CN102559554A

CN102559554A - 苏云金芽胞杆菌cry1Ca基因，表达蛋白及其应用

Info

Publication number: CN102559554A
Application number: CN2012100041163A
Authority: CN
Inventors: 高继国; 李海涛; 刘荣梅; 张�杰; 宋福平
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2032-01-09
Also published as: CN102559554B

Abstract

本发明涉及“苏云金芽胞杆菌cry1Ca13基因，表达蛋白及其应用”，属于生物防治技术领域。杀虫蛋白，具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，及编码该杀虫蛋白的基因，优选所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。上述基因对鳞翅目害虫具有高毒力，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

Description

苏云金芽胞杆菌cry1Ca基因,表达蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，特别是进一步，本发明涉及对鳞翅目害虫具有高毒力的Bt cry1Ca基因及由该基因所编码的蛋白质。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽胞形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E，Crickmore.N，Van Rie.J.，Lereclus.D，Baum.J，Feitelson.J，Zeigler.D.R.，Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev，1998，62(3)：775-806.]。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，目前(2011年10月)已发现种杀虫晶体蛋白605种，被分为70类cry蛋白和2类cyt蛋白。当今，采用喷施化学农药防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害，但化学农药造成环境污染，长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生态平衡。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。苏云金芽胞杆菌除了直接作为生物农药以外，1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cry1Ac。在接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1Ab基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2010年，25个国家种植了转基因作物，全球转基因作物累计种植面积超过十亿公顷，19个为发展中国家，排名前十位的国家种植面积都超过100万公顷，其中，有8个是发展中国家，90％都是小型农户。同时，有30多个国家新近批准种植转基因作物，日本、新加坡等国家批准进口转基因农作物。总的来说，已经有59个国家同意种植或进口转基因产品，中国则批准了所有的商业化生物技术，2010我国种植转基因作物350万公顷，排世界第六。转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。苏云金芽胞杆菌及其基因发掘已成为可持续发展农业中重要课题。

由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。

发明内容

本发明提供一种对鳞翅目害虫小菜蛾、甜菜夜蛾高毒力的苏云金芽胞杆菌LB-R-78，及其杀虫新基因cry1Ca13基因和其晶体杀虫蛋白，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

苏云金芽胞杆菌菌株LB-R-78，其保藏编号为：CGMCC No.5567。

苏云金芽胞杆菌菌株LB-R-78在杀杀灭小菜蛾，棉铃虫，甜菜夜蛾中的应用。

杀虫蛋白Cry1Ca13，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

cry1Ca13基因，编码杀虫蛋白Cry1Ca13。

优选其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

一种表达载体，其特征是含有cry1Ca13基因。

所述表达载体为pEB-cry1Ca，其骨架载体为pEB，其结构如图6所示。

所述表达载体为pSTK-cry1Ca，其骨架载体为pSTK，其结构如图7所示。

一种微生物转化体，其特征是含有cry1Ca13基因。

cry1Ca13基因在杀灭小菜蛾，棉铃虫，甜菜夜蛾害虫中的应用。

所述应用是将cry1Ca13基因表达的蛋白作为生物杀虫剂的有效成分。

本发明从辽宁千山圆通观附近土壤中分离得到一株苏云金芽胞杆菌菌株LB-R-78，其保藏编号为CGMCC No.5567，该菌株生物学特性为在生长周期中可以产生芽胞，并且同时产生有毒杀鞘翅目害虫作用的伴胞晶体，其对小菜蛾具有很强的杀灭能力；从该菌株中得到一个新基因的阳性克隆，即pEB-cry1Ca(见图6)，对其进行测序分析，发现克隆cry1Ca中含有3573个碱基，见SEQ ID NO1，编码1191个氨基酸，见SEQ ID NO2。与已发表的基因相比，与cry1Ca5相似性最高，相差5个氨基酸；从上述阳性克隆提取质粒，转入受体菌，得到表达菌株，测定基因的表达蛋白的活性，基因cry1Ca表达的蛋白对小菜蛾，甜菜夜蛾的初筛生测结果为校正死亡率为100％，见表1。

