CN101531713B

CN101531713B - Bt蛋白Cry56Aa1、其编码基因及应用

Info

Publication number: CN101531713B
Application number: CN2009100823012A
Authority: CN
Inventors: 李平; 郑爱萍; 朱军; 王玲霞; 王世全; 邓其明; 李双成; 刘怀年
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2009-04-13
Filing date: 2009-04-13
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2029-04-13
Also published as: CN101531713A; WO2010118631A1

Abstract

本发明提供了一种新的Bt蛋白Cry56Aa1及其编码基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的蛋白。本发明蛋白可以用于制备Bt杀虫剂，所述基因可以转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

Description

Bt蛋白Cry56Aa1、其编码基因及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的Bt蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。另外，蚊媒病在预防医学中占有重要位置，其中登革热和黄热病等蚊媒病传播力强、流行面广、发病率高、危害性大。据WHO统计，全世界每年感染登革热人数多达8000万，我国的海南省在1980和1986年曾经暴发过两次登革热，发病分别达到437469例和113589例。登革热和黄热病主要由埃及伊蚊传播。

为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystalproteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。

自1981年Schnepf从菌株HD-1Dipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来(Adang M.J et al，Characterized full-length andtruncated plasmid clones of the crystal protein of Bacillus thuringiensissubsp.kurstaki HD-73and their toxicity to Manduca sexta，Gene，1985，36(3)：289～300.)，人们已经分离克隆了390多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N，Zeigler D R，Feitelson J，et al.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidalcrystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev，1998，62：807-813；http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。一般而言，Cry1，Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cry1和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治(Kozie，M.G.，Beland，G.L.，Bowman，C.，et al.Field performance of elite transgenicmaize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillusthuringiensis.Bio/Technology，1993，11：194-200；Perlak，F.J.，Deaton，R.W.，Armstrong，T.A.，et al.Insect resistant cotton plants.bio/technology，1990；8：939-943；Van Frankenhuyzen，K.，Gringorten，L.，and Gauhier，D.1997.Cry9Ca1 toxin，a Bacillus thuringiensis insecticidal crystalprotein with high activity against the spruce bud worm(Choristoneurafnniferana).Appl.Environ，Microbviol.63：4132-4134；王飞，2001，苏云金芽孢杆菌特异菌株生物学特性及cry9新基因的研究，硕士论文，南开大学)。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛运用于蚊虫的防治(Goldberg L J，and Margalit J，1977.A bacterialspore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii，Uranotaenia unguiculata，Culex univitattus，Aedes aegypti，and Culexpipiens.Mosqito News，37：355-358；)。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性(Wu，D.，Johnson，J.J.，and Federici，B.A.1994.Synergism of mosquitocidal toxicity betweenCytA and CryIVD Proteins using inclusion sproduced from clonedgenes of Bacillus thuringiensis.Mol.Microbiol.13：965-972；Wirth，M.C.，Georghiou，G.P.，and Federeci，B.A.1997.CytA enables CryIVendotoxins of Bacillus thuringiensis to overcome high levels of CryIVresistance in the mosquito，Culex quinquefasciatus.Proc.Natl.Acad.Sci.94：10536-10540)

自本世纪初发现苏云金芽胞杆菌至今已有100多年的历史，在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是，由于大规模和反复使用苏云金芽胞杆菌，许多昆虫种群已相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(M cGaughey，W.H.1985.Insect resistance to the biological insecticide Bacillus thuringiensis.Science.229：193-195)，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)在Dipel(Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik，B.E.，Finson，N.，Groeters，F.R.，et al.1994.Reversal of resistance to Bacillus thuringiensisin Plutella xylostella.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91：4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.广东小菜蛾对苏云金杆菌的抗性研究.昆虫学报，39(3)：238-244；Hofte，H.，Van Rie，J.，Jansens，S.，Van Houtven，A.，Vanderbruggen，H.，and Vaeck，M.，1988.Monoclonal antibody analysis and insecticidal spectrum ofthree types of lepidopteran-specific insecticidal crystal proteins ofBacillus thuringiensis.Appl.Environ.Microbiol.54：2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf，E.，Crickmore，N.，Van Pie，J.，et al.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal Crystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3)：775-806)。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题(Regis L，et al.，2000.The useof bacterial larvicides in mosquito and black fly control programsinBrazil.Mem.Instituto Oswaldo Cruz，95：207-210.)，但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现(Georghiou G P，and Wirth M C，1997.Influence of exposure to singleversus multiple toxins of Bacillus thuringiensis subsp.israelensis ondevelopment of resistance in the mosquito Culex quinquefasciatus(Diptera：Culicidae).Applied and Environmental Microbiology，63：1095-1101.)。

