CN104946668A - cry1Ia基因及应用、由其编码的Cry1Ia蛋白及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种cry1Ia基因及应用、由其编码的Cry1Ia蛋白及制备方法和应用，其中cry1Ia基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。由cry1Ia基因编码的Cry1Ia蛋白，其制备方法为以SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列为引物，进行PCR扩增、与载体连接得到重组子、转化至大肠杆菌中得到转化子，然后培养，搜集菌体，将菌体破碎，取Cry1Ia蛋白。本发明的cry1Ia基因和Cry1Ia蛋白可应用于寄生线虫的防治，具有高效、低毒、生态环保、且能有效减少农药残留等优势。

Description

cry1Ia基因及应用、由其编码的Cry1Ia蛋白及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及cry1Ia基因及其应用，由cry1Ia基因的编码的Cry1Ia蛋白和编码蛋白在寄生线虫防治上的应用。

背景技术

植物寄生线虫病是农作物的重要病害之一。全球每年由植物寄生线虫所造成的作物损失超过千亿美元(Chiwold，2003)，线虫病害已成为农业生产上的一个突出问题。目前，农业生产上常采用化学杀线虫剂来防治植物寄生线虫病害，但现今市场上杀线虫剂的品种有限，大部分为高毒、高残留农药，长期单一地使用高毒、高残留的化学杀线虫剂，不仅对环境造成了严重的污染，也引发了农产品中农药残留超标、线虫抗药性日益突出等系列环境和社会问题。近年来，随着人们对农产品安全的日益关注，化学农药的使用越来越受到限制，因此，研发有效的杀线虫微生物以补充或替代化学杀线虫剂就显得日益迫切。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上应用最广泛、最成功的微生物杀虫剂，被广泛应用于农业、林业、贮藏以及卫生等领域的害虫防治。自从1961年Ciordia等首次发现Bt对牛肠道蛇形毛圆线虫(thichostrongylus colubriformis)卵和幼虫有杀灭作用以来，Bt的杀线虫作用才逐渐引起人们的关注。国内外已报道的具有杀线虫活性的Bt菌株主要包括Bt苏云金亚种(B.t.subsp.thuringiensis)、以色列亚种(B.t.subsp.Israelensis)、库斯塔克亚种(B.t.subsp.Kurstaki)和莫里斯亚种(B.t.subsp.Morris)。这些菌株对多种植物线虫具有生物活性，如酸酱线虫(Panagrellus redivivus)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)和大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)等(Schnepf，1998)。

1985年Bone等首次证实了Bt伴胞晶体蛋白(δ-内毒素)对线虫的作用活性，2003年Wei等研究了不同基因产生的伴胞晶体蛋白对几种自由生活线虫的毒性，从两个主要的B.t.晶体蛋白亚家族中表达出了7种不同的晶体毒素蛋白，通过测试这些晶体毒素蛋白对自由生活的线虫毒性，证实了其中4种晶体毒素蛋白(Cry5B、Cry6A、Cryl4A、Cry21A)对多种线虫种类均有活性，所测试的线虫至少对一种晶体毒素蛋白敏感，从而明确提出Bt晶体毒素蛋白具有杀线虫能力(Wei JZ,2003)。B.t.晶体毒素蛋白是由毒素蛋白基因(cry基因)编码的，不同苏云金芽胞杆菌亚种或菌株所具有的cry基因不同。1988年以来，美国Mycogen公司分离到一些对秀丽新小杆线虫、短体线虫、捻转血矛线虫等有毒性的苏云金芽胞杆菌，并从这些菌株中克隆了一些杀线虫毒素蛋白基因(参见http://appft.uspto.gov/netacgi)。到目前为止，全世界从B.t.菌株中已分离到的杀线虫基因主要有cry1、cry5、cry6、cry12、cry13、cry14以及cry21几大类，但数量十分有限，而且这些菌株、伴胞晶体蛋白及伴胞晶体蛋白基因几乎都以专利的形式加以保护，所涉及的菌株也多使用代号。因此，分离鉴定新的杀线虫Bt菌株与伴胞晶体蛋白引起国内外科学家的广泛重视。