cry1Ca13基因可按生物技术的常规方法转化微生物、植物，表现出对相关鳞翅目害虫的毒性。

将上述基因转化菌株，表达得到的蛋白可以制成生物农药用于杀死鳞翅目害虫。同时，可以转入植物构建抗虫转基因植物，用于害虫的防治。

本发明分离克隆的Bt cry1Ca13基因序列及其基因表达产物能够对鞘翅目害虫产生强毒力，特别是对小菜蛾有高活性，是很好的生物杀虫基因，有很广泛的应用前景。通过该cry1Ca13基因与cry1Ac、cry1Ab、cry1Ba、cry2Ab等基因表达产物组合，可扩大对鳞翅目害虫的虫谱。通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒性，可克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。

菌株保藏信息：

菌种分类命名：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏日期：2011年12月12日

保藏编号：CGMCC No.5567

附图说明

图1光学显微镜下观察菌株LB-R-78菌体的形态，

图2电镜下菌株LB-R-78菌体形态

图3含有目的基因的基因组PCR鉴定，

其中1：菌株LB-R-78PCR-RFLP结果，2：菌株LB-R-78PCR扩增产物M：Marker(100、200、500、750、1000、2000bp)

图4cry1Ca13基因全长PCR结果

M：Marker(300、500、800、1500、2000、3000、5000bp)，1：pEB-cry1Ca质粒DNA的Sal I消化产物；2：pEB-cry1Ca质粒DNA的Sma I/Sal I消化产物；3：pEB-cry1Ca质粒DNA 3.6kb全长扩增产物；4，5：pSTK-cry 1Ca酶切图谱

图5cry1Ca13基因在大肠杆菌中表达蛋白的SDS-PAGE

其中a为pEB-cry1Ca重组质粒的表达，b为pSTK-cry1Ca重组质粒的表达。

M：蛋白高分子量marker(200，116，97，66，44kDa)，1：IPTG诱导的pEB-cry1Ca可溶组分；2：IPTG诱导的pEB空载体可溶组分；3：IPTG诱导的pEB-cry1Ca非可溶组分；4：IPTG诱导的pEB空载体非可溶组分；5，6：BSA；7：pSTK-cry1Ca重组质粒在Bt无晶体突变株中的表达

图6pEB-cry1Ca结构示意图，

图7pSTK-cry1Ca结构示意图。

具体实施方式

实施例1、分离得到苏云金芽胞杆菌菌株LB-R-78

本申请人的实验室工作人员从黑龙江省五常市拉林镇附近土壤中分离的得到一株苏云金芽胞杆菌，苏云金芽胞杆菌的芽胞由外向内依次为芽胞外壁、芽胞衣、皮层、芽胞内壁，原生质膜和原生质体。其中皮层的主要成分是肽聚糖，不含营养细胞的多聚糖磷壁酸，它保持着芽胞的脱水状态和耐热性，另一方面，芽胞形成过程中，会产生大量DPA-Ca鳌合物，使得芽胞中的生物大分子形成耐热凝胶，在80℃下热处理20min，苏云金芽胞杆菌芽胞也不会死亡并且休眠的芽胞在75℃的亚致死温度下处理15min，活化效果最好，不但促其快速萌发，还可提高芽胞的成活率(喻子牛1990)。依据这一特性，可实施温度筛选(Knowles BH，Ellar D J.Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillusthuringiensis d-endotoxins with different specificity[J].Biochimica et biophysicaacta，1987，924：509-518.；戴莲韵，王学聘等.中国八个自然保护区森林土壤中苏云金芽胞杆的分布[J].微生物学报，1994，30(2)117-121)。

