CN110577587B - 分离的植物防御素多肽及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了分离的植物防御素多肽及其制备方法和用途。其中，该分离的植物防御素多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明的分离的植物防御素多肽能够有效抑制脑癌细胞生长，进而能够预防或治疗脑癌。

Description

分离的植物防御素多肽及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体地，涉及分离的植物防御素多肽及其制备方法和用途，更具体地，涉及分离的植物防御素多肽及其制备方法、分离的寡核苷酸、构建体、重组细胞、分离的植物防御素多肽在制备药物中的用途及药物。
背景技术
防御素是存在于动植物体内、富含半胱氨酸的阳离子小蛋白或多肽。作为动植物体内具有防御和保护功能的多肽，防御素具有广谱抗细菌、抗真菌和杀死很多带囊膜和不带囊膜病毒的生物学功能。防御素一般是由18-50个氨基酸组成，含有6-8个保守的半胱氨酸，形成3-4个二硫键，并具有一定化学稳定性结构的多肽物质。
研究发现，动植物的免疫细胞，如粒细胞和所有的上皮细胞，具有多种可以帮助杀死病原微生物的防御素存在，其作用机理首先是利用防御素的阳离子与细胞膜上负电荷相互作用而附着于细菌膜表面、通过与细胞膜脂质双层中蛋白间的相互作用、嵌入到细菌细胞膜中、形成离子通道或特殊的孔道，破坏其完整性并造成穿孔和细胞内离子和营养物溢出胞外而导致细菌的死亡。
目前，从动植物分离到的防御素种类多，分布广泛，从植物、昆虫、软体动物、甲壳动物、两栖动物、鱼类、鸟类及哺乳动物等生物均有发现。对不同来源防御素的作用范围，尚未有系统和深入的研究。特别是植物防御素在抗肿瘤药物方面的研究很少，尤其是在人类癌症药物的研究上，几乎还是空白。
因而，关于植物防御素的研究仍有待深入。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效抑制肿瘤细胞增殖的手段。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的植物防御素多肽。根据本发明的实施例，该分离的植物防御素多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。发明人发现，本发明的分离的植物防御素多肽能够有效抑制脑癌细胞生长，进而能够预防或治疗脑癌。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的寡核苷酸。根据本发明的实施例，该分离的寡核苷酸具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，所述分离的寡核苷酸编码前面所述的分离的植物防御素多肽。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种从植物浆果中分离获得前面所述的分离的植物防御素多肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)将所述植物浆果预冷后粉碎，然后进行酒精浸泡处理；(2)将经过酒精浸泡处理的果仁依次进行第一过滤、酒精浸洗和干燥处理，以便获得干燥的浆果粉末；(3)将所述干燥的浆果粉末依次进行硫酸浸泡处理和第一离心处理，以便收获上清液；(4)将所述上清液依次进行MES缓冲液调节、第二离心和第二过滤处理，以便获得离子交换层析样品；以及(5)将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离，以便获得所述分离的植物防御素多肽。发明人发现，利用本发明的该方法，能够快速有效地获得前面所述的分离的植物防御素多肽，且方法简单，操作方便，对设备无特殊要求，易于实现，并且获得的多肽纯度较高，能够有效用于预防或治疗脑癌。
根据本发明的一个实施例，所述方法包括：(1)将所述羞木树浆果预冷后粉碎，并用100％酒精中浸泡4小时；(2)将经过酒精浸泡处理的果仁依次进行第一过滤、100％酒精浸洗和干燥处理，以便获得干燥的浆果粉末；(3)利用0.05M的硫酸浸泡所述干燥的浆果粉末2小时，离心、收获上清液；(4)利用MES缓冲液调节所述上清液至20mM，并于13500rpm下进行第二离心30分钟后，利用0.45μm滤膜进行第二过滤处理，以便获得离子交换层析样品；以及(5)将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离，以便获得所述分离的植物防御素多肽。由此，能够有效获得前面所述的分离的植物防御素多肽，且获得的多肽品质良好，产率较高。
