CN110066342B - 一种具有免疫调节、中和消解内毒素和抗炎功能的杂合肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程及生物制剂技术领域，具体涉及一种具有免疫调节、中和消解内毒素和抗炎功能的生物活性杂合肽(以下简称“杂合肽”)及其制备方法与应用。本发明提供的杂合肽为抗菌肽LL‑37和胸腺肽Tα1经蛋白质工程计算机设计、杂合优化、体内外复筛得到(简写为LTA)，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。LTA具有较高的双向免疫调节活性，能够增强正常或免疫抑制状态下机体的免疫功能，保护免疫抑制对机体造成的损伤；在炎症状态下，LTA还可中和内毒素、抑制机体炎症反应，缓解炎症反应对组织的损伤，且具有细胞毒性低、安全性高，制备方便、成本低廉等优势，可作为理想的免疫抗炎调节剂，具有很好的应用潜力和价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及生物制剂领域，具体涉及一种具有免疫调节、中和消解内毒素和抗炎功能的杂合肽及其制备方法与应用。
背景技术
动物或人类在幼龄、体弱、疾病、应激、病原感染等情况下，经常导致免疫力降低，进而发生继发感染(细菌或病毒混合感染)，引起炎性反应(红、热、肿、痛等)。目前，对于感染和炎症治疗，传统上普遍使用的防治策略是使用抗生素和激素类抗炎药(如氢化可的松、地塞米松等)，虽能有效控制感染性炎症和非感染性炎症,但持续使用可引起多种副作用：如水盐代谢和糖、脂肪、蛋白质代谢的严重紊乱，并引起肾上腺皮质功能衰退、消化系统并发症或加重感染等。另外，畜牧养殖业中广泛使用抗生素保健促生长剂。在感染和炎症治疗中使用抗生素或激素类抗炎药也存在明显的问题：抗生素虽然能降低或杀死病原菌，但不能改善机体的免疫功能，相反，被抗生素杀死的病菌还产生内毒素或外毒素，进而加重炎症反应甚至导致全身性炎症反应综合征(Botwinski,2001)，轻则引起动物发热、厌食、体内能量过度消耗、体组织分解，免疫力和生产性能下降，重则可能导致畜禽死亡(Botwinski,2001；Zinner,1999)。近年来大量研究表明，许多抗生素在杀死细菌的同时，也能促使内毒素即脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)从细菌细胞膜上释放出来(Holzheimer,2001；Hurley,1995)，进而导致LPS大量聚集，引起炎症反应。内毒素LPS通常由致病性大肠杆菌、沙门氏杆菌、布氏杆菌、变形杆菌、猪流感与副猪嗜血杆菌等革兰氏阴性菌的细胞崩解产生，能诱发多种机体促炎细胞因子的释放，如TNF-α、白介素6(IL-6)和IL-1β等；同时还会诱导产生大量自由基导致氧化损伤，进而降低免疫力。因此，减少或消除内毒素LPS，可以降低或消除患病动物或人的炎症反应。综上所述，目前人类和动物所用的抗生素抗感染和糖皮质激素类抗炎药都存在明显缺陷，不宜持续使用。因此，开发一种新型、安全、无副作用、环保且同时具备免疫调节、消解内毒素和抗炎功能的活性肽，对人类健康或动物绿色安全养殖具有重要的现实意义和巨大的应用前景，是抗感染策略的新突破和新理念。
免疫系统可以通过免疫防御功能来保护机体免受外来微生物的入侵，同时能够及时清除体内衰老及癌变的细胞。一方面，当免疫功能低于正常水平时，机体极易被感染并诱发恶性肿瘤等的产生，从而使患者的病情加重难以治疗；但是另一方面，当免疫反应过度时会引起动物或人体强烈的炎症反应，导致机体损伤及各生理系统功能紊乱，进而影响机体正常的代谢过程，严重者甚至危及生命。由此可见，抗炎与免疫是免疫系统功能的两个方面，密切相关，不可分割，有时甚至是相互重叠的。因此，传统医药领域中，将抗炎药和免疫增强药截然分开是不符合机体实际需要或抗炎与免疫的相互作用原理的，并且大大增加了临床选药的复杂性和拮抗性。鉴于上述情况，开发安全高效、具有双向免疫调节功能的生物制剂或药物来改善动物和人体的免疫机能具有重要意义。
抗菌肽LL-37，是相对分子质量约5000Da(道尔顿)的多肽，是迄今在人体中发现的抗菌肽(cathelicidin)家族中的唯一成员，也是人体内唯一具有双亲性α螺旋结构的抗菌肽。LL-37广泛分布在人体的血液细胞和上皮细胞中，具有中和内毒素的作用，能与LPS和CD14结合，中和LPS的生物毒性；能够介导趋化作用，招募免疫细胞到达感染部位，清除病原物；以及促进血管生成等作用，是一类研究比较成熟的抗炎肽。
