CN104017084A

CN104017084A - 杂合抗菌抗病毒多肽、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN104017084A
Application number: CN201410191241.9A
Authority: CN
Inventors: 张日俊; 黄燕; 武如娟; 卫旭彪; 赵龙妹; 郑昭君; 商婷婷; 刘旭辉; 马广
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-05-07
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2014-09-03

Abstract

本发明提供一种新型的杂合抗菌抗病毒多肽，所述多肽的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和2所示。通过将编码所述多肽的基因克隆至表达载体pETSUMO，得到重组表达载体，然后通过热应激法转化入大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达，表达产物经SUMO蛋白酶酶切后经Ni-NTA Sepharose色谱柱纯化，分离获得目标多肽。所述多肽在体外对多种细菌、病毒均具有抑杀作用，且不易产生抗性，可作为理想的抗生素替代品和人畜生物性药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂等。

Description

杂合抗菌抗病毒多肽、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程及生物制药领域，具体地说，涉及一种新型的杂合抗菌抗病毒多肽、其制备方法及应用。

背景技术

抗生素对于控制、预防和治疗各种感染性疾病具有重要作用。由于抗生素的使用，到20世纪80年代，人类几乎可以征服所有的感染类疾病，然而，随着时间的推移以及抗生素的滥用，耐药菌株愈来愈多。有监测发现，最具代表性的耐药菌株当中，耐药的葡萄球菌已上升至40％；耐药的凝固酶阴性葡萄球菌则超过77％。现在，已经出现了能对抗所有抗生素的耐药菌，抗生素耐药问题已严重威胁到人类的健康。解除耐药菌对人类健康日益严重的威胁成为亟待解决的问题，因此新一类抗微生物物质的发现和研制已经成为国际上研究的热点。

抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs)是由生物细胞特定基因编码，经特定外界条件诱导产生的一类分子量较小的活性多肽，一般由20～60个氨基酸残基组成，具有抗细菌、真菌、病毒、肿瘤、内毒素和原生动物的作用，并且具有刺激单核细胞和嗜中性粒细胞的趋化，促进创伤愈合等生物学活性。自上世纪70年代末Boman等首次从惜古比天蚕中发现天蚕素以来，抗菌肽因其独特的杀菌机制和优良的理化性质吸引了越来越多专家学者的关注，并已成为安全绿色抗生素添加剂替代品的理想选择，在畜牧业生产中具有广阔的应用前景。

蜂毒素(又称蜂毒溶血肽，Melittin，缩写ME)由26个氨基酸组成，相对分子质量2984道尔顿，不含二硫键，是蜂毒中的主要活性物质，具有抗菌、抗辐射和非常显著的抗炎镇痛作用。蜂毒素能够抑制20～30种革兰氏阴性及革兰氏阳性病原微生物的繁育，并能对抗对青霉素有耐药性的金黄色葡萄球菌。蜂毒素是迄今为止人类发现的抗炎活性最强的物质之一，其抗炎活性是氢化可的松的100倍。但溶血性严重，不能单独作为药物使用，因此需要将它与其他抗菌肽组合成新杂合肽使用。LL-37，相对分子质量约5000道尔顿，是迄今在人体中发现的抗菌肽(cathelicidin)家族中的唯一成员，也是人体内唯一具有双亲性α螺旋结构的抗菌肽。其广泛分布在人体的血液细胞和上皮细胞中，具有广谱抗菌作用。抗菌活性依赖其螺旋构象的形成，通过“地毯样”机制杀灭细菌。此外，LL-37还具有中和内毒素的作用，能与LPS和CD14结合，中和LPS的生物活性；利用FPRL1作为受体介导趋化作用，招募免疫细胞到感染部位，清除病原物；促进血管生成等作用。

随着对抗菌肽结构、功能与杀菌机理研究的深入，研究人员开始尝试利用生物学方法设计杀菌活力更强、抗菌谱更广的新型抗菌肽。很多研究报道，将不同抗菌肽分子杂合是获得高抗菌活性低溶血性的新型抗菌肽分子的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的杂合抗菌抗病毒多肽、其制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明人在对蜂毒素和LL-37的序列、结构分析的基础上，进行杂合优化，获得一种新型的杂合抗菌抗病毒多肽，与母源肽(蜂毒素和LL-37)相比，除了具有更强抗菌作用外，还有抗病毒作用。所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

