CN110172437B - Cu2+增强苏云金芽胞杆菌杀虫活性及其应用 - Google Patents

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Abstract

Cu2+增强苏云金芽胞杆菌杀虫活性及其应用，本发明之苏云金芽胞杆菌，为苏云金芽胞杆菌X023，Bacillus thuringiensisX023，该菌种于2018年5月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2018283。本发明包括苏云金芽胞杆菌的发酵培养基中添加10‑5 M五水合硫酸铜，使苏云金芽胞杆菌发酵菌液对棉铃虫和小菜蛾的杀虫毒性显著提高。

Description

Cu2+增强苏云金芽胞杆菌杀虫活性及其应用
技术领域
本发明涉及苏云金芽胞杆菌发酵培养基的优化，一株苏云金芽胞杆菌 (Bacillusthuringiensis X023)的发酵培养及其应用，特别是涉及Cu2+增强苏云金芽胞杆菌杀虫活性的应用。
背景技术
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)制剂是一种高效特异、生态友好型生物农药，是在全世界得到广泛应用，主要在于它产生的杀虫晶体蛋白(Insecticidalcrystal proteins，ICPs)。目前，我国的苏云金芽胞杆菌(Bt)杀虫制剂的推广应用相对于化学农药优势不明显，主要在于使用成本较高。
早期研究表明：有很多因素会影响杀虫晶体蛋白的产生，其中最重要的一个因子就是矿物质元素。特别是微量金属离子，其在菌体生长代谢过程中作为酶的辅酶或辅助因子存在于蛋白酶中帮助蛋白质发挥其功能，或者作为电解质来平衡生物体内膜和外膜之间的电荷，具有其它物质不可替代的功能。许多研究表明，一些微量元素对芽胞和伴胞晶体的形成有明显的抑制或促进作用。铜离子和镁离子与135和65kDa毒素成分的生物合成有关，并且Ca2+、Fe2+和Mn2+也显示出对几种类型ICPs的合成有促进作用，锰离子也被证明可以显著提高芽胞的萌发和产量。
一些报道显示芽胞杆菌属，特别是苏云金芽胞杆菌，能够吸收一些重金属离子，包括铜、铬、镉、镍离子等。芽胞形成和ICPs合成是能量依赖性的生物过程，而铜作为细胞色素c氧化酶II亚基中最不可缺少的组成辅基之一，铜和铁将4个电子转移给氧，促进氧化磷酸化并产生ATP，可为该过程提供大量能量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，改良发酵培养基，提供Cu2+增强苏云金芽胞杆菌杀虫活性的应用，提高苏云金芽胞杆菌对小菜蛾和棉铃虫的杀虫毒力，降低发酵成本，推进苏云金芽胞杆菌的广泛应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，本发明之Cu2+增强苏云金芽胞杆菌杀虫活性的应用，往苏云金芽胞杆菌X023的发酵培养基中添加铜离子。
铜离子优选来源于硫酸铜、氯化铜、硝酸铜中的至少一种。
本发明所用苏云金芽胞杆菌，为苏云金芽胞杆菌X023(Bacillus thuringiensisX023，简称Bt X023)，该菌种于2018年5月16日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为 CCTCC NO：M 2018283。(参见专利公开文件109810920A)。
添加铜离子的发酵培养基的成份优选为：葡萄糖14-17g/L，蛋白胨12-15g/ L，KH2PO4·3H2O 1.2-1.6g/L，FeSO4·7H2O 0.02-0.03g/L，MnSO4·H2O 0.02-0.03 g/L，MgSO4·7H2O 0.25-0.30g/L，CuSO4·5H2O 0.0020-0.0025g/L，pH 6.8-7.4。
杀虫活性：
将苏云金芽胞杆菌X023接种到添加铜离子的发酵培养基中,28-30℃， 120-200rpm培养48-60h后，取发酵菌液，进行棉铃虫和小菜蛾的杀虫毒力生测。
苏云金芽胞杆菌作为重要生防菌，其作用范围涵盖多种农业害虫，本发明得到的苏云金芽胞杆菌发酵菌液对鳞翅目的靶标昆虫小菜蛾和棉铃虫有很好的毒性，能简捷、经济、显著地提高了苏云金芽胞杆菌对小菜蛾和棉铃虫的杀虫毒力，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为Bt X023菌株发酵48h相差显微镜观察结果图；
图2为Bt X023菌株在原始发酵培养基与优化发酵培养基(添加铜离子) 中的生长曲线图；
图3为Bt X023培养36h后提取全蛋白进行SDS-PAGE的结果图；M:蛋白 Marker；1-2:CK，3-4:CU；
图4为杀虫晶体蛋白表达量提高qRT-PCR验证结果图。
图5为乙酰辅酶A合成相关基因表达量提高qRT-PCR验证结果图。
图6为氨基酸合成相关基因表达量提高qRT-PCR验证结果图。
图7为能量代谢相关基因表达量提高qRT-PCR验证结果图。
微生物菌株保藏情况说明
苏云金芽胞杆菌X023(Bacillus thuringiensis X023)，该菌种于2018年5月16日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2018283。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例
(1)本实施例之苏云金芽胞杆菌X023(简称Bt X023)，该菌种于2018 年5月16日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为CCTCCNO：M 2018283。
(2)光学显微镜观察：
具体实施过程：取Bt X023培养48h的菌液1.5mL(未加铜离子的发酵培养基)，9000rpm，3min，离心，去上清，双蒸水清洗两遍，用200μL双蒸水重悬菌体，吸取10μL菌液滴于载玻片中央，盖上盖玻片，在100倍油镜下观察菌体的形态。图1是菌株Bt X023培养至48h的相差显微镜图片，图中显示该菌株为杆状产芽胞与菱形晶体的细菌。
(3)苏云金芽胞杆菌X023菌株在2号和3号培养基的生长曲线如图2所示，结果表明，同一株菌延滞期均为初始的2小时，对数生长期均在发酵开始后的2～16h，其中菌体进入稳定期的时间18h。此外进入衰退期的时间36h。但2号和3号培养基菌株在稳定期持续的时间基本保持一致。
1号培养基：LB培养基(g/L)：10g氯化钠，10g蛋白胨，5g酵母粉， 20g琼脂(液体培养基不加)，pH 6.8-7.4；
2号培养基：CK(未添加铜离子)发酵培养基的成份为：葡萄糖16g/L，蛋白胨14g/L，KH2PO4·3H2O 1.5g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·H2O 0.02g/L， MgSO4·7H2O 0.25g/L，pH 6.8-7.4。
3号培养基：CU(添加铜离子)发酵培养基的成份为：葡萄糖16g/L，蛋白胨14g/L，KH2PO4·3H2O 1.5g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·H2O 0.02g/ L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，CuSO4·5H2O 0.0020-0.0025g/L，pH 6.8-7.4。
具体实施过程：从LB平板上挑取单菌落，转接到20mL LB培养基中，28℃，120rpm，振荡培养12h后，按1％转接于30mL发酵培养基中，28℃,120rpm振荡培养，每2h取样，测定OD600值。
(4)发酵培养基(添加铜离子)后对Bacillus thuringiensis X023菌株的杀虫活性测定：
具体实施过程：Bt X023菌株在LB培养基中活化12h后，以1％的接种量分别接种到2号培养基、3号培养基中，培养60小时，收集发酵液。取一定量发酵液加入对应的发酵培养基稀释，使其形成具有不同稀释浓度、总体系为600 μL的发酵液，将稀释后的发酵液加入30mL的人工饲料并充分混合，最终使其中发酵液被分别稀释为20、10、5、2.5、1.25μL/mL五种浓度梯度。将30mL 的饲料平均加到3个平行的24孔生测板，即72个培养孔中，每个孔中添加一条幼虫，共72条。在28±1℃的培养箱中喂饲，每24小时记录死虫的数量和总虫数，培养时间不超过96小时。记录数据通过SPSS软件的prohibit分析以计算不同条件下X023发酵液的LC50(半致死浓度)，使用LC50的非重叠95％置信区间作为确定毒性显着差异的标准。
表1是Bt X023在发酵培养基中培养60h后的发酵液对小菜蛾的生测结果
Figure BDA0002098432560000051
表2是Bt X023在发酵培养基中培养60h后的发酵液对棉铃虫的生测结果
Figure BDA0002098432560000052
3号培养基发酵液对小菜蛾、棉铃虫的毒力分别是2号培养基发酵液毒力的1.65倍，2.42倍。
(5)Bacillus thuringiensis X023菌株的全蛋白提取与SDS-PAGE：
具体实施过程：根据苏云金芽胞杆菌X023的生长曲线，选择发酵培养36h 后的菌液，9000rpm，10min收集细胞沉淀，用PBS(20mM)洗涤2次。加入适量细胞裂解液(0.5M pH8.0Tris-Cl、8M尿素、65mM CHAPS、75mM NaCl、 2M硫脲、1mM PMSF、10mM蛋白酶抑制剂)，然后进行超声破碎处理(130 W，3S，3S，10min)，13000rpm，20min，获取上清，通过酶标仪进行蛋白质定量后，进行SDS-PAGE检测。图3是不同发酵条件下培养36h后提取Bt X023 全蛋白进行SDS-PAGE，M.蛋白Marker，1-3为三个生物学重复。
BtX023菌株36h全蛋白SDS-PAGE中，其产生有明显大量的130kDa的杀虫晶体蛋白条带,CU培养基培养后该蛋白表达显著提高。
(6)qRT-PCR验证
具体实施过程：首先通过Primer 5.0(Premier BiosoftInternational，PaloAlto， CA，USA)设计实时PCR的引物序列，引物名称及对应基因名称和验证蛋白名称描述如表3。
表3 Primer 5.0设计qRT-PCR的引物
Figure BDA0002098432560000061
Figure BDA0002098432560000071
使用TRIzol Reagent(Invitrogen)提取发酵培养36h的样品总RNA，通过吸光度测量(Thermo Scientifc NanoDrop 2000分光光度计)和琼脂糖电泳评估 RNA样品的质量和完整性，再利用DNase I去除残余的DNA后使用RevertAid TM First Strand cDNASynthesis Kit(Fermentas)将总RNA逆转录成cDNA，最后利用cDNA作模板、16S rRNA作为内参使用
Figure BDA0002098432560000072
GreenPCR Master Mix(Applied Biosystems)，用ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems， USA)进行相对qRT-PCR和进行两步实时RT-PCR分析。当两种处理之间的比值分别高于1.5或低于0.75时，认为mRNA表达显着上调或下调，qPCR验证如图4所示。结果显示：添加铜离子的发酵培养基培养36h，cry1Ac和vip3Aa 基因的表达量显著提高，Cry1Ac和Vip3Aa蛋白对小菜蛾的杀虫毒力生测实验证明添加铜离子后这两种ICPs表达的大幅提高是铜离子增效作用的直接体现。
(7)Cu2+增效机理
添加铜离子后，主要影响能量代谢和氨基酸合成过程。铜离子作为细胞色素c氧化酶体的重要辅基，在氧化磷酸化最后阶段传递电子给O2将其还原为 H2O。铜离子主要存在于细胞色素c氧化酶的II亚基上，II亚基也是细胞色素c 氧化酶发挥功能的重要亚基，如果缺乏铜离子，其结构将会不稳定，从而不能正常发挥功能作用。从qRT-PCR验证结果来看，细胞色素c氧化酶II亚基表达明显上调，与此同时，乙醛酸循环的两个关键酶AceA(异柠檬酸裂酶(Isocitrate lyase))和AceB(苹果酸合酶(malate synthase))的表达量显著提高，这表明添加铜离子使得能量代谢大幅提高。乙醛酸循环作为柠檬酸循环的一个重要的代谢旁路，广泛存在于植物、真菌和细菌中，可以利用少量的草酰乙酸产生大量的能量，其能量代谢效率要高于柠檬酸循环，大大提高乙酰CoA的利用效率。铜离子的添加也显著提高了氨基酸合成能力，支链氨基酸是ICPs中最主要的蛋白，也是苏云金芽胞杆菌绝大部分蛋白氨基酸组成的重要部分。这个结果也表明，产生的伴胞晶体所需的能量可能主要来自于乙醛酸循环和柠檬酸循环，而这两个循环所需要的乙酰辅酶A则主要来源于乙酸直接形成的乙酰辅酶A和由脂肪酸分解形成的乙酰辅酶A。

Claims (1)

1.向发酵培养基中添加的铜离子增强苏云金芽胞杆菌杀虫活性的应用，其特征在于，添加铜离子的发酵培养基的成份为：葡萄糖14-17 g/ L，蛋白胨12-15 g/ L，KH2PO4•3H2O1.2-1.6 g/ L，FeSO4•7H2O 0.02-0.03 g/ L，MnSO4•H2O 0.02-0.03 g/ L，MgSO4•7H2O0.25-0.30 g/ L，CuSO4•5H2O 0.0020-0.0025 g/ L，pH 6.8-7.4；
所述苏云金芽胞杆菌为苏云金芽胞杆菌 X023，Bacillus thuringiensisX023，该菌种于2018年 5 月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为 CCTCC NO：M2018283。
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