CN110272909B - 粉棒束孢Defensin基因、重组蛋白及应用 - Google Patents

粉棒束孢Defensin基因、重组蛋白及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及粉棒束孢的Defensin基因、基因和重组蛋白的制备方法、重组蛋白及应用。本发明从一株具有较强杀虫活力的粉棒束孢FTRSY‑2菌株出发，首次从粉棒束孢基因组中克隆出粉棒束孢Defensin基因，命名为Ifdef，以该基因为出发点，通过分子生物学的手段构建重组载体、工程菌、重组Defensin蛋白等，并对其进行了功能验证。本发明得到的重组Defensin蛋白性质稳定，产量和纯度较高，并具有广谱杀菌效力和药理活性，有潜力开发成为生防制剂、抗菌药品、抗肿瘤药品、保健产品等。

Description

粉棒束孢Defensin基因、重组蛋白及应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及粉棒束孢Defensin基因、基因和重组蛋白的制备方法、重组蛋白及应用。
背景技术
粉棒束孢(Isaria farinosa)，是丝状真菌棒束孢属(Isaria Fries)模式种，是一种主要的昆虫病原真菌，同时也是一种极具开发价值和商业利用价值的真菌，具体表现在：1)现有研究表明，粉棒束孢对多种类型的害虫具有良好的杀虫效果；2)粉棒束孢作为蝙蝠蛾幼虫的定殖真菌，其药用活性也越来越多地被研究和发现；3)已从粉棒束孢培养菌丝体中分离得到包括多糖、虫草酸、生物碱、吡啶酮、天然苯腙、喹唑啉酮、环状五肽、蒽醌类化合物等多种新化合物；4)研究证明粉棒束孢菌的代谢产物中具有类似生长素和细胞分裂素的物质等。然而目前针对粉棒束孢的研究主流还停留在宏观层面上，主要以粉棒束孢的代谢产物或孢子悬液或菌丝体作为研究对象，其微观分子层面的研究才刚刚起步，且现有的利用分子生物学手段对粉棒束孢进行的深入和系统研究，主要都集中在真菌分类及作为生防菌的角度进行。
申请号为201610476131.6的发明专利公开了一株粉棒束孢的发酵培养物在制备预防林业害虫的生防制剂中的应用，该发明主要是利用了菌株的发酵培养液。杨俊媛等学者从粉棒束孢培养菌丝体中分离得到多种有价值的化合物，但其研究依然停留在宏观层面。因此，有必要在全面、系统研究活性代谢产物的基础上深入开展粉棒束孢药理活性与基因功能之间的关系，以便构建出能够产生特定活性成分的超级生产菌株。
鉴于此，本实验从一株具有较强杀虫活力的粉棒束孢FTRSY-2菌株出发，，本课题组发现了一条与编码真菌防御素蛋白Defensin相似的基因，并首次从粉棒束孢基因组中克隆出粉棒束孢Defensin基因，命名为Ifdef，以该基因为出发点，通过分子生物学的手段构建重组载体、工程菌、重组Defensin蛋白等，并对其进行了功能验证。为进一步研究粉棒束孢防御素基因功能奠定基础，同时为其作为潜在的广谱抗菌肽应用提供理论依据，具有重要的研究意义和潜在的商业价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一，在于提供一种粉棒束孢的Defensin基因。
粉棒束孢的Defensin基因，所述的Defensin基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示和/或其中的片段。所述基因命名为Ifdef，Ifdef cDNA ORF全长为519bp，编码172个氨基酸，分子量约为18.4kDa
本发明的目的之二，在于提供上述粉棒束孢Defensin基因的制备方法。
上述Defensin基因的制备方法，根据粉棒束孢全基因组序列预测得到SEQ IDNO.1所示序列，根据所述SEQ ID NO.1序列设计若干引物对；提取粉棒束孢总RNA，反转cDNA，进行PCR扩增，获得如SEQ ID NO.1所示的Defensin基因。
本发明首次从粉棒束孢基因组中克隆出粉棒束孢Defensin基因，具有突破性的意义。
进一步，所述引物对包括如序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的一组引物对。所述序列SEQ ID NO.2的引物命名为Ifdef F；所述序列SEQ ID NO.3的引物命名为IfdefR。
