CN115057915B - 一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用 - Google Patents

一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请实施例公开了一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，用于测定大肠杆菌异源表达重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫的杀灭活性。本申请实施例方法包括：运用在线工具GENSCAN获取Bt Cry5B基因完整开放阅读框序列，分别在序列5’和3’端加入BamH I和Hind III酶切位点及其保护性碱基，得到嵌合序列；合成嵌合序列得到合成序列；将合成序列插入pMD19‑T克隆质粒进行TA克隆和测序分析，得到的克隆质粒用双酶切后连入pET‑32a(+)原核表达载体，得到pET‑32a‑Cry5B重组质粒；将pET‑32a‑Cry5B重组质粒转入原核表达菌DE3进行表达，得到重组Cry5B蛋白；重组Cry5B蛋白亲和层析后，得到纯化的重组Cry5B蛋白；将纯化的重组Cry5B蛋白进行倍比稀释，评价不同浓度重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫的杀灭活性。

Description

一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4 期幼虫活性药物中的应用
技术领域
本申请实施例涉及生物技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用。
背景技术
大熊猫是中国特有的珍稀物种，蛔虫是危害生和圈养大熊猫最为严重的一种肠道寄生性线虫，可引起大熊猫出现营养不良、消瘦，甚至死亡。临床上常用的驱虫药物包括伊维菌素和双羟萘酸噻嘧啶。
通过对临床上常用的驱虫药物包括伊维菌素和双羟萘酸噻嘧啶治愈效果进行评价，结果显示伊维菌素的虫卵转阴率为0-44％，双羟萘酸噻嘧啶的虫卵转阴率为80％，均低于“兽药注册技术要求国际协调合作组织(VICH)”标准(≥90％)，证实大熊猫蛔虫对两种驱虫药物，尤其是伊维菌素具有耐药性。此外，蛔虫虫卵长期污染环境，造成大熊猫反复感染，无疑加大了药物的使用密度和加快了耐药蛔虫株的出现，在这样的背景下，亟待寻求新的大熊猫蛔虫病治疗和防控方法。
发明内容
本申请实施例提供了一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，用于测试和测定大肠杆菌异源表达制备的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫的杀灭活性。
本申请实施例提供了一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B的制备及抗大熊猫蛔虫活性，其特征在于，包括：
S1、运用在线工具GENSCAN获取Bt Cry5B基因完整开放阅读框序列，分别在序列5’和3’端加入BamH I和Hind III酶切位点及其保护性碱基，得到嵌合序列；
S2、合成步骤S1中的所述嵌合序列以得到合成序列，将所述合成序列插入pMD19-T克隆质粒进行TA克隆和测序分析，得到克隆质粒；
S3、提取步骤S2中的所述克隆质粒，用双酶切后连入pET-32a(+)原核表达载体，得到pET-32a-Cry5B重组质粒；
S4、将步骤S3中的所述pET-32a-Cry5B重组质粒转入原核表达菌DE3后进行诱导表达，得到重组Cry5B蛋白；
S5、将步骤S4中的重组Cry5B蛋白进行亲和层析，得到纯化的重组Cry5B蛋白；
S6、将步骤S5中纯化的重组Cry5B进行倍比稀释，评价不同浓度纯化的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫的杀灭活性。
可选地，步骤S6中所述大熊猫蛔虫成虫和所述大熊猫L4期幼虫由成都大熊猫繁育研究基地提供，虫体采自基地自然感染大熊猫个体粪便。虫体经温生理盐水洗涤后，37℃过夜培养于含青霉素-链霉素-两性霉素B的Hanks平衡盐溶液。
可选地，步骤S2中所述合成序列通过信号肽预测以及TMHMM跨膜结构域分析后，使用BLAST P预测Cry5B蛋白保守结构域，使用DNAStar对不同Bt株源Cry5B基因编码核酸区序列进行一致性评估；MEGA进行多序列进行比对，构建基因系统进化树，并计算序列遗传距离。
可选地，步骤S3中所述pET-32a-Cry5B重组质粒经双酶切鉴定阳性重组质粒再次测序以验证其读码框的正确性。
可选地，对步骤S4中转入所述Cry5B重组质粒的原核表达DE3进行培养并检测Cry5B蛋白表达情况。
