CN102186878A - 人工肽聚糖裂解酶和肽聚糖结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有结合及裂解细菌的活性的重组多肽，其包含至少一个酶活性域和至少两个细菌细胞结合域。本发明进一步涉及具有结合细菌的活性的重组多肽，其包含至少两个细菌细胞结合域。进一步地，本发明涉及包含编码所述重组多肽的核苷酸序列的核酸分子、载体和宿主细胞。

Description

人工肽聚糖裂解酶和肽聚糖结合蛋白
本发明涉及具有结合及裂解细菌的活性的重组多肽，其包含至少一个酶活性域和至少两个细菌细胞结合域。本发明进一步涉及具有结合细菌的活性的重组多肽，其包含至少两个细菌细胞结合域。进一步地，本发明涉及包含编码所述重组多肽的核苷酸序列的核酸分子、载体和宿主细胞。
在近几年中，肽聚糖降解酶(像噬菌体内溶素)作为抗微生物剂得到了越来越多的关注。由于病原性细菌针对经典抗生素的耐药性正在不断出现和扩散，对控制这些生物体的备选方式的需求正在上升。尤其是在革兰氏阳性细菌的场合，噬菌体内溶素(如所谓的Enzybiotics)的应用是一种有希望的办法。由于革兰氏阳性菌没有外膜，这些酶也作为外溶素运作，即它们能从外部引起易感细胞裂解。这种特性可以例如在微生物生物学领域中利用，从细菌细胞有效地回收核酸和蛋白质，这在来自感染李斯特氏菌的噬菌体的内溶素中已经得到了证明。以控制食物携带的病原体单核细胞再生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的应用为目标，将编码这些溶素的基因导入多种乳酸细菌，包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和数种乳杆菌，它们在奶酪生产中被用作起子(starter)生物体。通过过表达及分泌内溶素，这些细菌显示出针对单核细胞增生李斯特氏菌细胞的裂解活性。迄今报告的由噬菌体编码的肽聚糖水解酶的医学应用包括检测和杀死炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，及在体外和在小鼠模型中控制肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
内溶素是在dsDNA噬菌体的晚期基因区中编码并在裂解性增殖周期结束时生成的细胞壁裂解性酶。这些酶在整合入细菌基因组的原噬菌体基因组内也有发现。它们的功能是从内部降解细菌肽聚糖，导致宿主细胞裂解及噬菌体后代释放。依照它们在肽聚糖内的不同靶键，内溶素可分成5个不同类：(i)N-乙酰基-β-D-胞壁质酶(也称作溶菌酶)和(ii)N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶，它们都是糖苷酶且均切割聚糖链的两种β-1，4糖苷键之一；(iii)裂解性转糖酶，其与胞壁质酶切割相同的键，但是通过不同的机制；(iv)N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶，其在聚糖与肽模块之间切割；和(v)内肽酶，其在肽模块内切割。除裂解性转糖酶外的所有内溶素都是水解酶。在裂解细菌自身或近亲细菌的细胞壁的细菌酶(所谓的自溶素)和其它细菌细胞壁裂解性多肽(如细菌素)中也发现了该酶活性。细菌自溶素是细胞壁裂解性酶，其在细胞壁重塑、细胞分裂、转化中，或作为毒力因子发挥重要作用。总之，它们可统称为肽聚糖裂解酶。在肽聚糖裂解酶作用下肽聚糖酶促降解，导致细胞壁的完整性丧失，并最终由于高内压力致使细胞破碎。
肽聚糖裂解酶杀死细菌细胞的特性，使得它们在下述方面成为令人感兴趣的候选者：用作抗人类和动物细菌感染的预防或治疗剂、用于在医学、公共或私人环境中充当消毒剂的抗微生物剂或Enzybiotic、用于在食品工业、动物饲料或化妆品工业中去除细菌污染的去污剂、或针对受细菌污染的表面的通用表面活性剂。肽聚糖裂解酶在细菌诊断中同样有用，因为它们可特异性结合及裂解来自不同细菌群、属、种、株或血清变型的细菌细胞。特异性细胞裂解常常与其他基于要检测的细菌细胞的细胞内容物的检测方法结合使用，这样的方法例如基于核酸的方法或免疫学方法。
内溶素、自溶素和其它来自革兰氏阳性菌背景的肽聚糖裂解酶显示出模块式的组织，其中催化活性和底物识别是分开的，且位于至少两个不同功能域中，即酶活性域(EAD)和细胞结合域(CBD)。大多数来自感染革兰氏阴性宿主的噬菌体的内溶素是单域的球状蛋白质。然而，最近报告了两种来自革兰氏阴性菌背景的溶素，它们由两个功能域组成。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)噬菌体ΦKZ和EL的内溶素由N端细胞结合域和C端催化域组成(Briers et al.Molecular Microbiology，Volume 65，Number 5，September 2007，pp.1334-1344(11))。相反，大多数来自感染革兰氏阳性细菌的噬菌体的内溶素具有域的相反取向的特征，即N端EAD和C端CBD。
仅对于很少几种内溶素而言，细菌细胞壁中被结合域识别的配体是已知的。肺炎球菌噬菌体Cpl-1溶菌酶特异性识别肺炎链球菌的细胞壁中含有胆碱的磷壁酸，因此其属于胆碱结合蛋白(CBP)家族。这些蛋白质的胆碱结合模块(CBM)是由一种约20个氨基酸残基的重复序列形成的，该重复序列以多个串联拷贝(范围为4至18)的形式存在。Cpl-1例示了这些酶的模块式模式，即有两个不同的域-EAD和CBD，它们通常经由一个短的接头区相连接。虽然大多数模块式噬菌体内溶素由一个催化域和一个底物结合域组成，但是有多种蛋白质包含两种不同酶活性，如例如无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)噬菌体B30的内溶素(胞壁质酶和内肽酶)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)噬菌体Φ11的内溶素(内肽酶和酰胺酶)、无乳链球菌噬菌体NCTC 11261的内溶素(内肽酶和胞壁质酶)、和沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)M噬菌体ΦWMY的内溶素(内肽酶和酰胺酶)。
起源于噬菌体和细菌的肽聚糖裂解酶、内溶素以及自溶素或细菌素显示出相似的模块架构，及细菌和噬菌体衍生的裂解性蛋白质的不同域间能发现高同源性的事实，提示共同的祖先和这些蛋白质通过功能域交换进行的共进化(Garcia et al.，1990，Gene 86，81-88)。Diaz等人(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.，87，8125-8129)创建了噬菌体和细菌肺炎球菌酶的嵌合物，其展现出组合的生化特性。Diaz等人(1991，J.Biol.Chem.，266，5464-6571)自缺少核苷酸同源性的基因构建了重组嵌合物，也证实了CBD在底物识别中的功能。Croux等人(1993，Mol.Microbiol.，9，1019-1025)甚至创建了基于肺炎球菌和梭菌细胞壁裂解性酶的嵌合物，这导致内溶素的酶活性转换到自其它细菌科的细胞。Sanz等人(1996，Eur.J.Biochem.，235，601-605)通过模块装配构建了多功能肺炎球菌胞壁质水解酶，其包含两个EAD和一个CBD。最近，报告了由溶葡萄球菌素、来自模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的肽聚糖水解酶、以及无乳链球菌噬菌体B30内溶素组成的融合蛋白及其C端截短型式(Donovan etal.2006，Appl.Environ.Microbiol.，72，2988-2996)。同样在这种情况中，人工构建物结合了两种酶的特性，既裂解葡萄球菌细胞又裂解链球菌细胞。Loessner等人(2002，Mol.Microbiol.，44，335-349)描述了CBD决定对细菌细胞壁碳水化合物的特异性识别和高亲和力结合的设想，其中使用了单核细胞增生李斯特氏菌作为角色模型。US 2004/0197833教导了固定化的分离的CBD在用于富集靶细胞的方法中的用途。
本发明的目的是提供改良的和有利的蛋白质，其为可靠地检测及富集和/或裂解细菌细胞提供可能。
如权利要求中限定的主题解决了该目的。
下面的图例示本发明。
图1：针对李斯特氏菌细胞的GFP双重CBD融合蛋白，以及充当参照物的GFP单一CBD构建物的示意图。GFP为绿色荧光蛋白；CBD500、CBD118、和CBDP35分别为李斯特氏菌噬菌体内溶素Ply500、Ply118、和PlyP35的细胞壁结合域；L为PlyPSA内溶素的接头区。
图2：带有两个相同CBD的肽聚糖结合蛋白，由于从细胞壁解离的减少而具有更高的亲和力。(A)双重CBD500融合蛋白以及充当参照物的各自单一CBD500构建物的示意图。GFP为绿色荧光蛋白；EAD500为李斯特氏菌噬菌体内溶素Ply500的酶活性域；CBD500为Ply500的细胞壁结合域。(B)HGFP_CBD500(黑色)和HGFP_CBD500-500(灰色)的SPR传感图的覆盖图，在50nM浓度测量。指明了结合和解离阶段。RU为相对响应单位。
图3：具有N端His标签的野生型ply500(空心圆圈)和H_EAD_CBD500-500(实心方框)针对单核细胞增生李斯特氏菌WSLC 1042细胞的相对裂解活性，在不同NaCl浓度用光度测定裂解测定法测量。野生型ply500在200mMNaCl时的最佳活性对应于1.0。所有测定进行一式三份。
