CN102153634B - 一种Bt二元毒素蛋白、编码该蛋白的基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的Bt二元毒素，包括Vip1Ac1和Vip2Ae3蛋白，所述Vip1Ac1蛋白具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的蛋白，所述的Vip2Ae3蛋白，具有SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的蛋白。本发明还提供编码上述蛋白的基因。本发明的二元毒素可以用于制备杀虫剂，所述基因可以转化水稻、玉米、小麦和蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

Description

一种Bt二元毒素蛋白、编码该蛋白的基因及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的Bt蛋白，编码该蛋白的基因和应用。

背景技术

在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失的重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。我国每年因各种病虫害而损失粮食4000万吨，约占全国粮食总产量的8.8％。据最新统计，我国发生的农作物主要病虫草害有1648种，其中虫害有838种。农业类害虫主要集中在鳞翅目之中，鞘翅目金龟甲总科内部分昆虫，如蛴螬，也是重要的世界性分布地下害虫，危害双子叶和单子叶粮食作物、多种蔬菜、油料、芋、棉、牧草以及花卉和果、林等播下的种子及幼苗。大量调查表明，蛴螬在地下害虫中为害居首位，占总地下害虫量的70-80％上。

为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但化学防治可对植物产生药害，引起人畜中毒，杀伤有益微生物，导致病原物产生抗药性。农药的高残留还可造成环境污染，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具对环境污染小，能有效的地保护天敌，发挥持续控制作用，并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在营养生长中期至稳定前期可产生具有杀虫活性的可溶性蛋白，名营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidalproteins，简称VIPs)，VIPs是由vip基因编码的，对敏感害虫有强烈的毒性，对高等动物和人无毒(Dong et al.，2007)VIPs的同源性与杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal proteins，简称ICPs)的同源性不同，作用机理以及受体不同；VIPs可以杀死ICPs不能杀死的害虫而扩大杀虫谱(Zhu et al.，2006)，并且可以杀死对ICPs产生抗性的害虫以解决害虫的抗性问题。因此，VIPs被赋予第二代杀虫蛋白称谓。自第一个VIPs发现以来，已经有数十个VIPs被发现，并被广泛地应用于控制鳞翅目和鞘翅目害虫。因此，VIPs将会成为生物防治剂和转基因抗虫工程植物的重要资源。

自1996年Estruch从菌株中克隆了第一个能表达出对多种鳞翅目害虫有杀虫活性的vip基因以来(Estruch et al.，1996)，人们已经分离克隆了80多种编码VIPs的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore et al.，1998)。目前所发现的营养生长期蛋白主要分为三类，即Vip1，Vip2和Vip3。

Vip1和Vip2主要产生与蜡状芽孢杆菌的营养生长期，是典型的二元毒素，约100kDa大小的Vip1多聚体蛋白与敏感害虫的中肠上皮受体结合后为约52kDa大小的Vip2进入靶细胞细胞质提供通道，从而导致细胞凋亡。Vip1和Vip2二元毒素主要对鞘翅目害虫有效，如：玉米根萤叶甲(Diabrotica virgijera virgifeva Leconte)，是一种原产北美洲南部和中美洲北部并于1992年以来在欧洲快速传播扩散的危险性玉米害虫，在美国是最重要的玉米害虫，该虫有较广的适生性和扩展性，并被我国列为检验检疫害虫(Warren et al.，1997；陈宏等，2009)。该虫危害大，传播速度快，且传入我国的可能性也很高，据预测分析我国大面积地区是玉米根萤叶甲的适生区，因此，寻找能高效防治此危险性害虫的新型毒素蛋白势在必行(张俊华等，2009；张丽杰等，2002)。

Vip3主要产生于苏云金芽孢杆菌的营养生长期，分子量约88kDa，其被取食后被水解为62kDa的多聚体并与敏感害虫中肠上皮的刷状缘膜囊结合，从而诱导细胞凋亡，对鳞翅目有毒杀作用，如小地老虎(Estruch et al.，1996；Yu et al.，1997；Milne et al.，2008)。小地老虎为多食性害虫，寄住范围十分广泛，能危害多种农作物，为农作物生产带来巨大的损失，目前还没有其他的Bt内毒素可以杀死该害虫，但是Vip3毒性蛋白可以杀死它。因此，Vip3类毒蛋白越来越受到大家的关注，被广泛的应用于鳞翅目害虫的防治，但是对Vip3蛋白多样性的理解是有限的，且Vip3毒素对控制害虫的潜能还没有被深入的研究。Vip3毒素蛋白不仅仅应用于生物杀虫剂的开发，其还被用于转基因以防治害虫，目前已经有vip3基因被转入玉米植株当中，可杀死多种鳞翅目害虫，且为解决Cry1A毒素的抗性问题提供新的方法(Christou et al.，2006)。

