CN106754849A - 一种多功能裂解酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及属于生物工程领域，特别涉及一种多功能裂解酶及其作为抗菌物质在防治奶牛乳房炎及食品中控制金黄色葡萄球菌及单核细胞增生性李斯特菌的污染的应用；一种多功能裂解酶，其特征在于其氨基酸序列为Seq ID NO 2。利用生物工程技术开发能够高效杀灭金黄色葡萄球菌及单核细胞增生性李斯特菌的酶制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性的灭活金黄色葡萄球菌，为目前防治奶牛乳房炎及控制食品中金黄色葡萄球菌及单核细胞增生性李斯特菌污染提供一种安全、无毒副作用的酶制剂来源。

Description

一种多功能裂解酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及属于生物工程领域，特别涉及一种多功能裂解酶及其作为抗菌物质在控制金黄色葡萄球菌及单核细胞增生性李斯特菌的污染的应用。

背景技术

奶牛乳房炎不仅给世界乳品工业带来巨大的经济损失，而且还危害到公共卫生和人类健康。引起奶牛乳房炎的主要原因是病原微生物感染，其中以金黄色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)、链球菌和大肠杆菌为主，约占奶牛乳房炎病例的90％以上。奶牛乳房炎最直接的治疗途径是使用抗生素，但治疗过程中乳汁会残留抗生素，从而会对人体产生一定的危害，更为严重的是，病原会因抗生素的长期摄入及高效量的滥用产生耐药毒力株。目前更多的途径是防治奶乳房炎的发生，防重于治，从而有利于养殖业的高速发展。

李斯特菌(Listeria)是一种能够引起动物和人李斯特菌病的革兰氏阳性细菌，其中单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是最重要的食源性人兽共患病原菌，主要表现为胃肠炎、败血症、脑膜脑炎和流产等，死亡率高达25-30％。在自然界中，Lm通常存在于土壤、河水、植物、屠宰场废弃物及动物源食品中(肉、奶及其制品、海产品等)，且与大多数人源病原菌不同的是Lm在低温环境中仍可生长繁殖(如2～8℃)，是冷藏食品以及即食(Ready-To-Eat,RTE)食品中威胁人类健康的重要病原菌之一。目前在牛奶以及多种即食性食品中均检测到李斯特菌，其在食品中的污染令人堪忧，且新分离的病原不仅耐药且对食品中是化学消毒剂均产生一定耐受性，如何有效的控制李斯特菌的污染已成为食品安全中的重大课题。

噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，又称细菌病毒。裂解性噬菌体感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之裂解，故又称毒性噬菌体。裂解酶是双链DNA噬菌体所特有的，是在感染宿主晚期由噬菌体表达的一类肽糖水解酶，该酶通过水解细菌细胞壁肽糖上糖与肽间的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连键最终使宿主细胞裂解。溶壁酶不仅特异性作用于宿主，且作用时间短，作用谱较噬菌体广。裂解酶具有高效、特异且不产生抗性等特点，目前在食品及医药行业已有成功应用的报道。在食品中，由于裂解酶能够作为抗菌剂来控制细菌污染，且作用快、无残留、无副作用，具有广泛的开发和应用价值。

发明内容

发明目的

本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码一种多功能裂解酶。

技术方案

一种多功能裂解酶，其特征在于其氨基酸序列为Seq ID NO.2。

一种多功能裂解酶的编码基因，其特征在于其核苷酸序列为Seq ID NO.1。

一种表达多功能裂解酶的制备方法，

具体步骤如下：

1)合成具有金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶酰胺酶活性的N端序列NO.3，合成具有金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶结合功能的SH3b NO.4，从李斯特菌噬菌体裂解酶序列中获得能够结合细胞壁的C端结合结构域序列NO.5，对三段序列进行连接获得重构酶片段；

2)构建表达多功能裂解酶的重组表达载体；

3)将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选得到表达多功能裂解酶的工程菌；

4)异丙基1-1硫代-β呋喃半乳糖苷诱导表达，获得重组基因表达产物；

5)将重组基因表达产物，经镍柱亲和层析纯化分离，得到重组的多功能裂解酶；

6)将纯化的多功能裂解酶产物经去毒素试剂盒进行去毒处理即≤0.01EU/μg内毒素。

所述的一种多功能裂解酶在用于消毒挤奶器具后控制奶牛养殖过程中奶牛乳房炎的发生及牛乳中金黄色葡萄球和单核细胞增生性李斯特菌污染控制的应用。

所述的一种多功能裂解酶在制备同时抑制金黄色葡萄球菌及单核细胞增生性李斯特菌污染或过度生长药物的应用。

所述的一种多功能裂解酶在制备抑制金黄色葡萄球和单核细胞增生性李斯特菌污染或过度生长药物应用，其特征在于所述的食品为由肉类，或蛋类，或奶制品，或粮食，或蔬菜，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。