例如，将第6位的Leu替换为Ile，或者在其末端缺失Leu Arg Asn三个氨基酸。因此，本发明的杂合抗菌抗病毒多肽还包括SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等功能的由SEQ ID No.1衍生的多肽。为便于表述，将该多肽命名为M-L。

本发明还提供编码所述杂合抗菌抗病毒多肽的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明还提供含有编码多肽M-L基因的载体。

本发明还提供含有编码多肽M-L基因、或上述载体的宿主细胞、转基因细胞系及工程菌。

可将编码多肽M-L的基因与表达载体可操作地连接，构建得到能够表达多肽M-L的重组表达载体，进而可以通过诸如热应激和电转化法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主细胞，得到转M-L基因的转化体，例如基因工程菌。

本发明还提供制备所述多肽M-L的方法，将构建的表达载体转化宿主菌，筛选阳性克隆，诱导表达目标多肽，并分离纯化表达产物。

例如，将编码多肽M-L的基因克隆至表达载体pETSUMO，得到重组表达载体pETSUMO-M-L，通过热应激法转化入大肠杆菌BL21中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，表达产物经SUMO蛋白酶酶切后经Ni-NTA Sepharose色谱柱纯化，分离获得目标多肽。

具体地，制备所述杂合抗菌抗病毒多肽的方法包括如下步骤：

1、重组大肠杆菌表达载体的构建：根据多肽M-L氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏好性，设计M-L基因序列，通过TA克隆与pETSUMO相连。转化大肠杆菌Mach1^TM-T1^R，卡那霉素筛选阳性克隆子，构建该多肽的大肠杆菌表达载体pETSUMO-M-L。提取质粒，用特异性引物进行PCR验证，验证正确后进行测序鉴定。证实该杂合抗菌抗病毒多肽大肠杆菌表达载体pETSUMO-M-L构建成功。

2、大肠杆菌的转化及筛选：重组质粒2μl与200μl已活化大肠杆菌BL21感受态细胞混合，冰浴5-30 min，冰浴后42℃水浴热击30s(热击过程中切忌振荡)，然后迅速将混合液置于冰上，迅速加入250μl室温的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养1h；培养后取200μl培养液涂布含50μg/ml卡那霉素的LB平板，然后倒置平板于37℃过夜培养。

随机挑取生长出的大肠杆菌菌落于LB培养，按照LifeTechnologies公司质粒提取试剂盒的操作方法提取重组质粒，并以其为模板进行PCR扩增SUMO-M-L基因，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外光下可见约110bp大小的明显条带，与SUMO-M-L基因的核苷酸序列大小一致，证明大肠杆菌高效表达菌株建立成功。

3、诱导表达：挑选阳性克隆，接种于含50μg/ml卡那霉素和1％葡萄糖的LB培养基中，37℃、180-200rpm摇床培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8时，加入IPTG溶液至终浓度1.5-2.0mM，继续培养，12000rpm离心5min，弃上清后-20℃保存。以未经诱导的菌液作为阴性对照。

表达上清液于12000rpm离心10min收集菌体，根据菌体量加入约5倍体积的裂解缓冲液重悬细胞，吹打均匀，静置10min后，冰浴条件下超声破碎仪破碎菌体，破碎程序为：工作时长2s、间歇时长6s，共40个循环，功率240w。破碎后，12000rmp、4℃离心5min，收集上清液进行Tricine-SDS-PAGE电泳，电泳结果显示出有融合蛋白表达，经测定融合蛋白表达量可达到165mg/L左右。

4、融合蛋白的纯化：融合蛋白经Ni-NTA Sepharose色谱柱纯化，收集各洗脱峰样品，Tricine-SDS-PAGE检测纯化效果。

5、融合蛋白酶切及目的蛋白的纯化：将洗脱峰样品在4℃、150mM NaCl溶液中透析12-24h，为加快透析速度可多次更换透析液。透析完成后，进行酶切反应，30℃酶切3h，电泳检测切割效果。