人类对于免疫活性肽的研究始于1981年，Jolles等首次从人乳蛋白水解物中分离得到一种具有免疫活性的肽段。此后，科学家们进行了大量的免疫活性肽方面的研究，其中，以胸腺肽研究报道较多，也较为深入。胸腺肽Tα1具有提高T细胞、CD4T细胞亚群和CD4T/CD8T细胞比例，促进巨噬细胞转移因子(MIF)、IFN、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1、IL-6及集落刺激因子(CSF)等细胞因子的生成，以及对抗原递呈细胞等作用，是一类研究比较成熟的免疫调节肽，已经作为药剂应用于临床动物疾病治疗。
随着对抗炎肽及免疫增强肽的结构、功能与作用机理研究的不断深入，科研人员开始尝试利用蛋白质工程方法设计安全性更高、调节活性更强的双向免疫调节肽。已有研究报道通过将不同类型的多肽进行杂合是获得多功能新型多肽或将不同免疫活性肽和抗炎肽杂合获得新型免疫抗炎调节药物。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有免疫调节、中和消解内毒素和抗炎功能的杂合肽及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明在对多肽LL-37和胸腺肽Tα1的序列、结构以及序列结构与功能的关系进行大量研究的基础上，运用蛋白质分子设计技术进行多肽LL-37和胸腺肽Tα1的杂合优化，通过对杂合肽的体内外筛选和序列优化，最终获得一种新型的免疫抗炎杂合肽(immunomodulating and anti-inflammatory hybridpeptide,IAIHP)，命名为LTA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。杂合肽LTA同时具有两个母源肽的功能，即具有双向免疫调节功能：在正常或免疫抑制状态下，能够提高机体的免疫功能；在炎症或内毒素存在状态下，LTA还可中和内毒素、抑制机体炎症反应。
首先，本发明提供一种具有免疫调节、中和消解内毒素和抗炎功能的杂合肽，所述杂合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。
上述在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上进行改造获得的具有相同功能的杂合肽的衍生多肽包括但不限于如下多肽：
(1)在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端或N端添加蛋白标签序列得到的多肽，例如：在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端或N端添加含有6个His残基的His标签得到的多肽；或在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端或N端添加GST或C-Myc标签得到的多肽；
本领域技术人员应该理解，为实现易于纯化、多肽标记等目的，在多肽的两端添加标签序列是本领域的常规技术手段，并不会对多肽本身固有的功能和活性造成影响，因此，上述在如SEQ ID NO.1所示的杂合肽LTA的两端添加标签序列得到的LTA衍生物也在本发明的保护范围内。
(2)在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸序列的保守性氨基酸替换得到的多肽，例如：将第6位的Leu替换为Ile不会对多肽的功能造成太大的影响。
在如SEQ ID NO.1所示的杂合肽序列的基础上进行改造获得的具有相同功能的杂合肽的衍生多肽，仍属于本专利保护范围。
本发明还提供编码所述具有免疫调节、中和消解内毒素和抗炎功能的杂合肽的基因。
在已知杂合肽LTA的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以根据对于多肽表达的需要，基于密码子的简并性原则和不同物种对于密码子的使用偏好性，设计具有不同核苷酸序列的杂合肽LTA的编码基因。
作为本发明的一种实施方式，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。如SEQID NO.6所示的基因为根据毕赤酵母的密码子偏好性设计的杂合肽LTA编码基因。
在如SEQ ID NO.6所示的编码序列的基础上进行改造获得的编码LTA或编码与LTA具有相同功能的衍生肽的基因，仍属于本专利保护范围。
进一步地，本发明还提供含有所述杂合肽编码基因的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或宿主细胞。
所述宿主细胞包括动植物细胞或细胞系、微生物细胞。
进一步地，本发明提供所述杂合肽的制备方法，包括：将编码所述杂合肽的基因导入宿主细胞中，表达所述杂合肽。
作为优选，所述制备方法包括：将所述杂合肽LTA的编码基因与表达载体连接，构建重组表达载体，通过转基因方法，将重组表达载体导入宿主细胞，得到导入LTA编码基因的宿主细胞。
所述转基因方法包括热应激转化、电转化法、转染等。