cry1Ia基因是cry基因家族中非常特殊的cry1类基因，最先由Tailor等从B.thuringiensis菌株4835中克隆，该基因编码一个81KD的蛋白，对鳞翅目的夜蛾科(Noctuidae)、卷叶蛾科(Tortricidae)、菜蛾科(Plutellidae)和鞘翅目的叶甲科(Chrysomelidae)的害虫具有较好的杀灭效果。cry1Ia基因在大都数Bt菌株中被沉默而没有表达产物((Kostichka et a1,1996)，其主要原因在cry1I基因编码区上游一般与cryl类基因相邻，称为cryl-crylI连锁，造成了crylI基因自身启动子的缺乏。

尽管cry1Ia基因在Bt菌株中普遍被沉默，但已有多个基因被克隆，全球分离克隆的cry1Ia基因有13种。但是目前为止，克隆获得的cry1Ia基因及表达蛋白的杀虫作用仅限于鳞翅目和鞘翅目害虫，还没有cry1Ia基因及表达产物对植物寄生线虫具有作用活性的相关研究报道。

湖南省植物保护研究所分离了一种苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株YC-10，并将其保藏至中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期2010年1月21日，保藏号为CCTCC NO：M 2010023。研究发现苏云金芽胞杆菌YC-10产生的伴胞晶体对植物寄生线虫具有较高的生物活性。然而，该菌株产生的伴胞晶体蛋白是由多种成分组成的混合物，不仅未明确具体杀线虫活性蛋白，且蛋白产量低，导致伴胞晶体抽提物在植物寄生线虫防治上很难广泛应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种从苏云金芽孢杆菌中分离得到的cry1Ia基因，该cry1Ia基因可应用于杀线虫的防治；本发明还提供了由cry1Ia基因编码的Cry1Ia蛋白及其制备方法和应用，Cry1Ia蛋白使之表现出对植物寄生线虫的毒性，具有高效、低毒、生态环保、且能有效减少农药残留等优势，可做为新型的生物农药。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

种cry1Ia基因，优选的，所述cry1Ia基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述cry1Ia基因在防治寄生线虫中的应用。

上述的应用，优选的，将cry1Ia基因转化植物，得到抗线虫植株的新品种。

上述的应用，优选的，将cry1Ia基因转化微生物，获得可高效表达用于防治线虫的蛋白，表达的蛋白可制成生物农药用于防治植物线虫病害。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述cry1Ia基因编码的Cry1Ia蛋白。

上述的Cry1Ia蛋白，优选的，所述Cry1Ia蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的Cry1Ia蛋白的制备方法，其特征在于，所述Cry1Ia蛋白的制备方法具体包括以下步骤：

S1、以SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列为引物，对所述cry1Ia基因进行PCR扩增得到扩增产物；

S2、将所述扩增产物与载体连接得到重组子；

S3、将所述重组子转化至大肠杆菌中得到转化子；

S4、将所述转化子进行活化、表达，得到Cry1Ia蛋白。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S2中所述载体为pQE30。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S4具体为：

S4-1、将所述转化子涂布于LB平板中，培养过夜得到培养液；

S4-2、将所述培养液接种于LB培养基中进行放大培养；

S4-3、加入诱导剂继续培养4～12h；

S4-4、搜集所述步骤S4-3培养得到的菌体进行超声破碎、离心得到Cry1Ia蛋白。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S4-1中所述LB平板中含有100μg/L的氨苄青霉素。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S4-2中将所述培养液方法培养至OD600为0.6～0.7。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S4-3中，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S4-3中，所述诱导剂的浓度为0.5mM。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的Cry1Ia蛋白或所述制备方法制备得到的Cry1Ia蛋白在防治寄生线虫中的应用。

上述的应用，优选的，所述寄生线虫为根结属线虫或孢囊属线虫。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种从苏云金芽胞杆菌YC-10分离得到的cry1Ia基因，将cry1Ia基因转化植物或微生物，获得可高效表达用于防治线虫的蛋白，表达的蛋白可制成生物农药用于防治植物线虫病害；还可以获得抗线虫植株的新品种，对线虫的防治效果好，致死率高。