所述的一种多功能裂解酶的应用，其特征在于用重组表达的多功能裂解酶产物制成杀菌剂。

所述的一种多功能裂解酶的应用，其特征在于：将纯化的多功能裂解酶产物与赋形剂复配后，用来即食性食品包装前抑制食品中金黄色葡萄球和单核细胞增生性李斯特菌的污染。

所述原核细胞表达载体为pET-28a(+)。

所述溶壁酶基因被插入pET-28a(+)的EcoRⅠ和Xho I酶切位点。

所述的工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)，培养温度为37℃。

所述诱导表达所用的诱导剂为IPTG，诱导浓度为0.5～1.0mmol/L，诱导表达的温度为20～26℃。

所述的分离纯化步骤包括镍亲和层析。

有益效果

本发明涉及到的溶壁酶序列是全新序列，其能够高效杀灭金黄色葡萄球和单核细胞增生性李斯特菌，该序列制成的制剂可以单独或复配使用为目前预防奶牛乳房炎及控制食品中金黄色葡萄球和单核细胞增生性李斯特菌污染提供一种安全、无毒副作用的酶制剂来源。

附图说明

图1多功能裂解酶LysKZ190表达产物的鉴定分析

泳道1：纯化的裂解酶蛋白LysKZ190

M:蛋白分子质量Maker

图2多功能裂解酶LysKZ190的杀菌活性鉴定

图3多功能裂解酶LysKZ190在牛奶中的杀菌效果

具体实施方式

本发明试验用噬菌体宿主菌金黄色葡萄球菌(Staphyloccus aureus，ATCC25923)购自美国标准菌种收藏中心(ATCC)；单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，保藏号：GIM1.228)购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。λ噬菌体基因组快速提取试剂盒(北京艾比根生物技术有限公司)。

实施例1：多功能裂解的构建

a)合成具有金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶酰胺酶活性的N端序列NO.3，合成具有金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶结合功能的SH3b NO.4，从李斯特菌噬菌体裂解酶序列中获得能够结合细胞壁的C端结合结构域序列NO.5，对三段序列进行连接获得重构酶片段；

b)将合成的片段通过EcoRⅠ和Xho I位点插入表达载体pET28a(+)中，构建表达多功能裂解酶的重组表达载体pET-LysKZ190；

c)将测序正确的质粒pET-LysKZ190转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将转化的菌液涂布于含有卡那青霉素(100μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜；挑取阳性克隆接种于含卡那青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃培养过夜后，对阳性克隆进行PCR及测序列鉴定，重组菌命名为DE3(pET-LysKZ190)。

实施例2：多功能裂解酶LysKZ190的诱导表达及纯化

将重组菌DE3(pET-LysKZ190)接种到含卡那青霉素(100μg/mL)的LB培养液中，37℃振荡过夜培养；次日，按1:100比例转接至100mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值约为0.5时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，28℃诱导5h。收集菌体，超声波破碎细胞，4℃，10,000rpm/min离心10min，收集上清，并将上清经0.22μm滤膜过滤，SDS-PAGE分析裂解上清中的蛋白表达情况。将过滤的裂解上清用His亲和层析镍柱(GE Healthcare,Sweden)纯化，具体按试剂盒说明步聚进行。将纯化的裂解酶LysKZ190产物经去毒素试剂盒(Novagen公司)进行去毒处理(≤0.01EU/μg内毒素)，进一步进行SDS-PAGE分析蛋白纯化效果。

SDS-PAGE分析结果如图1所示，重组菌DE3(pET-LysKZ190)经IPTG诱导后，其上清纯化的融合his蛋白在58kD的位置有较粗的诱导蛋白条带，与预期大小相符，从而表明，表达的多功能裂解酶蛋白产物LysKZ190为可溶性蛋白，其纯化浓度经测定为1.2mg/ml。