根据本发明的实施例，步骤(5)中将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离进一步包括：(5-1)将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离，然后用20mMMES缓冲液洗脱，其中所述离子交换柱包括C8硅胶柱和反向C2/C18硅胶柱；(5-2)依次利用含有0.1％三氟乙酸的5％的乙腈和0.1％三氟乙酸的50％乙腈对所述C8硅胶柱进行第一洗脱处理，以便获得第一洗脱样品；(5-3)于4摄氏度下，将所述第一洗脱样品进行第一真空干燥浓缩，并将经过第一真空干燥浓缩的样品溶解于含有0.1％三氟乙酸的5％乙腈中，以便获得溶解样品；(5-4)将所述溶解样品上样至所述反向C2/C18硅胶柱上，并依次利用含有0.1％三氟乙酸的5％的乙腈和0.1％三氟乙酸的50％乙腈对所述C8硅胶柱进行第二洗脱处理，以便获得第二洗脱样品；(5-5)于4摄氏度下，将所述第二洗脱样品进行第二真空干燥浓缩，并将经过第二真空干燥浓缩的样品溶解于水中反复抽提，以便获得所述分离的植物防御素多肽。由此，能够获得的前面所述分离的植物防御素多肽的纯度较高。
根据本发明的实施例，所述植物浆果为澳大利亚羞木树浆果。由此，前面所述分离的植物防御素多肽的产率较高。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的寡核苷酸。利用本发明的构建体可以有效转化重组细胞，并且通过培养转化获得的重组细胞能够快速有效地制备前面所述的分离的植物防御素多肽。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞包含前面所述的构建体。根据本发明的实施例，所述重组细胞为酵母细胞。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种获得前面所述分离的植物防御素多肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体接种至氨基酸缺陷型液体培养基，进行标准发酵罐深层通气培养80-100小时，以便获得发酵液；将所述发酵液进行分离纯化，以便获得所述分离的植物防御素多肽。发明人发现，利用本发明的该方法，能够有效制备所述分离的植物防御素多肽，且该方法操作简单，方便快捷，容易控制，易于实现规模化生产。
根据本发明的实施例，进行所述培养96小时。由此，有利于提高所述分离的植物防御素多肽的产率。
根据本发明的实施例，所述分离纯化包括：将所述发酵液进行分离处理，以便获得去除菌体的发酵液；将所述去除菌体的发酵液进行第一纳滤浓缩处理，以便获得第一浓缩液；将所述第一浓缩液进行加热处理，以便获得经过加热处理的第一浓缩液；将所述经过加热处理的第一浓缩液进行离心处理，以便获得经过离心的第一浓缩液；将所述经过离心的第一浓缩液进行凝胶柱分离，以便获得经过分离的第一浓缩液；将所述经过分离的第一浓缩液进行第二纳滤浓缩处理，以便获得第二浓缩液；将所述第二浓缩液进行冷冻干燥，以便获得所述分离的植物防御素多肽。由此，能够有效获得所述分离的植物防御素多肽，且获得的多肽纯度和产率较高。
在本发明的第七方面，本发明提供了前面所述的分离的植物防御素多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗脑癌。
在本发明的第八方面，本发明提供了一种药物。根据本发明的实施例，该药物包含前面所述的分离的植物防御素多肽。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗脑癌。
附图说明
图1显示了根据本发明的一个实施例的植物防御素AmBP-1的质谱图；
图2显示了根据本发明的一个实施例的重组克隆载体pVD5-AmBP-1的构建流程图；
图3显示了根据本发明的一个实施例的表达载体pTG3828-AmBP-1的构建流程图；
图4显示了根据本发明一个实施例的植物防御素AmBP-1对小鼠S180肉瘤移植肿瘤生长的抑制作用示意图；以及