(2)本发明提供了一种由cry1Ia基因编码得到的Cry1Ia蛋白，20mg/L处理南方根结线虫、大豆孢囊线虫J2，96h致死率达100％，不仅高效低毒，而且可以有效减少化学农药的使用，降低化学农药对环境的污染，并能减少线虫抗药性的产生，进而有利于环境保护，减少农产品上的农药残留，具有广阔的推广应用前景。

(3)本发明开拓了植物寄生线虫生物防治的新途径，扩大了适用于植物寄生线虫的生物农药资源。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1苏云金芽孢杆菌YC-10形态特征图。

图2为本发明实施例2中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，M为DNA Marker，ck为阴性对照。

图3为本发明实施例2中pQE30-cry1Ia载体构建示意图。

图4为本发明实施例2中构建成功的载体及其酶切图谱，从左到右分别为DNA Marker、重组质粒、质粒酶切、PCR扩增，ck为空载体PCR扩增。

图5为本发明实施例2中表达的Cry1Ia蛋白SDS-PAGE凝胶电泳检测结果。

图6为本发明实施例2中纯化后的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳检测结果。

图7为本发明实施例3中表达的蛋白对南方根结线虫室内生测结果图。

图8为本发明实施例3中转空载体菌株制备液对南方根结线虫室内生测结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1

一种从苏云金芽胞杆菌YC-10中分离得到的cry1Ia基因，本实施例的苏云金芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期2010年1月21日，保藏名称为苏云金芽胞杆菌YC-10，保藏号为CCTCC NO：M 2010023。

本实施例1的分离自根结线虫病田中健康烟草植株根，营养琼脂培养基保存备用。该菌株在营养琼脂培养基上生长良好，30℃下恒温培养2d，菌落直径可达0.2cm～0.5cm，菌落乳白色、圆形或椭圆形，不透明，边缘不齐呈毛玻状；该菌株的菌体扫描电镜观察呈短杆状，无鞭毛，大小为(1.0～1.2)×(2.0～4.0)μm(参见图1)；该菌株产椭圆形芽孢、近中生；该菌株G+，过氧化氢酶反应、V.P.反应均为阳性，能水解淀粉、明胶、卵磷脂，不能水解酪氨酸，不能将苯丙氨酸氧化脱氨，葡萄糖发酵产酸，含有脲酶，振荡培养后pH值呈碱性；该菌株耐高温，对氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素抗性强，最适生长温度为30℃，最高生长温度45℃，最低生长温度10℃，温度过高或过低都不利于菌株的生长；pH范围在pH4.5～9.5、5.5～8.5为其适宜的生长条件，pH值小于5.5或大于8.5生长受到明显抑制；在营养琼脂液体培养基中30℃培养，0～2h处于延滞期，对数生长期为2～16h，16h后为稳定期。

cry1Ia基因其分离方法具体包括以下步骤：

1、抽提DNA：

将保存的苏云金芽胞杆菌YC-10菌种在营养琼脂固体培养基上划平板，于30℃的恒温培养24h。挑取营养琼脂固体培养基上的单菌落在营养琼脂液体培养基中，以温度为30℃、转速为220r/min摇床培养48h，离心收集菌体。将收集的菌体用500μl TE缓冲液溶解后，加30μl质量百分含量为10％的SDS、3μl的PKase，混匀，于37℃下反应1小时。然后加100μl浓度为5M的NaCl溶液，混匀后再加入80μl的CTAB质量分数为10％的CTAB/NaCl溶液，混匀得到混合溶液；然后在混合溶液中加入与前述混合溶液等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液(酚/氯仿/异戊醇混合液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1)，混匀，在12000rpm离心5min。取离心后的上清液，再加入与前述上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液(氯仿/异戊醇混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1)，混匀，在12000rpm离心5min。取离心后的上清液加入相当于前述上清液2倍体积的无水乙醇(本实施例中无水乙醇还可替换为3/5体积的异丙醇)沉淀DNA，在10000rpm离心10min；用体积分数为70％的乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥，加TE溶解；然后在37℃下用RNase消化1小时，得到基因组DNA。

将提取得到的基因组DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提得到的基因组DNA完整性，检测结果为基因组DNA完整。