酶切反应体系：

酶切后，切下的融合标签以及未经酶切的融合蛋白因带有组氨酸标签可与Ni-NTA Sepharose色谱柱结合，而不带有组氨酸标签的重组杂合肽M-L则可以穿过层析柱。直接取镍柱穿透峰进行Tricine-SDS-PAGE，电泳结果显示有目的蛋白表达，经测定重组蛋白量可达到23mg/L左右。

以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、縢牒八联球菌作为指示菌，结果发现该多肽对这些菌均具有杀灭作用，此外，通过测定表明本发明多肽对病毒、常见细菌均有较强的抑制作用，可研制出新型高效抗生素替代品。本发明的多肽可用于制备抗菌药物、抗病毒药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂等。进而本发明还提供一种含有有效剂量的本发明多肽M-L的抗菌药物、抗病毒药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂等。

所述多肽M-L对包括但不限于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、八叠球菌、大肠杆菌、梭状芽孢杆菌、酵母、海洋红酵母、米曲霉、蜡状芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、格氏链球菌、嗜热链球菌、牛链球菌、炭疽杆菌、伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、宋内氏痢疾杆菌、霍乱弧菌、肺炎杆菌等在内的微生物具有抗菌效果；对包括但不限于流感病毒、蓝耳病病毒等在内的病毒具有抗病毒效果。

本发明首次将ME和LL-37杂合，得到的多肽M-L有望提高抑菌效果，且大大降低了毒性和溶血性，成为理想的抗生素替代品，具有巨大的应用价值。

采用本发明方法可以大量、高效地制备所述杂合抗菌抗病毒多肽，所制得的抗生素替代品具有广谱抗菌、抗病毒的生物学特性，且不易产生耐药性。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组表达载体pETSUMO-M-L的构建流程图。

图2为本发明实施例1中IPTG诱导表达SUMO-M-L融合蛋白Tricine-SDS-PAGE的电泳图；其中，1：蛋白质分子量标准；2：未诱导菌体破碎上清液；3-6：IPTG诱导1h、2h、3h、4h后菌体破碎上清液。

图3为本发明实施例1中纯化后的SUMO-M-L融合蛋白和酶切纯化后的重组抗菌肽M-L Tricine的SDS-PAGE电泳图；其中，1：纯化后的融合蛋白SUMO-M-L；M：蛋白质分子量标准；2：酶切纯化后的目的蛋白M-L条带。

图4为本发明实施例1中杂合多肽M-L的分子量测定结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1杂合抗菌抗病毒多肽M-L的制备

大肠杆菌Mach1^TM-T1^R、大肠杆菌BL21和表达载体pETSUMO(货号：inv-k300-01)均购自Invitrogen公司。

大肠杆菌Mach1^TM-T1^R和BL21单菌落接种于3-5ml LB(1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠)液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，按1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD₆₀₀＝0.5左右。将该菌悬液按1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD₆₀₀＝0.5左右时，停止培养。将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟收集菌体。向菌体中加入预冷的0.05mol/L CaCl₂溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，于4℃3000g离心10分钟。弃去上清，加入4ml预冷含15％甘油的0.05mol/L CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即制成感受态细胞悬液。按每管200μl的量分装成备用的大肠杆菌感受态细胞，立即使用或保存于-70℃。

根据多肽M-L氨基酸序列(SEQ ID No.1)和大肠杆菌密码子偏好，设计M-L基因序列(SEQ ID No.2)，并通过人工合成。通过TA克隆与表达载体pETSUMO相连(图1)，通过热应激方法转化大肠杆菌Mach1^TM-T1^R，构建该多肽的大肠杆菌重组表达载体pETSUMO-M-L按照天根生化科技(北京)有限公司质粒小提试剂盒的操作方法提取重组质粒，并以其为模板进行PCR扩增M-L基因，上游引物:5′-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3′；下游引物：5′-TAGTTATTCTCAGCGGTGG-3′，紫外灯下观察，鉴定转化结果，显示有目的条带存在。测序进一步鉴定目的片段的插入是否正确，并检验插入片段的保真度。经检验证实该抗菌多肽大肠杆菌重组表达载体pETSUMO-M-L构建成功。