实施例3：多功能裂解酶裂解活性鉴定

将金黄色葡萄球菌ATCC 25923及单核细胞增生性李斯特菌GIM1.228培养至OD₆₀₀＝0.8，用PBS洗涤后重悬，取900μl，加入100μl(100μg)纯化的裂解酶产物，混匀，室温下作用1h，用分光光度计动态测定菌液的OD₆₀₀值，OD₆₀₀的下降表明细菌被裂解。

结果如图2所示，纯化的LysKZ190产物对两种菌均有具有良好的裂解活性，在作用1h后，OD值从起始的0.8分别降到0.21和0.30，表明多功能裂解酶LysKZ190裂解活性较强。

实施例4：多功能裂解酶LysKZ190在牛奶中的灭菌作用

将巴氏杀菌牛奶分装为两组，A组接种宿主菌金黄色葡萄球菌ATCC 25923及单核细胞增生性李斯特菌各10⁵cfu/mL，加入100μg的LysKZ190蛋白；B组中仅加入金黄色葡萄球菌及单核细胞增生性李斯特菌作为对照，同时设PBS对照。将制备好的样品分别置于25℃(即室温)，在作用3h后检测宿主菌数量。

结果如图3所示，25℃作用3h后，金黄色葡萄球菌及单核细胞增生性李斯特菌数量分别下降了约3.57log和3.88log，与对照组比较呈显著性差异，从而表明LysKZ190在食品中有具有良好的杀菌作用，能够应用于食品的生物防控。

实施例5多功能裂解酶LysKZ190在预防奶牛乳炎中的抗菌效果

选自某奶牛场奶牛10头(显示疑似奶牛乳房炎表症)，随机分为2组。A组为LysKZ190预防组：将挤奶器具用含有多功能裂解酶的溶液(100μg/10ml)进行接触表面涂擦，再行挤奶，并在挤完奶后再次将乳房洗净擦干后用含有多功能裂解酶的溶液(500μg/50ml)直接涂擦乳房表面。B组为对照组，仅洗净擦干，不用任何药物。A组及B组用药均为每天早晚各2次，连用7天为一个预防疗程。

由表1可以看出，经多功能裂解酶LysKZ190预防的A组，体细胞数与初始数量比较有显著下降；而对照组中，体细胞数没有显著变化，且体细胞数仍高于正常体细胞数，表明伴有一定的炎症，需要加强预防，从而防止奶牛乳房炎的发病。

表1不同药物治疗奶牛乳房炎病牛的体细胞数检测结果

组别	用药	用酶前体细胞数(万/ml)	用酶后体细胞数(万/ml)
				A	裂解酶组	51.0±47.1	33.5±28.3
B	对照组	49.0±39.7	50.5±29.4

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种多功能裂解酶及其制备方法和应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggataca aagcagaacc gaaacctaca actcattttg ttgcactgcc taaaacgata 60

aaacatagtt taatcgtcga tgttgatgct tattatggtt tggactcggc aatcgattta 120

cctaactata ttttttacgt tggtagtaat agatactgga actttaagac accaggcaac 180

gcaagagcta tgcctgaagg ggattttgtc tataaagtgc ggcaatgtaa cacttctaga 240

tctcctaaac cagcactgtg gacaggtggt gcatggtatg caaattatag atatggtcca 300

tcaactaaaa gtaaatacaa ttggaacact tggggacaca ctaaacaggt ggttggtatt 360

gttgtatact tttatagtga agatcagtct aactctcctg cagcaggtaa accaacgaag 420

tttggtgtaa gacccggcag tggtggtgat atactaccaa attggaataa cgttagtaca 480

ccggaggcac cagttgtagg taactattgc cctaccggtg aatggaaaat atacggaact 540

tggtatgcaa caccggaaaa agtcaatggt ccacaaccta aagtaactag attcggtggt 600

ccattcgggt taaatagaat acttggcggt aactttgtat tacccgcagc tacaattgca 660

ggtgtacata gttgtatcag acacattact ggttataatc aacagaagga caataaagaa 720

gcttacaact gtaacagaac ttgtaacggt ccgccaccta atcttataaa acgcgttgcc 780

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aatttgctat ccaaaatgga tagtcccatt gaatttaaat ctacaaacca agcagaacag 900

cgccaccatc taaacaagct aaccaagaca actacataga aaatggactc tagcggacgc 960

tatacactaa gttggctaaa cagtatggta gtaacagagt tgctaactat tcaggaacag 1020

ctaacactag ccagacactc caagttggct tggggtcaac aagaggaagt ttttttagta 1080

aaattaacgg taagaaaggt cgcatatagg atggtatcag tacgaaagtt ctgcgaatta 1140

aaagcggcat tcacacaaat tcgaaagacc cagtatggaa tatccaagac agtagccgca 1200

gaaactataa gccaccaaca tgtacctctg tgtatcaagc acctgacgct atcggtgtta 1260

aggctactaa attcggagca gcagctacta tccaaattaa ccctactaaa gatatatacg 1320

aaatccaaag aggaaacggt gcagaccgag ttctccaatt tggtaataaa ccgc 1374

<210> 2

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Tyr Lys Ala Glu Pro Lys Pro Thr Thr His Phe Val Ala Leu