本发明的目的之三，在于提供一种重组质粒载体。
重组质粒载体，所述重组质粒载体包含权利要求1所述的SEQ ID NO.1序列和原核表达质粒；所述SEQ ID NO.1序列与原核表达质粒连接。
作为一种优选，所述原核表达质粒采用SUMO-pET28a质粒。
本发明的目的之四，在于提供一种基因工程菌。
重组质粒载体转化得到的产重组Defensin蛋白的基因工程菌。
进一步，所述重组Defensin蛋白在所述基因工程菌的包涵体和培养上清液中表达。所述基因工程菌由大肠杆菌BL21(DE3)制备得到。
本发明的目的之五，在于提供一种重组Defensin蛋白。
粉棒束孢的重组Defensin蛋白，所述重组Defensin蛋白的氨基酸序列包括SEQ IDNO.4所示和/或其中的片段。
粉棒束孢的重组Defensin蛋白，所述重组Defensin蛋白由所述的SEQ ID NO.1核苷酸序列翻译得到。
抗菌肽来源广泛，在哺乳动物、昆虫、鱼类、两栖动物、植物、真菌等自然界的大多数物种中存在。防御素是广泛存在于生物体中的一类内源性抗菌肽，富含半胱氨酸，具有抗细菌、真菌、病毒、肿瘤等功能。然而目前针对真菌防御素的报道不多，且多数是从具体某个菌株里分离得到，例如，从腐生子囊菌中分离出的Plectasin。因此，本发明通过分子生物学的手段得到粉棒束孢的重组Defensin蛋白具有突破性的意义
本发明的目的之六，在于提供一种多克隆抗体。
一种多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体包括上述的重组Defensin蛋白。
本发明的目的之七，在于提供上述重组Defensin蛋白的一系列应用。
上述重组Defensin蛋白在制备用于防治林业害虫的生防制剂中的应用。所述应用还可以由上述SEQ ID NO.1的核苷酸序列和重组质粒载体得到。
进一步，所述林业害虫包括油松毛虫、松梢螟、苹果蠹蛾、美国白蛾、落叶松卷蛾、黄刺蛾幼虫、板栗象甲、松墨天牛、柑桔粉蚧中的一种或多种。传统的生防制剂主要是以菌株或菌株代谢产物为基础制备，而本发明以重组Defensin蛋白为基础来制备，效力更强，可控性更高。
上述重组Defensin蛋白在制备广谱抗菌药物中的应用。所述应用还可以由上述SEQ ID NO.1的核苷酸序列和重组质粒载体得到。
进一步，所述细菌包括水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)、E.persicina、普城沙雷菌(Serratia plymuthica)、平凡假单胞菌(Pseudomonas trivialis)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、土生柔特勒菌(Raoultella terrigena)、河生肠杆菌(Lelliottiaamnigena)中的一种或多种。
进一步，所述重组Defensin蛋白可以为任意药学可接受剂型，所述广谱抗菌药物还包括药学上可接受的载体和/或助剂。
防御素作为一种生物体分泌的天然活性肽，抗菌谱广且作用方式独特，且相对不具有免疫原性，同时病原物也不易对其产生耐药性。目前研究报道的防御素已达30多种，但抗菌谱及抗菌能力却大有不同，推测可能是蛋白质三级结构的差异影响了其抗性谱范围及抗菌能力。本发明的重组Defensin蛋白三级结构预测表明活性位点存在6个半胱氨酸，但仅由一对二硫键形成β片状结构，同时含有一个α螺旋结构，与现有报道的其他防御素结构有一定差异，有望作为一种新型的抗生素替代品。
上述重组Defensin蛋白在制备多克隆抗体中的应用。所述应用还可以由上述SEQID NO.1的核苷酸序列和重组质粒载体得到。
上述重组Defensin蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。所述应用还可以由上述SEQID NO.1的核苷酸序列和重组质粒载体得到。
防御素可以通过直接的细胞毒性来杀死肿瘤细胞。防御素作用于肿瘤细胞后，显微镜下观察可见肿瘤细胞足样突起回缩、细胞间隙增大、部分细胞悬浮；在透射电镜下，可见肿瘤细胞膜破裂、细胞表面绒毛消失脱落、胞核被膜破裂、甚至细胞崩解等。研究还发现，防御素可以直接诱导肿瘤细胞死亡。