图5显示了根据本发明的一个实施例的AmBP-1治疗脑癌的影像图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的植物防御素多肽。根据本发明的实施例，该分离的植物防御素多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。发明人发现，本发明的分离的植物防御素多肽能够有效抑制脑癌细胞生长，进而能够预防或治疗脑癌。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的寡核苷酸。根据本发明的实施例，该分离的寡核苷酸具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，所述分离的寡核苷酸编码前面所述的分离的植物防御素多肽。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种从植物浆果中分离获得前面所述的分离的植物防御素多肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
(1)将所述植物浆果预冷后粉碎，然后进行酒精浸泡处理。根据本发明的实施例，酒精浸泡处理的条件不受特别限制。在本发明的一个实施例中，将所述植物浆果预冷后粉碎，并用100％酒精中浸泡4小时。根据本发明的实施例，所述植物浆果的种类不受特别限制，只要能够有效获得前面所述的分离的植物防御素多肽，本领域技术人员可以根据实际情况灵活选择。根据本发明的一个实施例，所述植物浆果为澳大利亚羞木树浆果。由此，前面所述分离的植物防御素多肽的产率较高。
(2)将经过酒精浸泡处理的浆果依次进行第一过滤、酒精浸洗和干燥处理，以便获得干燥的浆果粉末。根据本发明的一个具体示例，将经过酒精浸泡处理的浆果依次进行第一过滤、100％酒精浸洗和干燥处理，以便获得干燥的浆果粉末。
(3)将所述干燥的浆果粉末依次进行硫酸浸泡处理和第一离心处理，以便收获上清液。根据本发明的实施例，硫酸浸泡处理的条件不受特别限制。根据本发明的一个具体示例，利用0.05M的硫酸浸泡所述干燥的浆果粉末2小时，离心、收获上清液。
(4)将所述上清液依次进行MES缓冲液调节、第二离心和第二过滤处理，以便获得离子交换层析样品。根据本发明的一个具体示例，利用MES缓冲液调节所述上清液至20mM，并于13500rpm下进行第二离心30分钟后，利用0.45μm滤膜进行第二过滤处理，以便获得离子交换层析样品。
(5)将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离，以便获得所述分离的植物防御素多肽。由此，获得的分离的植物防御素多肽纯度较高。
根据本发明的实施例，步骤(5)中将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离进一步包括：(5-1)将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离，然后用20mMMES缓冲液洗脱，其中所述离子交换柱包括C8硅胶柱和反向C2/C18硅胶柱；(5-2)依次利用含有0.1％三氟乙酸的5％的乙腈和0.1％三氟乙酸的50％乙腈对所述C8硅胶柱进行第一洗脱处理，以便获得第一洗脱样品；(5-3)于4摄氏度下，将所述第一洗脱样品进行第一真空干燥浓缩，并将经过第一真空干燥浓缩的样品溶解于含有0.1％三氟乙酸的5％乙腈中，以便获得溶解样品；(5-4)将所述溶解样品上样至所述反向C2/C18硅胶柱上，并依次利用含有0.1％三氟乙酸的5％的乙腈和0.1％三氟乙酸的50％乙腈对所述C8硅胶柱进行第二洗脱处理，以便获得第二洗脱样品；(5-5)于4摄氏度下，将所述第二洗脱样品进行第二真空干燥浓缩，并将经过第二真空干燥浓缩的样品溶解于水中反复抽提，以便获得所述分离的植物防御素多肽。由此，能够获得的前面所述分离的植物防御素多肽的纯度较高。
发明人发现，利用本发明的该方法，能够快速有效地获得前面所述的分离的植物防御素多肽，且方法简单，操作方便，对设备无特殊要求，易于实现，并且获得的多肽纯度较高，能够有效用于预防或治疗脑癌。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的寡核苷酸。利用本发明的构建体可以有效转化重组细胞，并且通过培养转化获得的重组细胞能够快速有效地制备前面所述的分离的植物防御素多肽。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞包含前面所述的构建体。由此，利用本发明的重组细胞能够快速有效地制备前面所述的分离的植物防御素多肽，且制备获得的多肽能够有效用于预防或治疗脑癌。根据本发明的实施例，所述重组细胞为酵母细胞。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种获得前面所述分离的植物防御素多肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
将前面所述的构建体接种至氨基酸缺陷性液体培养基，进行标准发酵罐深层通气培养80-100小时，以便获得发酵液。根据本发明的实施例，进行所述培养96小时。由此，有利于提高所述分离的植物防御素多肽的产率。
将所述发酵液进行分离纯化，以便获得所述分离的植物防御素多肽。根据本发明的实施例，所述分离纯化包括：将所述发酵液进行分离处理，以便获得去除菌体的发酵液；将所述去除菌体的发酵液进行第一纳滤浓缩处理，以便获得第一浓缩液；将所述第一浓缩液进行加热处理，以便获得经过加热处理的第一浓缩液；将所述经过加热处理的第一浓缩液进行离心处理，以便获得经过离心的第一浓缩液；将所述经过离心的第一浓缩液进行凝胶柱分离，以便获得经过分离的第一浓缩液；将所述经过分离的第一浓缩液进行第二纳滤浓缩处理，以便获得第二浓缩液；将所述第二浓缩液进行冷冻干燥，以便获得所述分离的植物防御素多肽。由此，能够有效获得所述分离的植物防御素多肽，且获得的多肽纯度和产率较高。
发明人发现，利用本发明的该方法，能够有效制备所述分离的植物防御素多肽，且该方法操作简单，方便快捷，容易控制，易于实现规模化生产。
在本发明的第七方面，本发明提供了前面所述的分离的植物防御素多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗脑癌。
在本发明的第八方面，本发明提供了一种药物。根据本发明的实施例，该药物包含前面所述的分离的植物防御素多肽。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗脑癌。
实施例1：植物防御素AmBP-1的制备
(1)、将澳大利亚特有的羞木树浆果经放置在4摄氏度12小时预冷后，用食品粉碎机粉碎浆果，并用100％酒精中浸泡4小时；
(2)、经滤膜过滤除去浆果乳液中的脂肪，并用100％酒精反复浸洗浆果乳液，将半干的果仁粉状物置抽风厨中干燥；
(3)、用0.05M硫酸液体浸泡干燥后的果仁粉末2小时，然后离心、收获上清液、并用MES(2-(吗啉代)乙烷磺酸钠盐)调节上清液至20mM MES；
(4)、13500rpm离心30分钟，用0.45μm滤膜过滤后，制备成离子交换层析的样品；
(5)、用离子交换柱(Q—Sepharose Fast Flow,Pharmacias)层析分离上述的离子交换层析样品，用20mM MES洗脱，经过离子交换柱分离的植物防御素多肽将会与C8硅胶柱结合；
(6)、用适量的含有0.1％三氟乙酸(TFA)的5％的乙腈洗涤C8硅胶柱后，再用适量的含有0.1％三氟乙酸的50％乙腈进行洗脱；
(7)、将洗脱的样品在4摄氏度的真空旋转干燥器中干燥浓缩，将干燥浓缩后的样品溶解在含中有0.1％三氟乙酸(TFA)的5％乙腈中；
(8)、将步骤(7)获得的样品上样到反向C2/C18硅胶柱上，用含有0.1％三氟乙酸(TFA)的5％的乙腈洗涤后，再用含有0.l％三氟乙酸的50％的乙腈进行洗脱；
(9)、将洗脱的样品在4摄氏度的真空旋转干燥器中干燥浓缩，并将干燥浓缩后的样品溶解在水中反复抽提，以排除残余的乙腈；最后获得干燥浓缩后的样品，即为植物防御素AmBP-1。将获得的干燥浓缩后的样品溶解在水中，测定浓度和纯度，要求纯度在95％以上，质量在30-50毫克以上。
实施例2：植物防御素AmBP-1的质谱分析和氨基酸测序
将实施例1中分离获得的植物防御素AmBP-1委托澳大利亚昆士兰大学生物中心进行质谱分析和氨基酸测序。氨基酸测序分为N端测序和C端测序，利用氨肽酶(N端测序法)或羧肽酶(C端测序法)将肽链从两端依次切下，并检测切下的氨基酸的种类。
植物防御素AmBP-1的质谱图如图1所示。由图1的结果可知，植物防御素AmBP-1的结构正确。由测序结果可知，植物防御素AmBP-1具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列：EWTCSAPAGKRIYCNKGRCCSKFNWCGNTAAYCAGNCINCP(SEQ ID NO：1)。
实施例3：植物防御素AmBP-1基因(DNA)合成
根据酵母表达系统最嗜好基因编码设计植物防御素AmBP-1基因(DNA)序列，具体地，植物防御素AmBP-1基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列：GAATGGACTTGTTCTGCTCCAGCTGGAAATAGAATTTATTGTAATAAAGGTAGATGTTGTTCTAAATTTAATTGGTGTGGTAATACTGCTGCTTATTGTGCTGGTAATTGTATTAATTGTCCA(SEQ ID NO：2)。然后，委托生工生物工程(上海)有限公司，合成植物防御素AmBP-1基因序列。
实施例4：含有植物防御素AmBP-1基因的重组克隆载体pVD5和重组表达载体pTG3828的构建：
将实施例3合成的植物防御素AmBP-1的基因克隆到克隆载体pVD5的克隆位点，具体如下：
(1)、分别将植物防御素AmBP-1基因和克隆载体pVD5进行核酸限制性内切酶(HindIII/BamH I)酶切并线性化后，施行第一次连接反应。具体步骤如下：将500纳克、经HindIII/BamH I线性化的克隆载体pVD5与2微克、经Hind III/BamH I酶切处理的AmBP-1基因混合，同时，加入2微升10倍的T4DNA连接酶缓冲液、2微升T4DNA连接酶和2微升50％的PEG4000溶液，然后加入无核酸酶的纯净水至2微升(所有连接酶和溶液均从Fermentas LifeSciences公司购买)。链接反应在4摄氏度培育12小时后，进行Top10感受态细胞的转染试验，Top10感受态细胞(由Global Bioreactor PTY LTD馈赠)。相关感受态细胞转染实验的程序、以及利用氨苄青霉素筛选菌落，并获得重组克隆载体pVD5-AmBP-1的操作程序是以“分子克隆实验指南”(第三版)的相关试验方法。重组克隆载体pVD5-AmBP-1的构建流程图见图2。
(2)、将上述获得的重组克隆载体pVD5-AmBP-1利用核酸限制性内切酶(Sal I和BamH I)双酶切，以便释放分别含有位于目的基因上游的酵母菌配对因子的启动子、植物防御素AmBP-1基因和位于目的基因下游的两个表达终止位点(TAATAG)的基因族群，并利用核酸限制性内切酶(Sal I/Bgl II)线性化处理表达载体pTG3828质粒，以便获得线性化的表达载体pTG3828片段；
(3)、关于目的基因族群经Sal I和BamH I得双酶切、表达载体pTG3828的线性化、目的基因与线性化表达载体的酶连反应，重组菌落的抗生素抗性筛选和克隆等所有操作程序和方法均参照“分子克隆实验指南”(第三版)的相关试验方法。重组的表达载体pTG3828-AmBP-1的构建流程图见图3。
经核酸序列分析，确认重组的表达载体pTG3828构建正确。其中，在重组的表达载体pTG3828-AmBP-1中，含有细胞蛋白酶特异性识别位点，因此目的基因在完成基因表达时，其表达产物自动被细胞内蛋白酶所切割、释放，形成分泌型产物，释放成熟的蛋白质，并可通过分泌小泡、经内质网和高尔基复合体等微管系统、运输到质膜(PM)，从质膜分泌到胞外。
实施例5：酵母细胞的转化
将实施例4构建的重组表达载体pTG3828-AmBP-1、10mg鱼精DNA和经LiCl处理制备的酵母感受态细胞充分混匀后，于28℃静置培育12小时，然后使用氨基酸缺陷型选择培养基(SD Medium从BIO 101Systems公司购买)平板筛选重组酵母菌落。只有成功转化的C13BYS86细胞(Global Bioreactor PTY.LTD.赠送)才能形成菌落，由此获得转化酵母菌。
实施例6：生物学活性检测
挑取实施例5中获得的转化酵母菌菌落，利用液体YPD培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)，于28℃～30℃下，摇瓶培养70小时，然后将培养产物于3000rpm下离心，取上清液，并进行生物学活性检测。具体如下：
将等量转化酵母菌的培养上清与1000个菌落形成单位的大肠杆菌E.coli(100微升+100微升)混合，于37℃培育6小时后，接种LB固体培养基(0.5％酵母膏，1％蛋白胨，1％NaCl，2％琼脂粉)，然后于37℃培养箱中培养12小时。同时设置未接菌YPD培养液与1000个菌落形成单位的大肠杆菌E.coli混合的阳性对照。实验结果表明，与未接菌YPD培养液相比，转化酵母菌的培养上清菌落明显减少，表明有分泌性植物防御素AmBP-1产生。
实施例7：液质联用分析
将实施例6中证明有明显抑菌效果的转化酵母菌的培养上清进行质谱分析，并同时利用核酸序列分析和氨基酸序列的分子量测算进行比对，如果质谱特征条件和多肽分子量与氨基酸序列分子量的测算相符合，则证明载体构建和酵母转化成功。纯化的AmBP-1的质谱分析图谱见图1。在对有明显抑菌效果的转化酵母菌的培养上清进行质谱分析时，出现了分子量分别为4468、4479、和4500g/mol的三个吸收峰，但是，4466g/mol的吸收峰为最主要的吸收峰；在同时使用ChinaPeptidesCo.,Ltd的多肽计算器对克隆的AmBP-1核酸翻译后的多肽的分子量进行测算时，该41个氨基酸组成的多肽的分子量为：4466.11g/mol，该测算结果与质谱分析中最主要的4468g/mol吸收峰的分子量最为接近。
实施例8：转化体的培养
将实施例5中获得的转化酵母菌接种到氨基酸缺陷性液体培养基((SD Medium从BIO 101Systems公司购买))，在标准发酵罐深层通气培养，培养时间为96小时，然后，将得到的发酵液采用陶瓷膜分离掉菌体，接着将分离掉菌体的发酵液纳滤浓缩到蛋白质含量在5％左右，随后加热到80摄氏度，并保持20分钟，再冷却到20摄氏度，然后10000rpm离心30min分离去杂，向所得产物中添加10倍量pH为5的盐酸溶液稀释，使蛋白质含量在0.5％左右，过DEAE凝胶柱后，纳滤浓缩蛋白质含量在5％左右，冻干，得到纯化产物，产物纯度为95％，纯化产物与折干的培养基质量相比，产率为0.2％左右，其中，产率＝{(发酵液表达产物总质量×纳滤浓缩收率×去杂收率×DEAE凝胶分离收率×浓缩收率×冻干收率)/折干的培养基总质量)×l00％。
实施例9：植物防御素AmBP-1抗脑癌细胞体外试验
实验材料：
受试细胞：人脑癌SF126，SF17，HTB-12(中国药科大学)
仪器：超净工作台，恒温CO2培养箱(德国heraeus)，酶联免疫检测仪(Bio-RAD)，倒置生物显微镜(Olympus)
试剂：RPMT1640(GIBCO)，DMEM培养基(GIBCO)，胰蛋白酶(SIGMA)，新生牛血清，噻唑兰(MTT)，二甲基亚枫(DMSO)。
实验方法：
步骤1.取指数生长期的受试细胞SF126，SF17，HTB-12，分别加入0.25％胰蛋白酶消化液，使贴壁细胞脱落，计数，配成2～4×l04个/ml的细胞悬液。
步骤2.取步骤1中得到的细胞悬液接种于96孔板上，每孔180μ1，每种细胞3个处理，置于恒温CO2培养箱中，于温度为36.5℃士0.5℃下培养24小时。
步骤3.将实施例8中获得的纯化产物用2N盐酸溶解，制成20mg/ml的植物防御素AmBP-1溶液，然后经过培养的孔板中加入配好的植物防御素AmBP-1溶液，加入量使得每种细胞的3个处理间植物防御素AmBP-1的终浓度分别为6.66μg/ml，66.66μg/ml和200μg/ml，置于恒温CO2培养箱中，于温度为36.5℃士0.5℃下培养48小时。
步骤4.每孔加入MTT 20μl，置于恒温CO2培养箱中，于温度为36.5℃士0.5℃下反应4小时。
步骤5.吸弃上清液，加入DMSO 150μl/孔，平板摇床上震荡5分钟。
步骤6.用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的OD值，并计算植物防御素AmBP-1对不同脑癌细胞株的抑制率。抑制率是以被测定细胞的受抑制的百分比(％)所表示。其中，
细胞抑制率％＝(阴性对照组OD值–药敏组OD值/阴性对照组OD值)×100％。
测定结果见表1。
表l植物防御素AmBP-1对肿瘤细胞的抑制率
Figure BDA0001688037510000101
表1的结果说明，本发明提供的植物防御素AmBP-1对三种不同的人脑癌细胞系(SF126，SF17，HTB-12)有显著抑制作用，且抑制率与植物防御素AmBP-1的浓度呈正相关。
实施例10：植物防御素AmBP-1对小鼠S180肉瘤的抑制试验
实验动物：取35-40日龄、体重18-20g的清洁级雄性ICR小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证：SCXK(沪)2007-0005)35只，取含有生长旺盛期的SF126肉瘤细胞腹水，在无菌条件下制备成浓度为5×107个/ml的细胞悬液，以0.2ml/只的剂量接种于ICR小鼠右侧腋窝皮下，接种第二天将ICR小鼠随机分为5组，每组7只，其中，包括一个空白对照组，一个阳性对照组，三个实验组。
受试药物及配制方法：
将实施例8中获得的纯化产物，用无菌生理盐水溶解，配制成浓度为2mg/ml的澄清透明的溶液，给药剂量分别为100mg/kg、50mg/kg和25mg/kg，给药途径为静脉注射。
环磷酰胺(CTX，江苏省恒瑞制药有限公司)：用生理盐水充分溶解成浓度为2mg/ml的淡黄色澄明的溶液，给药剂量为30mg/kg，给药途径为静脉注射。
按照上述的给药剂量和给药途径，实验组给予不同剂量的植物防御素AmBP-1，阳性对照组给予环磷酰胺，空白对照组给予等量生理盐水，每天给药一次，共8次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。按照如下公式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(C-T)/C×100，其中，T表示治疗组(即实验组和阳性对照组)瘤重；C表示空白对照组瘤重。实验结果见表2。
表2植物防御素AmBP-1对小鼠S180肉瘤移植肿瘤生长的抑制作用(X±SD)