将阳性克隆中提取的质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21，方法如下：

重组质粒2μl与200μl已活化大肠杆菌BL21感受态细胞混合，冰浴5-30min，冰浴后42℃水浴热击30s(热击过程中切忌振荡)，然后迅速将混合液置于冰上，迅速加入250μl室温的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养1h；培养后取200μl培养液涂布含50μg/ml卡那霉素的LB平板，然后倒置平板于37℃过夜培养。

转化产物涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB平板进行筛选。挑选转化成功的菌落至含50μg/ml卡那霉素和1％葡萄糖的LB培养基，180rpm、37℃培养至对数期(OD₆₀₀＝0.6-0.8)；然后，向菌液中加入IPTG溶液至终浓度1.5mM诱导融合蛋白的表达，在加入IPTG后的0、1、2、3、4h取1ml菌液，12000rpm离心5min，弃上清后-20℃保存。根据菌体量加入约5倍体积的裂解缓冲液重悬细胞，吹打均匀，静置10min后，冰浴条件下超声破碎仪破碎菌体，破碎程序为：工作时长2s、间歇时长6s，共40个循环，功率240w。菌体破碎后，12000rmp、4℃离心5min，收集上清。将上清液与2×蛋白上样缓冲液等体积混合，沸水浴5min，进行Tricine-SDS-PAGE(图2)。电泳显示有融合蛋白表达，经测定蛋白量可达到165mg/L左右。

由于所使用的SUMO蛋白标签上带有组氨酸标签组氨酸标签(6×His)，可与Ni-NTA Sepharose色谱柱中Ni离子结合，并可被洗脱液洗脱下来，因此可用于带此标签蛋白的分离纯化。融合蛋白的Ni-NTA Sepharose色谱柱纯化方法参照产品使用说明，收集各洗脱峰样品，通过Tricine-SDS-PAGE电泳检测纯化效果(图3)。

将洗脱下来经电泳检测确认的融合蛋白在4℃、150mM NaCl溶液中透析12h，为加快透析速度可多次更换透析液。透析后的融合蛋白经SUMO蛋白酶在30℃恒温水浴箱中酶切(酶切反应体系见下)3h后，即可得到目的蛋白和SUMO标签，后者可以与Ni-NTA Sepharose色谱柱中的Ni离子结合，从而使重组目的蛋白直接穿过镍柱留在穿透峰里。穿透峰在4℃、150mM NaCl溶液中透析12h，为加快透析速度可多次更换透析液。透析完成后，进行Tricine-SDS-PAGE验证，以及蛋白分子量测定。Tricine-SDS-PAGE电泳结果显示90％的目的蛋白成功纯化(图3)，分子量结果显示重组蛋白分子量为3059.92Da(图4)。

酶切反应体系：

实施例2多肽M-L的热稳定性试验

取纯化后的重组蛋白各1ml分别置于40℃、60℃、80℃和100℃水浴条件下分别处理10、20、30min，用未处理的重组蛋白作为对照，以标准金黄色葡萄球菌为指示菌，用抑菌圈直径法测定处理前后样品的抑菌效果。实验重复3次，取其平均值作为测定结果。(表1)

表1加热处理后重组目的蛋白M-L对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径

注：对照为未经加热处理重组目的蛋白的抑菌圈直径。

表1结果表明，经过不同加热温度和时间的处理，对重组目的蛋白抑菌效果的影响是不同的，当加热温度不超过60℃时，随着加热时间的延长，其抑菌圈直径基本没有变化；当加热温度升高至80-100℃，其抑菌圈直径随温度增加和时间延长略有缩小，但仍表现出一定的抑菌效果。

实施例3多肽M-L对常见细菌的抑制作用

将经过干热灭菌(160℃，2h)的滤纸片(直径6mm)，置于重组目的蛋白溶液(32μg/ml)中充分浸泡24h，用无菌涂布器蘸取供试菌液，均匀地涂在培养基的表面制成含菌平板，取出经充分浸泡的滤纸片贴在含菌平板上，每一培养皿贴1片，置于37℃的恒温培养箱中培养24h，观察并测量抑菌圈的直径。(表2)

表2重组目的蛋白对各常见细菌的抑菌圈直径

细菌名称	重组目的蛋白的抑菌圈直径(mm)
		金黄色葡萄球菌(CVCC实验室保藏)	9.0
金黄色葡萄球菌(CICC10001)	18.4
		金黄色葡萄球菌(CVCC1885)	19.2
八叠球菌(CVCC实验室保藏)	9.8
		大肠杆菌(CVCC195)	17.2
大肠杆菌(CVCC222)	17.7