2、测序：

对步骤1中抽提得到的DNA基因组测序(基因组序列测定由深圳华大基因科技有限公司完成)，将测序结果登录到Genbank中，序列号：cp011349-cp011358。

经过测序，苏云金芽胞杆菌YC-10中含有1条大少为5.68M的染色体及大少不等的9个质粒。在菌株所包含的6028个基因中含有6个不同的cry基因，其中cry1Ia基因为其中之一。

实施例2

一种由实施例1的cry1Ia基因编码的蛋白，其制备方法具体包括以下步骤：

(1)PCR：

1.1设计引物：

F:5’—GCTTTATTTGACATTACAGCTAAGTAT—3’

R:5’—TAAATTTCATCCTACATCTAATCACTC—3’

1.2扩增：

以步骤1中抽提的DNA为模板进行PCR扩增得到PCR扩增片段。具体的PCR反应体系以及扩增条件如下：

反应体系：

PCR反应条件：94℃×3min→(94℃×45s→52℃×60s→72℃×90s)×35循环→72℃×10min→4℃。

1.3将步骤1.2得到的PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果参见图2。从图2中可知：显示在2200bp处有单一条带，与预期片段大少一致。

(2)构建重组质粒，构建过程参见图3：

2.1将PCR扩增片段利用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切，并同时酶切pQE30表达载体(Qiagen)，酶切PCR产物和载体经琼脂糖电泳后分别回收。

2.2将回收后的PCR产物和载体用T4DNA连接酶于16℃连接6h或4℃连接过夜得到重组载体(将成功插入cry1Ia基因的表达载体命名为pQE30-cry1Ia)。

2.3通过热激法将重组载体转化大肠杆菌菌株JM109中，得到转化产物。

2.4将步骤2.3得到的转化产物涂布于含100μg/L的氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，得到阳性转化子(含有该表达载体的转化子命名为JM109-pQE30-cry1Ia)。

2.5、对步骤2.4将得到的阳性转化子抽提质粒进行BamH I和Hind III双酶切验证。酶切结果参见图4，图4表明：有约2200bp左右条带，表明cry1Ia基因已成功插入表达载体。

对插入片段进行测序分析，测序结果为SEQ ID NO 1所述的DNA序列，序列全长2160bp。编码718个氨基酸，编码的蛋白序列如SEQ ID NO 2所示。

(3)编码蛋白的表达：

3.1将步骤2.3中含有pQE30-cry1Ia表达载体的大肠杆菌菌株JM109的菌种，挑取单菌落接种到含有100μg/ml氨苄青霉素LB培养基中进行活化，在37℃过夜培养。

3.2将培养得到的培养液以1∶50浓度接种于200mL的LB培养基中放大培养至OD600为0.6～0.7。

3.3加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至LB培养基中，IPTG的终浓度为0.5mM，37℃继续培养，并于4h、8h和12h分别取样2mL，离心收集菌体。

3.4在收集的菌体中加入1mL浓度为0.05M Tris-HCl(pH9.0)溶液悬浮菌体，超声波完全破碎菌体，4℃条件下12000rpm离心10min，收集上清进行电泳检测。

电泳检测采用12.5％的SDS-PAGE凝胶电泳检测，检测条件为100V，25mA电泳5小时，考马斯亮蓝染液(考马斯亮蓝染液的成分为：0.1％的考马斯亮兰，45％的甲醇，10％的冰醋酸)染色15min，脱色液(脱色液的成分为10％的甲醇，10％的冰醋酸)脱色15min后观察电泳结果。

电泳结果参见图5，其中，泳道1、2、3分别为4h、8h和12h抽提液，泳道4为空载体抽提液。从图5中可以看出，经过诱导培养后，在80KD处有明显的蛋白条带，且随着诱导培养时间的延长，表达量越大，检测结果与预测的氨基酸序列大少基本一致，初步认为为cry1Ia基因表达产物，而转有pQE30空载体的菌株蛋白抽提液中没有目的条带。