1 5 10 15

Pro Lys Thr Ile Lys His Ser Leu Ile Val Asp Val Asp Ala Tyr Tyr

20 25 30

Gly Leu Asp Ser Ala Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Ile Phe Tyr Val Gly

35 40 45

Ser Asn Arg Tyr Trp Asn Phe Lys Thr Pro Gly Asn Ala Arg Ala Met

50 55 60

Pro Glu Gly Asp Phe Val Tyr Lys Val Arg Gln Cys Asn Thr Ser Arg

65 70 75 80

Ser Pro Lys Pro Ala Leu Trp Thr Gly Gly Ala Trp Tyr Ala Asn Tyr

85 90 95

Arg Tyr Gly Pro Ser Thr Lys Ser Lys Tyr Asn Trp Asn Thr Trp Gly

100 105 110

His Thr Lys Gln Val Val Gly Ile Val Val Tyr Phe Tyr Ser Glu Asp

115 120 125

Gln Ser Asn Ser Pro Ala Ala Gly Lys Pro Thr Lys Phe Gly Val Arg

130 135 140

Pro Gly Ser Gly Gly Asp Ile Leu Pro Asn Trp Asn Asn Val Ser Thr

145 150 155 160

Pro Glu Ala Pro Val Val Gly Asn Tyr Cys Pro Thr Gly Glu Trp Lys

165 170 175

Ile Tyr Gly Thr Cys Tyr Ala Thr Pro Glu Lys Val Asn Gly Pro Gln

180 185 190

Pro Lys Val Thr Arg Phe Gly Gly Pro Phe Gly Leu Asn Arg Ile Leu

195 200 205

Gly Gly Asn Phe Val Leu Pro Ala Ala Thr Ile Ala Gly Val His Ser

210 215 220

Cys Ile Arg His Ile Thr Gly Tyr Asn Gln Gln Lys Asp Asn Lys Glu

225 230 235 240

Ala Tyr Asn Cys Asn Arg Thr Cys Asn Gly Pro Pro Pro Asn Leu Ile

245 250 255

Lys Arg Val Ala Thr Gly Val Ser Arg Thr Asp Arg Leu Thr Gly Pro

260 265 270

Ser Gly Ala Val Val Asp Lys Lys Asn Leu Leu Ser Lys Met Asp Ser

275 280 285

Pro Ile Glu Phe Lys Ser Thr Asn Gln Ala Glu Gln Arg His His Leu

290 295 300

Asn Lys Leu Thr Lys Thr Thr Thr Lys Met Asp Ser Ser Gly Arg Tyr

305 310 315 320

Thr Leu Ser Trp Leu Asn Ser Met Val Val Thr Glu Leu Leu Thr Ile

325 330 335

Gln Glu Gln Leu Thr Leu Ala Arg His Ser Lys Leu Ala Trp Gly Gln

340 345 350

Gln Glu Glu Val Phe Leu Val Lys Leu Thr Val Arg Lys Val Ala Tyr

355 360 365

Arg Met Val Ser Val Arg Lys Phe Cys Glu Leu Lys Ala Ala Phe Thr

370 375 380

Gln Ile Arg Lys Thr Gln Tyr Gly Ile Ser Lys Thr Val Ala Ala Glu

385 390 395 400

Thr Ile Ser His Gln His Val Pro Leu Cys Ile Lys His Leu Thr Leu

405 410 415

Ser Val Leu Arg Leu Leu Asn Ser Glu Gln Gln Leu Leu Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Leu Leu Lys Ile Tyr Thr Lys Ser Lys Glu Glu Thr Val Gln Thr

