CN103525835B

CN103525835B - 一种Bt cry71Aa1基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN103525835B
Application number: CN201310428864.9A
Authority: CN
Inventors: 郑爱萍; 李平; 李巧; 朱军; 邓其明; 王世全; 李双成
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Xinsiyuan High Tech Co ltd
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2033-09-18
Also published as: CN103525835A

Abstract

本发明提供了一种Bt cry71Aa1基因及其编码蛋白和应用,所述cry71Aa1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。所述cry71Aa1基因编码的Bt蛋白Cry71Aa1可以用于制备Bt杀虫剂，cry71Aa1基因可以转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

Description

一种Bt cry71Aa1基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Bt cry71Aa1基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素。多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白（Insectididal crystal proteins，简称ICPs），ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。

自1981年Schnepf从菌株HD-1中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了630多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N,et al.Microbiol Mol Biol Rev,1998,62:807-813;http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。现在已经分离克隆了72个类群的杀虫蛋白。一般而言，Cry1,Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cry1和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kDa，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis,简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛运用于蚊虫的防治。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实（McGaughey,1985.Science.229:193-195），原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟（Plodia interpunctella）在Dipel(Btsubsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性（Tabashnik B.E.,et al.1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:4120-4124），上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成（冯夏.1996.昆虫学报,39(3):238-244;Hofte H.,1988.Appl.Environ.Microbiol.54:2010-2017）。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性（Schnepf,E.,et al.1998.Mol.Biol.Rev.65(3):77 5-806）。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题,但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现（Georghiou G P,1997.Applied and Environmental Microbiology,63:1095-1101.）。

为避免抗性昆虫所造成的损失，许多针对于这个问题的方法被提出来，例如加大使用剂量和多基因协同使用，但是能从根本上解决这一问题的还是寻找新的、高毒力、宽杀虫谱的Bt基因资源，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种Bt cry71Aa1基因及其编码蛋白和应用。

为了实现本发明的目的，本发明通过对苏云金芽孢杆菌菌株HS18-1，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），保藏号为CGMCC No.2718，已在专利号为ZL200910081594.2的发明专利申请中公开。通过对本菌株HS18-1的毒力测试表明，菌株HS18-1对鳞翅目害虫，双翅目害虫等均具有极高的毒力。通过对本菌株的基因组和质粒测序进行研究，发现该菌株存在一个新的cry基因，设计其全长基因引物，克隆得到cry71Aa1基因的完整基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，全长为2151bp。分析表明，cry71Aa1基因GC含量为35.15%。编码716个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。在softberry网站采用bacterial sigma7.0promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将其命名为cry71Aa1。Cry71Aa1蛋白的氨基酸组成如表1所示。

表1 cry71Aa1蛋白的氨基酸组成

氨基酸	数目	百分比%	氨基酸	数目	百分比%
						Ala(A):	43	4.06	Met(M):	8	1.26
Cys(C):	10	1.28	Asn(N):	54	7.56
						Asp(D):	34	4.80	Pro(P):	33	4.03
Glu(E):	38	5.93	Gln(Q):	29	4.49
						Phe(F):	31	5.43	Arg(R):	36	6.65
Gly(G):	41	3.26	Ser(S):	63	7.02
						His(H):	14	1.96	Thr(T):	56	7.07
Ile(I):	49	6.81	Val(V):	28	3.48
						Lys(K):	32	4.96	Trp(W):	15	3.25
Leu(L):	61	8.48	Tyr(Y):	41	7.87

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白Cry71Aa1（如SEQ ID No.2）所示在不影响其活性的前提下，取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，得到与所述蛋白具有同等功能的衍生的突变蛋白质。

本发明的基因和蛋白质可以从Bt菌株HS18-1中克隆或分离得到，或者通过DNA肽合成的方法得到。

本发明提供一种Bt Cry71Aa1基因，所述Cry71Aa1基因具有（1）或（2）所示的核苷酸序列：

（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

（2）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明还提供了所述基因编码的Bt蛋白Cry71Aa1。