Figure BDA0001688037510000111
注：与空白对照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01
由图4，表2结果可知，植物防御素AmBP-1静脉注射对小鼠SF126肉瘤移植瘤有显著的生长抑制作用。不同浓度的植物防御素AmBP-1(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)分别经静脉注射给药，对小鼠SF126肉瘤移植瘤的抑瘤率分别达50％、64％和70％。阳性对照药环磷酰胺(CTX)以30mg/kg静脉注射，抑瘤率为53％。CTX显著降低实验动物体重，实验过程中有2只动物死亡，死亡率小于10％；而植物防御素AmBP-1静脉注射对实验动物的体重无明显影响，未出现动物死亡现象，实验结束后动物身体状况良好。
实施例11：植物防御素AmBP-1对人脑癌的治疗试验
患者背景：男性、七十一岁，2011年因结肠癌、诊断出为结肠癌。随后马上手术切除，切除后随即进行化疗治疗。2016年7月发现病人行动迟缓，语言有些障碍。进行脑部增强CT，检查后发现脑部出现转移。转移病灶已经达到4厘米了。右侧颞叶占位性病变，脑部转移瘤并脑疝形成。病理诊断为：转移型脑癌。因为脑转移瘤体积巨大，且处在脑中危险部位，因此，不能进行手术，化疗也不会有理想的效果。通过与患者和患者家属沟通，患者决定愿意接受使用植物防御素AmBP-1进行生物治疗。
治疗方法：
a)、将实施例8中获得的纯化的植物防御素AmBP-1以0.5％的比例与赋形剂(市售的50％小麦精粉和50％玉米精粉的混合物，经70摄氏度、12小时烤熟后、粉碎制粉)混合均匀并压制成2毫米的颗粒：每天服用三次，每次10克、饭前半小时服用。方法是将植物防御素AmBP-1颗粒倒入口中、温开水送服；
b)、将实施例8中获得的纯化的植物防御素AmBP-1以1％的比例与18.2MΩ的纯净水配制成植物防御素AmBP-1的口服液：每天服用四次，每次三毫升，饭后半小时服用。方法是将口服液倒入口中，含在舌下，含约三十分钟后吞服。每晚临睡前同样方法再含服一次。
植物防御素AmBP-1颗粒与植物防御素AmBP-1的口服液，按上述服用方法同时服用，植物防御素AmBP-1分别经肠粘膜和口腔粘膜吸收，达到有效治疗的结果。
治疗效果：患者在服用植物防御素AmBP-1期间未接受其它任何治疗。8月15日和9月16日检查头部肿瘤情况和全身体检，病情基本稳定，头部的病灶已经缩小到3.1厘米。
经大约六个月治疗后，到1月15日病情基本受控，脑部积水消失，并且脑部的病灶基本受到控制(图5)。该实例表明本发明的植物防御素AmBP-1能够有效用于治疗脑癌。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 瑞鑫百奥生物科技（深圳）有限公司
<120> 分离的植物防御素多肽及其制备方法和用途
<130> PIDC4180065
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1
<400> 1
Glu Trp Thr Cys Ser Ala Pro Ala Gly Lys Arg Ile Tyr Cys Asn Lys
1 5 10 15
Gly Arg Cys Cys Ser Lys Phe Asn Trp Cys Gly Asn Thr Ala Ala Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Asn Cys Ile Asn Cys Pro
35 40
<210> 2
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2
<400> 2
gaatggactt gttctgctcc agctggaaat agaatttatt gtaataaagg tagatgttgt 60
tctaaattta attggtgtgg taatactgct gcttattgtg ctggtaattg tattaattgt 120
cca 123

Claims (15)

1.一种分离的植物防御素多肽，其特征在于，所述分离的植物防御素多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
2.一种分离的核苷酸，其特征在于，所述分离的核苷酸序列的序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的分离的核苷酸，其特征在于，所述分离的核苷酸编码权利要求1所述的分离的植物防御素多肽。
4.一种从植物浆果中分离获得权利要求1所述的分离的植物防御素多肽的方法，其特征在于，包括：