图4：肽聚糖裂解酶针对肠球菌的最小杀细菌浓度(MBC)的测定。依赖于细胞裂解测定法中存在的Fab25VL(方框)或EADFab25_CBD25_CBD20(圆圈)的蛋白质浓度显示了粪肠球菌(Enterococcus faecalis)菌株17的存活细胞的细菌浓度。
如本文中使用的，术语“肽聚糖裂解酶”指适合于裂解细菌细胞壁的酶。该酶包含下面的构成肽聚糖裂解酶的“酶活性域”(EAD)的活性中的至少一种：内肽酶，N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酸-酰胺酶(酰胺酶)，N-乙酰基-胞壁质酶(溶菌酶或裂解性转糖酶)或N-乙酰基-氨基葡萄糖苷酶。或者该酶是由噬菌体或原噬菌体编码的，即所谓的“内溶素”，或者该酶衍生自相关的由细菌编码的细胞壁裂解酶，即所谓的“自溶素”或其它细菌肽聚糖裂解酶如细菌素、毒力因子或其它抗微生物多肽(例如溶葡萄球菌素、ALE-1溶素、变溶菌素、肠溶素)。另外，肽聚糖裂解酶还含有无酶活性且结合宿主细菌细胞壁的区，即所谓的CBD(细胞壁结合域)。
如本文中使用的，术语“肽聚糖结合蛋白”指人工构建的细菌细胞结合蛋白，其不具有前文就肽聚糖裂解酶所述的酶活性。肽聚糖结合蛋白包含超过一个衍生自CBD的CBD。肽聚糖结合蛋白是通过天然存在的CBD的改组和/或通过天然存在的CBD的倍增而构建的。
如本文中使用的，术语“域”指肽聚糖裂解酶的亚基，其被认为具有特定的功能，而且还可与结构或进化保守域一致。与域相关的特定功能是例如细菌肽聚糖裂解或细菌细胞结合。功能域有时也称作“模块”。
如本文中使用的，术语“CBD”指肽聚糖裂解酶的细胞壁结合域，其常常见于该蛋白质的C端。CBD域不具有水解细胞壁的酶活性，但是可介导肽聚糖裂解酶对细菌细胞壁的结合。如本文中使用的，术语CBD描述多肽链内衍生自天然存在肽聚糖裂解酶的区段。
如本文中使用的，术语“EAD”指肽聚糖裂解酶的负责水解细菌肽聚糖的酶活性域。它含有至少一种上文就肽聚糖裂解酶所描述的酶活性。如本文中使用的，术语EAD描述多肽链内衍生自天然存在肽聚糖裂解酶的区段。
“CHAP”域(半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶)指在来自细菌、噬菌体、古细菌和锥虫科真核生物的蛋白质中发现的约110个至约140个氨基酸残基的区域。该蛋白质可主要在肽聚糖水解中发挥功能。CHAP域通常与细菌型SH3域及与数个酰胺酶域家族有关。含有CHAP域的蛋白质可以在亲核攻击机制中利用催化性半胱氨酸残基。CHAP域含有两个不变的氨基酸残基，即半胱氨酸和组氨酸残基。这些残基形成含有CHAP域的蛋白质的推定的活性位点的一部分。
如本文中使用的，术语“ami”描述一种酶学上限定的域，其展现酰胺酶活性，即它水解肽聚糖骨架中的N-乙酰基胞壁胺(N-acetylmuramine)与邻近氨基酸残基(通常是肽接头中的L-ala)之间的酰胺键。酰胺酶的活性常常依赖于金属离子。
如本文中使用的，术语“SH3”域(有时也称作Src同源性3域)描述一种约60个氨基酸残基的非催化性小蛋白质域，它是与其它结合配偶相互作用的蛋白质的特征。它的身份是藉由一个富含脯氨酸的共有基序确定的。SH3域位于CBD内。在肽聚糖裂解酶中发现的SH3域常常是SH3b或SH3_5型的。
术语“野生型”指蛋白质或核酸就序列而言的天然存在形式。
如本文中使用的，术语“改组”指来自不同野生型酶的不同多肽片段组合成新的嵌合多肽构建物。在此语境中，所述酶优选肽聚糖裂解酶，所述片段优选EAD和CBD。通常，在核酸水平上通过分子生物学方法来组合片段。出于结构上或克隆的原因，可以在片段间引入额外的接头序列。
本发明的一个目的是由至少一个EAD和至少两个CBD构成的肽聚糖裂解酶。依照本发明人工创建的肽聚糖裂解酶展现新的特性，如与天然存在蛋白质相比更广的或不同的结合范围，或更高的对细菌细胞壁的结合亲和力，或更高的或不同的裂解活性，或其组合。
本发明的另一个目的是由至少两个CBD构成的肽聚糖结合蛋白。依照本发明人工创建的肽聚糖结合蛋白展现新的特性，如与天然存在蛋白质相比更广的或不同的结合范围或更高的对细菌细胞壁的结合亲和力或二者。
在依照本发明的肽聚糖裂解酶或肽聚糖结合蛋白中，所述至少两个CBD可衍生自两种不同肽聚糖裂解酶(域改组)，或可以通过内溶素中天然存在的一个CBD倍增而得到。如果依照本发明的肽聚糖裂解酶中存在多于一个EAD，那么这些EAD可衍生自两种不同肽聚糖裂解酶。
同时，本领域中描述了多种针对不同革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌属、种或株的肽聚糖裂解蛋白。肽聚糖裂解蛋白的模块性质及EAD与CBD之间的区别是公知的。在功能上表征了肽聚糖裂解蛋白中存在的多种保守域，而且通过合适的计算机程序能够预测它们在多肽或核苷酸序列内的存在，所述程序使用各自的蛋白质或核酸数据库，例如CDD(Marchler-Bauer et al.，2005；Nucleic Acids Research，33，D192-D196)；Pfam(Finn et al.，2006，Nucleic AcidsResearch 34，D247-D251)或SMART(Schultz et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864，Letunic et al.，2006，Nucleic Acids Res 34，D257-D260)，或者可以通过使用删除突变体的结合测定法预测它们在多肽或核苷酸序列内的存在(Loessner et al.，2002，Mol.Microbiol.，44，335-349)。依照本发明的人工肽聚糖裂解酶系使用标准的重组蛋白克隆和生产技术，通过将来源于EAD的期望酶活性与提供细胞结合活性的至少两个CBD加以组合来构建，所述标准技术如Sambrook et al.，Molecular cloning.A laboratory manual；2nd ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press 1989所述。依照本发明的人工肽聚糖结合蛋白系使用重组蛋白克隆和生产的标准技术，通过组合提供细胞结合活性的至少两个CBD来构建，所述标准技术见Sambrook et al.，Molecular cloning.Alaboratory manual；2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989。所述至少两个CBD可衍生自不同肽聚糖裂解酶，结果得到改组的嵌合酶，或者它们可衍生自来自一种天然存在酶的CBD的倍增，或二者的组合。大体上，所有天然存在肽聚糖裂解酶都是提供EAD和CBD域的潜在候选。
肽聚糖裂解酶优选包含至少一个选自下组的EAD：酰胺酶_5(噬菌体肽聚糖水解酶，pfam05382)，酰胺酶_2(N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶，pfam01510)，酰胺酶_3(N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶，pfam01520)，Transgly(转糖酶，pfam00912)，肽酶_M23(肽酶家族M23，pfam01551)，内溶素_自溶素(CD00737)，水解酶_2(细胞壁水解酶，pfam07486)，CHAP(酰胺酶，pfam05257)，转糖酶(转糖酶样域，pfam06737)，MtlB(膜结合的裂解性胞壁质转糖酶B，COG2951)，MtlA(膜结合的裂解性胞壁质转糖酶A，COG2821)，MtlE(膜结合的裂解性胞壁质转糖酶E，COG0741)，噬菌体_λ_溶菌酶(裂解N-乙酰基胞壁酸与N-乙酰基葡糖胺之间的键，CD00736)，肽酶_M74(青霉素不敏感性胞壁质内肽酶，pfam03411)，SLT(转糖酶SLT，pfam01464)，Lys(C型溶菌酶/α-乳清蛋白家族，pfam00062)，COG5632(N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶，COG5632)，MepA(胞壁质内肽酶，COG3770)，COG1215(糖基转移酶，COG1215)，AmiC(N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶，COG0860)，Spr(细胞壁相关水解酶，COG0791)，噬菌体_T4样_溶菌酶(裂解N-乙酰基胞壁酸与N-乙酰基葡糖胺之间的键，cd00735)，LT_GEWL(裂解性转糖酶(LT)和鹅卵白溶菌酶(GEWL)域，cd00254)，肽酶_S66(LD-羧肽酶，pfam02016)，Glyco_hydro_70(糖基水解酶家族70，pfam02324)，Glyco_hydro_25(糖基水解酶家族25)，VanY(D-丙氨酰基-D-丙氨酸羧肽酶，pfam02557)，和LYZ2(溶菌酶亚家族2，smart 00047)。
肽聚糖裂解酶优选包含至少一个选自下组的CBD：SH3_5(细菌SH3域，pfam08460)，SH3_4(细菌SH3域，pfam06347)，SH3_3(细菌SH3域，pfam08239)，SH3b(细菌SH3域同源物，smart00287)，LysM(在多种涉及细胞壁降解的酶中发现的LysM域，pfam01476和cd00118)，PG_结合_1(推定的肽聚糖结合域，pfam01471)，PG_结合_2(推定的肽聚糖结合域，pfam08823)，MtlA(来自胞壁质降解性转糖酶的肽聚糖结合域，pfam03462)，Cpl-7(Cpl-7溶菌酶的C端域，pfam08230)，CW_结合_1(推定的细胞壁结合重复，pfam01473)，LytB(推定的细胞壁结合域，COG2247)，和LytE(LysM重复，COG1388)。
优选地，上文描述的域具有范围为约15个至约250个氨基酸残基的氨基酸残基长度，优选是约20个至约200个氨基酸残基的范围内的长度。例如，在肽聚糖结合域中发现了长约15个至约40个氨基酸残基的域，如LysM域或负责胆碱结合CW_结合_1基序。这些小域常常也在野生型细胞壁裂解酶中作为天然重复基序被发现。这些域可以与来自其它细胞壁裂解酶的其他CBD组合以创建嵌合改组人工肽聚糖裂解酶或肽聚糖结合蛋白。
通常，肽聚糖裂解酶的完整EAD或CBD域比上文描述的保守域要大。优选地，EAD或CBD在长约50个残基至约400个残基的范围中。每个EAD和CBD含有至少一个功能域以展现它们的肽聚糖裂解或细菌细胞结合功能，但是也可以包含多于一个功能域和额外的功能未知的序列区段。肽聚糖结合酶的EAD和CBD域并非总是限定于上文描述的保守域。还有已知的肽聚糖结合酶(例如Ply118)，其结合及裂解细菌细胞，却未发现任何上文描述的保守域。潜在的域是否发挥EAD或CBD功能可以用合适的功能测定法(例如用于肽聚糖裂解(EAD)的光度测定裂解测定法、板裂解测定法(plate lysis assay)或最小杀细菌浓度(MBC)测定，及用于细胞结合(CBD)的细胞结合测定法、荧光显微术或结合亲和力测得)来测试。EAD和CBD的域边界可通过局部比对搜索工具(例如BLAST，于NCBI，Altschul et al.，1997，Nucleic Acids Res.17，3389-3402)来限定，这些工具寻找序列之间具有局部相似性的区域。另外，多种肽聚糖裂解酶的EAD和CBD域已经得到了描述。
优选地，本发明的肽聚糖裂解酶和肽聚糖结合蛋白由自选自下组的野生型肽聚糖裂解酶衍生的EAD和CBD构成：Ply500，Ply511，Ply118，Ply100，PlyP40，Ply3626，phiLM4内溶素，PlyCD119，PlyPSAa，Ply21，PlyBA，Ply12，PlyP35，PlyPH，PlyL，PlyB，phi11内溶素，phi MR11内溶素，phi12内溶素，金黄色葡萄球菌噬菌体PVL酰胺酶，plypitti26，ΦSA2usa内溶素，沃氏葡萄球菌M噬菌体ΦWMY PlyGBS的内溶素，B30内溶素，Cpl-1，Cpl-7，Cpl-9，PlyG，PlyC，pal酰胺酶，Fab25，Fab20，来自粪肠球菌V583原噬菌体的内溶素，溶葡萄球菌素，噬菌体PL-1酰胺酶，头状葡萄球菌(S.capitis)ALE-1内肽酶，变溶菌素(球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)ATCC 21553的N-乙酰基胞壁质酶)，肠溶素A(来自粪肠球菌LMG 2333的细胞壁降解性细菌素)，LysK，LytM，来自单核细胞增生李斯特氏菌的Ami自溶素，铜绿假单胞菌噬菌体ΦKZ和EL的内溶素，T4溶菌酶，gp61胞壁质酶，和STM0016胞壁质酶。
野生型肽聚糖裂解酶PlyP40的野生型形式的长度为344个氨基酸残基。它拥有两个功能域，它们与其它已知的内溶素只具有极小的同源性。第1至200位N端氨基酸残基代表如SEQ ID NO：103中所示的酶活性域(EAD)。PlyP40的细胞结合域(CBD)包含如SEQ ID NO：104中所示的C端第227-344位氨基酸残基。如此，衍生自野生型肽聚糖裂解酶PlyP40的EAD优选包含依照SEQ ID NO：103的氨基酸序列，而衍生自野生型肽聚糖裂解酶PlyP40的CBD优选包含依照SEQ ID NO：104的氨基酸序列。
自天然存在肽聚糖裂解酶衍生的用于构建依照本发明的酶和蛋白质的片段可以不仅仅组合根据如上所述保守功能域预测确定的序列区段，但是优选添加连接不同功能性模块的合适接头序列。接头序列可衍生自与限定功能域邻近的野生型序列，或者可以是本领域已知的外部合适接头序列。合适的接头是例如来自根据x射线结构限定的李斯特氏菌内溶素PlyPSA(
Figure BDA0000056076110000091
et al.，2006，J.Mol.Biol.，364，678-689)具有序列AAKNPN或TGKTVAAKNPNRHS(SEQ ID No：61和11)的短域接头。多聚甘氨酸接头也是本领域已知可充当柔性域接头的。优选的接头还有富含甘氨酸和丙氨酸的接头。SEQ ID NO：63、64和65给出了富含甘氨酸和丙氨酸的接头的具体序列。还优选作为天然接头存在(例如在肠溶素A SEQ ID NO：66中)的富含脯氨酸和苏氨酸的序列。富含脯氨酸和苏氨酸的接头序列可以用共有基序(PT)xP或(PT)xT来描述，其中x代表范围为1至10的整数。另一种可能的接头是Croux et al.，1993，Molec.Microbiol.，9，1019-1025中记载的EAD与CBD之间的所谓的“连接区”。技术人员知道数种如何预测从野生型酶取出的功能域的合适边界的方法，例如二级结构预测、预测域接头、检查蛋白质3D模型或检查蛋白质高分辨率X射线和NMR结构中的域接头和边界。合适的方法记载于例如Gamier et al.，1996，Methods in Enzymology 266，540-553；Miyazakiet al.，2002，J.Struct.Funct.Genomics，15，37-51；George und Heringa，2003，Protein Eng.15，871-879；Bae et al.，2005，Bioinformatics，21，2264-2270，Altschul et al.，1997，Nucleic Acids Res.17，3389-3402；Schwede et al.，2003，Nucleic Acids Research 31，3381-3385；Lund et al，CPHmodels 2.0：X3M aComputer Program to Extract 3D Models.Abstract at the CASP5conferenceA102，2002。EAD与CBD域之间或CBD与CBD域之间的多肽接头的长度在约5个至约150个氨基酸残基，优选约6个至约60个氨基酸残基的范围内。
优选地，依照本发明的肽聚糖裂解酶中EAD与CBD组合的次序从N端到C端是EAD-CBD1-CBD2(-CBDN，N＝3或更多)。还优选如下的变体，其中在EAD的N端或在C端相邻添加有至少另一个EAD。还优选如下的变体，其中至少有两个CBD位于N端，或位于N和C端而EAD位于中间。另外，可以包括标志物序列或标签，二者都可以位于N端、C端或中间，但是尤其优选在N端。
与它们所来源的野生型酶相比，依照本发明的肽聚糖裂解酶和肽聚糖结合蛋白展现新的特性。
肽聚糖裂解酶或肽聚糖结合蛋白的结合范围决定着被识别的细菌宿主的范围。大多数天然存在的肽聚糖裂解酶展现的宿主范围相对较窄。对于肽聚糖裂解酶或肽聚糖结合蛋白的技术应用而言，扩大蛋白质的宿主范围常常是有利的，以便能够杀死、捕捉或检测更多的细菌菌株或种(取决于相应的应用)。扩大同一种蛋白质的宿主范围可以避免为同一应用使用两种或更多种蛋白质，这具有降低蛋白质生产的花费、减少为不同蛋白质优化条件的工作、简化医药批准程序、及降低免疫原性等优点。例如，包含了葡萄球菌与肠球菌的扩大的宿主范围对于医院内感染——其中这两个属的多重耐药菌株越来越成问题——的治疗或预防而言是有用的。宿主范围的扩大在细菌检测或清除食物中的有害细菌的方法中也是有用的。例如，在李斯特氏菌的所有血清变型内均发现了致病性菌株。然而，天然存在的李斯特氏菌内溶素无一能够裂解来自所有血清变型的细胞。包含多于一种的依照本发明的CBD的肽聚糖裂解酶能够裂解所有血清变型。与天然存在蛋白质相比，没有扩大但稍有改变的宿主范围，对于需要裁量蛋白质以适于给定的待裂解、捕捉或检测的细菌细胞集合的应用可能是有用的。肽聚糖裂解酶或肽聚糖结合蛋白的结合范围可以用本领域已知的测定法或用实施例中描述的板裂解测定法、光度测定裂解测定法、结合测定法或荧光显微术来确定。
肽聚糖裂解酶或肽聚糖结合蛋白与野生型蛋白质相比更高的结合亲和力有助于减少任何依赖细菌细胞结合的技术应用，如细胞裂解、细胞捕捉、和检测等，所需要的蛋白质的量。这可降低治疗性应用的花费及其中的免疫学反应和潜在的副作用。在依赖细菌细胞捕捉的应用中，测定法对降低背景信号的清洗步骤的敏感性更低，温育时间可以缩短，而且检测测定法更加灵敏。升高的结合亲和力可以用本领域已知的测定法或者用实施例中描述的表面等离振子共振分析或用于测定最小杀细菌浓度的测定法来测量。
肽聚糖裂解酶与野生型酶相比升高的裂解活性在所有依赖细菌细胞裂解的应用，如感染的检测和治疗、卫生、作为细菌检测中的初始步骤的细胞裂解、或食物、饲料、化妆品等的致病性细菌的清除中是有用的。各种应用需要的蛋白质量与野生型蛋白质相比降低，这可降低成本并最大程度地减少治疗性应用中的免疫学反应和潜在副作用。与野生型相比改变的裂解活性可以是例如人工酶的不同最适pH或不同缓冲液组成(例如高离子强度、有机溶剂存在下的活性、特定离子存在下的活性)时更高的裂解活性。这还包括特定样品如食物、人类血清、或其它医学样品中更高的活性。人工酶的最适pH变为较低的pH对于例如人工酶在食品工业中的应用而言是令人感兴趣的，因为食品加工中的食品产品或半成品常常具有低pH值，例如在乳品业中。酶在高盐浓度下发挥功能在食品工业中，例如在乳酪生产中也是重要的。裂解活性的升高或改变可以用本领域已知的测定法或者用实施例中描述的板裂解测定法、光度测定裂解测定法、或用于测定最小杀细菌浓度的测定法来测定。