可选地，将转入所述Cry5B重组质粒的原核表达菌DE3接种于含Amp的LB平板，37℃过夜培养16h；挑取单个阳性菌落，接种于含Amp LB液体培养基中，37℃振摇培养2-3h；在菌液浓度到达OD450＝0.5时，加入IPTG至终浓度分别为0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L、1.8mmol/L、2mmol/L后继续振摇培养6h；分别吸取1mL培养液，10000xg离心10min，收获菌体沉淀，用PBS洗3次，用1×上样buffer处理，100℃水浴10min，SDS-PAGE检测Cry5B蛋白表达情况。
可选地，SDS-PAGE检测Cry5B蛋白表达情况表示在IPTG浓度为1.4mmol/L时，重组Cry5B蛋白的表达量最大；通过超声裂解处理后离心取上清和沉淀，进行蛋白可溶性分析；重组Cry5B蛋白主要表达于上清；使用Ni离子亲和层析柱对上清中的重组Cry5B蛋白进行纯化，通过BSA法测定纯化蛋白浓度。
可选地，通过虫体活力评分标准评价不同浓度的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫成虫的杀灭活性。
可选地，通过半数致死有效剂量ED50评价不同浓度的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫L4期幼虫的杀灭活性，得到的检测数据以平均值±标准差的形式表示。
可选地，使用SPSS统计软件对所述检测数据进行数据分析；通过用One-wayANOVA、LSD、Duncan或Scheffe法检验所述检测数据的组间差异显著性，P<0.05为差异性显著，置信区间设为95％。
从以上技术方案可以看出，本申请实施例具有以下优点：本发明通过在线工具GENSCAN获取Bt Cry5B基因完整开放阅读框序列，分别在序列5’和3’端加入BamHI和HindIII酶切位点及其保护性碱基，得到嵌合序列。合成嵌合序列得到合成序列。通过将合成序列插入pMD19-T克隆质粒进行TA克隆和测序分析，得到的阳性克隆质粒经双酶切后连入pET-32a(+)原核表达载体，得到pET-32a-Cry5B重组质粒。将步骤pET-32a-Cry5B重组质粒转入原核表达菌DE3后进行诱导表达，得到重组Cry5B蛋白。重组Cry5B蛋白进行亲和层析，得到纯化的重组Cry5B蛋白。最后将纯化的重组Cry5B蛋白进行倍比稀释，分别评价不同浓度纯化重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫的杀灭活性。本方案通过大肠杆菌异源表达制备重组Cry5B蛋白，用于测试测定该蛋白对大熊猫蛔虫具有杀灭活性。
附图说明
图1为本申请中一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用的一个实施例示意图；
图2为本申请中Bt YBT-1518Cry5B核苷酸及其氨基酸序列示意图；
图3为本申请中不同Bt株Cry5B-like蛋白的系统进化树示意图；
图4为本申请中重组Bt YBT-1518Cry5B蛋白的SDS-PAGE分析示意图；
图5为本申请中重组Bt Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫L4期幼虫毒力评价示意图；
图6为本申请中重组Bt Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫成虫的毒力评价示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本申请中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
大熊猫是中国特有的珍稀物种，蛔虫是危害大熊猫最为严重的一种肠道寄生性线虫。针对目前长期药物驱虫导致的大熊猫蛔虫耐药及生态污染问题，苏力菌(Bacillusthuringiensis，Bt)晶体蛋白Cry5B因其特异的线虫杀灭活性，是一种理想的新型抗蛔虫病药物候选。本研究拟通过原核表达方式产生Bt YBT-1518重组Cry5B蛋白，并评价其对大熊猫蛔虫的杀灭活性。
本申请中苏力菌晶体蛋白是菌体孢子生殖所产生的一种伴孢子蛋白，对脊椎动物无毒，而对昆虫等无脊椎动物却具有高效的杀虫活性，Bt晶体蛋白具有抑制或杀灭动物肠道线虫的活性，如锡兰钩虫、粪类圆线虫、多形螺旋线虫和捻转血矛线虫的活性，大熊猫蛔虫亦属肠道线虫，Cry5B可能是一种潜在的防控蛔虫病药物候选。然而考虑到Bt天然Cry5B蛋白产量有限，无法满足后续生产需要，本方案采用基因克隆和原核表达方式产生pET-32a-Cry5B重组质粒,通过pET-32a-Cry5B重组质粒转入大肠杆菌进行蛋白Cry5B的异源表达，本方案通过大肠杆菌异源表达制备重组Cry5B蛋白，用于测试和测定该蛋白对大熊猫蛔虫具有杀灭活性，而且能够降低成本提高经济效益，同时达到对大熊猫蛔虫绿色安全无污染的杀虫效果。