1、1菌株的分离

1)取分装的土样加入到50ml大离心管中，至锥形管锥形处。

2)加灭菌水至15ml处，放入玻璃珠5～10颗。

3)用振荡器将土样打碎。

4)放入水浴锅中80℃，20分钟。

5)取1.5ml的EP管，每个管中加1ml灭菌水，再从50ml管中取10微升菌液加入到EP管中混匀。

6)从EP管中取100微升喷到1/2LB培养基中，涂匀。

7)放入到30℃温箱中培养2～3天。

8)镜检观察。

晶体观察

光学显微镜：

将胞晶混合液滴于载玻片上，涂抹均匀，烘干固定，石炭酸复红染液染色3min，清水冲洗，100x油镜进行镜检，石炭酸复红染液配制方法参见文献(Baroy F，Lecadet M M，Deleluse A.Cloning and sequencing of three new putative toxin genes from Clostridiumbifermentans[J].Gene，1998，211：293-295)。见图1所示。在1/2LB培养基上培养48h后形成单菌落，光学显微镜下观察到菌株LB-R-78菌体为长杆状，芽胞为长圆棒状，晶体为双锥形。

电镜显微观察：

扫描电镜制样：孢晶混合液滴于玻璃片上，干燥，经锇酸固定，而后经酒精梯度脱水，临界点干燥，离子溅射喷金(2nm厚)，NewBio-TEMH-7500扫描电镜观察拍照。如图2所示。

生物学测定表明，对小菜蛾、甜菜夜蛾的初筛生测结果为校正死亡率为100％。

实施例2.获得新基因

2.1利用cry1类基因通用引物检测菌株LB-R-78，引物如下

扩增循环：94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。

结果如图3所示，菌株LB-R-78进行基因型的PCR-RFLP鉴定，用cry1类基因鉴定引物K5un2/K3un2获得了大小为1.6kb的PCR产物，将其进行Pst I/Xba I双酶切分析，获得了RFLP图谱，从此图可以看出，扩增获得的1.6kb PCR产物经酶切后产生了9条酶切片段，大小分别为801bp，758bp，518bp，423bp，322bp，239bp，140bp，95bp，16bp(Kuo et al，1996)，结果表明：LB-R-78中含有cry1Ca和cry1Ac基因。

2、1LB-R-78菌株中cry1Ca类基因的克隆

采用快速克隆方法对该菌株中的新cry基因进行分离克隆。

参考GenBank中公布的cry1Ca的基因编码区的5’端和3’端序列，设计了扩增全长cry1Ca类基因的一对引物，引物序列如下：

上游引物L5unx：5′-ATGGAGAATAATATTCAAAATCAATG-3′

下游引物L3unx：5′-TTCCTCCATAAGGAGTAATTCC-3′

用pfuDNA聚合酶，用如下体系进行PCR扩增。

超纯水补至50μL，混匀离心。

扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。

2.2连接方案

用超纯水补足体积到10μL，充分混匀，16℃连接4h或4℃连接过夜。

将纯化片段与载体pEB连接转化大肠杆菌JM109，得到阳性转化子。对转化子进行酶切，结果得到约3.5kb条带，表明cry1Ca类新基因序列已经成功插入。对插入片断进行测序分析，得到序列SEQ ID NO 1，序列全长3573bp，编码1191个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。

设计cry1Ca类基因的全长引物L5unx/L3unx，扩增得到cry1Ca 3.6kb的全长基因，将其与载体pEB、pSTK(公开载体，本所实验室有保存，可以对外公开发放)穿梭载体进行连接，转化入感受态JM109中，经抗性筛选、PCR鉴定及Sma I和Sal I双酶切分析，筛选出含有cry1Ca基因的阳性重组质粒。图4为阳性重组质粒酶切分析及PCR鉴定结果，经Sma I和Sal I酶切后，得到大小为5.7kb的载体条带和3.6kb全长基因条带，说明该表达载体构建正确，将其命名为pEB-cry1Ca(图6)。图4中的条带4、5表示cry1Ca与pSTK连接正确，将其命名为pSTK-cry1Ca(见图7)。

2.3转化方案

2.3.1大肠杆菌转化

1.挑取单菌落于5ml LB震荡培养过夜；

2.按1％接种量接种于LB液体培养基中，37℃，230rpm培养2-2.5hr，(OD₆₀₀＝0.5-0.6)；3.4℃，4,000rpm离心10min；

4.弃上清，加入预冷的0.1M CaCl₂50ml悬浮细胞，置于冰上30min以上；

5.4℃，4,000rpm离心10min，回收细胞；

6.用2-4ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬细胞，分装成200μl/0.5mL离心管中，于4℃保存(可保存一周)。

7.取200μl感受态细胞与5μL连接产物充分混匀，冰浴30min。

8.42℃热激1.5min，冰浴3min。

9.加入800μl LB培养基37℃培养45min。

10.取200μl涂板，加入相应的抗生素，及IPTG，X-gal，37℃培养。

2.3.2苏云金芽胞杆菌无晶体突变株的转化

Bt电击感受态的制备

以100ml菌液为例：

1)活化菌种，30℃，230rpm振荡过夜；按1％接种量取1ml于100ml TB液体培养基中，37℃，230rpm，2hr左右(OD₆₀₀＝0.2-0.3)；

2)4℃，8000rpm，离心6min，收集菌体；

3)先用少许无菌水清洗管壁，再用约100ml无菌水清洗菌体二次；

4)4℃，10,000rpm，离心6min，收集菌体；

5)先用少许超纯水清洗管壁，再用约100ml超纯水清洗菌体二次；

6)4℃，10,000rpm，离心6min，收集菌体；

7)加入2ml 40％PEG悬浮菌体；

8)4℃，10,000rpm，离心6min，收集菌体；

9)溶于2ml PEG中，分装于100μl/0.5ml Tube中

电击转化

1)100μl Bt感受态，加入2-5μl，DNA混匀加入0℃冰浴的电击杯，立即进行电击

2)电压2200V，电阻1000Ω，25μF操作要快，控制低温

3)加入1000μl LB培养基转于1.5ml的Ep管当中

4)30℃100-150rpm培养1小时

5)取200μl涂于1/2LB抗性培养基上，培养，观察晶体，鉴定基因。

2.4同源性分析

SEQ ID NO2与cry1Ca类基因比较，根据苏云金芽胞杆菌分类标准(Crickmore N，D RZeigler，J Feitelson，et al.1998.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensispesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol Biol Rev.62：807～813)为新基因，被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为cry1Ca13基因。

实施例3、基因表达与活性测定

3.1.1在上述克隆提取质粒DNA，转入受体菌Rosetta(DE3)中，获得表达菌株。

IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。

诱导表达过程如下：

1)活化菌种(37℃、12hr)；

2)10％接种于LB培养基中(37℃、2hr)；

3)加入诱导物IPTG，150rpm，18-22℃低温诱导4-20h；

4)离心收集菌体，加入10mM Tris·Cl(pH 8.0)悬浮；

5)破碎菌体(超声波破碎完全)；

离心12,000rpm 10min 4℃；

收集上清及沉淀各10-15μL，分别电泳检测。

聚丙烯酰胺凝胶配置如下。

上样：上样10-15μl，电泳：130-150V恒压。

染色与脱色：电泳后取出凝胶，用蒸馏水冲洗后，放入染色液中，60rpm振荡染色1hr左右，脱色液中脱色2hr左右，脱色至凝胶背景透明，清水中漂洗至蛋白带清晰。

将重组质粒pEB-cry1Ca转化到E.coli Rosetta(DE3)中，IPTG诱导表达，SDS-PAGE(8％)凝胶电泳。结果表明，无论是在可溶还是在非可溶组分中cry1Ca13基因都能通过表达载体pEB在大肠杆菌中高效表达134kD蛋白，而经IPTG诱导的转入Rosetta(DE3)的pEB空载体没有特异的目的条带产生(图5中a)。

将重组质粒pSTK-cry1Ca转化到Bt无晶体突变株HD73-中，产生134kD蛋白，如图5中b。

3.2Bt菌株LB-R-78及cry1Ca13基因编码蛋白的杀虫活性测定

将cry1Ca13基因表达蛋白，用水稀释到不同浓度，Bt菌株LB-R-78发酵液直接测定对鳞翅目害虫的杀虫活性，具体方法如下，

小菜蛾的生物活性测定：

对鳞翅目小菜蛾进行杀虫活性测定：试虫为3龄幼虫，采用浸叶法，将甘蓝叶片用清水洗净晾干，选取鲜嫩一致的叶片切成大小相近的形状，在稀释好的待测样品中浸泡10s后晾干，放入生测瓶中，每瓶接3龄幼虫20头，每个处理重复3次，25℃生化培养箱中保温，培养48h后调查死、活虫数。用POLO软件分析数据，计算LC₅₀。以Cry1Ac蛋白为阳性对照，灭菌水为阴性对照(生测参照张静涛等，2009)。

对甜菜夜蛾，棉铃虫室内杀虫活性测定：

称取5g人工饲料置一灭菌培养皿中，加入500μL待测样品稀释液，充分混匀，分装于经消毒(5％福尔马林浸泡)的24孔细胞培养板中。用毛笔轻轻接入棉铃虫、甜菜夜蛾初孵幼虫，每孔一头，每处理重复三次，放置25℃光照培养箱中，培养5天调查死、活虫数。计算LC₅₀。

试验数据表明LB-R-78菌株对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾都有杀虫活性，cry1Ca基因表达蛋白质对小菜蛾杀虫活性比对照cry1Ac蛋白质要高10倍、对甜菜夜蛾有明显的生物活性，而cry1Ac蛋白只有体重和发育的抑制，对棉铃虫生物学活性不如cry1Ac蛋白。具体结果如表1，2。

表1LB-R-78菌株对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾杀虫活性测定结果

生测样品	CK	LB-R-78
			小菜蛾	0	30
棉铃虫	0	30
			甜菜夜蛾	0	30
校正死亡率		100％

表2Cry1Ca蛋白对小菜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫杀虫活性测定结果

本发明的有益效果：本发明分离克隆的Bt cry1Ca13基因序列及其基因表达产物能够对鳞翅目害虫产生强毒力，可扩大对鳞翅目、鞘翅目害虫的杀虫谱。通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒性，可克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。

Claims

1.苏云金芽胞杆菌菌株LB-R-78，其保藏编号为：CGMCC No.5567。

2.苏云金芽胞杆菌菌株LB-R-78在杀灭小菜蛾，棉铃虫，甜菜夜蛾中的应用。

3.杀虫蛋白Cry1Ca13，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

4.cry1Ca13基因，编码杀虫蛋白Cry1Ca13。

5.权利要求4所述的cry1Ca13基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

6.一种表达载体，其特征是含有权利要求4或5所述的cry1Ca13基因。

7.权利要求6所述的表达载体为pEB-cry1Ca，其骨架载体为pEB，其结构如图6所示；或者所述表达载体为pSTK-cry1Ca，其骨架载体为pSTK，其结构如图7所示。

8.一种微生物转化体，其特征是含有权利要求4或5所述的cry1Ca13基因。

9.权利要求4或5所述的cry1Ca13基因在杀灭小菜蛾，棉铃虫，甜菜夜蛾害虫中的应用。

10.权利要求9所述应用，是将权利要求4或5所述的cry1Ca13基因表达的蛋白作为生物杀虫剂的有效成分。