本发明还提供了含有所述Cry71Aa1基因的载体及工程菌。

本发明还提供了一种用于扩增Cry71Aa1基因的引物，所述引物序列为：

引物pS71-F：5’-GCC GGATCC A ATGAATTCATATCAAAGTGAA-3’

引物pS71-R：5’-GGG GTCGACCTACTTTGTTTTAAATAAACT-3’。

本发明还提供了所述Cry71Aa1基因在提高植物抗虫性中的应用。

进一步地，所述应用为将Cry71Aa1基因与表达载体连接，得到能够表达Bt蛋白Cry71Aa1的重组表达载体，再通过转基因方法将所述重组表达载体导入植物，得到含有Cry71Aa1基因的转化体，表达Bt蛋白Cry71Aa1，提高植物抗虫性。

可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转cry71Aa1基因的转化体，例如农作物或者果树等植物，使其具备抗虫活性。

在本发明的一个实施例中，Bt蛋白cry71Aa1重组表达载体的获得是通过将cry71Aa基因插入到大肠杆菌-芽胞杆菌穿梭表达载体pSTK上得到重组表达载体pS71Aa1。

此外，还可以通过发酵本发明菌株Hs18-1，得到含有cry71Aa1蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明Bt蛋白。

本发明还提供了所述基因在培育转基因植物中的应用。

本领域技术人员可以根据本发明公开的cry71Aa1基因，将其转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。例如：利用密码子的简并性，将cry71Aa1基因设计具有水稻偏好密码子的基因序列，再将合成的cry71Aa1基因序列与载体 pCAMBIA1300连接，通过农杆菌介导转入到水稻基因组中，从而得到具有抗虫活性的转基因水稻品种。

本发明还提供了含有所述Bt蛋白Cry71Aa1的杀虫剂。

本发明还提供了所述Bt蛋白Cry71Aa1在提高植物抗虫性中的应用。

本发明提供Cry71Aa1蛋白是一种新的Bt蛋白，具有较好的杀虫活性，将其用于制备转基因植物，能够特异性杀灭害虫，并降低农药的使用量，降低成本，减少环境污染。目前还没有害虫或昆虫对该蛋白产生抗性的报道，因此，本发明的Bt蛋白Cry71Aa1具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于提高植物的抗虫性中。

附图说明

图1显示的是克隆得到的cry71Aa1全长基因的凝胶电泳图，其中：M为DNA marker；1为cry71Aa1基因。

图2显示的是重组质粒pS71Aa1的酶切鉴定图谱，其中：1为质粒pSTK质粒；2为重组质粒pS71Aa1的BamHI+SalI双酶切产物；3为插入的DNA；M为DNA marker。

图3显示的是cry71Aa1基因在无晶体突变株HD73^-中表达的SDS-PAGE检测图；其中：M为蛋白marker；1为含有重组质粒pS71Aa1的阳性转化子的表达蛋白，2为含有质粒pSTK的对照转无晶体突变株HD73^-转化子表达产生的表达蛋白。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

基因组DNA纯化试剂盒购自赛百盛公司；

E.coli Trans110购自北京全式金生物技术有限公司；

扫描电镜S-4800购自日本日立公司（Hitachi）；

若未特别指明，本发明实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，如未具体说明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 cry71Aa1基因的克隆

本发明从四川省沐川原始森林地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）新菌株HS18-1，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），保藏号为CGMCC No.2718，已在专利号为ZL200910081594.2的发明专利申请中公开。

采用基因组DNA纯化试剂盒提取菌株HS18-1的总DNA作为扩增cry71Aa1基因的模板，设计引物序列如下：以Bt菌株HS18-1的DNA为模板，以下列引物进行扩增，得到cry71Aa1基因。

PS71-F:GCC GGA TCC A ATGAATTCATATCAAAGTGAA

PS71-R:GGG GTC GAC CTACTTTGTTTTAAATAAACT

其中，下划线部分GGATCC为酶切位点BamH I，GTC GAC为酶切位点SalI。

上述各基因的扩增反应如下：

25μl PCR反应体系：

热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性50s，54℃退火50s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；扩增反应产物在0.7%琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。结果如图1所示，通过扩增得到了约为2151bp的序列，将该序列进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，与cry71Aa1基因序列一致。

