CN103333230A

CN103333230A - 苏云金芽孢杆菌基因cry1Da3及其应用

Info

Publication number: CN103333230A
Application number: CN2013102866930A
Authority: CN
Inventors: 黄天培; 束长龙; 张�杰; 宋福平
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2013-07-09
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2033-07-09
Also published as: CN103333230B

Abstract

本发明涉及苏云金芽孢杆菌基因cry1Da3及其应用，属于物防治领域。杀虫基因cry1Da3，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其编码的杀虫蛋白Cry1Da3，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。生物活性检测表明，该基因对小菜蛾、甜菜夜蛾有较强的杀灭能力。

Description

苏云金芽孢杆菌基因cry1Da3及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种苏云金芽孢杆菌基因cry1Da3以及其应用。

背景技术

虫害是造成农作物减产的重要原因之一,减少虫害的损失是增加粮食与饲料作物产量的重要途径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14%,直接给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水稻减产10%、小麦减产20%、棉花减产30%以上[夏启中,张明菊，抗植物虫害基因及其应用，鄂州大学学报,2005,(5):56-60.]。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害,但化学农药造成环境污染,生物杀虫剂成本较高。长期以来,大量喷施化学杀虫剂,不仅会增强害虫的抗药性,使益虫及其它生态区系遭受破坏,而且严重污染环境,提高生产成本,破坏生态平衡。因此,减少杀虫剂使用量,发展现代植物保护技术,已成为可持续发展农业中必须正视的课题之一。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E,Crickmore.N,Van Rie.J.,Lereclus.D,Baum.J,Feitelson.J,Zeigler.D.R.,Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev,1998,62(3):775-806.]。

自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，截止2008年6月已发现和克隆了412种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。

1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cry1Ac。在接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1A基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2007年,全球转基因作物种植面积增长率达12%，即增加1230万hm2，达到1.143亿hm2(2.824亿英亩)。第一个12年，转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。

由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。

因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。

发明内容

本发明从菌株HD12中克隆得到一个新的杀虫基因，其对小菜蛾，甜菜夜蛾具有较强的杀虫毒性，为生物防治提供了新的生物资源。

一种杀虫蛋白，其具有如SEQ ID NO2所示的第35-253位的氨基酸序列。

优选杀虫蛋白Cry1Da3的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。

一种苏云金芽孢杆菌杀虫基因，其具有的核苷酸序列编码上述杀虫蛋白。

所述杀虫基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

上述杀虫基因或蛋白在杀灭小菜蛾、甜菜夜蛾中的应用。

所述应用是将蛋白作为杀虫剂的有效成分用于杀灭小菜蛾、甜菜夜蛾。

本发明从菌株HD12中克隆得到了一个新的基因，提交Bt命名委员会命名为cry1Da3，经测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。经分析可知，该蛋白的Domain I由N端第35-109位，共74氨基酸组成，Domain II由第110-189位，79个氨基酸组成，Domain III由第190-253位、共63个氨基酸组成。因此，Cry1Da3蛋白的活性区估计在N-端的35-253位氨基酸附近（图3）。

经实验证明，该基因对小菜蛾，甜菜夜蛾具有较强的杀虫毒性，为生物防治提供了新的生物资源。

附图说明

图1HD12扫描电镜图片，

图2HD12PCR产物电泳图谱，

其中M:λDNA/Eco130I;1.PCR产物，

图3Cry1Da3蛋白三个结构域所在位置，

图4cry1Da3表达产物的SDS-PAGE分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

1、菌株来源：标准菌株HD12[Kuo.W,Chak.K.Identification of Novel cry-Type Genes fromBacillus thuringiensisStrains on the Basis of Restriction Fragment LengthPolymorphism of thePCR-Amplified DNA.Appl.Environ.Microbiol.,1996,62(4):1369–1377]。本申请人实验室有保藏，可以对公众发放。下面所用其它菌株和试剂都是商业产品。

2、菌株形态学观察特性：

Bt菌株接种于1/2LB培养基中，30℃培养大约两天，显微镜观察芽胞晶体释放后，刮取培养物用蒸馏水洗3-4遍，悬浮于1mL无菌水中，孢晶混合液滴于玻璃片上，干燥，经锇酸固定，而后经酒精梯度脱水，临界点干燥，离子溅射喷金（2nm），New Bio-TEMH-7500扫描电镜观察拍照（图4），可以观察到椭圆形芽孢与小菱形的晶体，说明菌株中存在杀虫晶体蛋白。

3、基因的克隆与序列分析：

3.1基因克隆：

设计引物扩增基因全长：

1Da5 ATGGAGATAAATAATCAGAAGCAATG

1Da3 TTCCTCCATAAGGAGTAATTCC

以Bt菌株HD12的基因组为模板，用上述引物、Phusion超保真DNA聚合酶扩增新cry基因，得到约3.5kb的片段。将该全长基因克隆入pEB载体，转化大肠杆菌。测序结果用Vector NTISuite9软件包中的ContigExpress程序进行拼接。得到该基因的序列，并将其翻译成氨基酸序列见附录。详细步骤如下：

1)HD12基因组制备

⑴将菌株HD12划线接种于LB培养基上，30℃培养到芽胞释放；尽可能刮取平板上全部菌体于1.5ml EP管中，用100μl TE溶液充分悬浮；加入100μl4%SDS溶液，充分混匀；加入200μl NaAc(3M，pH4.5)，混匀，12000rpm离心10分钟；