本申请实施例提供了一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，用于测试和测定大肠杆菌异源表达制备的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫具有杀灭活性。
请参阅图1和图2，本申请提供了一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，包括以下步骤：
S1、运用在线工具GENSCAN获取Bt Cry5B基因完整开放阅读框序列，分别在序列5’和3’端加入BamH I和Hind III酶切位点及其保护性碱基，得到嵌合序列；
S2、合成步骤S1中的嵌合序列以得到合成序列，将合成序列插入pMD19-T克隆质粒进行TA克隆和测序分析，得到克隆质粒；
S3、提取步骤S2中的克隆质粒，用双酶切后连入pET-32a(+)原核表达载体，得到pET-32a-Cry5B重组质粒；
S4、将步骤S3中的pET-32a-Cry5B重组质粒转入原核表达菌DE3后进行诱导表达，得到重组Cry5B蛋白；
S5、将步骤S4中的重组Cry5B蛋白进行亲和层析，得到纯化的重组Cry5B蛋白；
S6、将步骤S5中纯化的重组Cry5B进行倍比稀释，评价不同浓度纯化的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫的杀灭活性。
本实施例中，获取重组Cry5B蛋白首先通过Bt Cry5B基因序列的合成、克隆与序列分析。具体为根据GenBank公布的Bt YBT-1518Cry5B基因序列，通过运用在线工具GENSCAN获取其完整开放阅读框(ORF)序列，然后分别在序列5’和3’端加入BamHI和HindIII酶切位点及其保护性碱基，得到嵌合序列后提交生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。合成序列插入pMD19-T进行TA克隆和测序分析。
Bt Cry5B基因序列分析后，进行Bt Cry5B基因的原核表达与纯化，具体为，提取克隆质粒，双酶切后连入pET-32a(+)表达载体，构建pET-32a-Cry5B重组质粒，将pET-32a-Cry5B重组质粒转入原核表达菌DE3。DE3感受态细胞是采用大肠杆菌DE3菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化，DE3菌株适合表达非毒性蛋白，转化效率可达107，-70℃保存几个月转化效率不发生改变。为获得重组蛋白诱导表达量最大的最佳条件，需要对转入pET-32a-Cry5B重组质粒的原核表达DE3在不同浓度的活性诱导物质异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)下进行诱导培养。按最佳条件大量诱导表达后进行纯化，得到纯化的重组Cry5B蛋白。最后将倍比稀释的重组Cry5B蛋白加入大熊猫蛔虫成虫和大熊猫蛔虫L4期幼虫，进行不同浓度的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫的杀灭活性评价。
需要说明的是，如图2所示，合成Bt YBT-1518Cry5B基因完整ORF长度为3738bp，编码1246个氨基酸，分子量(MW)为139.889kD，理论等电点(pI)为5.18。信号肽和跨膜结构预测显示，Cry5B蛋白不含信号肽和跨膜区。
可选地，步骤S6中大熊猫蛔虫成虫和大熊猫L4期幼虫由成都大熊猫繁育研究基地提供，虫体采自基地自然感染大熊猫个体粪便。虫体经温生理盐水洗涤后，37℃过夜培养于含青霉素-链霉素-两性霉素B的Hanks平衡盐溶液。
本实施例中，虫体离体后通过生理盐水洗涤能够避免虫体细胞破裂，能够帮助虫体稳定其与外界的渗透压。此外，平衡盐溶液与细胞生长状态下的pH值、渗透压等环境状态一致，具有维持渗透压、控制酸碱平衡、供给细胞生存代谢所必需的能量和无机盐成分等作用，可满足体外实验中虫体生存并维持一定的代谢的基本需要。通过37℃过夜培养于含青霉素-链霉素-两性霉素B的Hanks平衡盐溶液，获得离体后稳定状态的虫体，以便进行后续步骤。
请参阅图3，本申请提供了一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B的制备及抗大熊猫蛔虫活性实施例，包括：
可选地，步骤S2中合成序列通过信号肽预测以及TMHMM跨膜结构域分析后，使用BLAST P预测Cry5B蛋白保守结构域，使用DNAStar对不同Bt株源Cry5B基因编码核酸区序列进行一致性评估；MEGA进行多序列进行比对，构建基因系统进化树，并计算序列遗传距离。