3.5表达的Cry1Ia蛋白含有组氨酸(6×His)标记，利用Qiagen公司的Ni-NTA树脂亲和层析试剂盒(QIA expressionist，Version 3.0，03/2001)进行纯化得到纯化蛋白。将纯化蛋白利用12.5％的SDS-PAGE凝胶电泳检测，检测结果参见图6，其中泳道1、2、3、4分别为第1、第2、第3和第4次洗脱液。从图6中可以看出，在80KDa处可见单一条带的表达蛋白，证明此蛋白为Cry1Ia蛋白。

(4)表达蛋白的大量提取：

4.1将步骤2.3中构建的含有pQE30-cry1Ia表达载体的大肠杆菌菌株JM109划平板接种到含有100μg/ml氨苄青霉素LB固体培养基中，37℃过夜培养。

4.2挑取单菌落接种到含有100μg/ml氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养至对数生长期。

4.3取对数生长期的培养液作为种子液，将种子液以体积分数为2％的接种浓度到200mLLB液体培养基中，进行扩大培养。扩大培养的条件为：37℃、220rpm振荡培养4h。

4.4加入诱导剂IPTG至LB液体培养基中IPTG的终浓度为0.5mM。

4.5继续恒温振荡培养8h。离心收集菌体，加入10mL浓度为0.05M的Tris-Hcl(pH9.0)溶液悬浮菌体，超声波完全破碎菌体，4℃条件下12000rpm离心10min，收集蛋白溶液，并以转有空载体的JM109菌株培养抽提液作为对照，利用Bradford法测定Cry1Ia蛋白浓度。

对比例1

以转有空载体的JM109菌株按照实施例2中步骤4的方法制备得到的蛋白溶液。

实施例3

一种实施例2的Cry1Ia蛋白在防治南方根结线虫J2的应用，具体的应用方法为：

(1)南方根结线虫J2及大豆孢囊线虫J2的收集

南方根结线虫为实验室室内盆栽辣椒扩繁保存种群，当辣椒根系上有大量根结出现时，取出根系，用水轻轻冲洗，取下卵囊，于0.5％次氯酸钠中消毒3min、灭菌水冲洗3次，放入由200目钢丝网做成的孵化池，并置于培养皿中，加入灭菌水，25℃恒温培养，3d后每24h收集新孵化的南方根结线虫J2备用。

(2)蛋白溶液的配制：

实验组：将实施例2的蛋白溶液稀释成浓度分别为：5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L和80.0mg/L。

对照组：转有空载体的制备液，按照最高蛋白浓度处理组倍数进行稀释。

(3)对南方根结线虫J2幼虫的毒力测定

将含有根结线虫J2的悬浮液用灭菌水进行稀释并计数，使1mL约含有线虫200条。

利用24孔生化培养板将线虫悬浮液分别与实验组的蛋白溶液及对照组蛋白质溶液等体积混合，使蛋白处理液浓度分别为2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L和40.0mg/L。同时以转有空载体的JM109菌株制备液作为对照，每个处理重复4次。

将24孔板放置于25±2℃的培养箱中，并分别于24h、48h、72h和96h分别利用显微镜进行观察，计数线虫死亡情况(以针触之线虫不动视为死亡)。其处理结果见表1。

表1Cry1Ia蛋白对南方根结线虫J2室内毒力结果

从表1中可以看出Cry1Ia蛋白对南方根结线虫J2有明显的毒杀作用，其96h对南方根结线虫J2的LC50为15.17mg/L。

图7为40mg/L的实施例2的Cry1Ia蛋白处理南方根结线虫48h的室内生测结果图；图8为相同条件下，对比例1的转有空载体的菌株制备液处理南方根结线虫的室内生测结果图，从图7和图8的对比可知，Cry1Ia蛋白对南方根结线虫J2有明显的毒杀作用。

实施例4

一种实施例2的Cry1Ia蛋白在防治大豆孢囊线虫J2的应用，具体的应用方法为：

1、大豆孢囊线虫J2的收集：

大豆孢囊线虫为实验室室内大豆上扩繁保存种群，挑取孢囊于0.5％次氯酸钠中消毒3min、灭菌水冲洗3次，放入由200目钢丝网做成的孵化池，并置于培养皿中，加入灭菌水，25℃恒温培养，5d后每24h收集新孵化的大豆孢囊线虫J2备用。