大肠杆菌(CICC1.907)	16.1
		梭状芽孢杆菌(CICC20464)	18.3
酵母(CICC2.120)	14.7
		酵母(本实验室分离保藏)	12.3
海洋红酵母(CICC)	18.9
		酵母(实验室分离保藏NM6)	16.6
米曲霉(CICC3.482)	11.1
		蜡状芽孢杆菌(CICC10024)	19.7
蜡状芽孢杆菌(CICC10041)	18.6
		嗜热脂肪芽孢杆菌(CICC10091)	17.1
格氏链球菌(CICC1.2496)	19.4
		嗜热链球菌(CICC1.2471)	18.9
牛链球菌(CICC1.1624)	18.4
		炭疽杆菌(CVCC实验室保藏)	9.9
枯草杆菌(CVCC实验室保藏)	8.0
		伤寒杆菌(CVCC实验室保藏)	12.5
鼠伤寒杆菌(CVCC实验室保藏)	13.9
		宋内氏痢疾杆菌(CVCC实验室保藏)	11.0
霍乱弧菌(CVCC实验室保藏)	12.9
		肺炎杆菌(CVCC实验室保藏)	11.5

从表2可以看出，抗菌多肽对各菌株均有不同程度的抑菌效果。

实施例4多肽M-L对病毒的抑制作用

1、药物细胞毒性实验(LD0测定)

对多肽M-L进行2倍浓度梯度稀释，共8个稀释度，即100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0.782μg/ml。取各稀释度液体0.2ml加入细胞管中(各稀释度3管)，37℃培养7天，观察Marc-145细胞病变。结果：多肽M-L第2管(1/4)至第8管(1/256)未出现病变，故LD0＝100。

2、病毒感染量滴定(TCID50测定)

(1)流感病毒10倍稀释，共3个稀释度，即10^-1、10^-2、10^-3。各稀释度病毒液0.2ml加入细胞管中(每稀释度5管)，37℃培养7天，观察Marc-145细胞病变。按Reed-Muench法计算结果：TCID50＝10^-5.8。

(2)蓝耳病病毒10倍稀释，共3个稀释度，即10^-1、10^-2、10^-3。每稀释度病毒液0.2ml加入细胞管中(各稀释度5管)，37℃孵育1h后吸去病毒液，hand’s液洗3遍，加入维持液，37℃培养7天，观察Marc-145细胞病变。按Reed-Muench法计算结果：TCID50＝10^-4.5。

通过耐高温实验、攻毒保护试验、抑菌实验、抗病毒实验等表明，本发明的杂合抗菌抗病毒多肽M-L是一种稳定的广谱抗菌肽，而且对革兰氏阳性菌具有较强的杀伤力，这可能是由抗菌肽的种类和特性决定的。同时，抗菌多肽虽然具有广谱抗菌活性，但它对于不同的微生物甚至同种菌不同株，在杀伤效率上可能存在差异。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种杂合抗菌抗病毒多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述多肽的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因，或权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.制备权利要求1所述多肽的方法，其特征在于，将权利要求4所述的载体转化宿主菌，筛选阳性克隆，诱导表达目标多肽，并分离纯化表达产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将权利要求3所述基因克隆至表达载体pET-SUMO，得到重组表达载体pETSUMO-M-L，通过热应激法转化入大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达，表达产物经SUMO蛋白酶酶切后经Ni-NTA Sepharose色谱柱纯化，分离获得目标多肽。

8.权利要求1所述多肽在制备抗菌药物、抗病毒药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述多肽对包括但不限于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、八叠球菌、大肠杆菌、梭状芽孢杆菌、酵母、海洋红酵母、米曲霉、蜡状芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、格氏链球菌、嗜热链球菌、牛链球菌、炭疽杆菌、伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、宋内氏痢疾杆菌、霍乱弧菌、肺炎杆菌在内的微生物具有抗菌效果；对包括但不限于流感病毒、蓝耳病病毒在内的病毒具有抗病毒效果。

10.含有权利要求1所述1多肽的抗菌药物、抗病毒药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂。