CN105368733A - 一株苏云金芽孢杆菌新菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种苏云金芽孢杆菌（<i>Bacillusthuringiensis</i>）新菌株BN23-5，保藏号为CGMCCNo.9448。通过对BN23-5的毒力活性测试表明，BN23-5对鳞翅目等，具有极高的毒力。可以将本发明苏云金芽孢杆菌BN23-5制成杀虫剂，用于重要农作物害虫的防治。从而使苏云金芽孢杆菌杀虫剂的产品多样化和系列化，扩大了苏云金芽孢杆菌杀虫剂的使用范围，降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

Description

一株苏云金芽孢杆菌新菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物新菌株及其应用，具体地说是一种苏云金芽孢杆菌及其在农业虫害防治中的应用。

背景技术

在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素。据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14%，病害损失达12%，草害损失达11%。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。

苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白（Insectididalcrystalproteins，简称ICPs），ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。

自1981年Schnepf从菌株HD-1Dipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来（AdangM.Jetal,Characterizedfull-lengthandtruncatedplasmidclonesofthecrystalproteinofBacillusthuringiensissubsp.kurstakiHD-73andtheirtoxicitytoManducasexta,Gene,1985，36(3)：289～300.），人们已经分离克隆了700多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(CrickmoreN,ZeiglerDR,FeitelsonJ,etal.RevisionofthenomenclaturefortheBacillusthuringiensispesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev,1998,62:807-813;http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。一般而言，Cry1,Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cry1和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治(Kozie,M.G.,Beland,G.L.,Bowman,C.,etal.FieldperformanceofelitetransgenicmaizeplantsexpressinganinsecticidalproteinderivedfromBacillusthuringiensis.Bio/Technology,1993,11:194-200；Perlak,F.J.,Deaton,R.W.,Armstrong,T.A.，etal.Insectresistantcottonplants.bio/technology，1990；8:939-943；VanFrankenhuyzen,K.,Gringorten,L.,andGauhier,D.1997.Cry9Ca1toxin,aBacillusthuringiensisinsecticidalcrystalproteinwithhighactivityagainstthesprucebudworm(Choristoneurafnniferana).Appl.Environ,Microbviol.63:4132-4134;王飞，2001，苏云金芽孢杆菌特异菌株生物学特性及cry9新基因的研究，硕士论文，南开大学)。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B.thuringiensissubsp.israelensis,简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛运用于蚊虫的防治（GoldbergLJ,andMargalitJ,1977.AbacterialsporedemonstratingrapidlarvicidalactivityagainstAnophelessergentii，Uranotaeniaunguiculata，Culexunivitattus,Aedesaegypti，andCulexpipiens.MosqitoNews,37:355-358;）。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性（Wu,D.,Johnson,J.J.,andFederici,B.A.1994.SynergismofmosquitocidaltoxicitybetweenCytAandCryIVDProteinsusinginclusionsproducedfromclonedgenesofBacillusthuringiensis.Mol.Microbiol.13:965-972;Wirth,M.C.,Georghiou,G.P.,andFedereci,B.A.1997.CytAenablesCryIVendotoxinsofBacillusthuringiensistoovercomehighlevelsofCryIVresistanceinthemosquito,Culexquinquefasciatus.Proc.Natl.Acad.Sci.94:10536–10540）。

自本世纪初发现苏云金芽胞杆菌至今己有100多年的历史，在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是，由于大规模和反复使用苏云金芽胞杆菌，许多昆虫种群己相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实（McGaughey,W.H.1985.InsectresistancetothebiologicalinsecticideBacillusthuringiensis.Science.229:193-195），原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟（Plodiainterpunctella）在Dipel(Btsubsp.kurstaikHD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性（Tabashnik,B.E.,Finson,N.,Groeters,F.R.,etal.1994.ReversalofresistancetoBacillusthuringiensisinPlutellaxylostella.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:4120-4124），上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成（冯夏.1996.广东小菜蛾对苏云金杆菌的抗性研究.昆虫学报,39(3):238-244;Hofte,H.,VanRie,J.,Jansens,S.,VanHoutven,A.,Vanderbruggen,H.,andVaeck,M.,1988.Monoclonalantibodyanalysisandinsecticidalspectrumofthreetypesoflepidopteran-specificinsecticidalcrystalproteinsofBacillusthuringiensis.Appl.Environ.Microbiol.54:2010-2017）。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性（Schnepf,E.,Crickmore,N.,VanPie,J.,etal.1998.BacillusthuringiensisanditspesticidalCrystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3):775-806）。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题（RegisL,etal.,2000.TheuseofbacteriallarvicidesinmosquitoandblackflycontrolprogramsinBrazil.Mem.InstitutoOswaldoCruz,95:207-210.）,但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现（GeorghiouGP,andWirthMC,1997.InfluenceofexposuretosingleversusmultipletoxinsofBacillusthuringiensissubsp.israelensisondevelopmentofresistanceinthemosquitoCulexquinquefasciatus(Diptera:Culicidae).AppliedandEnvironmentalMicrobiology,63:1095-1101.）。

