CN101570760B - 重组鼠β-防御素3多肽及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明通过基因工程技术构建鼠β-防御素3基因(Mbd-3)的原核重组质粒，将原核重组质粒转入工程菌进行诱导高效表达鼠β-防御素3多肽(MBD-3)并进行表达产物的提取、纯化和凝血酶酶切释放出有活性的MBD-3成熟肽。本发明通过微量液体稀释法检测重组鼠β-防御素3抗不同丝状真菌的最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MFC)，证明了重组鼠β-防御素3多肽具有抗病原性丝状真菌的作用，以便开发出一类治疗真菌感染的新型药物。

Description

重组鼠β-防御素3多肽及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及重组鼠β-防御素3多肽及其制备方法与用途。

背景技术

β-防御素广泛分布于人、鼠、牛、羊、猪的多种器官上皮细胞内，包括皮肤、呼吸道、尿道、肠道和口腔粘膜上皮细胞等。目前，已经运用生物信息学方法发现了大约30种人β-防御素基因和45种鼠β-防御素基因(Michael等，2005)。鼠β-防御素3(MBD-3)的基因上游启动子有前NF-KB、NF-IL-6和STAT等的结合位点，当病原体相关模式分子(PAMP)与上皮细胞表面的模式识别受体(包括CD14，TLRs等)结合后，在多种促炎因子(TNF-α，IL-1β)参与下，激活NF-κB等转录因子，再与启动子区的NF-κB、NF-IL-6结合位点结合，使其基因激活并转录和翻译，属于诱导性表达(Yang D，et al.Cellular andMolecular Life Sciences，2006，in press)。关于MBD-3的抗微生物活性，已证实人工合成的MBD-3具有抗金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的作用(Burd等，2002)，但未见关于抗丝状真菌的相关报道，而且人工合成的β-防御素，造价昂贵、产量少且不能保证多肽的生物学活性。

近年来，随着广谱抗生素、激素、免疫抑制剂的广泛应用，以及AIDS的蔓延、器官移植和介入技术的推广应用，使真菌感染的发病率呈现上升趋势，美国国家医院内感染监测中心(NN IS)资料显示，2004年的真菌感染率为20世纪90年代的2.4倍(Beck-sagueC，et al.Infection Disease，1993，167：1247.)，念珠菌属和曲霉属是目前最常见的真菌感染的病原菌(Malcolm DR.Journal of Anitimicrobial Chemotherapy，2005，56：i5.)，某些真菌引起的系统性感染致死率高达90％。对于艾滋病患者(AIDS)，真菌感染是最常见的机会性感染，其发病率和死亡率均较高。虽然不同作用机制的抗真菌药物在治疗真菌感染中发挥了重要作用，但随着感染菌种逐渐发生变化，有关耐药菌株的报道逐渐增多，使得真菌感染的治疗面临着严峻的挑战。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供鼠β-防御素3的原核重组质粒与该重组质粒表达的重组鼠β-防御素3多肽及其制备方法，并证明重组鼠β-防御素3多肽对丝状真菌具有抑制作用，以便开发出一类治疗丝状真菌感染的新型药物，为降低AIDS因机会性感染、医院内真菌感染的死亡率开辟一条新途径。

鼠β-防御素3基因(Mbd-3)已在GenBank注册，注册号AF092929，其cDNA碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。本发明的技术方案是：运用分子克隆技术克隆小鼠β-防御素3基因(Mbd-3)，将Mbd-3基因片段插入到原核载体构建原核重组质粒，然后进行体外表达和表达产物的提取，并用凝血酶酶切释放出有活性的重组鼠β-防御素3成熟肽，具体步骤依次如下：

1、通过RT-PCR反应，获得鼠β-防御素3成熟肽编码基因；

2、将上述扩增的鼠β-防御素3基因片段插入到原核载体构建原核重组质粒，再将重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；

3、利用PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析；

4、将正确克隆的原核重组质粒转化入工程菌中进行表达，分离纯化表达的蛋白即获得重组鼠β-防御素3融合蛋白(fMBD-3)；

5、采用SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白的正确性；

6、采用凝血酶酶切释放出成熟有活性的重组鼠β-防御素3成熟肽(rMBD-3)；

7、采用SDS-PAGE、Western blot和质谱分析鉴定重组鼠β-防御素3成熟肽的正确性。

所述原核载体为pET质粒系统，所述pET质粒系统包括pET28a-c(+)、pET29a-c(+)、pET32a-c(+)等原核表达质粒。

对于重组鼠β-防御素3多肽的抗丝状真菌活性鉴定，采用微量液体稀释法，实验证明，重组鼠β-防御素3多肽对丝状真菌具有明显的抑制和杀灭作用，其中对曲霉菌的最小抑制浓度(MIC)为5-10μM，最小杀菌浓度(MFC)为25μM；对犬小孢子菌的MIC为0.25μM，MFC为10μM；对红色毛癣菌的MIC为0.01μM，MFC为0.5μM。