本实施例中，BLAST P检索Cry5B蛋白保守结构域，结果表明：Cry5B蛋白包含Endotoxin_N结构域(91-327aa，E-value＝4.73e-11)、δ-Endotoxin_C结构域(554-695aa，E-value＝2.04e-23)、Endotoxin_C结构域(562-695aa，E-value＝1.68e-28)、Endotoxin_C2结构域(758-827aa，E-value＝3.25e-04)、Cry1Ac_D5结构域(827-986aa，E-value＝8.87e-21)。DNAStar序列一致分析显示，Bt YBT-1518与Bt PS86Q3(U19725.1)、Bt zjfc85(JQ821366.1)、Bt Sbt003(HM461869.1)、Bt DB27(KF771886.1)、Bt LBIT-107(MF893204.1)、BtDB27(KF771886.1)、Bt ARP258(KC156687.1)和BtSbt072(JF521578.1)晶体蛋白的序列一致性分别为99.84％、99.76％、88.66％、68.39％、67.65％和66.85％。BtYBT-1518Cry5B与其他31种株源的晶体蛋白系统进化分析如图3所示，结果表明，32种晶体蛋白同系物聚为3大类，其中Bt YBT-1518Cry5B与Bt PS86Q3、Bt zjfc85和Bt Sbt003聚为一类，且与Bt PS86Q3关系最近。
请参阅图4，本申请提供了一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B的制备及抗大熊猫蛔虫活性实施例，包括：
可选地，步骤S3中pET-32a-Cry5B重组质粒经双酶切鉴定阳性重组质粒再次测序以验证其读码框的正确性。
可选地，对步骤S4中转入Cry5B重组质粒的原核表达DE3进行培养并检测Cry5B蛋白表达情况。
可选地，将转入Cry5B重组质粒的原核表达菌DE3接种于含Amp的LB平板，37℃过夜培养16h；挑取单个阳性菌落，接种于含Amp LB液体培养基中，37℃振摇培养2-3h；在菌液浓度到达OD450＝0.5时，加入IPTG至终浓度分别为0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L、1.8mmol/L、2mmol/L后继续振摇培养6h；分别吸取1mL培养液，10000xg离心10min，收获菌体沉淀，用PBS洗3次，用1×上样buffer处理，100℃水浴10min，SDS-PAGE检测Cry5B蛋白表达情况。
可选地，SDS-PAGE检测Cry5B蛋白表达情况表示在IPTG浓度为1.4mmol/L时，重组Cry5B蛋白的表达量最大；通过超声裂解处理后离心取上清和沉淀，进行蛋白可溶性分析；重组Cry5B蛋白主要表达于上清；使用Ni离子亲和层析柱对上清中的重组Cry5B蛋白进行纯化，通过BSA法测定纯化蛋白浓度。
本实施例中，用过双酶切后连入pET-32a(+)原核表达载体，得到pET-32a-Cry5B重组质粒之后，需要确定其读码框的正确性。具体的，将pET-32a-Cry5B重组质粒经双酶切鉴定阳性重组质粒后送上海Invitrogen公司进行再次测序以验证其读码框的正确性。
将重组阳性质粒pET-32a-Cry5B转入原核表达菌DE3后，需要确定重组Cry5B蛋白大量诱导的最佳条件，即重组Cry5B蛋白的表达量达到最大的IPTG浓度。具体的，在不同IPTG浓度(0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L、1.8mmol/L、2mmol/L)诱导6h后，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达情况，如图4所示。与空载和未诱导组相比，不同浓度组的IPTG均可诱导重组pET-32a-Cry5B表达菌产生与预期大小一致的目的蛋白条带(约159kDa，含标签蛋白～20kDa；图3)，证实Bt YBT-1518Cry5B基因可在DE3中成功表达。
同时结果显示，在IPTG浓度为1.4mmol/L时，重组Cry5B蛋白的表达量达到最大。按照该最佳条件大量诱导表达目的蛋白，并做超声裂解处理，重组Cry5B蛋白主要表达于上清。使用Ni离子亲和层析柱对上清中的重组Cry5B蛋白进行纯化，BSA法测定其浓度为～5mg/L。
需要说明的是，图4中M为蛋白Marker；1为IPTG诱导pET-32a(+)空载组；2为未经IPTG诱导pET-32a-Cry5B组；3-10表示不同IPTG浓度(0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L、1.8mmol/L、2mmol/L)诱导pET-32a-Cry5B组；11为IPTG诱导pET-32a-Cry5B表达菌的裂解上清液；箭头标识目的蛋白。
请参阅图5和图6，本申请提供了一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B的制备及抗大熊猫蛔虫活性实施例，包括：
可选地，通过虫体活力评分标准评价不同浓度的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫成虫的杀灭活性。