上述重组Defensin蛋白在制备提高人体免疫功能的保健品中的应用。所述应用还可以由上述SEQ ID NO.1的核苷酸序列和重组质粒载体得到。
系统进化树分析发现本发明的Ifdef基因编码的Defensin蛋白与冬虫夏草菌的Defensin同源性为99％，而冬虫夏草被公认为具有调节免疫、抗疲劳等多种功效，因此本发明的重组Defensin蛋白及相应菌株具备与冬虫夏草相当的开发成保健品的潜力。
本发明的有益效果在于：
1)本发明从一株具有较强杀虫活力的粉棒束孢FTRSY-2菌株出发，首次从粉棒束孢基因组中克隆出粉棒束孢Defensin基因，命名为Ifdef，以该基因为出发点，通过分子生物学的手段构建重组载体、工程菌、重组Defensin蛋白等，并对其进行了功能验证。从而为粉棒束孢功能基因的研究及其对寄主、环境互作分子机制的阐明、药用价值的深入研究奠定理论基础，同时为构建产生特定功能的活性成分的超级菌株奠定了基础。
2)本发明得到的重组Defensin蛋白性质稳定，产量和纯度较高，并具有广谱杀菌效力和药理活性，有潜力开发成为生防制剂、抗菌药品、抗肿瘤药品和保健产品。
附图说明
图1：Ifdef基因的DNA序列及所对应的氨基酸序列(框中为信号肽)。
图2：重组Defensin蛋白二级结构预测。
图3：重组Defensin蛋白三维结构图。
图4：粉棒束孢重组Defensin蛋白与其他真菌Defensin蛋白的氨基酸序列相似性分析(*标注为活性位点)。
图5：粉棒束孢重组Defensin蛋白与其他真菌Defensin蛋白的系统进化树。
图6：粉棒束孢Ifdef基因扩增。
图7：Ifdef基因在感病大蜡螟不同时间及不同组织中的表达量。
图8：Ifdef基因扩增、表达载体酶切验证及重组蛋白表达(A、B：M:DL2000marker；1:Ifdef扩增产物；2:BamH I/Sal I酶切验证；C：1:上清；2:上清2(2M尿素溶解包涵体)；3:包涵体2倍稀释(8M尿素溶解包涵体)；4:包涵体5倍稀释(8M尿素溶解包涵体)；5:包涵体5倍稀释(6M尿素溶解包涵体)；6:0.4mg/mL BSA；7:marker)
图9：Defensin重组蛋白特异性检测及感病大蜡螟血液中Ifdef基因表达量测定(A：多克隆抗体特异性及灵敏度检测；B:感病大蜡螟血液中Defensin蛋白表达量检测；(M：marker；1：FTRSY-2野生株总蛋白；2：CK；3-7：0h、12h、24h、48h、72h感病大蜡螟血液总蛋白；8：阴性对照))
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明的实验材料
1.实验材料
1.1供试菌株及昆虫
粉棒束孢FTRSY-2菌株；大肠杆菌BL21(DE3)；大蜡螟幼虫
1.2质粒载体
pCambiaMX9质粒(GenBank accession number：KX755248，具kana抗性)；
pGapneoR12质粒(GenBank accessionnumber：KY363244，具G418抗性)。
实施例1
1.基因组DNA提取
基因组DNA提取采用天根植物基因组提取试剂盒，按说明书步骤提取。
2.基因组RNA提取
基因组RNA提取采用天根植物基因组提取试剂盒，按说明书步骤提取。
3.微量快速PCR验证
采取微量菌丝PCR扩增：无菌牙签挑取少量粉棒束孢菌丝至EP管中，液氮速冻研磨后，加入50μL Lysis Buffer，混合均匀，95℃，10min；取菌丝裂解液2μL进行常规PCR扩增。
4.生物信息学分析
运用常规的生物信息分析软件进行。
5.生物信息学分析结果