435 440 445

Glu Phe Ser Asn Leu Val Ile Asn Arg

450 455

<210> 3

<211> 471

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggataca aagcagaacc gaaacctaca actcattttg ttgcactgcc taaaacgata 60

aaacatagtt taatcgtcga tgttgatgct tattatggtt tggactcggc aatcgattta 120

cctaactata ttttttacgt tggtagtaat agatactgga actttaagac accaggcaac 180

gcaagagcta tgcctgaagg ggattttgtc tataaagtgc ggcaatgtaa cacttctaga 240

tctcctaaac cagcactgtg gacaggtggt gcatggtatg caaattatag atatggtcca 300

tcaactaaaa gtaaatacaa ttggaacact tggggacaca ctaaacaggt ggttggtatt 360

gttgtatact tttatagtga agatcagtct aactctcctg cagcaggtaa accaacgaag 420

tttggtgtaa gacccggcag tggtggtgat atactaccaa attggaataa c 471

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttagtacac cggaggcacc agttgtaggt aactattgcc ctaccggtga atggaaaata 60

tacggaactt ggtatgcaac accggaaaaa gtcaatggtc cacaacctaa agtaactaga 120

ttcggtggtc cattcgggtt aaatagaata cttggcggta actttgtatt acccgcagct 180

acaattgcag gtgtacatag ttgtatcaga cacattactg gttataatca acagaaggac 240

aataaagaag cttacaactg taacagaact tgtaacggtc cgccacctaa tcttataaaa 300

cgcgttgcca caggagtatc taga 324

<210> 5

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

actgacagac ttacaggtcc atctggagca gtagtggata aaaaaaattt gctatccaaa 60

atggatagtc ccattgaatt taaatctaca aaccaagcag aacagcgcca ccatctaaac 120

aagctaacca agacaactac atagaaaatg gactctagcg gacgctatac actaagttgg 180

ctaaacagta tggtagtaac agagttgcta actattcagg aacagctaac actagccaga 240

cactccaagt tggcttgggg tcaacaagag gaagtttttt tagtaaaatt aacggtaaga 300

aaggtcgcat ataggatggt atcagtacga aagttctgcg aattaaaagc ggcattcaca 360

caaattcgaa agacccagta tggaatatcc aagacagtag ccgcagaaac tataagccac 420

caacatgtac ctctgtgtat caagcacctg acgctatcgg tgttaaggct actaaattcg 480

gagcagcagc tactatccaa attaacccta ctaaagatat atacgaaatc caaagaggaa 540

acggtgcaga ccgagttctc caatttggta ataaaccgc 579

Claims (8)

1.一种多功能裂解酶，其特征在于其氨基酸序列为Seq ID NO.2。

2.一种多功能裂解酶的编码基因，其特征在于其核苷酸序列为Seq ID NO.1。

3.一种表达多功能裂解酶的制备方法，其特征在于以下步骤：

构建表达多功能裂解酶的重组表达载体：合成具有金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶酰胺酶活性的N端序列NO. 3，合成具有金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶结合功能的SH3b NO.4，从李斯特菌噬菌体裂解酶序列中获得能够结合细胞壁的C端结合结构域序列 NO.5，对三段序列进行连接获得重构酶片段；

将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选得到表达多功能裂解酶的工程菌；

异丙基1-1硫代-β呋喃半乳糖苷诱导表达，获得重组基因表达产物；

将重组基因表达产物，经镍柱亲和层析纯化分离，得到重组的多功能裂解酶；

将纯化的多功能裂解酶产物经去毒素试剂盒进行去毒处理即≤0.01 EU/μg内毒素。

4.根据权利要求1所述的一种多功能裂解酶在用于消毒挤奶器具后控制奶牛养殖过程中奶牛乳房炎的发生及牛乳中金黄色葡萄球菌及单核细胞增生性李斯特菌污染控制的应用。

5.根据权利要求1所述的一种多功能裂解酶在制备同时抑制金黄色葡萄球菌及单核细胞增生性李斯特菌污染或过度生长药物的应用。

6.根据权利要求1所述的一种多功能裂解酶在制备抑制金黄色葡萄球和单核细胞增生性李斯特菌污染或过度生长药物应用，其特征在于所述的食品为由肉类，或蛋类，或奶制品，或粮食，或蔬菜，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。

7.权利要求5所述的一种李斯特菌噬菌体溶壁酶的应用，其特征在于用重组表达的多功能裂解酶产物制成杀菌剂。

8.权利要求5所述的一种多功能裂解酶的应用，其特征在于：将纯化的多功能裂解酶产物与赋形剂复配后，用来即食性食品包装前抑制食品中金黄色葡萄球和单核细胞增生性李斯特菌的污染。