2、Cry1Ia蛋白对大豆孢囊线虫J2幼虫的毒力测定

按照实施例3的方法，检测Cry1Ia对大豆孢囊线虫J2作用，结果见表2。

表2Cry1Ia蛋白对大豆包囊线虫J2室内毒力结果

从表2可以看出，Cry1Ia蛋白对大豆孢囊线虫J2毒杀作用明显，96h对大豆孢囊线虫J2的LC50达到13.02mg/L。

实施例5

一种实施例2的Cry1Ia蛋白在温室条件下防治作物根结线虫病的应用，具体的应用方法为：

1、供试作物为番茄，品种为湘粉一号(市场购买)。在塑料盆中装入灭菌土(粘土∶营养土＝2∶1)，播种番茄。番茄苗长出4～5片真叶时移栽于直径15cm小盆钵(盆钵中装灭菌土)，每盆一棵。待移栽苗成活后进行处理。

2、蛋白溶液的配制：

实验组：将实施例3的蛋白溶液稀释成浓度分别为：10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L。

药剂对照组：1.8％阿维菌素乳油800倍稀释作为对照药剂。

空白对照组：转有空载体的菌株制备液。

3、处理作物：

分别将实验组、药剂对照组和空白对照组的溶液处理番茄，每组处理10株，每株番茄浇灌100mL处理液，接种根结线虫400条/株。每个处理3次重复，区组随机排列。将经过处理后的番茄置于25℃～27℃的温室中培养，定期浇水，60d后拔取植株进行病情调查，并根据根结数目进行病情分级，计算防效。

病情指数分级标准如下：

0级：无根结。

Ⅰ级：根结占全根系的1％～25％。

Ⅱ级：根结占全根系的26％～50％。

Ⅲ级：根结占全根系的51％～75％。

Ⅳ级：根结占全根系的76％～100％。

病情指数(％)＝Σ(各级植物数×级值)/(调查总株数×最高级值)×100。

防治效果(％)＝(空白对照病情指数－药剂处理后病情指数)/空白对照病情指数×100。

本实施例的试验结果如下表3所示。

表3：Cry1Ia蛋白溶液防治番茄根结线虫病温室盆栽试验结果

从表3中可知：利用本发明中的工程菌制备的Cry1Ia蛋白对番茄根结线虫病有明显的防治效果，每株100mL 40mg/L蛋白溶液处理，其防效达到了86.75％，表现出该工程菌及其产品在植物寄生线虫生物防治上的巨大应用潜力。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种cry1Ia基因，其特征在于，所述cry1Ia基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述cry1Ia基因在防治寄生线虫中的应用。

3.一种由权利要求1所述cry1Ia基因编码的Cry1Ia蛋白。

4.根据权利要求3所述的Cry1Ia蛋白，其特征在于，所述Cry1Ia蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列。

5.一种权利要求3或4所述的Cry1Ia蛋白的制备方法，其特征在于，所述Cry1Ia蛋白的制备方法具体包括以下步骤：

S1、以SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列为引物，对所述cry1Ia基因进行PCR扩增得到扩增产物；

S2、将所述扩增产物与载体连接得到重组子；

S3、将所述重组子转化至大肠杆菌中得到转化子；

S4、将所述转化子进行活化、表达，得到Cry1Ia蛋白。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4具体为：

S4-1、将所述转化子涂布于LB平板中，培养过夜得到培养液；

S4-2、将所述培养液接种于LB培养基中进行放大培养；

S4-3、加入诱导剂继续培养4～12h；

S4-4、搜集所述步骤S4-3培养得到的菌体进行超声破碎、离心得到Cry1Ia蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4-2中将所述培养液方法培养至OD600为0.6～0.7。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4-3中，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；所述诱导剂的浓度为0.5mM；所述步骤S4-1中所述LB平板中含有100μg/L的氨苄青霉素。

9.一种权利要求3至4中任一项所述的Cry1Ia蛋白或权利要求5至8中任一项所述制备方法制备得到的Cry1Ia蛋白在防治寄生线虫中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述寄生线虫为根结属线虫或孢囊属线虫。