为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对上述不足提供一种新的BT毒力蛋白资源。

本发明的第二个目的在于提供编码所述蛋白的基因。

本发明的目的还在于提供上述蛋白及基因的应用。

本发明从四川省成都平原土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)新菌株YWC2-8。通过对YWC2-8的毒力测试表明，YWC2-8对鞘翅目害虫、鳞翅目害虫、双翅目害虫等等，均具有极高的毒力。

根据Cry56类基因保守序列设计1对特异引物，扩增其基因组DNA，结果表明该菌株存在Cry56类基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到Cry56Aa基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，序列SEQ ID NO1的全长为1992bp，分析表明，GC含量为37.15％，编码663个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。在softberry网站采用bacterial sigma7.0promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将其命名为cry56Aa1。本发明进一步分析了Cry56Aa1蛋白的氨基酸组成(见表1)。

表1 Cry56Aa1蛋白的氨基酸组成

氨基酸	百分比％	氨基酸	百分比％
				Ala(A)：	2.02	Met(M)：	1.01
Cys(C)：	6.73	Asn(N)：	5.05
				Asp(D)：	1.68	Pro(P)：	5.69
Glu(E)：	1.85	Gln(Q)：	1.68

Phe(F)：	7.24	Arg(R)：	11.62
				Gly(G)：	4.38	Ser(S)：	13.64
His(H)：	1.01	Thr(T)：	6.23
				Ile(I)：	8.42	Val(V)：	2.69
Lys(K)：	6.40	Trp(W)：	2.86
				Leu(L)：	6.06	Tyr(Y)：	6.73

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第90位的Pro替换为Gly。因此，本发明Bt蛋白还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有Cry56Aa1蛋白同等活性的由Cry56Aa1衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的基因和蛋白质可以从菌株YWC2-8中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。

可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转Cry56Aa1基因的转化体，例如农作物或者果树等植物，使其具备抗虫活性。

此外，还可以通过发酵本发明菌株YWC2-8，得到含有Cry56Aa1蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明Bt蛋白。

本领域技术人员还可以根据本发明公开的基因，将其转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

附图说明

图1显示的是cry56Aa1全长基因克隆，其中M，marker；1，cry56Aa1基因。

图2显示的是重组质粒pET-56Aa的酶切鉴定图谱，其中1重组质粒pET-56Aa；2，用Nde I+EcoR I双酶切pET-30a；3，Nde I+EcoR I双酶切pET-56Aa；4，插入的DNA；M1、M2为Marker。

图3显示的是在E.coli BL21(DE3)中表达Cry56Aa1的SDS-PAGE检测，其中M为蛋白marker；1.阴性对照(E.coiiBL21(DE3)(pET-30a))；2.裂解上清；3.Cry56Aa1包涵体。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1cry56Aa1基因的克隆

本发明从四川省成都平原土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)新菌株，该菌株已于2009年1月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为CGMCCNo.2860。

本例通过如下方法克隆得到Cry56Aa1基因的全长序列。

采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株YWC2-8的总DNA。设计引物序列如下：

P1：5’ATGAATTCATATCAAAATAAAAATGA 3’

P2：5’CTAGAGATTATTGGTAAACAAATCGT 3’

PCR反应体系：

10×buffer 2.5μl

MgCl₂(25mM) 1.5μl

Taq酶 0.2μl

dNTPs(2.5mM) 2μl

引物 2μl

模板 5μl

最终反应体积 25μl

热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火温度根据引物而定，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃停止反应。扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。结果如图1所示，通过扩增得到了约为2000bp的序列，将该序列进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，与目的序列一致。