自本世纪初发现苏云金芽孢杆菌至今已有100多年的历史，在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是，由于大规模和反复使用苏云金芽孢杆菌，许多昆虫种群已相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(McGaughey，1985)，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)在Dipel(Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik et al.，1994)；上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏，1996；Hofte et al.，1988)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf et al.，1998)。另外，有研究证明Bt在大田的使用中尚未发现抗性问题(Regis et al.，2000)，但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现(Georghiou and Wirth，1997.)。

为增加杀虫谱和避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力基因资源是解决抗性问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的在于提供一种BT二元毒素Vip1Ac1和Vip2Ae3蛋白，编码所述蛋白的基因及其应用。

本发明从四川省海螺沟土原始森林壤中分离得到的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HL12，该菌株已于2010年6月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(保藏号为CGMCCNo.3912)。通过对HL12的毒力测试表明，HL12对鞘翅目、鳞翅目害虫等等，均具有极高的毒力。根据vip1和vip2类基因保守序列设计2对特异引物，扩增其基因组DNA，结果表明该菌株存在vip1和vip2类基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到vip1Ac1和vip2Ae3基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，全长分别为2310bp和1389bp。分析表明，vip1Ac1基因的GC含量为34.29％，编码770个氨基酸组成的蛋白，分子量约86kDa；vip2Ae3基因的GC含量为30.96％，编码463个氨基酸组成的蛋白，分子量约52kDa。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示，将其命名为Vip1Ac1和Vip2Ae3。Vip1Ac1蛋白的氨基酸组成如表1；Vip2Ae3蛋白的氨基酸组成如表2。

表1 Vip1Ac1蛋白的氨基酸组成

氨基酸	百分比％	氨基酸	百分比％
				Ala(A)：	4.19	Met(M)：	2.09
Cys(C)：	0.24	Asn(N)：	7.41
				Asp(D)：	7.46	Pro(P)：	3.57
Glu(E)：	6.48	Gln(Q)：	4.68
				Phe(F)：	4.63	Arg(R)：	2.44
Gly(G)：	3.53	Ser(S)：	6.21
				His(H)：	1.24	Thr(T)：	6.80
Ile(I)：	6.04	Val(V)：	5.51
				Lys(K)：	11.85	Trp(W)：	2.04
Leu(L)：	7.22	Tyr(Y)：	6.35

表2 Vip2Ae3蛋白的氨基酸组成

氨基酸	百分比％	氨基酸	百分比％
				Ala(A)：	3.52	Met(M)：	2.21
Cys(C)：	0.40	Asn(N)：	6.96
				Asp(D)：	6.14	Pro(P)：	2.08
Glu(E)：	8.96	Gln(Q)：	3.85
				Phe(F)：	4.90	Arg(R)：	3.15
Gly(G)：	3.34	Ser(S)：	5.88
				His(H)：	1.53	Thr(T)：	5.10
Ile(I)：	6.91	Val(V)：	4.63
				Lys(K)：	14.44	Trp(W)：	2.02
Leu(L)：	9.50	Tyr(Y)：	4.47

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明Vip蛋白还包括SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有二元毒素Vip1Ac1和Vip2Ae3蛋白同等活性的由Vip1Ac1和Vip2Ae3衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的基因和蛋白质可以从菌株HL12克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。

可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转vip1Ac1和vip2Ae3基因的转化体，例如农作物或者果树等植物，使其具备抗虫活性。

此外，还可以通过发酵本发明菌株HL12，得到含有二元毒素Vip1Ac1和Vip2Ae3蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明Vip蛋白。

本领域技术人员还可以根据本发明公开的基因，将其转化水稻、玉米、棉花、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

本发明提供的新的毒力蛋白，其对鞘翅目等害虫有较好的杀虫活性，如：华北大黑鳃金龟、玉米象、绿豆象等；其不仅能增加杀虫谱，还能避免昆虫产生抗性，对我国的生物防治有着十分重要的意义。

附图说明

图1为克隆得到的vip1Ac1和vip2Ae3全长基因的凝胶电泳图，其中M：marker；1：vip1Ac1基因；2：vip2Ae3基因。

图2为vip1Ac1的单价重组质粒、vip2Ae3的单价基因重组质粒，以及vip1Ac1和vip2Ae3二价重组质粒pCO-1Ac-2Ae的酶切鉴定图谱，其中M，marker；1：质粒pCO-2Ae的EcoR I+Sal I双酶切产物；2：pCO-1Ac的Nde I+Xho I双酶切产物；3：插入vip2Ae3基因；4：pCO-1Ac-2Ae的EcoR I+Sal I双酶切产物；5：pCO-1Ac-2Ae的EcoRI+Xho I双酶切产物；6：pCO-1Ac-2Ae的Nde I+Xho I双酶切产物；7：插入vip1Ac1基因。