可选地，通过半数致死有效剂量ED50评价不同浓度的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫L4期幼虫的杀灭活性，得到的检测数据以平均值±标准差的形式表示。
可选地，使用SPSS统计软件对检测数据进行数据分析；通过用One-way ANOVA、LSD、Duncan或Scheffe法检验检测数据的组间差异显著性，P<0.05为差异性显著，置信区间设为95％。
本实施例中，确定在IPTG浓度为1.4mmol/L下重组Cry5B蛋白诱导表达量之后，需要确定不同浓度重组Cry5B蛋白在同时间条件下对大熊猫蛔虫的杀灭活性。
(1)对于大熊猫L4期幼虫
按照每孔6条的比例培养，在24孔细胞板中分别加入浓度为0μg/mL、1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的重组Cry5B蛋白，37℃培养7天，计算各浓度处理下的重组Cry5B蛋白ED50，每浓度设3次重复，期间每天更换培养液。得到的检测数据以平均值±标准差的形式表示，使用SPSS统计软件对检测数据进行数据分析；通过用One-way ANOVA、LSD、Duncan或Scheffe法检验检测数据的组间差异显著性，P<0.05为差异性显著，置信区间设为95％。其中，ED50表示半数致死有效剂量，是指在量反应中能引起50％最大反应强度的药量，在质反应中能引起50％实验对象出现阳性反应时的药量。
如图5中A组数据所示，随着培养时间的推移，大熊猫蛔虫L4期幼虫表现出对重组Cry5B蛋白显著的剂量依赖性，其第3天的ED50值为14.5μg/mL(95％置信区间0.57-1.23)，第5天的ED50值为1.3μg/mL(95％置信区间0.05-0.78)，第7天的ED50值为0.16μg/mL(95％置信区间0.05-0.78)，试验组与对照组从第2天开始，差异显著(P<0.05)。
(2)对于大熊猫成虫
按照每瓶3条的比例培养，在500mL烧瓶中分别加入浓度为0μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的重组Cry5B蛋白，37℃培养7天，观察各浓度处理下虫体的活力，每浓度设3次重复，期间每天更换培养液。虫体活力评分标准为：与对照组虫体活力相似，3分；与对照组虫体活力相比，虫体活力降低，2分；需要刺激虫体才表现运动，1分；刺激虫体仍无任何运动，0分。
如图6中B组数据所示，在接触重组Cry5B蛋白的第2.5天，实验组虫体活力就显著下降，具体体现为100μg/mL浓度组虫体基本不动(指数评分1)，10μg/mL浓度组虫体活动减慢(指数评分2)，而对照组虫体却充满活力(指数评分3)。在接触重组Cry5B蛋白的第7天，100μg/mL浓度组虫体全部死亡(多次触摸均未移动)；10μg/mL浓度组中2条虫体死亡(多次触摸均未移动)，1条虫体仅在触摸时移动(指数评分1)；对照组虫体仍较健康，2条虫体与先前活性相比(指数评分3)，1条虫体活力降低(指数评分2)，试验组与对照组差异极显著(P<0.01)。
本实施例中，大熊猫蛔虫对重组Cry5B蛋白的毒性具有显著的剂量依赖性，随着作用剂量的增大，无论幼虫和成虫的死亡率也相应增加，但成虫对重组Cry5B蛋白的毒性似乎更敏感。例如，在浓度10μg/mL处理第2.5天后，所有成虫均出现明显的活动降低的现象，相反却仅约50％的幼虫呈现中毒现象。大熊猫蛔虫成虫相较于大熊猫L4期幼虫，成虫对重组Cry5B蛋白似乎更敏感，更易出现中毒症状。重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫L4期幼虫和成虫均具有较强的毒杀作用。
尽管已经用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其他的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，其特征在于，所述蛋白Cry5B的制备方法包括：
S1、运用在线工具GENSCAN获取Bt Cry5B基因完整开放阅读框序列，分别在序列5’和3’端加入BamH I和Hind III酶切位点及其保护性碱基，得到嵌合序列；
S2、合成步骤S1中的所述嵌合序列以得到合成序列，将所述合成序列插入pMD19-T克隆质粒进行TA克隆和测序分析，得到克隆质粒；
S3、提取步骤S2中的所述克隆质粒，用双酶切后连入pET-32a(+)原核表达载体，得到pET-32a-Cry5B重组质粒；
S4、将步骤S3中的所述pET-32a-Cry5B重组质粒转入原核表达菌DE3后进行诱导表达，得到重组Cry5B蛋白；
S5、将步骤S4中的重组Cry5B蛋白进行亲和层析，得到纯化的重组Cry5B蛋白；