实施例2 cry56Aa基因的表达及杀虫活性测定

根据cry56Aa基因开放阅读框两端序列，设计并合成一对特异性引物cry56A：5′-GCGCATATG(NdeI)ATGAGTATGAAATCATTGATTC-3′；cry56R：5′-CGGAATTC(EcoR I)CACGTCAGGGGTAAATTCGATT-3′，分别在5’端引物Nde I和EcoR I酶切位点。以YWC2-8质粒为模板进行扩增，扩增的产物采用Nde I和EcoR I进行双酶切，酶切产物与同样进行双酶切后的载体pET-30a(+)连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，提取其质粒酶切电泳验证了插入片断大小符合预期目的后(图2)，再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)。将重组质粒命名为pET-56Aa，含重组质粒的重组子命名为E.coli.BL21(56Aa)。SDS-PAGE分析表明cry56Aa基因的表达产物在菌体超声破碎后的沉淀中(图3)，分子量约为76kDa左右，与预测的蛋白分子量相符。cry56Aa基因表达产物分别对甜菜夜蛾，棉铃虫及伊蚊的生测结果表明：表达产物对这三种虫都具有较好的杀虫活性。对甜菜夜蛾杀虫活性最高，LC₅₀为4.8ng/mL；对伊蚊的LC₅₀为16.72ng/mL；对棉铃虫杀虫活性最低，LC₅₀为23.16ng/mL。蛋白对鳞翅目杀虫活性的的测定方法参见(Song FP，ZhangJ，Gu AX，et al.，2003.Identification of cry1I-type genes fromBacillus thuringiensis strains and characterization of a novelcry1I-type gene.Appl.Environ.Microbiol 69：5207-5211)，蛋白对双翅目杀虫活性的的测定方法参见(Ibarra JE，del Rincón MC，Sergio Ordúz，et al.，2003.Diversity of Bacillusthuringienisis Strains from Latin America with InsecticidalActivity against Different Mosquito Species.Appl EnvironMicrobiol 69：5269-5274).

序列表

<110>四川农业大学

<120>Bt蛋白Cry56Aa1、其编码基因及应用

<130>KHP09112228.4

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1992

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis YWC2-8

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1992)

<400>1

atg aat tca tat caa aat aaa aat gaa tat gaa ata tcg gat gct tca 48

Met Asn Ser Tyr Gln Asn Lys Asn Glu Tyr Glu Ile Ser Asp Ala Ser

1 5 10 15

cga aac aac tct aat atg tct act cgt tat cct cgg tac cca cta gca 96

Arg Asn Asn Ser Asn Met Ser Thr Arg Tyr Pro Arg Tyr Pro Leu Ala

20 25 30

aat aat cca caa atg cct atg cga aat acg aac tat aaa gaa tgg tta 144

Asn Asn Pro Gln Met Pro Met Arg Asn Thr Asn Tyr Lys Glu Trp Leu

35 40 45

gct atg tgt gca gat aat aaa gat aat gaa caa gtg cct att agt ccc 192

Ala Met Cys Ala Asp Asn Lys Asp Asn Glu Gln Val Pro Ile Ser Pro

50 55 60

ctt gat caa gaa tgg aga act gtt ctt cca att ctc ttc tcc gct gct 240

Leu Asp Gln Glu Trp Arg Thr Val Leu Pro Ile Leu Phe Ser Ala Ala

65 70 75 80

gct tct tta aca gga tta ata tca ctt cca act ttt ggt gct ata tca 288

Ala Ser Leu Thr Gly Leu Ile Ser Leu Pro Thr Phe Gly Ala Ile Ser

85 90 95

gca gga gca gcc ata gca gca gcc ttg acg tct att ttg ttc cct agt 336

Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Thr Ser Ile Leu Phe Pro Ser

100 105 110

caa ggt cca gat gta ttc aac gag ctt atg ggg gct aca gaa aat tta 384

Gln Gly Pro Asp Val Phe Asn Glu Leu Met Gly Ala Thr Glu Asn Leu

115 120 125

cta aaa aga gaa ata gag act tat gtt aga gga aga gcg gct tca gaa 432

Leu Lys Arg Glu Ile Glu Thr Tyr Val Arg Gly Arg Ala Ala Ser Glu

130 135 140

ctt cta gcc tta gaa gat caa aga gca tat ttt aaa tca gct ttt gat 480

Leu Leu Ala Leu Glu Asp Gln Arg Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Phe Asp