（1）将所述植物浆果预冷后粉碎，然后进行酒精浸泡处理；
（2）将经过酒精浸泡处理的果仁依次进行第一过滤、酒精浸洗和干燥处理，以便获得干燥的浆果粉末；
（3）将所述干燥的浆果粉末依次进行硫酸浸泡处理和第一离心处理，以便收获上清液；
（4）将所述上清液依次进行MES缓冲液调节、第二离心和第二过滤处理，以便获得离子交换层析样品；以及
（5）将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离，以便获得所述分离的植物防御素多肽；
所述植物浆果为澳大利亚羞木树浆果。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）将所述羞木树浆果预冷后粉碎，并用100%酒精中浸泡4小时；
（2）将经过酒精浸泡处理的果仁依次进行第一过滤、100%酒精浸洗和干燥处理，以便获得干燥的浆果粉末；
（3）利用0.05M的硫酸浸泡所述干燥的浆果粉末2小时，离心、收获上清液；
（4）利用MES缓冲液调节所述上清液至20mM，并于13500rpm下进行第二离心30分钟后，利用0.45μm滤膜进行第二过滤处理，以便获得离子交换层析样品；以及
（5）将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离，以便获得所述分离的植物防御素多肽。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（5）中将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离进一步包括：
（5-1）将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离，然后用20mMMES缓冲液洗脱，其中所述离子交换柱包括C8硅胶柱和反向C2/C18硅胶柱；
（5-2）依次利用含有0.1%三氟乙酸的5%的乙腈和0.1%三氟乙酸的50%乙腈对所述C8硅胶柱进行第一洗脱处理，以便获得第一洗脱样品；
（5-3）于4摄氏度下，将所述第一洗脱样品进行第一真空干燥浓缩，并将经过第一真空干燥浓缩的样品溶解于含有0.1%三氟乙酸的5%乙腈中，以便获得溶解样品；
（5-4）将所述溶解样品上样至所述反向C2/C18硅胶柱上，并依次利用含有0.1%三氟乙酸的5%的乙腈和0.1%三氟乙酸的50%乙腈对所述C8硅胶柱进行第二洗脱处理，以便获得第二洗脱样品；
（5-5）于4摄氏度下，将所述第二洗脱样品进行第二真空干燥浓缩，并将经过第二真空干燥浓缩的样品溶解于水中反复抽提，以便获得所述分离的植物防御素多肽。
7.一种构建体，其特征在于，包含权利要求2或3所述的分离的核苷酸。
8.一种重组细胞，其包含权利要求7所述的构建体。
9.根据权利要求8所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为酵母细胞。
10.一种获得权利要求1所述分离的植物防御素多肽的方法，其特征在于，
将权利要求8或9所述重组细胞接种至氨基酸缺陷性液体培养基，进行标准发酵罐深层通气培养80-100小时，以便获得发酵液；
将所述发酵液进行分离纯化，以便获得所述分离的植物防御素多肽。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，进行所述培养96小时。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述分离纯化包括：
将所述发酵液进行分离处理，以便获得去除菌体的发酵液；
将所述去除菌体的发酵液进行第一纳滤浓缩处理，以便获得第一浓缩液；
将所述第一浓缩液进行加热处理，以便获得经过加热处理的第一浓缩液；
将所述经过加热处理的第一浓缩液进行离心处理，以便获得经过离心的第一浓缩液；
将所述经过离心的第一浓缩液进行凝胶柱分离，以便获得经过分离的第一浓缩液；
将所述经过分离的第一浓缩液进行第二纳滤浓缩处理，以便获得第二浓缩液；
将所述第二浓缩液进行冷冻干燥，以便获得所述分离的植物防御素多肽。
13.权利要求1所述的分离的植物防御素多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗脑癌。
14.一种药物，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的植物防御素多肽。
15.根据权利要求14所述的药物，其特征在于，所述药物用于治疗脑癌。
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