所述宿主细胞包括但不限于动植物细胞、微生物细胞。
作为优选，所述宿主细胞为酵母，更优选为毕赤酵母。
当采用毕赤酵母作为宿主细胞时，采用经毕赤酵母密码子偏好性优化的序列如SEQ ID NO.6所示的编码基因表达所述杂合肽，具有更优的表达量。
作为本发明的一种实施方式，所述杂合肽的制备以毕赤酵母为宿主，以表达载体pPICZαA为载体，通过甲醇诱导表达杂合肽，具体包括如下步骤：
(1)将杂合肽LTA的编码基因连接至表达载体pPICZαA，构建重组表达载体；
(2)将上述重组表达载体转化至毕赤酵母GS115中，构建导入杂合肽LTA编码基因的重组工程菌；
(3)培养上述重组工程菌，添加甲醇诱导杂合肽LTA的表达；
(4)收集培养液上清，纯化获得杂合肽LTA。
本发明通过体内和体外试验证明，杂合肽LTA不仅能够提高机体正常以及免疫缺陷状态下的免疫活性，提高细胞因子的表达量，促进小鼠生长，缓解免疫缺陷对小鼠脾脏以及胸腺造成的伤害；而且能够在炎症反应过程中，抑制LPS诱导的炎症反应，降低细胞因子表达量，缓解炎症状态对小鼠体重以及肠道造成的伤害，具有良好的免疫抗炎双向调节作用。
基于上述功能，本发明提供所述杂合肽或采用所述制备方法制备得到的杂合肽或所述杂合肽的编码基因或含有所述杂合肽编码基因的生物材料在制备免疫调节制剂中的应用。
作为优选，所述免疫调节制剂为免疫增强剂。
本发明还提供所述杂合肽或采用所述制备方法制备得到的杂合肽或所述杂合肽的编码基因或含有所述杂合肽编码基因的生物材料在制备抗炎制剂或中和消解内毒素制剂中的应用。
本发明所述制剂包括药物、保健品以及食品或饲料添加剂。
上述免疫增强剂可用于包括环磷酰胺(CY)造成的机体免疫抑制反应在内的多种类型的免疫抑制的预防和治疗。
上述抗炎制剂或中和消解内毒素制剂可用于包括LPS诱导的炎症反应在内的多种炎症或内毒素血症的预防和治疗。
本发明还提供一种产品，所述产品包含所述杂合肽或包含采用所述方法制备得到的杂合肽。
所述产品为选自药物、保健品以及食品或饲料添加剂中的任意一种。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种药物组合物，包含所述杂合肽或包含采用所述杂合肽的制备方法制备得到的杂合肽。
所述药物组合物可以以所述杂合肽为有效成分或将所述杂合肽复配其它活性成分组成药物组合物的有效成分。
作为优选，所述药物组合物还包含药学领域可接收的载体或辅料。
本发明的有益效果在于：
本发明首次通过将LL-37和Tα1杂合，经优化和筛选得到免疫抗炎杂合肽LTA，多肽LTA同时具有两个母源肽的功能，即具有双向免疫调节功能，并且，与母源肽LL-37和Tα1的相应活性相比，其免疫调节活性、抗炎活性和中和消解内毒素活性更强：在正常或免疫抑制状态下，能够显著提高机体的免疫功能，保护免疫抑制对机体造成的损伤；在炎症状态下，LTA还可抑制机体炎症反应，缓解炎症反应对组织的损伤；同时LTA具有细胞毒性低、安全性高，制备方法简单、成本低廉的优势，可作为理想的免疫调节剂、抗炎剂、内毒素解毒剂，广泛用于人和动物的医药、食品、保健、饲料、营养等领域，具有巨大的应用价值。
本发明提供的杂合肽的制备方法，可实现杂合肽LTA的大量、高效制备，制得的杂合肽LTA具有双向免疫调节及中和消解内毒素和抗炎活性，且无明显毒副作用。
附图说明
图1为本发明实施例1中候选杂合肽的分子对接图，其中，A为3个候选杂合肽的分子对接3D模拟图，B为杂合肽在分子对接过程中吸收或释放的能量(正值代表吸收能量，负值代表释放能量)。
图2为本发明实施例1中重组表达载体pPICZαA-LTA的构建流程图。
图3为本发明实施例1中重组表达载体pPICZαA-LTA的PCR鉴定凝胶电泳结果，其中，M为DNA分子量标准；泳道1-4为包含多肽LTA编码基因的目的片段。
图4为本发明实施例1中纯化的毕赤酵母工程菌表达的多肽LTA的电泳和质谱检测结果，A为SDS-PAGE电泳检测结果，其中，M为蛋白质分子量标准；泳道1-2为甲醇诱导144h发酵上清液经纯化后的目的蛋白LTA的条带；B为纯化多肽LTA的质谱检测结果图。
图5为本发明实施例2中多肽LTA及其母源肽LL-37、Tα1对LPS的中和活性，其中LTA、LL-37及Tα1分别代表多肽LTA、LL-37及Tα1，PMB代表多粘菌素B。
图6为本发明实施例3中杂合肽LTA以及母源肽LL-37和Tα1对小鼠巨噬细胞的细胞存活率的影响。
图7为本发明实施例4中多肽LTA对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞因子表达量的影响；其中，A为TNF-α的表达量；B为IFN-γ的表达量；Control代表正常组，LPS代表LPS诱导炎症的模型组，LL-37代表试验组1(正常条件下加入LL-37处理)，Tα1代表试验组2(正常条件下加入Tα1处理)，LTA代表试验组3(正常条件下加入LTA处理)，LL-37+LPS代表试验组4(加入LL-37处理后用LPS诱导炎症模型)，Tα1+LPS代表试验组5(加入Tα1处理后用LPS诱导炎症模型)，LTA+LPS代表试验组6(加入LTA处理后用LPS诱导炎症模型)；*代表二者比较有显著性差异(p<0.5)，**代表二者比较有极显著性差异(p<0.01)。
图8为本发明实施例5中多肽LTA对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫调节作用；其中，A为LTA对免疫抑制小鼠体重的影响；B为LTA免疫抑制小鼠脾脏的影响；C为LTA对免疫抑制小鼠胸腺的影响；D为LTA对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响；E为LTA对小鼠细胞因子IFN-γ释放量的影响；F为LTA对小鼠细胞因子IL-6释放量的影响；Control代表空白组，CY代表模型组，LTA+CY代表试验组；*代表与空白对照组有显著性差异(p<0.5)，#代表与模型组有显著性差异(p<0.5)。
图9为本发明实施例6中多肽LTA对小鼠炎症反应的抑制作用；其中，A为LTA对小鼠体重的影响；B为LTA小鼠肠道长度的影响；C为LTA对小鼠空肠组织完整性影响；D为LTA对小鼠细胞因子IFN-γ释放量的影响；E为LTA对小鼠细胞因子IL-6释放量的影响；Control代表空白组，LPS代表模型组，LTA+LPS代表试验组；*代表与空白对照组有显著性差异(p<0.5)，#代表与模型组有显著性差异(p<0.5)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，其中，大肠杆菌感受态细胞Top 10、毕赤酵母GS115和表达载体pPICZαA均购自Invitrogen公司。
实施例1免疫抗炎杂合肽LTA的制备
1、杂合肽序列的获得
通过对多肽LL-37(序列如SEQ ID NO.2所示)和胸腺肽Tα1(序列如SEQ ID NO.3所示)的序列、结构以及序列结构与功能的关系进行研究，利用蛋白质分子设计技术进行多肽LL-37和胸腺肽Tα1的杂合，得到多条候选杂合肽。本实施例以杂合肽LTA(序列如SEQ IDNO.1所示)、Tα1-LL-37(序列如SEQ ID NO.4所示)以及LL-37-Tα1’(序列如SEQ ID NO.5所示)为例，说明免疫抗炎杂合肽LTA的筛选过程。
利用髓样分化蛋白-2(MD-2)的特性(即MD-2与TLR4结合，赋予TLR4对包括LPS在内的各种配体的反应性；而且MD-2能促进TLR4和TLR2的表达，并与TLR4在细胞内的分布密切相关；因此，MD-2不仅仅是TLR4的辅助分子，而且还是天然免疫中的调控分子，在感染、炎症、免疫等病理生理过程中具有广泛的生物学功能)，将各候选杂合肽分别与MD-2蛋白进行分子对接，根据分子对接的打分情况，初步预测各候选杂合肽的抗炎免疫效果。
候选杂合肽LTA、Tα1-LL-37以及LL-37-Tα1’的分子对接结果如图1的A所示，三种候选杂合肽与MD-2结合的能量变化情况如图1的B所示，三种候选杂合肽与MD-2结合均能释放能量，其中，杂合肽LTA释放能量最多，说明其与MD-2的结合更为稳定，具有更好的抗炎免疫活性。综合其它筛选实验结果，最终筛选得到杂合肽LTA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、重组表达载体构建
根据杂合肽LTA(简称多肽LTA)氨基酸序列和毕赤酵母密码子偏好，设计并合成多肽LTA的编码基因(序列如SEQ ID NO.6所示)，在如SEQ ID NO.6所示的LTA编码基因序列的基础上，在其C端添加His标签，将带His标签的LTA编码基因序列(序列如SEQ ID NO.7所示)与表达载体pPICZαA连接，转化至大肠杆菌Top 10感受态细胞，构建重组表达载体pPICZαA-LTA，载体构建过程如图2所示。
按照天根生化科技(免疫)有限公司质粒小提试剂盒的操作方法提取质粒，以提取的质粒作为模板进行PCR扩增LTA基因，上游引物：5′-TCGGTAAGGAATTCAAGAGA-3′；下游引物：5′-GATGATGTTCAACAACTTCC-3′。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，鉴定转化结果，如图3所示，显示扩增产物中存在LTA基因目的条带(129bp)。对重组质粒进行测序进一步鉴定目的片段的插入是否正确，并检验插入片段的保真度。经测序证实重组表达载体pPICZαA-LTA构建成功。
3、毕赤酵母感受态细胞的制备