145 150 155 160

tat tgg aga tta cat cct aca gat ggc aat gct ata gct acg gtt gcc 528

Tyr Trp Arg Leu His Pro Thr Asp Gly Asn Ala Ile Ala Thr Val Ala

165 170 175

gct agg ttc cac aca gta aat ggt gct ttt gta aca gca atg cgc tta 576

Ala Arg Phe His Thr Val Asn Gly Ala Phe Val Thr Ala Met Arg Leu

180 185 190

ttc aga ccg gca ggt tat gaa gca tta ctg tta cca gtt tat gca caa 624

Phe Arg Pro Ala Gly Tyr Glu Ala Leu Leu Leu Pro Val Tyr Ala Gln

195 200 205

gcg gcg cgt ctt cat tta ctc cat tta cga gat ggt gtc ctg ttt gcg 672

Ala Ala Arg Leu His Leu Leu His Leu Arg Asp Gly Val Leu Phe Ala

210 215 220

aat gaa tgg gga cta gct aaa cca gac cct gga gac tta cat gac caa 720

Asn Glu Trp Gly Leu Ala Lys Pro Asp Pro Gly Asp Leu His Asp Gln

225 230 235 240

gaa ttt aat gct aag gcc gct gag tat gca gat tat tgt gaa tta acg 768

Glu Phe Asn Ala Lys Ala Ala Glu Tyr Ala Asp Tyr Cys Glu Leu Thr

245 250 255

tat aat aca gag cta aac cgc att aaa act act tca ggt aaa aca tgg 816

Tyr Asn Thr Glu Leu Asn Arg Ile Lys Thr Thr Ser Gly Lys Thr Trp

260 265 270

ttt gat tat aat caa tac cga cga ctt atg aca ttt gct gtt ttg gat 864

Phe Asp Tyr Asn Gln Tyr Arg Arg Leu Met Thr Phe Ala Val Leu Asp

275 280 285

gta gtt gct aaa ttt tca att tta aat cct cgc ata tat agc tta gct 912

Val Val Ala Lys Phe Ser Ile Leu Asn Pro Arg Ile Tyr Ser Leu Ala

290 295 300

ttg caa gga gaa att ctc act cga aaa ata tat acc gat cct gtt aat 960

Leu Gln Gly Glu Ile Leu Thr Arg Lys Ile Tyr Thr Asp Pro Val Asn

305 310 315 320

ttc tca cca ggt tct tca att gca gat gat gaa aat aga tat aca gtc 1008

Phe Ser Pro Gly Ser Ser Ile Ala Asp Asp Glu Asn Arg Tyr Thr Val

325 330 335

cca cca tca cat gtt aga caa tta gtc aac tca aga tta ttt act aac 1056

Pro Pro Ser His Val Arg Gln Leu Val Asn Ser Arg Leu Phe Thr Asn

340 345 350

gtg gca tct gtt caa aat gct gga ttt att gga aat caa aat cgt tat 1104

Val Ala Ser Val Gln Asn Ala Gly Phe Ile Gly Asn Gln Asn Arg Tyr

355 360 365

aaa aat ata ggc gtt agc gat cta gtt gat ggt cct ata atc gga caa 1152

Lys Asn Ile Gly Val Ser Asp Leu Val Asp Gly Pro Ile Ile Gly Gln

370 375 380

tca gta ttc gaa aaa gtg gat gca gat ata ccg aca aat gta tcg gtt 1200

Ser Val Phe Glu Lys Val Asp Ala Asp Ile Pro Thr Asn Val Ser Val

385 390 395 400

ttt gaa gtt ggt gta aat ggt ata cag aac gat tat cca cga aat ata 1248

Phe Glu Val Gly Val Asn Gly Ile Gln Asn Asp Tyr Pro Arg Asn Ile

405 410 415

ggt ttg aaa aag act cct tca aac gca ttt aca aat aat tat gct gga 1296

Gly Leu Lys Lys Thr Pro Ser Asn Ala Phe Thr Asn Asn Tyr Ala Gly

420 425 430

agt acg aat aat tta ggt cct ttt act acg gtc tct ttg cca cct aaa 1344

Ser Thr Asn Asn Leu Gly Pro Phe Thr Thr Val Ser Leu Pro Pro Lys

435 440 445

gac gat aaa cca tta gat cat act aat ttt agt cat cga tta tca gat 1392

Asp Asp Lys Pro Leu Asp His Thr Asn Phe Ser His Arg Leu Ser Asp