查找粉棒束孢的全基因组信息，获得一条粉棒束孢Ifdef基因，分析发现：IfdefcDNA ORF全长为519bp，该基因编码172个氨基酸(图1)，分子量约为18.4kDa，等电点为5.06，平均疏水性为-0.313，且稳定性比较好。信号肽预测结果表明该序列具有信号肽，其切割位点在N端第16和17个氨基酸之间；二级结构预测如图2所示，表明该蛋白序列由α螺旋、β折叠、β转角及无规则卷曲构成；三维结构预测如图3所示，粉棒束孢的防御素的成熟肽分子中含有一个保守的CSαβ(cysteine-stabilizedαβ)基序，即包括1个α螺旋和3股反向平行的β折叠片层结构，肽链中包括6个半胱氨酸，形成3对二硫键稳定其三级结构。序列比对结果显示粉棒束孢Defensin氨基酸序列和已经报道的曲霉属真菌，如棒曲霉、黄曲霉、黑曲霉、烟曲霉等的Defensin氨基酸序列相似度不高，序列较特异(图4)；系统进化树分析发现粉棒束孢Defensin蛋白与冬虫夏草菌(Cordyceps confragosa)的Defensin同源性为99％(图5)。
实施例2
基因cDNA ORF全长克隆：
查找粉棒束孢全基因组序列得到预测的Ifdef基因全长序列，设计引物Ifdef F/R。提取粉棒束孢总RNA，反转cDNA，进行PCR扩增，获得Ifdef基因cDNA ORF全长。取5μLPCR扩增产物进行电泳验证。
实验结果：
扩增得到全长519bp的片段，PCR扩增结果如图6所示。
实施例3
Ifdef基因在感病大蜡螟组织中表达分析
配制浓度为1×107分生孢子/mL的WT菌株孢悬液，注射接种，28℃恒温培养箱保湿培养，接种0h、12h、24h、48h、72h之后取血淋巴、表皮、脂肪体及中肠组织，提RNA后，反转cDNA，进行RT-qPCR。
实验结果：
结果如图7所示。随侵染时间延长，Ifdef基因在大蜡螟幼虫各个组织中的基因表达量不同，侵染12h后开始检测Ifdef基因的表达，且血液中基因表达量最高，之后随侵染时间延长，表达量降低，到侵染48h后在脂肪体及中肠中检测到少许基因表达。
实施例4
Ifdef基因原核表达及多克隆抗体制备
(1)质粒SUMO-pET28a-def构建
提取阳性菌株的重组质粒，以引物Ifdef F/R扩增Ifdef基因cDNA ORF全长，命名为def。电泳验证后切胶回收，具体步骤按照试剂盒说明书进行。
将提取的质粒SUMO-pET28a和回收的Ifdef基因cDNA回收片段def分别进行BamHI/Sal I双酶切。电泳验证后切胶回收，将回收的线性化质粒SUMO-pET28a和Ifdef基因cDNA回收片段def进行连接，连接方法按文献常规方法进行。
(2)Defensin蛋白诱导表达及表达形式鉴定
将含Ifdef基因的重组大肠杆菌BL21(DE3)菌液在液体LB培养基中按1％接种量接种，37℃摇床振荡过夜培养至对数生长期，OD600值为0.5-0.6范围时，加入终浓度为1mM/L的ITPG诱导剂，再培养5-8h后离心收集菌体，ddH2O重悬后破碎，8000rpm离心10min，沉淀用5mL ddH2O重悬。取10μL上清液及沉淀重悬液进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝R-250染色4h后进行脱色，鉴定表达产物的存在形式。纯化蛋白并制备相应多克隆抗体。
(3)抗原及内源Defensin蛋白Western Blot检测
以制备的多克隆抗体(1：1000)为一抗、羊抗兔IgG-HRP(1：5000)为二抗，采用Western-blot方法分析多克隆抗体的特异性；分别提取粉棒束孢侵染大蜡螟不同时期各组织的总蛋白，检测感病大蜡螟组织中粉棒束孢Defensin蛋白的表达量。
实验结果：
提取粉棒束孢总RNA，反转cDNA，采用引物Ifdef F/R进行PCR扩增，获得Ifdef基因cDNA ORF全长共519bp，PCR产物电泳鉴定大小正确(图8A)，测序成功后克隆到SUMO-pET28a载体上，酶切鉴定(图8B)后诱导表达，经SDS-PAGE分析，结果如图8C所示。由可以看出，目标蛋白大小大约为36kDa，在上清液中检测到目标蛋白的表达，但大多数以包涵体形式存在，说明在大肠杆菌BL21(DE3)中Defensin蛋白表达在包涵体和上清中。
Western-blot方法分析抗Ifdef基因重组蛋白多克隆抗体的特异性，结果见图9。表达的重组蛋白能与多克隆抗体发生特异性血清学反应(图9A)，在36kDa可见一明显的免疫反应条带，其大小与预测Ifdef基因重组蛋白分子量相近，同时抗体灵敏度高，1：1000稀释后可检测到500pg抗原。在同时以侵染后大蜡螟血液中的总蛋白，检测Ifdef基因在感病大蜡螟组织中表达量，结果显示除野生菌株能检测到少量蛋白表达外，感病大蜡螟血液中检测不到Defensin蛋白表达(图9B)，对比RT-qPCR结果可以看出，在感病大蜡螟血液Ifdef基因表达量低，无法检测到相应蛋白。