S6、将步骤S5中纯化的重组Cry5B进行倍比稀释，评价不同浓度纯化的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫的杀灭活性；
所述重组Cry5B蛋白基因完整ORF长度为3738bp，编码1246个氨基酸，分子量MW为139.889kD，理论等电点pI为5.18；重组Cry5B蛋白不含信号肽和跨膜区；
所述重组Cry5B蛋白包含Endotoxin_N结构域、δ-Endotoxin_C结构域、Endotoxin_C结构域、Endotoxin_C2结构域、Cry1Ac_D5结构域；
对于大熊猫蛔虫L4期幼虫，所述重组Cry5B蛋白的半数致死有效剂量ED50值第3天为14.5μg/mL，95％置信区间0.57-1.23；ED50值第5天为1.3μg/mL，95％置信区间0.05-0.78；ED50值第7天为0.16μg/mL，95％置信区间0.05-0.78；
对于大熊猫蛔虫成虫，所述重组Cry5B蛋白杀灭大熊猫蛔虫成虫的使用浓度为10μg/mL-100μg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，其特征在于，步骤S6中所述大熊猫蛔虫成虫和所述大熊猫L4期幼虫由成都大熊猫繁育研究基地提供，虫体采自基地自然感染大熊猫个体粪便；虫体经温生理盐水洗涤后，37℃过夜培养于含青霉素-链霉素-两性霉素B的Hanks平衡盐溶液。
3.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，其特征在于，步骤S2中所述合成序列通过信号肽预测以及TMHMM跨膜结构域分析后，使用BLAST P预测Cry5B蛋白保守结构域，使用DNAStar对不同Bt株源Cry5B基因编码核酸区序列进行一致性评估；MEGA进行多序列进行比对，构建基因系统进化树，并计算序列遗传距离。
4.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，其特征在于，步骤S3中所述pET-32a-Cry5B重组质粒经双酶切鉴定阳性重组质粒再次测序以验证其读码框的正确性。
5.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，其特征在于，对步骤S4中转入所述Cry5B重组质粒的原核表达DE3进行培养并检测Cry5B蛋白表达情况。
6.根据权利要求5所述的一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，其特征在于，将转入所述Cry5B重组质粒的原核表达菌DE3接种于含Amp的LB平板，37℃过夜培养16h；挑取单个阳性菌落，接种于含Amp LB液体培养基中，37℃振摇培养2-3h；在菌液浓度到达OD450＝0.5时，加入IPTG至终浓度分别为0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L、1.8mmol/L、2mmol/L后继续振摇培养6h；分别吸取1mL培养液，10000xg离心10min，收获菌体沉淀，用PBS洗3次，用1×上样buffer处理，100℃水浴10min，SDS-PAGE检测Cry5B蛋白表达情况。
7.根据权利要求6中所述的一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，其特征在于，SDS-PAGE检测Cry5B蛋白表达情况表示在IPTG浓度为1.4mmol/L时，重组Cry5B蛋白的表达量最大；通过超声裂解处理后离心取上清和沉淀，进行蛋白可溶性分析；重组Cry5B蛋白主要表达于上清；使用Ni离子亲和层析柱对上清中的重组Cry5B蛋白进行纯化，通过BSA法测定纯化蛋白浓度。
8.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，其特征在于，通过虫体活力评分标准评价不同浓度的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫成虫的杀灭活性。
9.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，其特征在于，通过半数致死有效剂量ED50评价不同浓度的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫L4期幼虫的杀灭活性，得到的检测数据以平均值±标准差的形式表示。
10.根据权利要求9中所述的一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，其特征在于，使用SPSS统计软件对所述检测数据进行数据分析；通过用One-way ANOVA、LSD、Duncan或Scheffe法检验所述检测数据的组间差异显著性，P<0.05为差异性显著，置信区间设为95％。
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