450 455 460

ata att ctt cct gga aat aag ggc tca tct ttt gca tgg act cat gtt 1440

Ile Ile Leu Pro Gly Asn Lys Gly Ser Ser Phe Ala Trp Thr His Val

465 470 475 480

gat gtc gat cct aca gga aac tat tta tca aca act aag att aat tta 1488

Asp Val Asp Pro Thr Gly Asn Tyr Leu Ser Thr Thr Lys Ile Asn Leu

485490495

ata cct gct aca aaa gca tct aaa cta cca ctt tcg ttc cag cta aga 1536

Ile Pro Ala Thr Lys Ala Ser Lys Leu Pro Leu Ser Phe Gln Leu Arg

500 505 510

aag gga cca gga ttt ata ggg gga gat tta gtc aga tta gga aat ggc 1584

Lys Gly Pro Gly Phe Ile Gly Gly Asp Leu Val Arg Leu Gly Asn Gly

515 520 525

gtc gga att tct tat aag ttt aat ttc caa tcc tcc gat agc tca gct 1632

Val Gly Ile Ser Tyr Lys Phe Asn Phe Gln Ser Ser Asp Ser Ser Ala

530 535 540

aat ttt aga att cgt ata cgt tat gca ggt gca ggt tca ggt gct agt 1680

Asn Phe Arg Ile Arg Ile Arg Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ser

545 550 555 560

ggt ggt ggg cag gta tat ttt aaa tta ggg aat tat caa tct cca gat 1728

Gly Gly Gly Gln Val Tyr Phe Lys Leu Gly Asn Tyr Gln Ser Pro Asp

565 570 575

act tct tgg ggc cat act gga ttt gac tct aac aat gtg aag tat aat 1776

Thr Ser Trp Gly His Thr Gly Phe Asp Ser Asn Asn Val Lys Tyr Asn

580 585 590

caa ttt aaa gta tta gag ctt ttg gga act gca gga aac att aca gct 1824

Gln Phe Lys Val Leu Glu Leu Leu Gly Thr Ala Gly Asn Ile Thr Ala

595 600 605

aac gac ttg gaa att ata gta tgg aca agg gac cca ggt gct tct gat 1872

Asn Asp Leu Glu Ile Ile Val Trp Thr Arg Asp Pro Gly Ala Ser Asp

610 615 620

ttt tat cta gat aga ttg gaa tta atc cca atg acg ggg ata tca aca 1920

Phe Tyr Leu Asp Arg Leu Glu Leu Ile Pro Met Thr Gly Ile Ser Thr

625 630 635 640

gaa tac aat gaa cca caa aaa ttg gaa aca gcc aaa aaa gcg gtg aac 1968

Glu Tyr Asn Glu Pro Gln Lys Leu Glu Thr Ala Lys Lys Ala Val Asn

645 650 655

gat ttg ttt acc aat aat ctc tag 1992

Asp Leu Phe Thr Asn Asn Leu

660

<210>2

<211>663

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis YWC2-8

<400>2

Met Asn Ser Tyr Gln Asn Lys Asn Glu Tyr Glu Ile Ser Asp Ala Ser

1 5 10 15

Arg Asn Asn Ser Asn Met Ser Thr Arg Tyr Pro Arg Tyr Pro Leu Ala

20 25 30

Asn Asn Pro Gln Met Pro Met Arg Asn Thr Asn Tyr Lys Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Met Cys Ala Asp Asn Lys Asp Asn Glu Gln Val Pro Ile Ser Pro

50 55 60

Leu Asp Gln Glu Trp Arg Thr Val Leu Pro Ile Leu Phe Ser Ala Ala

65 70 75 80

Ala Ser Leu Thr Gly Leu Ile Ser Leu Pro Thr Phe Gly Ala Ile Ser

85 90 95

Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Thr Ser Ile Leu Phe Pro Ser

100 105 110

Gln Gly Pro Asp Val Phe Asn Glu Leu Met Gly Ala Thr Glu Asn Leu

115 120 125

Leu Lys Arg Glu Ile Glu Thr Tyr Val Arg Gly Arg Ala Ala Ser Glu

130 135 140

Leu Leu Ala Leu Glu Asp Gln Arg Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Phe Asp

145 150 155 160

Tyr Trp Arg Leu His Pro Thr Asp Gly Asn Ala Ile Ala Thr Val Ala

165 170 175

Ala Arg Phe His Thr Val Asn Gly Ala Phe Val Thr Ala Met Arg Leu

180 185 190

Phe Arg Pro Ala Gly Tyr Glu Ala Leu Leu Leu Pro Val Tyr Ala Gln

195 200 205

Ala Ala Arg Leu His Leu Leu His Leu Arg Asp Gly Val Leu Phe Ala

210 215 220

Asn Glu Trp Gly Leu Ala Lys Pro Asp Pro Gly Asp Leu His Asp Gln

225 230 235 240

Glu Phe Asn Ala Lys Ala Ala Glu Tyr Ala Asp Tyr Cys Glu Leu Thr

245 250 255

Tyr Asn Thr Glu Leu Asn Arg Ile Lys Thr Thr Ser Gly Lys Thr Trp

260 265 270

Phe Asp Tyr Asn Gln Tyr Arg Arg Leu Met Thr Phe Ala Val Leu Asp

275 280 285

Val Val Ala Lys Phe Ser Ile Leu Asn Pro Arg Ile Tyr Ser Leu Ala

290 295 300

Leu Gln Gly Glu Ile Leu Thr Arg Lys Ile Tyr Thr Asp Pro Val Asn

305 310 315 320

Phe Ser Pro Gly Ser Ser Ile Ala Asp Asp Glu Asn Arg Tyr Thr Val

325 330 335

Pro Pro Ser His Val Arg Gln Leu Val Asn Ser Arg Leu Phe Thr Asn

340 345 350

Val Ala Ser Val Gln Asn Ala Gly Phe Ile Gly Asn Gln Asn Arg Tyr

355 360 365

Lys Asn Ile Gly Val Ser Asp Leu Val Asp Gly Pro Ile Ile Gly Gln

370 375 380

Ser Val Phe Glu Lys Val Asp Ala Asp Ile Pro Thr Asn Val Ser Val

385 390 395 400

Phe Glu Val Gly Val Asn Gly Ile Gln Asn Asp Tyr Pro Arg Asn Ile

405 410 415

Gly Leu Lys Lys Thr Pro Ser Asn Ala Phe Thr Asn Asn Tyr Ala Gly

420 425 430

Ser Thr Asn Asn Leu Gly Pro Phe Thr Thr Val Ser Leu Pro Pro Lys

435 440 445

Asp Asp Lys Pro Leu Asp His Thr Asn Phe Ser His Arg Leu Ser Asp

450 455 460

Ile Ile Leu Pro Gly Asn Lys Gly Ser Ser Phe Ala Trp Thr His Val

465 470 475 480

Asp Val Asp Pro Thr Gly Asn Tyr Leu Ser Thr Thr Lys Ile Asn Leu

485 490 495

Ile Pro Ala Thr Lys Ala Ser Lys Leu Pro Leu Ser Phe Gln Leu Arg

500 505 510

Lys Gly Pro Gly Phe Ile Gly Gly Asp Leu Val Arg Leu Gly Asn Gly

515 520 525

Val Gly Ile Ser Tyr Lys Phe Asn Phe Gln Ser Ser Asp Ser Ser Ala

530 535 540

Asn Phe Arg Ile Arg Ile Arg Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ser

545 550 555 560

Gly Gly Gly Gln Val Tyr Phe Lys Leu Gly Asn Tyr Gln Ser Pro Asp

565 570 575

Thr Ser Trp Gly His Thr Gly Phe Asp Ser Asn Asn Val Lys Tyr Asn

580 585 590

Gln Phe Lys Val Leu Glu Leu Leu Gly Thr Ala Gly Asn Ile Thr Ala

595 600 605

Asn Asp Leu Glu Ile Ile Val Trp Thr Arg Asp Pro Gly Ala Ser Asp

610 615 620

Phe Tyr Leu Asp Arg Leu Glu Leu Ile Pro Met Thr Gly Ile Ser Thr

625 630 635 640

Glu Tyr Asn Glu Pro Gln Lys Leu Glu Thr Ala Lys Lys Ala Val Asn

645 650 655

Asp Leu Phe Thr Asn Asn Leu

660

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atgaattcat atcaaaataa aaatga 26

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ctagagatta ttggtaaaca aatcgt 26

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gcgcatatga tgagtatgaa atcattgatt c 31

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cggaattcca cgtcaggggt aaattcgatt 30

Claims

1.一种Bt蛋白Cry56Aal，其氨基酸序列是：

1)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸且具有同等活性的蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5.由权利要求4所述表达载体转化的宿主细胞。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其为植物宿主细胞。

7.含有权利要求1所述蛋白的杀虫剂。

8.权利要求2或3所述基因或权利要求4所述表达载体在制备转基因植物中的应用。

9.权利要求2或3所述基因或权利要求4所述表达载体在提高植物抗虫性中的应用。