实施例5
重组Defensin蛋白活性检测
(1)抑菌活性检测
采用生长抑制法进行重组Defensin蛋白的体外抑菌活性检测。用双蒸水作空白对照，以氨苄青霉素(Ampicillin)、链霉素(Streptomycin)、头孢霉素(Cefalothin)、硫酸卡那霉素(Kanamycin)为阳性对照，对照药剂和重组蛋白均采用1×PBS稀释，使其终浓度为100μg/mL。在37℃的条件下，将水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)、E.persicina、普城沙雷菌(Serratia plymuthica)、平凡假单胞菌(Pseudomonas trivialis)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、土生柔特勒菌(Raoultella terrigena)、河生肠杆菌(Lelliottiaamnigena)等从粉棒束孢生境及宿主虫尸上分离的供试菌株培养12h，再用LB培养基将其稀释至OD600值为0.001；取稀释菌液加入96孔板中，加入供试药物，每个测试菌株三次重复；37℃培养12h后测量OD600值，观察重组蛋白的抑菌活性。
实验结果：
实验结果见表1。重组Defensin蛋白在100μg/mL的使用浓度下对R.aquatilis的抑制作用与氨苄青霉素对照药剂相当，对E.persicina的抑制率达17.99％，比氨苄青霉素对照药剂的抑制率高出48.63％，对其他菌也显示出一定的抑制力。
表1重组Defensin蛋白对不同细菌的抑制率
Figure BDA0002126544130000111
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110>太极集团有限公司；西南大学
<120>粉棒束孢Defensin基因、重组蛋白及应用
<160> 4
<170> PatentIn Version 3.5
<210> 1
<211> 519
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ATGAAGTTCT CTCTCGTCGC ATTCGCTCTG GCCTCGACGG CGTCCGCCAT CTGCCACAAC 60
TCCATCGCCT GCCTCACCGG CGGCGACGAG ATGTGCAGCA AGGTGTGCTA CCGCCAAGGC 120
AACAACAACG GCGGCCGCTG CGCGCCCCGC GACGGCTGCC CCGGCTTCAC CATCTGCGCG 180
TGCTACCCCC AGAAGCGCGA CGACACCCAC GCCGTGCGTG ACGCCGAGGA GCAGCTGTGG 240
GCGGACGAGG TAAAGCCCGG CATCGCGCCG TACGTCGCCG ACGAGGACCT CGAGAAGCGC 300
GAGGTGCGCG AGGCCGCCGT CGAGGCCGCC CTCCGTGACG TCGGCAGTGA CGTTGCAGCC 360
CGCGACGAGG CCGCGCCGCT CATGACGCGC AGCTTCTGCT GCAGCCTGAT CCCGCCGGCC 420
AGCGGCCTCT GCTGCGACAA CCACTGCACC TACATTGGAA AGAAGGGCGG TCAGTGCAAG 480
GACCGCGGCG ACGGTGATAT CTGCTACTGC AACAACTAG 519
<210> 2
<211>30
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ATATAGATCT ATCTGCCACA ACTCCATCGC 30
<210> 3
<211>30
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ATATGTCGAC GTTGTTGCAG TAGCAGATAT 30
