm；微弹飞行距离(Particle flightdistance)：7cm；压力：1,350psi；真空度：25inches Hg.；

(8)把培养皿放在托盘上，使愈伤都集中在托盘中间的圆圈内，将托盘插入倒数第二档；

(9)打开基因枪的电源；

(10)打开真空泵；

(11)关闭基因枪的门，按下“抽真空”键（Vac），当真空表读数达到25inches Hg.时，使键置于“保持（Hold）”档；

(12)按下“射击（Fire）”健直到射击结束；

(13)按下“放气”健，使真空表读数归零；

(14)打开基因枪门，取出培养皿，盖好盖子并用封口膜封好；

(15)重复上述步骤，直至完成转化。

转化愈伤组织的筛选和植株的再生

(1)将转化后的愈伤组织置于黑暗中，28℃培养过夜，然后转移到N6诱导培养基上培养5～7天；

(2)将愈伤转移到筛选培养基上（含PPT20mg/L），两周继代一次，选择色泽正常、分化良好的愈伤，弃去衰老死亡的愈伤。每皿的培养物不宜过多，愈伤块应尽量小些，并使愈伤紧贴培养基；

(3)继代3～4次后，将愈伤移至N6分化培养基上，在光周期为亮/暗=16/8，28℃条件下培养，每两周继代一次；

(4)将发生绿芽的愈伤组织切分；

(5)当小植株长到1～2cm高时，转移进三角瓶中（含MS生根培养基）继续培养；

(6)3～4叶期且根系较发达时，将小苗移入小花盆中，移入温室培养；二周后移入大花盆，

直至开花结实。

9．转基因植株的PCR检测

转基因植株基因组DNA的提取―SDS法

1.称取0.2g的叶片放入1.5ml离心管，用液氮充分研磨成粉末。

2.加入500μl SDS-Buffer（100mM Tris，50mM EDTA，500mM NaCl，pH8.0），混匀。再加入20μl20%SDS，轻轻混匀后置于65℃水浴10分钟。

3.加入250μl5M KAc，混匀，冰上放置30分钟。

4.4℃离心，12000rpm，10分钟。

5.取上清，移入新的离心管中，加入等体积的异丙醇中，冰浴5分钟。

6.4℃离心，12000rpm，10分钟。

7.弃上清，70%乙醇洗涤两次，真空干燥DNA后，加入40μl无菌双蒸水溶解，-20℃保存备用。

PCR检测

PCR反应条件

检测引物：

VIP3F:5‘-ATGAATATGAATAATACTAAATT-3’

VIP3R:5‘-TTACTTAATTGAGACATCG-3’

经过抗性筛选得到10株抗性植株，提取抗性植株基因组，以其做模板，进行PCR检测，共得到6株PCR阳性植株（图5）。提取PCR阳性植株可溶性蛋白，4号植株Vip3X蛋白的含量最高可占总可溶蛋白的0.19%。（见图6）。未优化序列的对照载体的PCR阳性植株未检测到蛋白表达。

10.PCR阳性植株的生物活性测定

将PCR阳性植株移栽，当植株生长到6～8叶时，将小地老虎初孵幼虫接于心叶中,以未转化植株作为阴性对照，接虫2周后调查食叶级别。结果显示,人工接虫小地老虎后，转基因植株单株间的抗虫性表现有一定差异：转基因植株对小地老虎表现为抗性，没有或只有很小的小地老虎危害的虫孔(图7)，未转化植株被小地老虎咬食严重,叶片虫孔大且虫孔数目多，已影响到植株的正常生长。

表1T₀代转基因植株的抗虫性统计

Claims (8)

1.对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因vip3X，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

2.一种表达载体，其含有权利要求1所述的杀虫基因vip3X。

3.如权利要求2所述的表达载体，其为pUS，结构如图4中所示。

4.对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因vip3X在杀害鳞翅目害虫中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，所述鳞翅目害虫为小地老虎、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾。

6.如权利要求5所述的应用，为将杀虫基因蛋白Vip3X制成杀虫剂用于杀害鳞翅目害虫，所述杀虫基因蛋白Vip3X的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。

7.如权利要求5所述的应用，为将权利要求1所述的杀虫基因vip3X转入植物或微生物中，表达抗鳞翅目害虫的特性。

8.如权利要求7所述的应用，所述杀虫基因vip3X具有如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，所述植物为玉米。

Images