为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力菌株及基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治也有着十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种对农业生产和卫生安全领域的一些主要害虫，特别是蔬菜、棉花、玉米、水稻、以及森林等鳞翅目害虫具有较高毒力的苏云金芽孢杆菌新菌株BN23-5。

本发明菌株是四川省成都市地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）新菌株，该菌株已于2014年07月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis），保藏号CGMCCNo.9448。

BN23-5具体通过如下方法筛选获得：采用醋酸钠－抗生素分离法，称取10g土样（四川省成都市地区）放入装有50ml醋酸钠培养基的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素各400μg/ml，摇床培养（200r/min，30℃）4h。培养结束后取土壤悬液10ml，加入无菌的离心管3000r/min离心15min，取上层混浊液2ml于65℃水浴15min，取热处理后的混浊液0.1ml涂平板，将平板置30℃培养箱中培养；48h后从平板上挑取类似Bt的菌株涂片，发现一株含有菱形晶体形态的Bt菌株，将其命名为BN23-5。

该菌株BN23-5细胞呈杆状，两端钝圆，能形成芽胞，同时能形成菱形伴胞晶体，见附图1。菌株大小为(1.2-1.5)μm×(3.5-4.4)μm，通常单个、或两个、或短链细胞存在，一个营养细胞为一个孢子囊，每个孢子囊内含有一个芽孢，次端生，另一端有一个伴孢晶体，孢子囊不膨大。

经鉴定，关于该菌株的信息包括：能形成芽胞，同时能形成菱形伴胞晶体（图1），SDS-PAGE电泳表明，菌株BN23-5主要产生约130kDa左右大小的蛋白（图2）；生物学测定表明，该菌株对小菜蛾杀虫活性最高，LC ₅₀ 为1.27ug/mL；对玉米螟的LC ₅₀ 为3.49ug/mL；对甜菜夜蛾杀虫活性最低，LC50为70.66ug/mL（表1）。

本发明进一步对菌株BN23-5中的cry基因进行了鉴定。结果表明，BN23-5中存在cry1类基因（图3）。采用基因组DNA纯化试剂盒（购自赛百盛公司）提取菌株BN23-5的总DNA；分别设计全长基因引物并以菌株BN23-5总DNA为模板扩增得到cry1Ha-like的全长基因，结果表明该基因的全长约为3507bp（图4）。将其纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接，转化，挑取有目的片段的阳性克隆，进行测序。将测序结果在GenBank上进行检索，结果表明所获得的基因为新基因。cry1Ha-like基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO5所示。现将它命名为cry1Hc1。

通过对BN23-5的毒力测试表明，BN23-5对鳞翅目害虫具有极高的毒力。因而，可以将本发明苏云金芽孢杆菌BN23-5制成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。从而使苏云金芽孢杆菌杀虫剂的产品多样化和系列化，扩大了苏云金芽孢杆菌杀虫剂的使用范围。本领域技术人员还可以根据本发明公开的基因，将其转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为BN23-5菌株的菱形伴孢晶体、芽孢及营养细胞（5000×）；

图2为BN23-5菌株SDS-PAGE电泳分析，其中：M为蛋白质Marker；

图3为BN23-5菌株中cry基因型的PCR鉴定，其中：M为DNAMarker，1为cry1类基因扩增产物；

图4菌株BN23-5中cry1Hc1全长基因的PCR扩增产物，其中：M，DNAmarker;1,Cry1Hc1基因。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1含有多种cry基因的苏云金芽孢杆菌的筛选与鉴定

土壤采自四川省成都市地区土壤。采用醋酸钠－抗生素分离法，称取10g土样放入装有50ml醋酸钠培养基的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素各400μg/ml，摇床培养（200r/min，30℃）4h。培养结束后取土壤悬液10ml，加入无菌的离心管3000r/min离心15min，取上层混浊液2ml于65℃水浴15min，取热处理后的混浊液0.1ml涂平板，将平板置30℃培养箱中培养。48h后从平板上挑取类似Bt的菌株涂片。发现一株含有菱形晶体形态的Bt菌株（见附图1）。经用光学显微镜和电子显微镜观察，该菌株细胞呈杆状，两端钝圆，菌株大小为(1.2-1.5)μm×(3.5-4.4)um，通常单个、或两个、或短链细胞存在，一个营养细胞为一个孢子囊，每个孢子囊内含有一个芽孢，次端生，另一端有一个伴孢晶体，孢子囊不膨大。

实施例2菌株BN23-5中cry基因的鉴定

根据cry1类基因保守序列设计1对特异引物：

K5un2（SEQIDNO1）:AGGACCAGGATTTACAGGAGG

K3un2（SEQIDNO2）:GCTGTGACACGAAGGATATAGCCAC

用下列PCR反应体系鉴定：

10×buffer2.5μl

MgCl₂(25mM)1.5μl

Taq酶0.2μl

dNTPs(2.5mM)2μl

引物2μl

模板5μlμ

最终反应体积25μl

热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火温度根据引物而定，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃停止反应。扩增反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。结果如图3所示，利用上述引物分别对模板进行扩增，分别得到了目标扩增产物，表明BN23-5中含有cry基因。

实施例3cry1Ha-like基因的克隆

采用基因组DNA纯化试剂盒（购自赛百盛公司）提取菌株BN23-5的总DNA；设计其全长基因引物P1、P2（引物序列如下）；以菌株BN23-5总DNA为模板分别用所述引物进行PCR扩增，反应体系和反应程序同实施例2；用引物P1和P2扩增cry1Ha-like全长基因，得到长3507bp的片断(见附图4)。将纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接，转化，分别挑取含有有目的片段的阳性克隆，测序，分别得到序列SEQIDNo.1。

P1（SEQIDNO3）：5’ATGGAGAATAAAAATCAACAC3’

P2（SEQIDNO4）：5’CTATTCCTCCATAAGGAG3’

cry1Ha-like基因的序列分析

序列SEQIDNo.7的全长为长3507bp，分析表明，GC含量为39.58%，编码1169个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。在softberry网站采用bacterialsigma7.0promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将其命名为Cry1Hc1。本发明进一步分析了Cry1Hc1蛋白的氨基酸组成（见表2）。

实施例4菌株BN23-5的活性检测

小菜蛾生测：将BN23-5表达的蛋白配制成5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.01ug/mL等6个不同的浓度梯度；选老嫩适中的卷心菜叶片洗净，晾干；紫外灯下照射15min，剪成2×2cm²大小，分放在不同浓度菌液中，浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以LB浸泡叶片作为对照，每个培养皿放4片叶片；选放健康的2-3龄小菜蛾20头；每处理重复3次，置室内，于3d后调查幼虫死亡情况。

玉米螟生测：将BN23-5表达的蛋白配制成10，5，2.5，1.25，0.625，0.01ug/mL等6个不同的浓度梯度，将蛋白加入饲养玉米螟的饲料中混匀，以E.coli.BL21(DE3)混合的饲料为对照，然后每处理投入20头2-3玉米螟，每处理3次重复，7d后调查幼虫死亡情况。

甜菜夜蛾生测：将BN23-5表达的蛋白配制成1，20，40，80，160，320ug/mL等6个不同的浓度梯度，将饲料加入不同浓度的蛋白溶液中，浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以E.coli.BL21(DE3)浸泡饲料作为阴性对照，清水浸泡饲料为空白对照，然后每处理投入20头2-3龄甜菜夜蛾，每处理3次重复，3d后统计结果。用SPSS10.0软件计算LC ₅₀ ；结果如表1，结果表明，E.coli.BL21(DE3)和空白对照对小菜蛾、玉米螟和甜菜夜蛾不具杀虫活性，而菌株对这三类害虫均具有毒杀活性。

序列表说明：

SEQIDNo.1&2是用于扩增cry1类基因保守序列的特异性引物；SEQIDNo.3&4是引物对p1&p2用于扩增cry1Hc1基因的特异性引物；SEQIDNo.5&6分别是cry1Hc1基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。

Claims (8)

1.苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）BN23-5，保藏号为CGMCCNo.9448。

2.含有权利要求1所述苏云金芽孢杆菌BN23-5的菌剂。

3.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌BN23-5或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂在提高植物抗虫性中的应用。

4.含有权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌BN23-5或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂的杀虫剂。

5.如权利要求4所述的杀虫剂，其特征在于，所述的杀虫剂为杀鳞翅目类害虫的杀虫剂。

6.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌BN23-5或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂在制备转基因植物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物包括棉花、油料作物、蔬菜、花卉和/或草。

8.以权利要求1所述苏云金芽孢杆菌BN23-5为有效成分的制剂在农业上的应用。