实施例2 Cry71Aa1蛋白获得

实施例1扩增的产物cry71Aa1基因用BamH I和Sal I进行双酶切，酶切产物与同样进行双酶切后的穿梭载体pSTK连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，提取其质粒酶切电泳验证插入片断大小符合预期目的片段（如图2所示），得到重组质粒pSTK-cry71Aa1。将重组质粒转入E.coli Trans110中使重组质粒DNA去甲基化。然后提取质粒，将去甲基化后的重组质粒通过电转化转入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株HD73^-中表达。电转化的参数设置均为2.2kV、1000Ω和25μF。含重组质粒阳性重组菌株命名为HD71Aa1。同时将pSTK质粒转化苏云金芽孢杆菌无晶体突变株HD73^-作为阴性对照，将阳性转化子于1/2LB培养基中，在200r/min、28℃下培养72h，离心培养液收集菌体，弃上清，用无菌水水洗菌体3次，加入30mL10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)超声波破碎，提取表达蛋白，用SDS-PAGE对表达蛋白进行检测。

如图3所示，SDS-PAGE分析表明：转化子HD71Aa1中表达约80kDa左右的Cry71Aa1蛋白；表达蛋白的分子量与预测的蛋白分子量相符合。

实施例3 cry71Aa1基因在HD73-中表达的显微观察

实施例2中，将各阳性转化子于1/2LB培养基中，在200r/min、28℃下培养，待90%以上的芽孢形成后收集菌体，制片于光学显微镜下观察转化子是否会产生晶体蛋白，若产生晶体蛋白则采用扫描电镜观察晶体形态。

通过SDS-PAGE，光学显微镜和扫描电镜观察，cry71Aa1基因在HD73^-中表达但是不能形成伴孢晶体。

实施例4 Cry71Aa1蛋白杀虫活性测定

将实施例2获得的HD71aA1阳性转化子培养后的芽孢和晶体混合物分别对甜菜夜蛾进行杀虫活性测定。首先将混合物配制成13.7，24，48，80.3，144.5ug/mL等5个不同的浓度梯度，然后每个浓度梯度的处理投入45头一龄甜菜夜蛾幼虫，每个处理重复3次，转化pSTK质粒的苏云金芽孢杆菌无晶体突变株HD73^-作为阴性对照，清水为空白对照；72h后统计结果，LC₅₀用SPSS10.0软件分析。

由表2可以看出：HD71Aa1转化子对甜菜夜蛾幼虫具有一定的杀虫活性，其LC50为210.1μg/mL。阴性对照均对甜菜夜蛾无杀虫活性。

表2三种不同转化子表达蛋白对库蚊的杀虫活性

注：表2中，N表示无杀虫活性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种Bt Cry71Aa1基因，其特征在于，所述Cry71Aa1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.权利要求1所述基因编码的Bt蛋白Cry71Aa1。

3.含有权利要求1所述Cry71Aa1基因的载体。

4.含有权利要求1所述Cry71Aa1基因的工程菌。

5.一种用于扩增权利要求1所述Cry71Aa1基因的引物，其特征在于，所述引物序列为：

引物pS71-F：5’-GCC GGATCC A ATGAATTCATATCAAAGTGAA-3’

引物pS71-R：5’-GGG GTCGACCTACTTTGTTTTAAATAAACT-3’。

6.权利要求1所述的Cry71Aa1基因在提高植物抗虫性中的应用，其特征在于，所述抗虫性表现为抗甜菜夜蛾。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为将Cry71Aa1基因与表达载体连接，得到能够表达Bt蛋白Cry71Aa1的重组表达载体，再通过转基因方法将所述重组表达载体导入植物，得到含有Cry71Aa1基因的转化体，表达Bt蛋白Cry71Aa1，提高植物抗虫性。

8.权利要求1所述基因在培育转基因植物中的应用。

9.权利要求2所述Bt蛋白Cry71Aa1在提高植物抗虫性中的应用，其特征在于，所述抗虫性表现为抗甜菜夜蛾。