将毕赤酵母GS115的单菌落接种于3-5ml YPD(2％胰蛋白胨，2％葡萄糖，1％酵母粉，pH 7.0)液体培养基中，于30℃振荡培养12小时左右，按1:100-1:50的体积比接种于100ml YPD液体培养基中，于30℃振荡培养至OD600为1.3-1.5左右，停止培养。将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃、1500×g离心5分钟收集菌体。向菌体中加入预冷的无菌水轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，于4℃、1500×g离心5分钟。弃去上清，加入10ml预冷的无菌山梨醇溶液(1M)，重悬菌体，即制得感受态细胞悬液。每管200μl分装成备用的毕赤酵母GS115感受态细胞，立即使用或保存于-70℃。
4、表达杂合肽LTA的毕赤酵母工程菌的构建
将上述步骤3构建得到的重组表达载体pPICZαA-LTA转化毕赤酵母GS115菌株，具体方法如下：
经线性化的重组质粒pPICZαA-LTA 5-10μg与200μl已活化毕赤酵母GS115的感受态细胞混合，移入电转杯，冰浴5-30min，冰浴后电转若干秒(电转过程中切忌振荡)，然后迅速将混合液置于冰上，迅速加入1ml冰浴的1M山梨醇溶液，使菌体悬浮并混匀转至1.5mlEP管中，置于冰上，然后加入2ml YPD液体培养基，30℃培养3h，使菌株复苏并形成抗性。待重组菌形成抗性后取200μl培养液涂布于含100μg/ml卡那霉素的YPDS平板，然后倒置平板于30℃过夜培养。挑选上述YPDS平板上长出的单菌落接种于含100μg/ml卡那霉素的YPD液体培养基中过夜培养，采用质粒小提中量试剂盒提取质粒，然后通过PCR验证鉴定阳性转化子，得到表达杂合肽LTA的毕赤酵母工程菌。
5、杂合肽LTA工程菌的诱导表达
挑选表达杂合肽LTA的毕赤酵母工程菌接种于含100μg/ml卡那霉素的BMGY培养基中，30℃、180-200rpm摇床培养至OD600为2-6时，低速离心收集菌体；用BMMY培养基重悬菌体至OD600为1，30℃、200rpm振荡培养。在振荡培养过程中，每隔24h添加甲醇至终浓度为5％进行多肽LTA的诱导表达。在甲醇诱导144h时取2ml菌液，12000rpm离心5min，收集上清后置于-20℃保存。将收集的培养上清液进行Tricine-SDS-PAGE电泳检测，电泳结果显示，培养上清液中含有多肽LTA，多肽LTA成功表达，经测定多肽LTA的表达量可达到40mg/L左右。
6、杂合肽LTA的纯化
在合成LTA的编码基因时，在其C端添加了组氨酸标签(6×His)，因此，多肽LTA可与Ni-NTA Sepharose色谱柱中的Ni2+结合，利用不同浓度咪唑洗脱液对发酵上清液进行洗脱并收集洗脱峰样品，可实现多肽LTA的分离纯化。多肽LTA的Ni-NTA Sepharose色谱柱纯化方法参照色谱柱产品使用说明，收集各洗脱峰样品，通过Tricine-SDS-PAGE电泳检测纯化效果，LTA的分子量大小为3.9kDa，结果如图4的A所示，结果表明，经纯化获得了纯度较高的多肽LTA；纯化的LTA的质谱检测结果如图4的B所示，结果表明，纯化多肽的其分子量与LTA的理论分子量一致。
实施例2杂合肽LTA对LPS的中和作用
利用无热源内毒素检查用水将多肽LTA及其母源肽LL-37、Tα1溶解稀释为不同浓度的溶液(0-64μg/mL)，分别取100μL的上述各浓度的多肽溶液与LPS(1EU/mL)混合。37℃孵育30min后，采用显色机制鲎试剂盒检测多肽LTA、LL-37、Tα1对LPS的中和率，以多粘菌素B(PMB)作为对照。结果如图5所示，多肽LTA具有较高的LPS中和活性，其LPS中和活性与多粘菌素B相当，在浓度为8μg/mL时，多肽LTA对LPS的中和率接近100％，且其中和活性显著高于其母源肽LL-37及Tα1。
实施例3杂合肽LTA对小鼠巨噬细胞细胞存活率的影响
取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7接种于96孔板中，初始细胞培养密度为1×104个/mL，每孔100μL，在37℃，5％CO2的条件下培养过夜后，分别加入一系列浓度梯度的LTA、LL-37及Tα1(0-100μg/mL)溶液，培养24h后，利用CCK8法检测多肽LTA对小鼠巨噬细胞存活率的影响。结果如图6所示，多肽LTA的细胞毒性较其母源肽LL-37显著降低，且在0-100μg/mL浓度范围内巨噬细胞的存活率大于83％，表明LTA的细胞毒性较低，具有较高的安全性。
实施例4杂合肽LTA在小鼠巨噬细胞中的免疫调节活性
将杂合肽LTA及其母源肽LL-37、Tα1用DMEM培养基稀释，配制浓度为10μg/mL的多肽溶液，检测杂合肽LTA及其母源肽LL-37、Tα1对正常状态下以及LPS诱导的炎症状态下的小鼠巨噬细胞RAW264.7的TNF-α、IFN-γ等细胞因子分泌的影响。分别设置正常组(Control)、模型组(LPS)、试验组1(LL-37)、试验组2(Tα1)试验组3(LTA)和试验组4(LL-37+LPS)、试验组5(Tα1+LPS)、试验组6(LTA+LPS)其中，正常组不做任何处理；试验组1、2、3分别在细胞过夜培养后加入终浓度为10μg/mL LL-37、Tα1或LTA溶液；试验组4、5、6分别在细胞过夜培养后加入终浓度为10μg/mL LL-37、Tα1或LTA溶液，一小时后，模型组与试验组4、5、6加入终浓度为100ng/mL的LPS溶液。采用ELISA方法检测细胞因子TNF-α和IFN-γ，结果如图7所示，在正常状态下，杂合肽LTA可显著小鼠巨噬细胞的细胞因子TNF-α(图7的A)、IFN-γ(图7的B)的表达量，且LTA组巨噬细胞细胞因子TNF-α、IFN-γ的表达量显著高于LL-37组和Tα1组；但与此同时，当细胞处于LPS诱导的炎症状态时，LTA又能够显著抑制TNF-α(图7的A)、IFN-γ(图7的B)细胞因子的表达，且抑制效果优于其母源肽LL-37和Tα1。由此说明，多肽LTA具有双向免疫调节作用，既可增强细胞正常状态下的免疫活性，也能抑制炎症状态下细胞的炎症反应，且其免疫抗炎效果均优于其母源肽LL-37和Tα1。
实施例5杂合肽LTA对免疫抑制小鼠的免疫调节作用
本实施例采用C57BL/6系雄性小鼠(体重20～22g，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司)进行动物实验，整个实验过程都参照欧洲实验动物伦理委员会的指导原则(86/609/EEC)，并且获得中国农业大学实验动物伦理委员会的许可。动物饲养环境为清洁级，环境温度22±2℃，湿度50％～55％，8:00～20:00光照。小鼠每笼6～8只饲养，可自由摄食饮水。
1、多肽LTA对免疫抑制小鼠的体重及免疫器官重量的影响
取36只健康雄性小鼠随机分为3组，每组12只。分为空白组(Control)：生理盐水；模型组(CY)：注射环磷酰胺CY(100mg/kg)；试验组(LTA+CY)：注射LTA(10mg/kg)和环磷酰胺CY(100mg/kg)。
对试验组小鼠进行腹腔注射给药多肽LTA(给药剂量为10mg/kg)，连续14天，每天一次，空白组和模型组给予相应体积的生理盐水。自给药的第8天开始，对模型组和试验组小鼠进行腹腔注射环磷酰胺100mg/kg，空白组给予等量生理盐水，隔天注射，共注射4次，制备免疫功能低下的动物模型。末次给药后，将小鼠颈椎脱臼处死，记录小鼠体重，取脾脏及胸腺并分别称其湿重，计算小鼠脾脏指数与胸腺指数(脾脏指数＝小鼠脾重/体重。胸腺指数＝小鼠胸腺重量/体重)。结果如图8的A、B和C所示，结果表明，模型组小鼠的体重、脾脏指数和胸腺指数均比空白组显著降低，说明环磷酰胺可抑制小鼠生长，降低免疫器官指数，抑制免疫；而试验组小鼠的体重、脾脏指数与胸腺指数均恢复到空白组的正常水平，说明多肽LTA可促进免疫功能低下小鼠的生长，并对免疫功能低下小鼠的免疫器官具有保护作用。
2、多肽LTA对免疫抑制小鼠的巨噬细胞吞噬活性的影响
取36只健康雄性小鼠随机分为3组，每组12只。分为空白组：生理盐水；模型组：注射环磷酰胺CY(100mg/kg)；试验组：注射LTA(10mg/kg)和环磷酰胺CY(100mg/kg)。
空白组、模型组和试验组的给药方式同上述1中所述，在末次给药24h后，将小鼠采血处死后，分别在75％的乙醇中浸泡5-10s，注射4mL添加肝素的RPMI1640于腹腔内，离心洗出液，弃上清，分离得到腹腔巨噬细胞。向沉淀中加入0.5mL含10％胎牛血清的RPMI1640重悬，将细胞浓度调整5×106个/mL，接种于96孔板中，在37℃、5％CO2环境下培养3h后，弃上清，加入中性红生理盐水溶液，10min后裂解细胞，在540nm波长下检测其吸光度。实验结果如图8的D所示，结果表明，与空白组相比，模型组的中性红细胞吞噬率显著降低，环磷酰胺可抑制小鼠巨噬细胞的吞噬活性，而加入LTA可恢复免疫功能低下小鼠的巨噬细胞的吞噬活性，进而加强免疫功能低下的小鼠的机体固有性免疫。
(3)多肽LTA对免疫抑制小鼠的细胞因子释放量的影响
取36只健康雄性小鼠随机分为3组，每组12只。分为空白组：生理盐水；模型组：注射环磷酰胺CY(100mg/kg)；试验组：注射LTA(10mg/kg)和环磷酰胺CY(100mg/kg)。
空白组、模型组和试验组的给药方式同上述1中所述，在末次给药24h后，眼球取血，分离血清，采用ELISA法检测小鼠血清中细胞因子(IFN-γ、IL-6)的含量。实验结果如图8的E和F所示，结果表明，与空白组相比，模型组小鼠的细胞因子(IFN-γ、IL-6)的含量显著降低；而给药多肽LTA可显著提高免疫抑制小鼠血清中的细胞因子(IFN-γ、IL-6)的含量，进而提高免疫功能低下小鼠的免疫活性。
实施例6杂合肽LTA对炎症状态小鼠的抗炎作用
