CN103201381A - 新的细胞内溶素 - Google Patents

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S.R.布兰科多桑托斯
L.D.克鲁斯肯斯
R.拉维格尼
M.瓦尔马格
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Abstract

本发明涉及具有细胞内溶素活性的多肽，其具有依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列，以及所述多肽的片段或衍生物。此外，本发明涉及编码所述多肽或其片段或衍生物的核酸分子，包含所述核酸分子的载体，以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及所述多肽、或其片段或衍生物用作药物，尤其是用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染、作为诊断手段、作为化妆物质或作为消毒剂。本发明还涉及所述多肽或其片段或衍生物用来处理或防止食品、食品加工设备、食品加工工厂，与食品接触的表面、医疗设备、医院和诊所的表面的细菌污染，尤其是革兰氏阴性污染。此外，本发明涉及包含所述多肽或其片段或衍生物的药物组合物。

Description

新的细胞内溶素
技术领域
本发明涉及具有细胞内溶素活性的多肽，其具有依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列，以及所述多肽的片段或衍生物。此外，本发明涉及编码所述多肽或其片段或衍生物的核酸分子，包含所述核酸分子的载体，以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及所述多肽、或其片段或衍生物用作药物，尤其是用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染、作为诊断手段、作为化妆物质或作为消毒剂。本发明还涉及所述多肽或其片段或衍生物用来处理或防止食品、食品加工设备、食品加工工厂，与食品接触的表面、医疗设备、医院和诊所的表面的细菌污染，尤其是革兰氏阴性污染。此外，本发明涉及包含所述多肽或其片段或衍生物的药物组合物。
发明背景
革兰氏阴性细菌具有外膜，其特点为特征性的不对称双分子层。外膜的双分子层由含有磷脂(主要为磷脂酰乙醇胺)的内侧单分子层和主要由单一糖脂——脂多糖(LPS)构成的外侧单分子层组成。在细菌界，LPS结构具有广阔的多样性，且LPS结构可响应主导的环境条件而受到修饰。LPS层的稳定性以及不同LPS分子之间的相互作用主要通过二价离子(Mg2+、Ca2+)与LPS分子的阴离子组分(脂质A中的磷酸基团和KDO的内核和羧基基团)的静电相互作用达成。此外，由于缺乏不饱和脂肪酸所致，脂质A疏水部分的密集而有序的包装形成具有高粘性的刚性结构。这使其较不易被亲脂性分子渗透，并赋予外膜(OM)额外的稳定性。
已知多种类型的具有杀菌或抑菌活性的试剂，例如抗生素、细胞内溶素、抗微生物肽和防卫素。然而，微生物对抗生素的增加的抗性对于治疗越来越多由细菌导致的感染造成困难。革兰氏阴性细菌如肠杆菌科，诸如沙门氏菌属(Salmonella sp.)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)导致的感染产生了特别的困难。
细胞内溶素为细菌噬菌体(或细菌的病毒)编码的肽聚糖水解酶。其在噬菌体复制的裂解周期中的晚期基因表达过程中合成，并通过降解细菌肽聚糖来介导后代病毒体从受感染的细胞的释放。其为β(1,4)-糖基化酶(溶菌酶)、糖基转移酶、酰胺酶或内肽酶。细胞内溶素的抗微生物应用已经在1991年由Gasson(GB2243611)提出。尽管细胞内溶素的杀灭能力久为人知，由于抗生素的成功和主宰地位，这些酶作为抗细菌剂的用途一直受忽略。仅在多重抗生素耐药性细菌出现后，用细胞内溶素对抗人类病原体这一简单概念方才受到注意。出现了开发完全新类型的抗细菌剂的令人瞩目的需求，且用作酶抗生素(enzybiotics)(“酶”和“抗生素”的糅合术语)的细胞内溶素完美地符合该需求。在2001年，Fischetti及其同事首次阐明了细菌噬菌体Cl细胞内溶素对A组链球菌的治疗潜力(Nelson等，2001)。从此，许多文献确立了细胞内溶素作为控制细菌感染，特别是革兰氏阳性细菌的细菌感染的有吸引力和补充的替代手段。接着，针对其他革兰氏阳性病原体如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)(Loeffler等,2001)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)(Schuch等,2002)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(Cheng等,2005)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(Rashel等,2007)的不同的细胞内溶素证明了其作为酶抗生素的效力。目前，细胞内溶素疗法面临的最严重的挑战在于革兰氏阴性细菌对细胞内溶素的外源作用不敏感，这是由于外膜屏蔽了细胞内溶素接触肽聚糖。这一点目前阻碍了有效的内溶素范围扩展到重要的革兰氏阴性病原体。
抗微生物肽(AMP)代表一大类短的、阳离子性或两亲性(amphipatic)、由基因编码的肽抗生素，其可见于几乎所有生物。不同的AMP显示不同的特性，且该类型中的许多肽不仅作为抗生素，还作为细胞穿透肽的模板正经受彻底的研究。尽管分享一些共同特征(例如，阳离子性，两亲性和小尺寸)，AMP序列变化极大，且已提出至少四种结构组(α-螺旋，β-片层，延伸型(extended)和环状(looped))引起观察到的AMP构象的多样性。同样，已提出了几种其作为抗生素的作用模式，且显示例如许多这些肽的主要靶是细胞膜，而对于其他肽，主要靶是细胞质侵袭和核心代谢功能的扰乱。尽管缺乏特异性靶结合，AMP可变得足够集中(concentrated)以显示协作活性(cooperative activity)，例如，通过在膜上形成孔，如对于大部分AMP的情况下。然而，该现象仅在模式磷脂双分子层中观察到，且在一些情况下，需要在膜中AMP的浓度高至每六个磷脂分子一个肽分子来使这些事件发生。所述浓度接近甚至可达到全膜饱和。因为对于AMP最低抑制浓度(MIC)通常在低微摩尔范围，可理解地，对于这些阈值的相关性及其在体内的重要性产生了怀疑(Melo等,Naturereviews,Microbiology,2009,245)。
防卫素是由小的、阳离子性、富含半胱氨酸和精氨酸的抗微生物肽构成的一个大家族，见于脊椎动物和无脊椎动物两者。防卫素根据半胱氨酸的间隔样式(spacing pattern)分为五个组：植物、无脊椎动物、α-、β-和θ-防卫素。后三种主要见于哺乳动物。α-防卫素为见于嗜中性粒细胞和肠上皮细胞的蛋白质。β-防卫素为最广泛分布的，并由白细胞和许多类型的上皮细胞所分泌。θ-防卫素目前很少见，例如见于猕猴(rhesus macaques)的白血病。防卫素对细菌、真菌和许多有包膜和无包膜病毒有活性。然而，多数情况下有效杀灭细菌所需的浓度较高，即在微摩尔范围。许多肽的活性在生理盐条件、二价阳离子和血清的存在下受限。取决于疏水氨基酸残基的含量，防卫素亦显示溶血活性。
因此，存在对针对革兰氏阴性细菌的新型抗微生物剂的需要。
发明概要
本发明涉及新的具有细胞内溶素活性的多肽，其从肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritis)噬菌体PVPSE1分离而来，可用于制备针对革兰氏阴性细菌的新型抗细菌剂。
本发明的第一个目的提供涂有具有细胞内溶素活性的多肽，其包含依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或其片段或衍生物。
包含依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽优选由依照SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码。
在一个优选的实施方案中所述片段包含依照SEQ ID NO:3和/或5的氨基酸序列，优选分别由核苷酸序列SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:6编码。
在另一个优选的实施方案中所述衍生物在依照SEQ ID NO:1、3和/或5的氨基酸序列中具有缺失、添加、插入和/或取代。
在另一个优选的实施方案中，所述依照本发明的多肽或其片段或衍生物在N-或C-段融合于具有破坏膜或LPS活性的肽段，尤其是阳离子性或多聚阳离子性肽。
所述肽、片段或其衍生物或融合蛋白可以进一步包含标签，优选His6-标签。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述多肽包含依照SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
本发明的另一个目的涉及这样的融合蛋白，其包含依照前述任一项权利要求的多肽以及在N端或C端融合于所述多肽的肽段，其中所述肽段是阳离子性肽、多聚阳离子性肽、两亲肽、寿司肽(sushi peptide)、防卫素、疏水性肽和/或抗微生物肽。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述肽段包含约5至约100个氨基酸残基，尤其是约5个至50个氨基酸残基，尤其是约5个至30个氨基酸残基。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述阳离子性和/或多聚阳离子性肽段包含选自下组的至少一个氨基酸残基：精氨酸、组氨酸和赖氨酸残基，尤其是其中所述肽段中包含的至少70%的氨基酸残基是精氨酸、组氨酸和/或赖氨酸残基，尤其是精氨酸和/或赖氨酸残基。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述两亲肽包含至少一个选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的荷正电的氨基酸残基，与至少一个选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基的疏水性氨基酸残基组合，其中所述两亲肽中的至少70%的所述氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸残基，而所述两亲肽中的大约30%的所述氨基酸残基为缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸或甘氨酸残基。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述肽段包含依照SEQ ID NO:14-19的氨基酸序列。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述融合蛋白包含依照SEQ IDNO:13的氨基酸序列。
本发明的另一个目的涉及包含依照SEQ ID NO:13的核酸分子的载体。
本发明的另一个目的提供编码依照本发明的多肽、其片段或衍生物、或融合蛋白的分离的核酸分子。
本发明的另一个目的涉及包含依照本发明的核酸分子的载体。
本发明的另一个目的涉及包含依照本发明的核酸分子或依照本发明的载体的宿主细胞。
本发明的另一个目的涉及依照本发明的多肽、片段或衍生物或依照本发明的融合蛋白作为人医学、兽医医学或诊断物质，作为食物中或化妆品上的抗微生物剂，作为消毒剂或在环境领域中使用。
在一个优选的实施方案中，所述依照本发明的多肽、片段或衍生物或融合蛋白在制备用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染的药物中使用。
另一个优选的实施方案涉及所述所述依照本发明的多肽、片段或衍生物或融合蛋白用于处理或防止食品、食品加工设备、食品加工工厂、与食品接触的表面、医疗设备、医院及诊所中的表面的革兰氏阴性细菌污染的用途。
本发明的另一个优选的实施方案涉及包含本发明的多肽或本发明的融合蛋白的药物组合物。
详细说明
附图说明
下列附图用于例示本发明。
附图1显示了使用BLASTp和Pfam分析系统对野生型模块性肠炎沙门氏菌细胞内溶素PVPSE1gp146的功能性分析。氨基酸和DNA和氨基酸序列，如它们在野生型噬菌体中出现的，分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。预测的N端肽聚糖结合结构域(PBD，氨基酸3-39，SEQ ID NO:3，加下划线的)和C端溶菌酶样超家族催化结构域(氨基酸81-234，SEQ ID NO:5，加灰色高亮的)在示意图和序列中均可视化。
图2–PVPSE1gp146(左)和PK-PVPSE1gp147(右)的重组表达和纯化的SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析显示洗脱蛋白级分，相对于LMW参照标志物，以及穿透级分(FT)和废液级分(W)。26.4kDa(之于PVPSE1gp146)和27.7kDa(之于PK-PVPSE1gp146)左右的粗条带显示了这两种重组蛋白的高产率。可见一些次要的次级条带(蛋白降解)以及分别位于52.8kDa和55.4kDa左右的蛋白二聚化。
图3-肠炎沙门氏菌噬菌体细胞内溶素PVPSE1gp146在洗脱缓冲液中对经外膜通透化的铜绿假单胞菌PAO1的溶胞壁活性的饱和曲线。显示了递增浓度的PVPSE1gp146(以nM计，X轴)的活性(以ΔOD655nm/min计，Y轴)。此外，对线性曲线部分的最佳线性回归表示为趋势线，以及相应的最优R平方值。结果是一式三份测定的。PAO1Krylov底物溶于最优的KH2PO4/KH2PO4缓冲液中。
图4显示的是修饰的标签-PVP-SE1gp146变体的可能的二维模块化结构。展示了PVP-SE1gp146的推定的N端肽聚糖结合结构域(PBD)和C端溶菌酶样超家族催化性壳聚糖酶结构域，以及N端融合的抗细菌肽标签(APT)的方向。
图5显示PVPSE1gp146(蓝色条)和PK-PVP-SE1gp146(红色条)在42℃(A)和50℃(B)下温育后在24h中不同时间点内对外膜通透化后的PAO1细胞底物的热稳定性。将溶胞壁活性与时间点0的未加热样品相对比较，并以百分比表示。显示了三个独立实验的平均值和标准偏差。
图6显示了PVP-SE1gp146(A)和PK-PVP-SE1gp146(B)在50-100℃温育0(蓝色)、20(红色)、40(绿色)和60(紫色)分钟时间(对于PVP-SE1gp146)；和0(蓝色)、20(红色)、30(绿色)、和40(紫色)分钟时间(对于PK-PVP-SE1gp146)之后对经过膜通透化的PAO1细胞底物的热稳定性。将溶胞壁活性与时间点0的未加热样品相对比较，并以百分比表示。显示了三个独立实验的平均值和标准偏差。
说明
定义
下列术语若在本文中出现，则应具有下面的定义。
如本文中使用的术语“蛋白质”与术语“多肽”所指相同。本文中使用的术语“蛋白质”指氨基酸残基通过肽键以特定序列连接的直链聚合物。蛋白的氨基酸残基可通过例如共价附着多种基团如糖和磷酸来修饰。其他的物质如血红素或脂质可更松散的与多肽链相联系，得到偶合的蛋白质，其也包含于本文中使用的术语“蛋白质”中。有多种方式阐明多肽链的折叠，特别是针对α螺旋和β折叠片层的存在。如本文中使用的术语“蛋白质”指所有四种类型的蛋白质，即全α、全β、α/β和α加上β。
如本文中使用的术语“融合蛋白”指由两个核酸序列融合所得的表达产物。上述蛋白可在例如重组DNA表达系统中产生。而且，如本文中使用的术语“融合蛋白”指第一氨基酸序列如例如细胞内溶素，与第二或别的氨基酸序列的融合物。所述第二或别的氨基酸序列优选是肽段，特别是阳离子性肽或多聚阳离子性肽。优选地，所述第二和/或别的氨基酸序列对于第一氨基酸序列为外源的，并不与第一氨基酸序列的任何域实质上同源。
如本文中使用的术语“肽段”指连接于蛋白质如细胞内溶素的任何类型的肽。然而，本发明的意义中的肽段不指His6-标签,Strep-标签,Avi-标签,Myc-标签,Gst-标签,JS-标签,半胱氨酸(cystein)-标签,FLAG-标签或本领域中已知的其他标签，硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白(MBP)。与如本文中使用的术语“肽段”相对，术语“标签”指可用于帮助多肽的表达和/或亲和纯化，将多肽固定于表面或者充当标志物或标记部分以供检测多肽(例如通过在不同的ELISA测定形式中的抗体结合)的肽，只要使该标签可用于上述所列举之一的功能并非由所述肽所荷的正电荷所致即可。然而，His6标签可能取决于相应的pH，亦可荷正电，但却是因为其结合于固定化的二价阳离子而用作亲合纯化工具而并非用作根据本发明的肽段。
如本文中使用的术语“肽”指由约2至约100个氨基酸残基，更优选约4至约50个氨基酸残基，更优选约5至30个氨基酸残基组成的短多肽，其中一个氨基酸残基的氨基基团通过肽键连接于另一个氨基酸残基的羧基基团。肽可具有特定功能。肽可为天然出现的肽或合成设计和产生的肽。所述肽可例如通过酶法或化学剪切来源于天然蛋白或从天然蛋白移出，或者可使用常规的肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(参见Sambrook,J.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1989))来制备。
本文中使用的术语“细胞内溶素”指适于水解细菌细胞壁的酶。“细胞内溶素”包含至少一个具有至少下述活性之一的“酶活性域(EAD)”：内肽酶、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(酰胺酶)、N-乙酰基胞壁酰胺酶(N-acetyl-muramidase)、N-乙酰基-氨基葡萄糖苷酶(溶菌酶)或转糖基酶。此外，所述细胞内溶素还可含有不具酶活性并结合于宿主细菌细胞壁的区，即所谓CBD(细胞壁结合结构域)。所述细胞内溶素可含有两个或更多个CBD。然而，如本文中使用的术语“细胞内溶素”还指具有至少一个EAD但没有CBD的酶。一般而言，细胞壁结合结构域能够结合细菌表面上不同的组分。优选地，所述细胞壁结合结构域为肽聚糖结合结构域并结合于细菌的肽聚糖结构。细胞内溶素的不同结构域可通过结构域接头连接。
如本发明所使用的术语“结构域接头”是指起着将单个蛋白结构域彼此相连的作用的氨基酸序列。作为规则，结构域接头不形成或仅形成很少的规则二级结构，如α螺旋或β-片层，并且能够占据就结构背景而言的不同构象。检测结构域接头的方法以及接头序列的特征是本领域公知的，例如描述于Bae等,2005,Bioinformatics,21,2264-2270或George&Heringa,2003,ProteinEngineering,15,871-879中。
如本文所使用的术语“野生型”或“wt”是指如SEQ ID NO:1所示的细胞内溶素PVPSE1gp146的氨基酸序列。编码该野生型细胞内溶素PVPSE1gp146的核酸序列描述于SEQ ID NO:2。
如本文中使用的术语“缺失”指从对应的起始序列去除1、2、3、4、5或更多个氨基酸或核酸残基。
如本文中使用的术语“插入”或“添加”指向对应的起始序列插入或添加1、2、3、4、5或更多个氨基酸或核酸残基。
如本文中使用的术语“取代”指用不同的氨基酸残基替换位于特定位置的氨基酸残基。
如本文中使用的术语“细胞壁”指所有构成革兰氏阴性细菌外细胞围绕物(enclosure)并由此确保其完整性的组分。具体而言，如本文中使用的术语“细胞壁”指肽聚糖、革兰氏阴性细菌具有脂多糖的外膜、细菌细胞膜，但也指沉积于肽聚糖上的其他层例如荚膜(capsule)、外蛋白层或粘液(slime)。
如本文中使用的术语“EAD”指细胞内溶素的酶活性结构域。EAD负责水解细菌肽聚糖。其呈现细胞内溶素的至少一种酶活性。EAD还可由超过一种酶活性模块构成。本文中使用的术语“EAD”与术语“催化结构域”同义。
本发明涉及一种新的模块性(modular)细胞内溶素，其分离自肠炎沙门氏菌噬菌体PVPSE1，可用于制备针对革兰氏阴性细菌的新型抗细菌剂。尤其是，本发明涉及包含依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽或其片段或衍生物。所述包含依照SEQ ID NO:1的多肽优选由依照SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码。
具有依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列的细胞内溶素PVPSE1gp146的长度为236个氨基酸。其包含一个N端细胞壁结合结构域(CBC)和一个C端酶活性结构域(EAD)。该N端CBD是一个肽聚糖结合结构域(PGB,aa3～39)，具有依照SEQ ID NO:3的氨基酸序列以及依照SEQ ID NO:4的核苷酸序列。C端EAD是一个催化结构域(aa81～234)，与溶菌酶样超家族的催化结构域一致，且具有依照SEQ ID NO:5的氨基酸序列及依照SEQ ID NO:6的核苷酸序列。细胞内溶素PVPSE1gp146的PGB和催化结构域通过结构域接头连接。
因此，依照本发明的肽的优选片段是包含依照SEQ ID NO:3和/或依照SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。
依照本发明的衍生物是包含依照SEQ ID NO:1、3和/或5的氨基酸序列但具有另外的修饰和/或改变的多肽。
在一个实施方案中，依照本发明的细胞内溶素的衍生物的所述修饰和/或改变可以是突变，尤其是缺失、插入、添加、取代或其任何组合，和/或氨基酸残基的化学改变，例如生物素化、乙酰化、PEG化、氨基、SH或羧基基团的化学变化。依照本发明的所述衍生物呈现PVPSE1gp146(SEQ ID NO:1)的溶解活性和/或依照本发明的所述片段活性。所述活性可为PVPSE1gp146活性和/或依照本发明的片段活性的约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或约200%。所述活性可由本领域技术人员通过本领域公知的测定法来测量，例如平板裂解(platelysis)测定法或液体裂解(liquid lysis)测定法，其例如描述于(Briers等，J.Biochem.Biophys Methods70：531-533，(2007))。
在本发明优选的实施方案中，依照本发明的多肽、片段和/或衍生物还在N端或C端包含标签，诸如His6标签、Strep标签、Avi标签、Myc标签、Gst标签、JS标签、半胱氨酸标签、FLAG标签，或其他本领域公知的标签。在本发明优选的实施方案中，所述标签与依照本发明的多肽、片段和/或衍生物在C端连接。所述标签可通过额外的氨基酸残基与所述多肽、片段和/或衍生物连接。所述额外的氨基酸残基可由至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外氨基酸残基组成。在本发明优选实施方案中，所述标签通过额外的氨基酸残基Leu-Glu或Lys-Gly连接于依照本发明的多肽、片段和/或衍生物。在优选的实施方案中，本发明涉及包含依照SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽。与具有依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽相比，具有依照SEQ IDNO:7的氨基酸序列的多肽分别包含额外的C端His6-标签，所述标签通过额外的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)与具有依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的C端连接。此外，在第2和第3位导入了BamHI限制性位点。包含依照SEQ ID NO:7的氨基酸残基的多肽优选由依照SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码。
本发明的另一个方面是这样的融合蛋白，其由依照本发明的多肽、片段和/或衍生物，以及与该依照本发明的多肽、片段和/或衍生物多肽在N端或C段融合以增强该细胞内溶素针对革兰氏阴性细菌的活性的、具有膜破坏活性或LPS破坏活性的肽段构成。优选地，所述肽段是根据WO2010023207的阳离子性肽和/或多聚阳离子性肽，通过提述将该文件完整并入本文。
依照本发明的融合蛋白的肽段优选与依照本发明的多肽、片段和/或衍生物共价连接。优选地，所述肽段由至少5个、更优选至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或至少100个氨基酸残基组成。特别优选的肽段包含约5至约100个氨基酸残基、约5至约50个或约5至30个氨基酸残基。更优选的肽段包含约6至约42个氨基酸残基、约6至约39个氨基酸残基、约6至约38个氨基酸残基、约6至约31个氨基酸残基、约6至约25个氨基酸残基、约6至约24个氨基酸残基、约6至约22个氨基酸残基、约6至约21个氨基酸残基、约6至约20个氨基酸残基、约6至约19个氨基酸残基、约6至约16个氨基酸残基、约6至约14个氨基酸残基、约6至约12个氨基酸残基、约6至约10个氨基酸残基或约6至约9个氨基酸残基。优选地，所述肽段不是诸如His6标签、Strep标签、Avi标签、Myc标签、Gst标签、JS标签、半胱氨酸标签、FLAG标签、或其他本领域公知标签的标签，也不是硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白(MBP)。然而，该肽段可额外的包含此类标签或多个标签等，其用于纯化或定位蛋白。
本发明还涉及编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的分离的核酸分子。根据本发明的特别优选的核酸分子包含根据SEQ ID NO:2、6或18的核酸序列。本发明还涉及包含根据本发明的核酸分子的载体。所述载体可提供根据本发明的所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的组成型或诱导型表达。本发明还涉及用于从微生物获得所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的方法，如经遗传修饰的合适的宿主细胞，其表达所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白。所述宿主细胞可为微生物如细菌或酵母，或者动物细胞例如哺乳动物细胞特别是人细胞。在本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。宿主可仅由于生物技术上的原因选取，例如产量、溶解度、成本等，但也可从医药的观点来选取，例如，非病理性细菌或酵母或人细胞。本发明的另一个方面涉及用于遗传转化合适的宿主细胞以获得本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的表达的方法，其中所述宿主细胞是通过将编码所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的遗传物质引入所述宿主细胞，并通过本领域技术人员众所公知的遗传工程方法获得其翻译和表达来遗传修饰的。
在另一个方面本发明涉及组合物，优选药物组合物，其包含依照本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或经下述核酸分子或载体转化的宿主，所述核酸分子或载体包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。
在本发明优选实施方案中，所述组合物包含其他的试剂，其渗透革兰氏阴性细菌的外膜，如金属螯合剂例如EDTA、TRIS、乳酸、乳铁蛋白、多粘菌素、柠檬酸和/或其他如Vaara(Agents that increase the permeability of theouter membrane.Vaara M.Microbiol Rev.1992Sep;56(3):395-441)所述的物质。还优选的是包含上述提及的渗透剂的组合的组合物。特别优选的是包含约10μM至约100mM EDTA、更优选约50μM至约10mM EDTA、更优选约0.5mM至约10mM EDTA、更优选约0.5mM至约2mM EDTA、更优选约0.5mM至约1mM EDTA的组合物。还优选包含约0.5mM至约2mM EDTA，更优选约1mM EDTA以及另外约10至约100mM TRIS的组合物。