本发明所涉及的新型小鼠β-防御素多肽3(MBD-3)的制备及其应用具有以下有益效果：

1、防御素是人体固有免疫的组成成分，因而对人体细胞基本没有影响，安全性高，毒副作用小，且具有极高的差异毒力。

2、实验证明，重组鼠β-防御素3多肽对丝状真菌具有明显的抑制和杀灭作用，因而为丝状真菌感染所致疾病提供了一类新型治疗药物。

3、重组鼠β-防御素3多肽与稳定剂、防腐剂等混合后，可以直接肌肉注射，诱导机体的免疫应答而发挥抗丝状真菌作用。

4、由于采用大肠杆菌工程菌可以准确表达重组鼠β-防御素3多肽，并具有高效低耗的生产能力及生物合成的产品具有天然结构、自动分泌并简捷纯化等诸多的优势，因而可降低生产成本，有利于工业化生产。

附图说明

图1为原核载体pET32a(+)的结构示意图。

图2为本发明所述重组鼠β-防御素3的原核重组质粒pET32a(+)/MBD-3的结构示意图。

图3为本发明所述重组鼠β-防御素3的原核重组质粒pET32a(+)/MBD-3的测序图。

图4为本发明所述重组鼠β-防御素3的cDNA序列和多肽序列，图中，cDNA序列中的79-199为原核重组质粒所含序列，其对应的下划线部分为重组鼠β-防御素3(MBD-3)成熟肽序列。

图5为本发明所述重组鼠β-防御素3的原核重组质粒pET32a(+)/MBD-3的PCR和酶切鉴定图谱，图中泳道2为pET32a(+)/MBD-3质粒Bgl II和Xho I双酶切产物，泳道3为以pET32a(+)/MBD-3质粒为模板的PCR产物，在约140bp处可见一条条带，与预期产物大小相符，泳道1、4分别为DNA Markerλ-ECOT14I Digestion和100bp DNAMarker。

图6为融合蛋白fMBD-3及用凝血酶酶切后释放成熟肽rMBD-3的SDS-PAGE电泳结果图，图中，泳道2为宿主菌超声破碎离心后收集的上清，泳道3为纯化的融合蛋白fMBD-3，在约21kDa处出现一条条带，与预期融合蛋白的分子量相符，表明融合蛋白诱导成功；泳道4为凝血酶酶切fMBD-3后的产物，泳道5为纯化的成熟肽rMBD-3，在约4.5kDa处有一条条带，与MBD-3成熟肽的分子量相符，表明凝血酶很好切开了融合蛋白并完全释放出成熟肽rMBD-3；泳道1为低分子量蛋白Marker，泳道6为超低分子量蛋白预染Marker。

图7为本发明所述重组鼠β-防御素3成熟肽和融合蛋白fMBD-3的Western-blot鉴定图，泳道1为超低分子量蛋白预染Marker，泳道2为成熟肽rMBD-3，在约4.5kDa处有一条目的条带，泳道3为融合蛋白fMBD-3，在约21kDa处有一条目的条带。

图8为本发明所述重组鼠β-防御素3成熟肽rMBD-3的质谱分析图。

图9为用本发明所述重组鼠β-防御素3成熟肽作抗丝状真菌实验时96微孔板的加样示意图，图中，孢子①为黄曲霉菌，孢子②为黑曲霉菌，孢子③为犬小孢子菌，孢子④为红色毛癣菌。

具体实施方式

实施例1：重组鼠β-防御素3多肽的制备

1、获取小鼠Mbd-3基因

(1)用Trizol试剂(购自美国Invitroge公司)提取小鼠注射大肠杆菌LPS(购自美国Sigma公司)12小时后的呼吸道上皮的总RNA；

1)以2.5mg/kg的剂量给BALB/c小鼠腹腔注射LPS，12h后摘眼球放血处死小鼠；

2)无菌条件下取小鼠肺组织100mg；

3)加入1ml Trizol；

4)在液氮中充分研磨，颠倒混匀10下，室温静置5min；

5)加入0.2ml氯仿，颠倒混匀10下，室温静置5min；

6)4℃离心12000rpm 15min；

7)取上清(约0.4ml)移入另一EP管中；

8)加入等体积预冷异丙醇混匀，室温孵育10min；

9)4℃离心14000rpm 10min；

10)弃上清，加入70％乙醇1ml，旋涡混匀，4℃离心12000rpm 5min，弃上清，重复一次；

11)弃上清，超净台内空气干燥5min；

12)用去RNA酶的双蒸水30μl溶解沉淀。抽提出的RNA经1％琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测。