本实施例采用C57BL/6系雄性小鼠(体重20～22g，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司)进行动物实验，整个试验过程都参照欧洲实验动物伦理委员会的指导原则(86/609/EEC)，并且获得中国农业大学实验动物伦理委员会的许可。动物饲养环境为清洁级，环境温度22±2℃，湿度50％～55％，8:00～20:00光照。小鼠每笼6～8只饲养，可自用摄食饮水。
1、多肽LTA对炎症状态小鼠的体重及肠道的影响
取36只健康雄性小鼠随机分为3组，每组12只。分为空白组(Control)：生理盐水；模型组(LPS)：LPS(10mg/kg)；试验组(LTA+LPS)：LTA(10mg/kg)、LPS(10mg/kg)。
对试验组小鼠进行腹腔注射给药多肽LTA(给药剂量为10mg/kg)，连续7天，每天一次，对空白组及模型组小鼠给予相应体积的生理盐水。在末次给药1h后，对模型组和试验组小鼠进行腹腔注射LPS(10mg/kg)，空白组给予等量生理盐水，6h后小鼠颈椎脱臼处死，记录小鼠的体重和肠道长度，取小鼠空肠进行H&E染色切片观察。实验结果如图9的A、B和C所示，结果表明，模型组小鼠的体重和肠道长度均比空白组显著降低，并且通过切片观察发现模型组的肠绒毛形态受损，同时粘膜下层出现明显的水肿现象，说明LPS诱导的炎症反应会导致小鼠体重下降，肠道萎缩、损伤；而试验组小鼠的体重和肠道长度恢复到空白组的正常水平，肠绒毛形态，以及水肿现象均有明显改善，说明多肽LTA可保护LPS诱导的炎症反应对小鼠体重及肠道造成的损伤。
2、多肽LTA对炎症状态小鼠的细胞因子表达量的影响
取36只健康雄性小鼠随机分为3组，每组12只。分为空白组：生理盐水；模型组：LPS(10mg/kg)；试验组：LTA(10mg/kg)、LPS(10mg/kg)。
空白组、模型组和试验组的给药方式同上述1中所述，在末次给药1h后，对模型组和试验组小鼠进行腹腔注射LPS(10mg/kg)，空白组给予等量生理盐水，6h后眼球取血，分离血清，采用ELISA法检测小鼠血清中细胞因子(IFN-γ、IL-6)的含量。实验结果如图9的D、E所示，结果表明，与空白组相比，模型组小鼠的细胞因子(IFN-γ、IL-6)含量显著升高；而试验组给药多肽LTA可显著抑制LPS诱导的细胞因子(IFN-γ、IL-6)的表达量，进而抑制炎症反应。
综上所述，杂合肽LTA具有双向免疫调节作用。一方面，LTA能够增强正常状态或免疫功能抑制状态下机体的免疫活性，促进机体固有免疫方面巨噬细胞对异物的吞噬能力，提高细胞因子的表达量，保护免疫抑制对机体造成的损伤。因此，多肽LTA可以用于防治由于免疫防御与免疫监视功能低下引起的感染。
另一方面，多肽LTA可抑制机体炎症反应，降低炎症状态下细胞因子的释放量，缓解炎症反应对动物及人的肠道等组织的损伤。因此，多肽LTA又可用于炎症性疾病(如肠炎等)的治疗。
此外，本发明也进行了多肽LTA的衍生物，如末端酰胺化的LTA以及对第6位氨基酸进行相应替换后的LTA的功能实验，结果表明，多肽LTA的上述衍生物也同样具有与多肽LTA相似的免疫抗炎双向调节功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种具有免疫调节、中和消解内毒素和抗炎功能的杂合肽及其制备方法与应用
<130> KHP191110421.0
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu
1 5 10 15
Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Lys Gly Lys Lys Glu Val Val Glu
20 25 30
<210> 2
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu
1 5 10 15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
20 25 30
Pro Arg Thr Glu Ser
35
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu
1 5 10 15
Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn
20 25
<210> 4
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Lys Lys Glu Val Val Glu Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val
1 5 10 15
Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Lys