一方面，本发明涉及可用于裂解、捕捉和/或检测李斯特氏菌细菌的人工肽聚糖裂解酶和肽聚糖结合蛋白。发明人使用上文所述方法组合李斯特氏菌内溶素ply500(SEQ ID NO：1)、ply118(SEQ ID NO：3)和plyP35(SEQ ID NO：5)的域以创建与野生型酶相比展现新特性的人工肽聚糖裂解酶和肽聚糖结合蛋白。Ply500包含一个保守D-丙氨酰基-D-丙氨酸羧肽酶(VanY；pfam02557)域作为EAD。Ply500的CBD始于约H133至Q150范围中的氨基酸残基并终于K289。对于Ply118，在氨基酸序列内没有发现保守域。然而，根据与同源肽聚糖裂解酶的序列比对，推导出Ply118的CBD始于约D90至K180范围中的氨基酸残基并终于氨基酸残基K289。CBD118优选的N端起始氨基酸残基是D90、K100、G127、S151、N161或K180。PlyP35也包含一个保守D-丙氨酰基-D-丙氨酸羧肽酶(VanY；pfam02557)域作为EAD。PlyP35的CBD始于约P130至N156范围中的氨基酸残基并终于Y281至K291范围中的氨基酸残基。CBDP35优选的N端起始氨基酸残基是P130、A134、K143和N156。CBDP35优选的C端氨基酸残基是Y281、L286、和K291。
依照本发明的优选肽聚糖结合蛋白是CBD500-118(SEQ ID NO：7)和CBD500L118(SEQ ID NO：9)，CBD500-118包含位于N端的ply500的CBD(氨基酸残基H133至K289)和位于C端的ply118的CBD(氨基酸残基D90至I281)，二者相互连接而没有额外的接头序列；而CBD500L118包含ply500的CBD(氨基酸残基Q150至K289)和ply118的CBD(氨基酸残基K100至I281)，这两个域通过接头(L)连接。这里的域接头是具有氨基酸序列TGKTVAAKNPNRHS(SEQ ID NO：11)的plyPSA接头区，其对应于来自李斯特氏菌内溶素PlyPSA的氨基酸残基173至186(
Figure BDA0000056076110000111
et al.，2006，J.Mol.Biol.，364，678-689)。
另一依照本发明的优选实施方案是人工肽聚糖结合蛋白CBD118-500(SEQ ID NO：13)和CBD118L500(SEQ ID NO：15)，CBD118-500包含位于N端的ply500的CBD(氨基酸残基H133至K289)和位于C端的ply118的CBD(氨基酸残基D90至I281)，二者相互连接而没有额外的接头序列；而CBD118L500包含ply118的CBD(氨基酸残基K100至I281)和ply500的CBD(氨基酸残基Q150至K289)，两个域通过接头(L)连接。这里的域接头是plyPSA接头区(SEQID NO：11)。
与衍生CBD域的野生型酶ply500和ply118相比，关于宿主范围和结合活性，肽聚糖结合蛋白CBD500-118、CBD500L118、CBD118-500、和CBD118L500都展现改变的细胞结合活性。构建物CBD500L118和CBD118L500的细胞结合活性揭示了两个域之间的接头有助于实现兼具各野生型酶的结合特异性的扩大的宿主范围。
其他依照本发明的优选肽聚糖结合蛋白有：CBD500-P35(SEQ ID NO：17)和具有相反CBD取向的蛋白质CBDP35-500(SEQ ID NO：19)，其中CBD500-P35包含位于N端的ply500的CBD(氨基酸残基Q150至K289)和位于C端的plyP35的CBD(氨基酸残基P130至K291)，而CBDP35-500包含位于N端的plyP35的CBD(氨基酸残基P130至K291)和位于C端的ply500的CBD(氨基酸残基Q150至K289)。这里，各CBD不是通过外部接头序列相连接的，因为plyP35的CBD的片段包括plyP35的内部域接头。
人工肽聚糖结合蛋白CBD500-P35和CBDP35-500都展现与衍生CBD域的野生型酶ply500和plyP35相比扩大的宿主范围。这两种嵌合蛋白都在同一种蛋白质内兼具两种野生型酶的不同结合特异性。在这种情况下CBD的取向不产生差别。两种CBD都可以位于N端，也可以位于C端。
其他依照本发明的优选肽聚糖结合蛋白是CBD500-500(SEQ IDNO：21)，其展现两份ply500的CBD(氨基酸残基Q150至K289)，和人工肽聚糖裂解酶EAD-CBD500-500(SEQ ID NO：23)，其双份展现ply500中的天然存在CBD。
两种依照本发明的蛋白质均展现比野生型高的对李斯特氏菌细胞的结合亲和力，而且EAD-CBD500-500还展现与ply500相比更高的在高盐浓度下的裂解活性。
另一方面，本发明涉及可用于裂解、捕捉或检测肠球菌细菌的人工肽聚糖裂解酶。本发明者使用上文所述方法组合了肠球菌内溶素Fab25VL(SEQID NO：25)和Fab20VL(SEQ ID NO：27)的域以创建与野生型酶相比展现新特性的人工肽聚糖裂解酶和肽聚糖结合蛋白。
Fab25VL是长度为317个氨基酸残基的一种内溶素，其优先结合及裂解来自屎肠球菌(Enterococcus faeciun)物种的细菌，但是也有一些来自粪肠球菌物种的菌株。位于N端的Fab25VL之EAD(氨基酸残基1至167)展现保守酰胺酶2域，其发挥N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸-酰胺酶的功能。CBD包含氨基酸残基200至317。在两个域之间观察到一个包含氨基酸残基168至199的接头区。Fab20VL是长度为365个氨基酸残基的一种内溶素，其优先结合及裂解来自粪肠球菌物种的细菌。位于N端的Fab20VL之EAD(氨基酸残基40至194)也展现保守酰胺酶_2域，其发挥N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸-酰胺酶的功能。Fab20VL之CBD(氨基酸残基215至365)在其C端部分中包含细菌SH3域，其显示与来自葡萄球菌和链球菌噬菌体的肽聚糖裂解酶的同源性。构建了Fab20VL删除氨基酸残基1至19的一种N端截短变体-Fab20K(SEQID NO：29)，其显示在大肠杆菌中的表达比Fab20VL要好。
依照本发明的一种优选肽聚糖裂解酶是SEQ ID NO：31，其兼具Fab25的EAD和CBD(氨基酸残基1至317)与Fab20VL的CBD(氨基酸残基215至365)及来自Fab20VL的短接头区段(氨基酸残基200至214)。该构建物称作EADFab25_CBD25_CBD20。EADFab25_CBD25_CBD20展现与野生型酶相比有如下新特征：扩大的宿主范围、升高的相对活细胞的裂解活性和升高的结合亲和力。
其他依照本发明的优选肽聚糖结合酶由至少两个EAD和至少两个能够检测及结合葡萄球菌细菌的CBD构成。
优选地，依照本发明的肽聚糖裂解蛋白包含标签，诸如His标签(Nieba etal.，1997，Anal.Biochem.，252，217-228)、Strep标签(Voss&Skerra，1997，Protein Eng.，10，975-982)、Avi标签(US 5,723,584；US 5,874239)、Myc标签(Evan et al.，Mol&Cell Biol，5，3610-3616)、GST标签(Peng et al.1993，ProteinExpr.Purif.，412，95-100)、JS标签(WO 2008/077397)、半胱氨酸标签(EP1399551，SEQ IDs No：6和7)、HA标签(氨基酸序列EQKLISEEDL)、FLAG标签(Hopp et al.，Bio/Technology.1988；6：1204-1210)或本领域已知的其它标签。优选地，标签偶联至依照本发明的肽聚糖裂解蛋白的C端或N端，最优选N端。标签可用于易化肽聚糖裂解蛋白的表达和/或纯化、将依照本发明的肽聚糖裂解蛋白固定化至表面或充当肽聚糖裂解蛋白检测(例如各种ELISA测定模式中借助抗体结合的检测)的标志物。
优选地，依照本发明的肽聚糖裂解蛋白包含标志物或标记物模块，诸如生物素、链霉亲合素、GFP(绿色荧光蛋白)、YFP(黄色荧光蛋白)、青色荧光蛋白、RedStar蛋白或其它荧光标志物、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、免疫金标记物、自旋标记物或本领域已知的其它标志物和标记物。可以以重组方式(in a recombinant)来搭接标志物，如果标志物是多肽性质的话，或者通过多肽残基的化学修饰来在翻译后搭接标志物。当它们在诊断中使用时，标志物或标记物对于检测依照本发明的肽聚糖裂解蛋白尤其有用。
其他优选肽聚糖裂解蛋白是构建物HGFP-CBD118-500(SEQ IDNO：33)、HGFP-CBD500-118(SEQ ID NO：35)、HGFP-CBD118L500(SEQ IDNO：37)、HGFP-CBD500L118(SEQ ID NO：39)、HGFP-CBD500-P35(SEQ IDNO：41)、HGFP-CBDP35-500(SEQ ID NO：43)、HCBD500-GFP-CBD118(SEQID NO：45)、HCBD118-GFP-CBD500(SEQ ID NO：47)、HGFP-CBD500-500(SEQ ID NO：49)、和HEAD-CBD500-500(SEQ ID NO：51)。H表示包括六个组氨酸的his标签(SEQ ID NO：53)，而GFP表示作为荧光标志物引入的绿色荧光蛋白(SEQ ID NO：55)。
所有上文所述包括his标签和GFP标志物的融合构建物均显示李斯特氏菌细胞结合活性和额外的肽聚糖裂解酶裂解活性。然而，构建物HCBD500-GFP-CBD118和HCBD118-GFP-CBD500显示GFP标志物位于N端相比于位于两个CBD域之间是优选的，因为细胞结合活性，尤其是CBD118的细胞结合活性在这些构建物中降低。
总之，本发明的目的是通过对功能域的人工组合来改变及改进野生型肽聚糖裂解酶的特性，这通过天然存在域的改组或倍增来进行。依照本发明的肽聚糖裂解酶由至少一个EAD和至少两个CBD构成，以扩大天然存在蛋白质的结合范围、和/或提高对细菌细胞壁的结合亲和力、和/或提高或改变裂解活性。依照本发明的肽聚糖结合蛋白由至少两个CBD构成，以扩大天然存在蛋白质的结合范围、和/或提高对细菌细胞壁的结合亲和力。在依照本发明的多肽中，所述至少两个CBD是从两种不同肽聚糖裂解酶(域改组)衍生或通过天然存在CBD倍增而得到的。
优选的是SEQ ID NO：7，9，13，15，17，19，21，23，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101中所示重组多肽。
在本发明的另一个优选实施方案中，上文所列的依照本发明的重组多肽包含氨基酸序列的修饰和/或改变。此类改变和/或修饰可包含突变，诸如删除、插入和添加、替代或其组合和/或氨基酸残基的化学变化，例如生物素化、乙酰基化、PEG化、氨基、SH-或羧基的化学变化。所述修饰和/或改变的重组多肽展现上文所列的各种重组多肽的单一域的活性。然而，所述每一个单一域的活性均可以高于或低于上文所述的各种重组多肽的单一域的活性。具体而言，所述单一域的活性可以是上文所列各种重组多肽的单一域的活性的约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200％或更多。单一域的活性可通过本文前面已经描述的关于测量CBD和EAD活性的测定法来加以测量。
又一方面，本发明涉及核酸分子，其包含编码依照本发明的多肽的核苷酸序列。
优选的是如下的核酸分子，其中该核酸分子包含SEQ ID NO：8，10，14，16，18，20，22，24，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102中所示核苷酸序列。
又一方面，本发明涉及包含本发明核酸序列的载体。优选地，所述载体提供所述本发明多肽在合适宿主细胞中的表达。所述宿主细胞可以仅仅根据生物技术上的理由，例如产量/产率、溶解度、成本等，来加以选择，但是也可以从医学观点来选择，例如非病理性细菌或酵母、人类细胞，如果所述细胞要对受试者施用的话。所述载体可以提供所述依照本发明的多肽的组成性或诱导型表达。
在本发明的又一方面，在用于在受试者中治疗或预防细菌感染，特别是治疗或预防由革兰氏阳性细菌像葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemoylyticus)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、产色葡萄球菌(S.chromogenes)、猪葡萄球菌(S.hyicus)、沃氏葡萄球菌和/或木糖葡萄球菌(S.xylosus))、肠球菌(例如屎肠球菌、屎肠球菌(VRE)、粪肠球菌)、链球菌(酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Spneumomae)、变异链球菌(S.mutans)、乳房链球菌(S.uberis)、无乳链球菌(S.agalactiae)、停乳链球菌(S.dysgalactiae)、兰氏A、B、C群的链球菌)、梭菌(例如产气荚膜梭菌(C.perfrmgens)、艰难梭菌(C.difficile)、破伤风梭菌(C.tetani)、肉毒梭菌(C.botulinum)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum))、芽孢杆菌(例如炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌(B.cereus))、李斯特氏菌(例如单核细胞增生李斯特氏菌、无害李斯特氏菌(L.innocua))、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenza)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphteriae)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acne)、分枝杆菌(例如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis))引起的感染的方法中采用上文所述多肽和/或细胞。或者，在用于在受试者中治疗或预防细菌感染，特别是治疗或预防由包括人类或动物致病性菌株的细菌群、科、属或种的革兰氏阴性细菌如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(埃希氏菌属(Escherichia)尤其是大肠杆菌/大肠埃希氏菌(E.coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)尤其是肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、摩根氏菌属(Morganella)、变形菌属(Proteus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)(假单胞菌属(Pseudomonas)尤其是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas))、奈瑟氏菌属(Neisseria)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、柯克斯氏体属(Coxiella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳菌属(Gardnerella)、螺旋体科(Spirochaetaceae)(密螺旋体属(Treponema)和疏螺旋体属(Borrelia))、钩端螺旋体科(Leptospiraceae)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、缠绕杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Streptobacillus)、类杆菌科(Bacteroidaceae)(类杆菌属(Bacteroides)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas))、不动杆菌属(Acinetobacter)尤其是鲍氏不动杆菌(A.baumanii)引起的感染的方法中采用依照本发明的多肽和/或细胞。
所述受试者可以是人类受试者或动物，特别是畜牧业和/或乳品业中使用的动物诸如牛。所述治疗方法涵盖以足够量将所述本发明多肽应用至感染部位或要针对感染进行预防性处理的部位。
具体而言，所述治疗方法可用于治疗或预防皮肤的、软组织的、呼吸系统、肺、消化道、眼、耳、牙、鼻咽、口、骨、阴道、伤口的感染、菌血症和/或心内膜炎。
在又一个优选实施方案中，在动物中，特别是在牲畜和奶牛中治疗(或预防)葡萄球菌感染的方法中使用依照本发明的多肽。具体而言，本发明的多肽适合于在治疗(或预防)牛乳腺炎，特别是由金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌、产色葡萄球菌、猪葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌引起的牛乳腺炎的方法中使用。
此外，本发明的多肽可以预防性用作消毒剂，特别是在手术之前或之后，或者例如在血液透析期间。类似地，可以用本发明的多肽处理早产婴儿和免疫受损的人，或者那些需要假体装置的受试者，或是预防性地或是在急性感染期间。在相同的背景中，可以用本发明的多肽处理医院内感染，尤其是由抗生素耐药性菌株像金黄色葡萄球菌(MRSA)、屎肠球菌(VRE)、铜绿假单胞菌(FQRP)或抗生素耐药性艰难梭菌引起的，预防性地或在急性期期间。在这个实施方案中，本发明的多肽也可用作消毒剂，与在消毒液中有用的其它组分如去污剂、Tensids、溶剂、抗生素、羊毛硫抗生素(Lanthibiotics)、或细菌素组合。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的多肽用于医学治疗，如果要治疗(或预防)的感染是由多重耐药性细菌菌株，特别是对一种或多种下面的抗生素耐药性的菌株引起的话：青霉素，链霉素，四环素，甲氧西林，头孢噻吩，庆大霉素，头孢噻肟，头孢菌素，万古霉素，利奈唑胺，头孢他啶，亚胺培南或达托霉素。此外，本发明的多肽可以在治疗方法中使用，即与常规抗细菌剂，诸如抗生素、羊毛硫抗生素、细菌素其它内溶素、等组合地施用它们。
依照本发明的治疗(或预防)方法中使用的施用剂量和路径取决于要治疗的具体的疾病/感染部位。在具体的实施方案中，施用路径可以是例如口服、局部、鼻咽、胃肠外、静脉内、直肠或任何其它施用路径。
为了将本发明的多肽应用至感染部位(或有感染危险的部位)，可以以这样的方式配制本发明的多肽，使得肽聚糖裂解酶针对环境影响诸如蛋白酶、氧化、免疫应答等受到保护，直至它到达感染部位。
因此，本发明的多肽可以配制成胶囊剂、糖锭剂、丸剂、栓剂、注射液或任何其它医药上合理的盖伦制剂。在一些实施方案中，这些盖伦制剂可包含合适的载体、稳定剂、调味剂、缓冲剂或其它合适试剂。
例如，对于局部应用，可以借助洗剂(lotion)或硬膏剂(plaster)来施用本发明的多肽。
对于鼻咽应用，可以在盐水中配制依照本发明的多肽以经由喷雾器应用至鼻。
对于肠的处理，例如在牛乳腺炎中，可想到栓剂配制剂。或者，可考虑口服施用。在这种情况中，本发明的多肽必须针对严酷的消化环境受到保护，直至到达感染部位。这可以例如通过使用细菌作为载体来实现，细菌可以经过胃中的初始消化步骤而存活，并随后将本发明的多肽分泌入肠环境。
所有医学应用均依赖于本发明多肽在遭遇致病性细菌时特异性且立即地加以裂解的效果。这通过提供致病性细菌和细菌载荷降低及同时援救免疫系统，对所处理受试者的健康状况产生直接影响。如此，本领域技术人员面对的主要任务是为要治疗的各种疾病精确地配制本发明的多肽。为了这个目的，通常可使用与这些应用的常规药物所采用的相同的盖伦制剂。
在本发明的又一方面，上文所述多肽和/或细胞是药物组合物的一种成分，所述药物组合物任选包含载体物质。
在又一方面，多肽和/或细胞是化妆品组合物的一部分。如上所述，数种细菌能在患者身体暴露于环境的表面，诸如皮肤上引起刺激。为了预防此类刺激或为了消除所述细菌病原体的微小症候，可采用专用的化妆品制备物，其包含足够量的本发明多肽以裂解已存在的或新定殖的致病性细菌。
在又一方面，本发明涉及所述依照本发明的多肽在食物中、在食品加工设备上、在食品加工厂中、在会接触食物的表面诸如架子和食物存储区上及在所有其它致病性、兼性致病性或其它不期望的细菌会潜在感染食物材料的情形中的用途。
在又一方面，本发明涉及所述依照本发明的多肽在细菌感染的诊断中的用途。在这个方面，依照本发明的多肽用作特异性裂解致病性细菌的工具。通过添加去污剂如Triton X-100或其它可削弱细菌细胞包膜的添加剂如多粘菌素B，可帮助依照本发明的多肽对细菌细胞的裂解。需要特异性细胞裂解作为初始步骤，随后使用基于核酸的方法如PCR、核酸杂交或NASBA(基于核酸序列的扩增)、免疫学方法如IMS、免疫荧光或ELISA技术、或其它依赖于细菌细胞的细胞内容物的方法如使用对独特细菌群或种特异性的蛋白质(例如β-半乳糖苷酶之于肠细菌、凝固酶之于凝固酶阳性菌株)的酶测定法，来特异性地检测细菌。
本发明的另一个方面是依照本发明的肽聚糖结合蛋白用于在样品中结合、富集、清除、捕捉及检测致病性或其它方面不期望的细菌的用途。关于依照本发明的方法的样品是任何被认为应当含有细菌或含有细菌的材料，而细菌是检测、结合、富集、清除或捕捉的靶物。样品可以是食品或饲料材料、表面材料或者人类或兽医诊断探针。细菌检测是藉由检测连接于依照本发明的肽聚糖结合蛋白的标志物、或通过检测所述蛋白质自身(例如通过免疫学方法如ELISA)来实施的。对于依照本发明的方法，依照本发明的肽聚糖结合蛋白可以固定化在合适的支持结构上，例如微量滴定板、测试条、载玻片、晶片、滤材、反应管、磁铁、玻璃或胶乳颗粒、移液器尖头或流通室槽。支持材料可以包括例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、PMMA、乙酸纤维素、硝酸纤维素、玻璃、硅晶片、胶乳。固定化可以通过吸附、通过共价结合或通过其他蛋白质来实现，其中共价结合是优选的。重要的是，固定化是功能性的，就是说，所述肽聚糖结合蛋白展现细菌可到达的结构，尽管它们结合于支持材料。
实施例
实施例1：DNA技术和克隆规程
采用依照Sambrook et al.，Molecular cloning.A laboratory manual；2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989的DNA技术和克隆规程来构建编码基于内溶素的融合蛋白的质粒。质粒pQE-30(QIAGEN)及其衍生物pHGFP、pHGFP_CBD118、pHGFP_CBD500(Loessner et al.2002)、和pHEADPSA(Korndoerfer et al.2006)作为载体骨架用于构建编码N端带6xHis标签的人工融合蛋白的质粒(H代表His标签)。借助引物引入将片段插入质粒需要的限制性位点。或是通过分别扩增两个CBD片段并随后连接，或是通过经由基于PCR的通过交叠延伸进行的基因剪接(SOE PCR)方法(Horton et al.1990)来融合两个片段，创建双重CBD融合构建物。藉由EcoRI/MunI位点以两个取向(in both orientation)连接CBD118(SEQ ID NO：57)和CBD500(SEQ ID NO：58)编码片段，然后插入pHGFP的SacI/SalI位点，产生pHGFP_CBD118-500和pHGFP_CBD500-118。通过相同方式，创建质粒pHGFP_CBDP35-500和pHGFP_CBD500-P35。对于pHGFP_CBD118L500和pHGFP_CBD500L118，通过SOE PCR在两个CBD之间引入编码PlyPSA接头的片段，然后插入pHGFP。对于pHCBD500_GFP_118和pHCBD118_GFP_500，首先通过SOEPCR藉由KpnI位点融合5’CBD和GFP片段，然后分别连接入pHGFP_CBD118和pHGFP_CBD500的BamHI/SacI位点，替换这些质粒中仅有的GFP片段。为了构建pHGFP_CBD500-500，将CBD500片段克隆入pHGFP_CBD500的SacI位点，使得CBD500加倍。通过将完整ply500基因插入pHGFP_CBD500的BamHI/SacI位点，替换GFP片段，而创建pHEAD_CBD500-500。所有构建物均省略除3’端处之外的所有终止密码子以容许遗传融合。普遍在3’端处导入TAA作为终止密码子。所有构建物通过核苷酸测序得到证实。
实施例2：带His标签的重组蛋白的过表达和纯化
在大肠杆菌XL1-Blue MRF’(Stratagene)中实施带His标签的(各构建物中缩写为“H”)融合蛋白的过表达。于30℃在含有100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml四环素(以进行质粒选择)的改良LB培养基(15g/l胰蛋白胨、8g/l酵母提取物、5g/l NaCl)中培养各菌株，一旦OD600达到0.5就添加0.1-1mMIPTG作为诱导物。于30℃再温育4小时后，将生成含有GFP域的蛋白质的培养物于4℃保存过夜，之后收获，并且将每250ml的培养物在5ml缓冲液A(500mM NaCl、50mM Na2HPO4、5mM咪唑、0.1％Tween 20，pH 8.0)中。若果不存在GFP，那么诱导后4小时离心沉降细胞。通过两次穿过100MPa的French Press 20K室(SLM Aminco)来破碎细胞，并通过离心和过滤(0.2μMPES膜，Millipore)来除去细胞碎片。
使用Micro Biospin柱(BIORAD)通过固定化金属亲和层析(IMAC)及Ni-NTA Superflow树脂(QIAGEN)来纯化粗提取物中的带6xHis标签的靶蛋白。以缓冲液B(500mM NaCl、50mM Na2HPO4、250mM咪唑、0.1％Tween20，pH 8.0)为洗脱缓冲液。将纯化的蛋白质针对更换两次的透析缓冲液(100mM NaCl、50mM NaH2PO4、0.005％至0.1％Tween 20，pH 8.0)透析，过滤(0.2μM PES膜，Millipore)，添加50％(v/v)甘油后保存于-20℃。对于每一种蛋白质，通过SDS-PAGE来分析过表达和纯化的过程，并以分光光度法(NanoDrop ND-1000分光光度计)测定蛋白质浓度。
实施例3：结合测定法和荧光显微术
使用所有种和血清变型的李斯特氏菌菌株的一个代表组(表1)通过结合来检查GFP-CBD融合蛋白的结合特性。将PBST缓冲液(50mM NaH2PO4、120mM NaCl，pH 8.0、0.01％Tween 20)中每一种菌株的晚期对数期细胞与过量的GFP-CBD蛋白一起于室温温育5分钟。用缓冲液清洗两次后，将细胞准备好进行荧光显微术，使用Axioplan显微镜和激发BP为450-490nm、分光器FT为510nm、且发射LP为520nm的滤光片组(Carl ZeissAG)。通过使用LeicaDFC320照相机来获得经标记细胞的照片。对于每一项测定，通过目视检查来评估结合强度，使用四级打分系统：++，+，(+)，和-分别表示强、弱、很弱和无结合。
构建物HGFP_CBD500-118和HGFP_CBD118-500(其中两个细胞壁结合域都以两个取向直接彼此融合，且连接有N端GFP域)都显示对测试的血清变型4、5、和6菌株的所有菌株的弱结合。这符合单独的CBD500的结合样式，因此这些结果提示CBD118在这些构建物中没有功能。另一方面，显示了CBD500不需要位于蛋白质的C端来保留功能性。在融合构建物中两个结构域的柔性增强可使得CBD118有功能的假设下，我们创建了蛋白质HGFP_CBD500L118和HGFP_CBD118L500，它们包括PlyPSA的接头肽来使各CBD分开。同样，两种构建物均标记了属于血清变型4、5、和6菌株的所有菌株，但是另外还测试了七种血清变型1/2菌株中的四种。根据荧光显微术，观察到后者主要在两极和隔膜位置被标记，如对HGFP_CBD118观察到的那样。相反，两种蛋白质都使血清变型4、5、和6的菌株染色，在细胞表面上均匀分布，像HGFP_CBD500一样。由此可见，这些双重CBD构建物结合了两种CBD的特性，尽管它们在血清变型1/2、3、和“7”内的结合范围比HGFP_CBD118的要窄。引入短接头不仅使CBD118能够到达其配体，而且它还增强C端位置的CBD500的结合。融合蛋白HGFP_CBD118L500展示与HGFP_CBD500同等强的对大多数血清变型4、5、和6细胞的染色。另外，生成了两种融合构建物，其中将GFP放置在中央位置，而CBD500和CBD118或是位于N端或是位于C端。在HCBD500_GFP_CBD118中，CBD118直接连接于GFP的C端，从而使其处于与HGFP_CBD118中相同的环境中。这种蛋白质能够标记测试的所有血清变型1/2菌株，尽管染色很弱。构建物HCBD_118GFP_CBD500(其中各CBD取向相反)强结合了大多数血清变型4、5、和6菌株，但是只弱标记了一种血清变型1/2菌株。同样，CBD500在位于C端时显示出更强的结合。然而，证明了它在位于N端位置时也是功能性的(HCBD500_GFP_CBD118)。
Figure BDA0000056076110000231
Figure BDA0000056076110000241
在又一种办法中，双重CBD融合构建物中的CBD118被CBDP35(SEQ IDNO：59)替换。噬菌体P35的内溶素的CBD强标记了血清变型1/2和3的大多数菌株以及血清变型4、5、和6的一些菌株，分布均匀地结合在全部细胞表面上。新构建的蛋白质HGFP_CBD500-P35和HGFP_CBDP35-500所呈现的结合样式几乎就是Ply500和PlyP35的各单一CBD的结合样式的组合：它们对所有被CBD500和/或CBDP35结合的菌株均展示强结合，无论各单一CBD在融合物中的定位如何。这些结果证明了来自不同肽聚糖裂解酶的两种细胞壁结合域的组合在人工融合蛋白中能完全发挥功能，即使当它们不是在C端位置时。
实施例4：通过表面等离振子共振分析(SPR)测定结合亲和力
使用BIAcore X仪器和Cl传感器芯片(BIAcore，Uppsala，Sweden)通过表面等离振子共振分析来测定HGFP_CBD500(SEQ ID NO：60)和HGFP_CBD500-500对单核细胞增生李斯特氏菌WSLC 1042的细胞壁的亲和力。将芯片表面用胺偶联法活化，并在两个流动室(70μl 0.5mg/ml蛋白质，在10mM乙酸钠缓冲液pH 5中，流速5μl/min)中用HGFP-CBD500分子包被。然后在HBS缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005％Tween 20，pH 7.8)中将热灭活的WSLC 1042细胞结合至流动室Fc2(3.0x 1010个细胞/ml；15μl，流速3μl/min)中的固定化CBD。最后，测量固定化细胞与HBS缓冲液中3种不同浓度的HGFP_CBD500(50nM、100nM、200nM)和HGFP_CBD500-500(12.5nM、25nM、50nM)之间的相互作用(30μl，10μl/min)，Fcl充当参照室。结合期测量3分钟，解离期测量12分钟。所有步骤于25℃进行。采用“1∶1结合有质量转移”模型用BIAevaluation软件4.1版(BIAcore)实施动力学数据的评估。表2中给出了每一种蛋白质测量三种浓度获得的平衡结合常数。
表2：HGFP_CBD500和HGFP_CBD500-500结合单核细胞增生李斯特氏菌WSLC 1042细胞壁的平衡亲和常数(KA)。
Figure BDA0000056076110000261
Figure BDA0000056076110000271
与包含噬菌体A500内溶素ply500的天然CBD的HGFP_CBD500相比，包含人工双重CBD的构建物HGFP_CBD500-500显示出以高大约50倍的亲和力结合固定化李斯特氏菌细胞。比较单CBD与双CBD蛋白构建物二者的传感图，显而易见的是两种构建物的主要区别在解离期。一旦结合至细胞表面，HGFP_CBD500解离比HGFP_CBD500-500要快得多，结果是双CBD构建物的整体亲和力更高。
实施例5：光度测定裂解测定法
通过光度测定裂解测定法测定野生型和嵌合肽聚糖裂解酶的裂解活性。制备单核细胞增生李斯特氏菌菌株WSLC 1001(血清变型1/2c)和WSLC1042(血清变型4b)的底物细胞，方法是在TB培养基中培养细菌直至对数晚期，并将它们以50倍浓度在PBS缓冲液(50mM NaH2PO4、120mM NaCl，pH 8.0)中冷冻。以总体积1ml进行测定，细胞在PBS中稀释至初始OD600为大约1.0。将所有要比较的纯化的天然内溶素和嵌合蛋白以20μl体积以等摩尔量添加至细胞，并以15秒为间隔测量600nm处的OD，最多10分钟。所使用的酶浓度的范围为30至152pmol/ml。对于阴性对照，将20μl缓冲液添加至细胞。所有测定一式三份进行。Loessner等人(2002，Mol.Microbiol.44，335-349)提出离子相互作用是CBD结合其在细胞壁中的配体的分子基础。内溶素ply500的CBD在NaCl浓度大约100mM显示出最佳结合，而且结合能力随盐浓度升高而降低。基于这一点，在高盐浓度下比较了带his标签的野生型ply500(HPL500)与依照本发明利用天然存在的CBD500倍增而得到的构建物ply500H_EAD_CBD500-500的裂解活性。如上所述进行测定，但是使用多个NaCl浓度(介于1M和2M之间)。将光度测定曲线标准化并根据对照测定的数据来校正(校正值＝值+(1-对照值))。使用软件SigmaPlot 9.0(Systat Software，Inc.)用下面的S型函数拟合所得曲线：f＝y0+a/(1+exp(-(x-x0)/b))^c。确定该函数的最陡斜率，其对应于相对酶活性。
令人惊讶地，在1M NaCl或更高的盐浓度，依照本发明的肽聚糖裂解酶H_EAD_CBD500-500显示出比天然存在的酶ply500要高的裂解活性。
实施例6：肠球菌内溶素的蛋白质表达和纯化
在大肠杆菌HMS174DE3中表达并自其分离肠球菌内溶素Fab25VL、Fab20VL、Fab20K、和依照本发明的肽聚糖裂解酶EADFab25_CBD25_CBD20。用1mM IPTG诱导后，于37℃进行3小时的蛋白质表达。通过离心(5000rpm，15分钟，4℃)收获细菌细胞沉淀，在25ml缓冲液A(25mM Tris pH 8.0、500mM NaCl、20mM咪唑、0.1％Tween 20、10％甘油)中重悬浮，并在微型流化仪中破碎细胞。通过离心(12000rpm，5分钟，4℃)除去细菌细胞碎片。对上清液进行硫酸铵沉淀至30％饱和。通过离心(12000rpm，5分钟，4℃)收集沉淀物。将包含内溶素的上清液应用至使用5ml PhenylSepharose柱(High Sub FF，Amersham)的疏水层析。用10倍体积的缓冲液B(25mM Tris pH 7.0、500mM NaCl、30％硫酸钠、10％甘油)清洗柱。用10个柱体积的缓冲液C(25mM Tris pH 7.0、500mM NaCl、10％甘油)洗脱内溶素。对含有蛋白质的级分在考马斯染色的SDS凝胶上分析内溶素。合并含有内溶素的级分，并依照实施例7在板裂解测定法中分析裂解活性。
实施例7：通过板裂解测定法来测试肽聚糖裂解蛋白针对肠球菌细菌的裂解活性和宿主范围
将多种来自医学相关物种屎肠球菌和粪肠球菌的肠球菌属细菌在3mlBHI培养基的预培养物中于37℃培养过夜。对于每一种菌株，将2ml预培养物接种入25ml新鲜培养基，并温育至OD600nm达到1左右。通过于4℃以4500rpm离心15分钟来收获细菌细胞。将细胞离心沉淀在500μl BHI培养基中重悬浮。为了测试针对热灭活的细胞的裂解活性(表3)，将细胞于85℃温育45分钟，并通过以1400rpm离心来收集。将细胞离心沉淀在10ml LB顶层琼脂中重悬浮，并将顶层琼脂倾倒在LB板上。为了测试针对活细胞的裂解活性(表4)，将肠球菌预培养物在1ml BHI培养基中培养过夜，将预培养物与10ml BHI顶层琼脂混合，倾倒在LB板上，并于30℃温育2小时。使用肠球菌内溶素Fab25VL、Fab20K、内溶素Fab25VL与Fab20K等摩尔组合、和依照本发明的人工酶EADFab25_CBD25_CBD20。将每份5μl的肽聚糖裂解性蛋白质溶液用移液器点加到浸没在顶层琼脂中的菌苔上。将板于30℃温育18小时后使用四级得分系统分析点的蛋白质溶液周围的裂解图的出现：+++、++、+、和-分别表示强、中等、弱、弱和无裂解。
表3：使用肽聚糖裂解酶针对热灭活的肠球菌细胞的板裂解测定法
Figure BDA0000056076110000291
表4：使用肽聚糖裂解酶针对活的肠球菌细胞的板裂解测定法
Figure BDA0000056076110000292
Figure BDA0000056076110000301
发现使用热灭活的肠球菌细胞(表3)，内溶素Fab20K高效裂解所有粪肠球菌菌株，但是不裂解屎肠球菌。Fab20内溶素似乎是对粪肠球菌菌株特异性的。Fab25VL高效裂解所有屎肠球菌菌株，但是只裂解两种粪肠球菌菌株。其它粪肠球菌菌株被以中等效率裂解或根本不被裂解。因此，天然存在内溶素Fab25VL不是严格对屎肠球菌特异性的，但是比来自粪肠球菌种的菌株更可靠地裂解来自这个种的菌株。两种内溶素Fab25VL和Fab20K的1∶1混合物高效裂解了测试的所有菌株，但是只使用一种依照本发明的酶即EADFab25_CBD25_CBD20(其兼具Fab25VL和Fab20K的CBD，但是只具有Fab25VL的EAD)就实现了这一点。只使用一种酶而非两种酶可简化酶生产，降低花费，且可最大程度地减少治疗性应用中的免疫学反应。在用活细胞进行测定的情况下(表4)，使用依照本发明的酶EADFab25_CBD25_CBD20的优点更加突出。尽管Fab25VL在这些测定条件下主要裂解屎肠球菌细胞，而且只低效裂解一些粪肠球菌细胞，但是内溶素Fab20K根本不起作用。活的细胞根本不被裂解，提示可能在活的细胞中内溶素结合的细胞编码受体或肽聚糖裂解的底物分子无法触及。两种酶的组合没有改善这种情况，但是使用EADFab25_CBD25_CBD20进行的细胞裂解得到了好得多的结果。测试的所有菌株至少被低效裂解，大多数菌株被高效裂解。这个出乎意料的结果显示，依照本发明的人工肽聚糖裂解酶在特定用途中可具有有利效果，即使初步表征提示的是使用多于一种CBD在细菌宿主范围上的纯叠加效应。
实施例8：肽聚糖裂解酶针对肠球菌的最小杀细菌浓度(MBC)的测定
将粪肠球菌菌株17在BHI培养基中于37℃培养过夜。将预培养物1∶10稀释入25ml新鲜培养基，并于37℃温育至OD600nm达到1左右。通过于4℃以4500rpm离心5分钟来收获细菌细胞，并将细胞离心沉淀在裂解缓冲液(包括2mM CaCl2、10mM BSA的PBS(2.25mM NaH2PO3、7.75mM Na2HPO3、150mMNaCl))中重悬浮至浓度为105cfu/ml。将Fab25VL和EADFab25_CBD25_CBD20的蛋白质溶液(1mg/ml)在裂解缓冲液中连续稀释至50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml、0.005μg/ml、0.0005μg/ml、和0.00005μg/ml。将450μl细胞悬浮液与50μl每一种浓度的蛋白质溶液混合，并于37℃温育1小时。作为对照，温育未添加蛋白质的裂解缓冲液。将100μl 1∶10和1∶100稀释的裂解样品涂布至LB琼脂板，于37℃温育1天，并对经过肽聚糖裂解酶裂解仍生存的细胞计数。例如，MBC 99.9％定义为使初始细菌细胞浓度降低1000倍的最低酶浓度。在这种情况中，存活细胞的cfu/ml必须低于102。
观察到使用依照本发明的肽聚糖裂解酶EADFab25_CBD25_CBD20针对粪肠球菌菌株17的MBC比天然存在的酶Fab25VL要低。EADFab25_CBD25_CBD20的MBC 99.9％为0.05ug/ml，而使用Fab25VL为5μg/ml。这个结果提示EADFab25_CBD25_CBD20对细菌细胞的结合亲和力更高和/或裂解活性升高。使用依照本发明的多肽，杀死病原性细菌需要使用的蛋白质要少100倍。
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Claims (16)

1.具有结合及裂解细菌的活性的重组多肽，其包含至少一个酶活性域和至少两个细菌细胞结合域。
2.具有结合细菌的活性的重组多肽，其包含至少两个细菌细胞结合域。
3.依照权利要求1的重组多肽，其包含两个酶活性域。
4.依照权利要求1、2或3中任一项的重组多肽，其中所述酶活性域和/或细菌细胞结合域衍生自两种不同的肽聚糖裂解酶。
5.依照权利要求1至4中任一项的重组多肽，其中所述酶活性域选自下组：
酰胺酶_5(噬菌体肽聚糖水解酶，pfam05382)，酰胺酶_2(N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶，pfam01510)，酰胺酶_3(N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶，pfam01520)，Transgly(转糖酶，pfam00912)，肽酶_M23(肽酶家族M23，pfam01551)，内溶素_自溶素(CD00737)，水解酶_2(细胞壁水解酶，pfam07486)，CHAP(酰胺酶，pfam05257)，转糖酶(转糖酶样域，pfam06737)，MtlB(膜结合的裂解性胞壁质转糖酶B，COG2951)，MtlA(膜结合的裂解性胞壁质转糖酶A，COG2821)，MtlE(膜结合的裂解性胞壁质转糖酶E，COG0741)，噬菌体_λ_溶菌酶(N-乙酰基胞壁酸与N-乙酰基葡糖胺之间的键的裂解，CD00736)，肽酶_M74(青霉素不敏感性胞壁质内肽酶，pfam03411)，SLT(转糖酶SLT，pfam01464)，Lys(C型溶菌酶/α-乳清蛋白家族，pfam00062)，COG5632(N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶，COG5632)，MepA(胞壁质内肽酶，COG3770)，COG1215(糖基转移酶，COG1215)，AmiC(N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶，COG0860)，Spr(细胞壁相关水解酶，COG0791)，噬菌体_T4样_溶菌酶(N-乙酰基胞壁酸与N-乙酰基葡糖胺之间的键的裂解，cd00735)，LT_GEWL(裂解性转糖酶(LT)和鹅卵白溶菌酶(GEWL)域，cd00254)，肽酶_S66(LD-羧肽酶，pfam02016)，Glyco_hydro_70(糖基水解酶家族70，pfam02324)，Glyco_hydro_25(糖基水解酶家族25)，VanY(D-丙氨酰基-D-丙氨酸羧肽酶，pfam02557)，和LYZ2(溶菌酶亚家族2，smart 00047)。
6.依照权利要求1至4中任一项的重组多肽，其中所述细菌细胞结合域选自下组：SH3_5(细菌SH3域，pfam08460)，SH3_4(细菌SH3域，pfam06347)，SH3_3(细菌SH3域，pfam08239)，SH3b(细菌SH3域同源物，smart00287)，LysM(在多种涉及细胞壁降解的酶中发现的LysM域，pfam01476和cd00118)，PG_结合_1(推定的肽聚糖结合域，pfam01471)，PG_结合_2(推定的肽聚糖结合域，pfam08823)，MtlA(来自胞壁质降解性转糖酶的肽聚糖结合域，pfam03462)，Cpl-7(Cpl-7溶菌酶的C端域，pfam08230)，CW_结合_1(推定的细胞壁结合重复，pfam01473)，LytB(推定的细胞壁结合域，COG2247)，和LytE(LysM重复，COG1388)。
7.依照权利要求1至6中任一项的重组多肽，其中所述域的长度在长约15个至约250个氨基酸残基的范围内，特别是长度在约20个至约200个氨基酸残基的范围内，更特别的是长度为约15个至约40个氨基酸残基。
8.依照权利要求1至7中任一项的重组多肽，其中所述酶活性域和/或所述细菌细胞结合域衍生自选自下组的野生型肽聚糖裂解酶：Ply500，Ply511，Ply118，Ply100，PlyP40，Ply3626，phiLM4内溶素，PlyCD119，PlyPSAa，Ply21，PlyBA，Ply12，PlyP35，PlyPH，PlyL，PlyB，phi11内溶素，phi MR11内溶素，phi12内溶素，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)噬菌体PVL酰胺酶，plypitti26，ΦpSA2usa内溶素，沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)M噬菌体ΦWMY的内溶素PlyGBS，B30内溶素，Cpl-1，Cpl-7，Cpl-9，Plyg，PlyC，pal酰胺酶，Fab25，Fab20，来自粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)V583原噬菌体的内溶素，溶葡萄球菌素，噬菌体PL-1酰胺酶，头状葡萄球菌(S.capitis)ALE-1内肽酶，变溶菌素(球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)ATCC 21553的N-乙酰基胞壁质酶)，肠溶素A(来自粪肠球菌LMG 2333的细胞壁降解性细菌素)，LysK，LytM，来自单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的Ami自溶素，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)噬菌体ΦpKZ和EL的内溶素，T4溶菌酶，gp61胞壁质酶，和STM0016胞壁质酶。
9.依照权利要求8的重组多肽，其中所述衍生自PlyP40的酶活性域是由依照SEQ ID NO：103的氨基酸序列编码的和/或其中所述衍生自PlyP40的细菌细胞结合域是由依照SEQ ID NO：104的氨基酸序列编码的。
10.如SEQ ID NO：7，9，13，15，17，19，21，23，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101中所示的重组多肽。
11.核酸分子，其包含编码依照权利要求1至10中任一项的重组多肽的核苷酸序列。
12.依照权利要求11的核酸分子，其中所述核酸分子包含如SEQ ID NO：8，10，14，16，18，20，22，24，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102中所示的核苷酸序列。
13.载体，其包含依照权利要求11或12的核酸分子。
14.依照权利要求1至9中任一项的重组多肽，其用作药物。
15.依照权利要求1至9中任一项的重组多肽作为医学、公共或私人环境中的消毒剂，作为工业、动物饲料或化妆品工业中的细菌污染的去污剂或作为针对受细菌污染的表面的表面活性剂的用途。
16.依照权利要求1至9中任一项的重组多肽作为医学、食品或饲料诊断或环境诊断中的诊断手段的用途。
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