(2)单链cDNA的合成

1)于冰盒上在去RNA酶的小EP管内加入上述总RNA 5μl(浓度0.5μg/μl)为模板，加入试剂盒自带的oligo(dT)₁₈ 1μl为引物，加入去RNA酶的双蒸水6μl，充分混匀并瞬时离心3～5s后将反应物置PCR仪70℃孵育5min；

2)从PCR仪中取出反应物，置冰上冷却约10s，瞬时离心3～5s；

3)在冰上依次加入5×反应缓冲液4μl，RNA酶抑制剂1μl，dNTP混合物2μl，充分混匀并在高速离心3～5s后将反应物置PCR仪37℃孵育5min；

4)重复2)的操作；

5)于冰盒上给反应管加反转录酶1μl，充分混匀并瞬时离心3～5s后将反应物置PCR仪42℃孵育60min、70℃孵育10min；

6)从PCR仪中取出反应物，置冰上冷却约10s，瞬时离心3～5s，收集反应液待用。整个反应的体系如下：

(3)cDNA的PCR反应

1)反应体系如下：

2)PCR扩增引物

上游引物：5’-ga aga tct tct ggt gcc acg cgg ttc taa aat caa caa t-3’(5’端设有Bgl II酶切位点和保护碱基，并在酶切位点后加上了编码凝血酶的序列)

下游引物：5’-gc ctc gag cta ttt tct tgc agc att tg-3’(5’端设有Xhol I酶切位点和保护碱基，含终止密码子tga)

3)PCR反应条件

94℃预变性4min，94℃变性30sec、54℃复性35sec、72℃延伸30sec，30个循环后72℃延伸5min。

(4)扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析

2、原核载体和Mbd-3基因片段的预处理

原核载体选用pET32a(+)(Novagen公司)

(1)用限制性内切酶Bgl II及Xhol I(限制性内切酶均购自TaKaRa公司)双酶切原核载体pET32a(+)和Mbd-3基因片段，37℃过夜，反应体系如下：

(2)反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的紫外灯下，按胶回收试剂盒(购自Omega公司)的说明回收大片段。

3、Mbd-3基因与pET32a(+)原核载体的连接及转化

(1)将上述步骤中所获得的原核载体片段及Mbd-3基因片段粗略定量后，按Mbd-3基因片段与原核载体的分子数比为1～3∶1的连接反应原则进行连接实验。连接反应时应分别设立无插入片段和无载体的对照管，反应体系如下：

(2)整个反应过程在T4DNA连接酶(购自TaKaRa公司)作用下在PCR仪中22℃反应过夜。使上述扩增的Mbd-3基因片段插入到pET32a(+)原核载体中，所构建的原核重组质粒pET32a(+)/MBD-3见图2。

(3)将连接产物分别转化大肠杆菌JM109(Novagen公司)的感受态细胞(按《分子克隆操作指南》自制)。连接产物的转化方法主要步骤如下：

1)取连接产物5μl加入大肠杆菌JM109的感受态细胞100μl置于1.5ml Ep管中，阴性对照为大肠杆菌JM109的感受态细胞100μl置于1.5ml Ep管中。

2)置于冰上30min。

3)42℃循环水浴90s。

4)快速将管转至冰浴中，冷却1min-2min。

5)加0.6ml SOC培养基(蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NaCl 0.5g，KCl 0.186g，MgCl₂0.95g，用ddH₂O溶解后定容于980ml，高压灭菌，待冷却至室温后加入无菌20％葡萄糖20ml)，置于冰上。

6)37℃，50rpm振摇1h。

7)取100μl转化细胞+5μl 0.1g/ml Amp，均匀涂布于含Amp的平板，置37℃孵箱培养过夜。

4、PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析

PCR扩增产物获得大小约140bp(理论值142bp)的目的条带；原核重组质粒(pET32a(+)/MBD-3)酶切鉴定结果见图5，图5显示，在约140bp处出现一条条带，与预期产物大小相符；原核重组质粒测序结果见图3(该测序由上海英骏公司完成)，图3表明，所构建的重组质粒不仅含有完整的Mbd-3序列，而且阅读框架也正确无误，目的序列测序结果提交GenBank进行核酸BLAST比对，结果显示所克隆的Mbd-3基因与本实施例引物设计所用的Mbd-3基因序列完全相同，没有碱基突变，原核重组质粒中所含碱基序列如SEQ ID NO.1所述。