⑵收集上清，加入等体积异丙醇，-20℃静置20分钟；

⑶12000rpm离心10分钟，弃上清；

⑷用70%的无水乙醇清洗沉淀，室温晾干；

⑸用100μl TE溶液溶解；-20℃保存备用。

2)PCR反应体系：

PCR反应条件：94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，30个循环，最后72℃延伸10分钟。

3)PCR结果用0.7%琼脂糖胶进行电泳检测（图2）。

结果显示，引物可以从HD12菌株中扩增到可以扩增到典型的3.5kB的基因条带，可以用于进一步杀虫基因克隆。

4)杀虫基因与载体连接

用超纯水补足体积到10μL，充分混匀，16℃连接4h或4℃连接过夜。

5)杀虫基因连接产物转化

⑴取200μl感受态细胞（JM109）与5μL连接产物充分混匀，冰浴30min。

⑵42℃热激1.5min，冰浴3min。

⑶加入800μl LB培养基37℃培养45min。

⑷取200μl涂板，加入相应的抗生素（氨苄青霉素），及IPTG，X-gal，37℃培养。

3.2新基因的序列分析

将该基因在GeneBank进行登记，Accession Number为HQ439784，提交Bt命名委员会命名为cry1Da3，如SEQ ID NO1所示，其编码的蛋白为Cry1Da3，如SEQ ID NO2所示。

用AlginX软件对Cry1Da3蛋白进行了理化性质分析（表1）：该基因全长3492bp，编码的氨基酸为1164个，推算所编码蛋白分子量为约130kDa。该蛋白的理论等电点为5.30，为弱酸性蛋白质。

表1Cry1Da3蛋白理化性质分析

分析项目	全长蛋白
		氨基酸数	1164
分子量	131994.25
		每微克蛋白的摩尔数	7.576皮摩尔
等电点	5.30
		电荷数pH7	-34.86

表2Cry1Da3蛋白的氨基酸组成成分分析

同时，NCBI Conserved Domain Summary分析结果表明该蛋白的Domain I由N端第35-109位，共74氨基酸组成，Domain II由第110-189位，79个氨基酸组成，Domain III由第190-253位、共63个氨基酸组成。因此，Cry1Da3蛋白的活性区估计在N-端的35-253位氨基酸附近（图3）。

4、基因在大肠杆菌中表达研究：

4.1基因表达载体构建

全长基因克隆入pEB载体，阳性克隆接种至LB培养基中，37℃，230rpm培养过夜，提取质粒，转化大肠杆菌Rosetta菌株。经PCR、酶切鉴定后再经过序列测定鉴定阳性重组子后诱导表达。

4.2基因诱导表达

ZYP-5052培养基：Tryptone1.0%，Yeast extract0.5%，0.05mol/L Na2HPO4，0.05mol/LKH2PO4，0.025mol/L(NH4)2SO4，0.002mol/L MgSO4。

乳糖自诱导蛋白表达：

1）单菌落于LB液体培养基37℃、220rpm活化12h；

2）1%接种于200mL ZYp-5052培养基中，同时加4mL50x5052，20℃，240rpm、48h诱导表达；

3）8000rpm、3min离心收集菌体，用10mL20mmol/L Tris·Cl(pH8.0)悬浮菌体；

4）破碎菌体（超声波破碎完全）5min；

5）4℃、12000rpm、10min离心收集上清及沉淀，分别进行蛋白电泳检测，如图4所示，结果显示cry1Da3基因表达了约130kD的蛋白，与推导的Cry1Da3蛋白理化性质分析结果一致。

5、杀虫活性测定

小菜蛾:采用浸叶法，将甘蓝叶片用清水洗净晾干，选取鲜嫩一致的甘蓝叶片切成大小相近的块状，在待测样品稀释液中浸泡10min，晾干，放入生测瓶中，每瓶接2-3龄幼虫20头，每个处理重复三次，25℃生化培养箱中保温，培养48h后调查死、活虫数，并观察幼虫取食情况。

甜菜夜蛾：称取5g人工饲料，加入500μl待测样品稀释液，于灭菌培养皿中充分混匀，混匀的饲料平均分装于24孔细胞培养板中。每孔接入甜菜夜蛾初孵幼虫一头，每处理重复三次，用清水处理的作为对照。放置26℃光照培养箱中培养，培养5天后调查死亡率，并观察幼虫取食、发育情况。

实验表明（见表3），Cry1Da3蛋白对小菜蛾、甜菜夜蛾有较好的杀虫活性。

表3生测结果

Claims

1.一种杀虫蛋白，其具有如SEQ ID NO2所示的第35-253位的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的杀虫蛋白，命名为Cry1Da3，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。

3.一种苏云金芽孢杆菌杀虫基因，其核苷酸序列编码权利要求1或者2所述的杀虫蛋白。

4.根据权利要求3所述的所述杀虫基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

5.权利要求3或4所述杀虫基因或权利要求1或2所述的杀虫蛋白在杀灭小菜蛾、甜菜夜蛾中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，是将权利要求2所述的杀虫蛋白作为杀虫剂的有效成分用于杀灭小菜蛾、甜菜夜蛾。