<210> 4
<211>172
<212> PRT
<213>人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Met Lys Phe Ser Leu Val Ala Phe Ala Leu Ala Ser Thr Ala Ser Ala
1 5 10 15
Ile Cys His Asn Ser Ile Ala Cys Leu Thr Gly Gly Asp Glu Met Cys
20 25 30
Ser Lys Val Cys Tyr Arg Gln Gly Asn Asn Asn Gly Gly Arg Cys Ala
35 40 45
Pro Arg Asp Gly Cys Pro Gly Phe Thr Ile Cys Ala Cys Tyr Pro Gln
50 55 60
Lys Arg Asp Asp Thr His Ala Val Arg Asp Ala Glu Glu Gln Leu Trp
65 70 75 80
Ala Asp Glu Val Lys Pro Gly Ile Ala Pro Tyr Val Ala Asp Glu Asp
85 90 95
Leu Glu Lys Arg Glu Val Arg Glu Ala Ala Val Glu Ala Ala Leu Arg
100 105 110
Asp Val Gly Ser Asp Val Ala Ala Arg Asp Glu Ala Ala Pro Leu Met
115 120 125
Thr Arg Ser Phe Cys Cys Ser Leu Ile Pro Pro Ala Ser Gly Leu Cys
130 135 140
Cys Asp Asn His Cys Thr Tyr Ile Gly Lys Lys Gly Gly Gln Cys Lys
145 150 155 160
Asp Arg Gly Asp Gly Asp Ile Cys Tyr Cys Asn Asn
165 170

Claims (9)

1.粉棒束孢的Defensin基因，其特征在于，所述的Defensin基因的核苷酸序列为SEQID NO.1所示。
2.重组质粒载体，其特征在于，所述重组质粒载体包含权利要求1所述的SEQ ID NO.1序列和原核表达质粒；所述SEQ ID NO.1序列与原核表达质粒连接。
3.权利要求2中所述重组质粒载体转化得到的产重组Defensin蛋白的基因工程菌。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组Defensin蛋白在所述基因工程菌的包涵体和培养上清液中表达。
5.粉棒束孢的重组Defensin蛋白，其特征在于，所述重组Defensin蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
6.粉棒束孢的重组Defensin蛋白，其特征在于，所述重组Defensin蛋白由权利要求1所述的SEQ ID NO.1核苷酸序列翻译得到。
7.权利要求5或6所述的重组Defensin蛋白在制备广谱抗细菌药物中的应用；所述细菌为水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)、E.persicina、普城沙雷菌(Serratiaplymuthica)、平凡假单胞菌(Pseudomonas trivialis)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、土生柔特勒菌(Raoultella terrigena)、河生肠杆菌(Lelliottia amnigena)中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组Defensin蛋白可以为任意药学可接受剂型，所述广谱抗细菌药物还包括药学上可接受的载体和/或助剂。
9.权利要求5或6所述的重组Defensin蛋白在制备多克隆抗体中的应用。
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