5、重组MBD-3融合蛋白(fMBD-3)的诱导表达及鉴定

将鉴定正确的原核重组质粒pET32a(+)/MBD-3转化大肠杆菌Rossetta-gami(2)菌株(购自Novagen公司)，即重组菌为Rossetta-gami(2)-pET32a(+)/MBD-3，异丙基β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导重组质粒的表达：采用优化条件SOB培养基(蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NaCl 0.5g，KCl 0.186g，MgCl₂0.95g，用ddH₂O溶解后定容于1000ml ddH₂O，高压灭菌)，培养温度为34℃，在菌体对数生长中期添加终浓度为的0.5mMIPTG，诱导后4h表达终止发酵。

SDS-PAGE、Western-blot鉴定Rossetta-gami(2)-pET32a(+)/MBD-3的融合蛋白fMBD-3的表达情况。将变性后的蛋白质Marker和重组融合蛋白fMBD-3在5％的浓缩胶和12％的分离胶中进行SDS-PAGE电泳。电泳完备后，进行Western-blot鉴定，将凝胶上的蛋白质电转移到硝酸纤维素滤膜上，电转移后的膜用封闭液(约5％的PBST脱脂奶粉)室温摇床震摇封闭处理1h；再加入羊MBD-3多克隆抗体(Santa公司产品)应用液，4℃过夜；充分洗涤后再加入酶标二抗(兔抗羊IgG)，室温摇床震摇作用1h；充分洗涤后加底物显色。

Western-blot鉴定结果见图7，图7显示，pET32a(+)/MBD-3融合蛋白分子质量约21kD，表明成功获得了融合蛋白fMBD-3。

6、融合蛋白fMBD-3的纯化

原核载体pET-32a(+)N端带有6个连续组氨酸残基(6×His Tag)的识别位点，所表达的融合蛋白可以用金属螯合亲和层析方法纯化，并且洗脱后仍能保持其活性，所以采用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白。具体步骤如下：

(1)重组菌Rossetta-gami(2)-pET32a(+)/MBD-3菌体超声破碎(功率：300W；超声时间：5s；间隔时间：5s；工作次数：20次；冰浴：10min；重复4次)，离心收集可溶蛋白；

(2)融合蛋白的纯化：用His Trap FF Crude纯化柱(GE公司)和

 purifier蛋白纯化仪(BOX-900)，采用亲和层析从中分离目标融合蛋白。先将亲和柱用30mM咪唑缓冲液平衡，至基线走平约3CV后，1ml/min进样可溶蛋白进行吸附，再用30mM咪唑缓冲液平衡柱子约3CV后，用洗脱液(300mM咪唑)进行洗脱，收集被洗脱的目标蛋白(fMBD-3)。将收集的样品在5％的浓缩胶和12％的分离胶中进行SDS-PAGE分析，电泳结果见图6，图6显示，在21kDa处出现一条条带，与预期融合蛋白的分子量相符。

7、成熟肽rMBD-3的释放和鉴定

以fMBD-3为底物(1mg/ml)，加入凝血酶(10U/mg融合蛋白)。酶切条件：25℃，20Mm Tris-HCL，100Mm NaCL，pH8.0，12h。以SDS-PAGE电泳酶切产物，酶切结果见图6，图6显示，在约4.5kDa处有一条条带，与成熟肽rMBD-3的分子量(理论值：4.6KD)相符，表明凝血酶很好切开了fMBD-3并完全释放出成熟肽rMBD-3，rMBD-3的序列见图4中的下划线部分。对获得的rMBD-3进行16％SDS-PAGE、Western-blot和质谱分析鉴定。结果显示，经凝血酶酶切后，标签蛋白被完全切除(大小约16kDa)。酶切产物经纯化及脱盐、浓缩处理，得到rMBD-3(大小约4.5kDa)(见图6)。融合蛋白fMBD-3和成熟肽rMBD-3的Western Blot实验结果显示有约21kD和4.5kD左右的蛋白印迹条带(详见图7)，其分子量大小与理论值相符。纯化的rMBD-3经质谱仪分析，可知样品中大约90％是分子量4632Da的多肽，该分子量与MBD-3成熟肽的理论分子量4636.36Da非常接近(见图8)。

实施例2：重组鼠β-防御素3多肽的抗丝状真菌活性测定

1、培养基的制备

(1)1/2马铃薯葡萄糖培养基(1/2PDB：10％马铃薯，1％葡萄糖，pH自然)，其中加入四环素(终浓度10μg/ml)和头孢噻肟(终浓度100μg/ml)。

(2)沙氏葡萄糖琼脂培养基(1％蛋白胨，2％葡萄糖，pH自然)

2、丝状真菌菌种的准备

将黄曲霉菌(临床分离株)、黑曲霉菌(临床分离株)、犬小孢子菌(临床分离株)、红色毛癣菌(临床分离株)菌种接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于28℃条件下生长7-10天。

3、实验菌的制备

黄曲霉菌、黑曲霉菌、犬小孢子菌和红色毛癣菌各取约5mg，分别置于5ml 1/2PDB培养基中，用无菌吸管吹打10次，静置10分钟后取上清定菌量，用血细胞计数板计分生孢子或碎菌丝成分，以1/2PDB调节分生孢子或碎菌丝成分至不同最终菌量：黄曲霉菌和黑曲霉菌5×10⁴/ml，犬小孢子菌和红色毛癣菌1×10³/ml。

4、重组鼠β-防御素3成熟肽rMBD-3的稀释

以0.2M NaHCO3(pH8.5)稀释实施例1制备的rMBD-3，浓度为500μM-0.1μM，共12个稀释度：500μM、250μM、100μM、50μM、25μM、10μM、5μM、2.5μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.1μM。

5、实验步骤

在96微孔板中分别加入以1/2PDB稀释的黄曲霉菌、黑曲霉菌、犬小孢子菌和红色毛癣菌菌液，每种菌14孔，每孔90μl。在装有上述四种丝状真菌的1-12孔分别加入500μM-0.1μM不同稀释度的rMBD-310μl，在装有上述四种丝状真菌的第13孔加入10μl 0.2M NaHCO3(pH8.5)作为阳性对照孔，在装有上述四种丝状真菌的第14孔加入敏感抗真菌药(0.2mg/ml咪康唑)作为阴性对照孔，然后于28℃恒温培养箱培养。MIC判定：培养48h后观察生长现象，肉眼观察或以光电比色浊度计在530nm波长下进行判定，以无真菌生长的最小防御素多肽浓度为最小抑制浓度MIC。MFC判定：将无真菌生长孔的培养液吸出，接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于28℃恒温培养箱培养，48h后观察，以无真菌生长的最小防御素多肽浓度为最小杀真菌浓度MFC。

6、实验结果

实验终点时观察96孔板中各孔的丝状真菌生长情况，各阳性对照孔(第13孔)，均见有菌生长；各阴性对照孔(第14孔)，均未见有菌生长。在加入成熟肽rMBD-3的各孔中，以无真菌生长的最小rMBD-3浓度为成熟肽rMBD-3对该丝状真菌的MIC；观察转种后各孔丝状真菌的生长情况，以无真菌生长的最小rMBD-3多肽浓度为成熟肽rMBD-3对该丝状真菌的MFC。成熟肽rMBD-3对黄曲霉菌、黑曲霉菌、犬小孢子菌和红色毛癣菌的MIC和MFC结果见下表：

7、结论

从上述实验结果可知，本发明所述重组鼠β-防御素3成熟肽rMBD-3对曲霉菌的MIC为5-10μM，MFC为25μM；对犬小孢子菌的MIC为0.25μM，MFC为10μM；对红色毛癣菌的MIC为0.01μM，MFC为0.5μM。上述实验结果表明，本发明所述重组鼠β-防御素3多肽对丝状真菌具有明显的抑制和杀灭作用。

SEQUENCE  LISTING

<110>四川大学

<120>重组鼠β-防御素3多肽及其制备方法与用途

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>344

<212>DNA

<213>小鼠

<400>

gcttcagtca tgaggatcca ttaccttctc tttgcatttc tcctggtgct gctgtctcca  60

cctgcagctt ttagcaaaaa aatcaacaat ccagtaagtt gtttgaggaa aggaggcaga 120

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aaacaagtgc tccctagcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa                  344

Claims (2)

1.重组鼠β-防御素3多肽在制备抗丝状真菌的药物中的应用，所述重组鼠β-防御素3多肽由序列表中SEQIDNO.1所示的鼠β-防御素3基因与原核载体构建的原核重组质粒表达而成。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述原核载体为pET质粒系统。

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