图3为vip1Ac1和vip2Ae3单价及二价基因在E.coli BL21(DE3)中诱导其表达后的SDS-PAGE检测图，其中M：蛋白marker；1：阴性对照E.coli BL21(DE3)(pCO-LADuet)；2：E.coiiBL21(DE3)(pCO-1Ac)；3：E.coli BL21(DE3)(pCO-1Ac-2Ae)；4：E.coliBL21(DE3)(pCO-2Ae)；5：野生菌HL12营养生长期蛋白。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 vip1Ac1基因的克隆

本发明从四川省海螺沟原始森林地区土壤中分离得到的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株，该菌株已于2010年6月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1院号3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏号为CGMCCNo.3921。

本例通过如下方法克隆得到vip1Ac和vip2Ae3基因的全长序列。

采用基因组DNA纯化试剂盒(购自AXYGEN公司)提取菌株HL12的总DNA。设计引物序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.7和SEQ ID No.8所示，其中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列用来扩增vip1Ac，SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示序列用于扩增vip2Ae3。

PCR反应体系：

10×buffer(含MgCl₂)     5μl

Taq酶                   0.5μl

dNTPs(10mM)             1μl

引物                    5μl

模板                    1μl

最终反应体积            50μl

热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火温度根据引物而定，72℃延伸根据全序列长度而定，30个循环；72℃延伸10min；4℃停止反应。扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。

结果如图1所示，用序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物扩增得到了约为2310bp的序列，将该序列进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。用序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物扩增得到了约为1400bp的序列，将该序列进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2 vip1Ac1和Vip2Ae3二价基因的表达及杀虫活性测定

由于Vip1和Vip2是二元毒素，因此，选择二价表达载体pCOLADuet-1为载体(购自默克公司)，将HL12菌株中扩增出的vip1Ac1和vip2Ae3基因同时插入该载体，诱导其表达后做生物测定。

根据vip1Ac1和vip2Ae3基因开放阅读框两端序列，设计并合成两对特异性引物，序列如SEQ ID No.9～12所示。

以HL12总DNA为模板进行扩增，反应程序和扩增条件同实施例1；扩增的vip1Ac1采Nde I和EcoR I进行双酶切，扩增的vip2Ae3用EcoR I和Sal I进行双酶切，酶切产物先后与同样进行双酶切后的双价基因表达载体pCOLADuet-1连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，提取其质粒酶切电泳验证了插入片断大小符合预期目的(图2)，再转入受体菌E.coli Rosetta(DE3)。将重组质粒命名为pCO-1Ac-2Ae，含重组质粒的重组子命名为E.coli-Rosetta(1Ac-2Ae)。SDS-PAGE分析vip1Ac1和vip2Ae3基因的表达产物(图3)，Vip1Ac1分子量约为100kDa，Vip2Ae3的分子量约为52kDa左右，与预测的蛋白分子量相符。

vip1Ac1和vip2Ae3基因的表达产物以及其二价基因表达产物对华北大黑鳃金龟、玉米象和绿豆象做生物测定，其结果如表1所示。两个基因的单价表达菌体裂解液对这三种鞘翅目无杀虫活性，但是相同浓度二价表达菌体裂解液对它们有一定的杀虫活性，这个结果也符合Vip1和Vip2二元毒素的杀虫机理，即Vip1Ac1与敏感害虫的中肠上皮受体结合后为Vip2Ae3进入靶细胞细胞质提供通道，从而导致细胞凋亡。二价基因表达蛋白对三种害虫的毒性从置信区间来看有部分重叠，所以其毒性差异不大。单从致死中浓的数值来看，vip1Ac1和vip2Ae3基因的共表达蛋白对玉米象的毒性最大，其致死中浓为38.29μg/mL；对绿豆象的毒性次之，其致死中浓为42.15μg/mL；对华北大黑鳃金龟毒杀活性相对最弱，其致死中浓为65.76μg/mL。毒性测定以E.coli-Rosetta(pCOLADuet)菌体裂解液作为阴性对照，其对三种测试害虫无杀虫活性。

表1 Vip1Ac1和Vip2Ae3二元毒素的杀虫活性

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种Bt二元毒素，其特征在于，包括Vip1Ac1蛋白和Vip2Ae3蛋白，编码Vip1Ac1蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码Vip2Ae3蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.含有编码Vip1Ac1蛋白和Vip2Ae3蛋白的基因的载体，编码Vip1Ac1蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码Vip2Ae3蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求2所述载体的宿主细胞。

4.含有权利要求1所述二元毒素的杀虫剂。

Images