20 25 30
<210> 5
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu
1 5 10 15
Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Lys Glu Val Val Glu Lys Lys Gly
20 25 30
<210> 6
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcggtaagg aattcaagag aatcgttcaa agaatcaagg acttcttgag aaacttggtt 60
ccaagaactg aaaaggaaaa gaaggaagtt gttgaa 96
<210> 7
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtaccatcg gtaaggaatt caagagaatc gttcaaagaa tcaaggactt cttgagaaac 60
ttggttccaa gaactgaaaa ggaaaagaag gaagttgttg aacatcatca tcatcatcat 120
tgatctaga 129
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcggtaagga attcaagaga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatgatgttc aacaacttcc 20
Claims (11)
1.一种具有免疫调节、中和消解内毒素和抗炎功能的杂合肽，其特征在于，所述杂合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述杂合肽的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或宿主细胞。
5.制备权利要求1所述杂合肽的方法，其特征在于，包括：将权利要求2或3所述的基因导入宿主细胞中，表达所述杂合肽。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为酵母。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母。
8.权利要求1所述杂合肽或采用权利要求5～7任一项所述方法制备得到的杂合肽或权利要求2或3所述基因或权利要求4所述生物材料在制备免疫调节制剂中的应用。
9.权利要求1所述的杂合肽或采用权利要求5～7任一项所述方法制备得到的杂合肽或权利要求2或3所述基因或权利要求4所述生物材料在制备抗炎制剂或中和消解内毒素制剂中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述制剂为药物、保健品、食品或饲料添加剂。
11.一种产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1所述杂合肽或包含采用权利要求5～7任一项所述方法制备得到的杂合肽；
所述产品为选自药物、保健品、食品或饲料添加剂中的任意一种。
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| CN111944059B (zh) * | 2020-07-28 | 2022-03-01 | 中国农业大学 | 一种兼具抗菌、免疫调节、抗感染和抗炎活性的多功能杂合肽及其制备方法和应用 |
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| CN111944060B (zh) * | 2020-07-29 | 2022-02-25 | 中国农业大学 | 一种兼具抗菌、抗炎、解毒活性的多功能杂合肽及其应用 |
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2019
- 2019-04-03 CN CN201910264950.8A patent/CN110066342B/zh active Active
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| 杂合抗菌肽设计及生物学活性的研究进展;武如娟，张日俊;《中国生物工程杂志》;20130915;第33卷(第9期);全文 * |
Also Published As
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|---|---|
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