本发明还涉及用作药物的根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或经包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列的核酸转化的宿主。在其他方面，本发明涉及根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或经包含下述核酸分子的载体转化的宿主在制备用于治疗和/或预防与病原性革兰氏阴性细菌相关的病症、疾病或病状中的用途，所述核酸分子包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。具体而言，待治疗和/或预防的病症、疾病或病状可以由下述包含人或动物的病原性菌株的细菌组、科、属或种的革兰氏阴性细菌引起，如肠杆菌科(埃希氏菌属(Escherichia)特别是大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)特别是肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)(假单胞菌属特别是铜绿假单胞菌、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘胺醇单胞菌属(Sphingomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas))、奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibiro)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、曼氏菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、螺旋体科(Spriochaetaceae)(密螺旋体属(Treponema)和疏螺旋体属(Borrelia))、钩端螺旋体科(Leptospiraceae)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Streptobacillus)、类杆菌科(Bacteroidaceae)(类杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、卟啉单胞菌(Porphyromonas))、不动杆菌属(Acinetobacter)、特别是鲍氏不动杆菌(A.baumanii)。特别的，待治疗和/或预防的病症、疾病或病状可由铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、大肠杆菌和/或鼠伤寒沙门氏菌造成。
本发明还涉及包含根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或经下述核酸转化的宿主的药物，所述核酸包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。
在其他方面，本发明涉及在需要治疗和/或预防的受试者中治疗病症、疾病或病状的方法，所述方法包括施与所述受试者有效量的根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或有效量的经下述核酸转化的宿主或根据本发明的组合物，所述核酸包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。所述受试者可为人或动物。
具体而言，所述治疗方法可用于治疗和/或预防由革兰氏阴性细菌特别是上述列举的革兰氏阴性细菌造成的皮肤，软组织，呼吸系统，肺，消化道，眼，耳，牙齿，鼻咽，口，骨，阴道，菌血症(bacteraemia)伤口和/或心内膜炎的感染。
用于本发明的治疗(或预防)方法中的施用剂量和途径取决于待治疗的具体疾病/感染位置。施用途径可例如为经口、局部、鼻咽、肠胃外、静脉内、直肠或任何其他的施用途径。对于将根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或有效量的经核酸(所述核酸包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列)转化的宿主或根据本发明的组合物施用于感染位置(或有受感染危险的位置)，可使用下述制剂，所述制剂保护活性化合物免受环境影响如蛋白酶、氧化、免疫应答等，直至其抵达感染位置。因此，所述制剂可为胶囊、锭剂、丸剂、栓剂、可注射溶液或任何其他医药上合理的盖仑(galenic)制剂。优选地，所述盖仑制剂可包含合适的载体、稳定剂、调味剂、缓冲剂或其他合适的试剂。例如，对于局部施用，所述制剂可为洗液或硬膏(plaster)，对于鼻咽施用所述试剂可为通过喷雾施与鼻部的盐水溶液。
优选地，如果待治疗(或预防)的感染是由多重抗性的细菌菌株，特别是针对一种或多种下述抗生素具有抗性的菌株造成时，将根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白用于医疗，所述抗生素为：链霉素、四环素、头孢噻吩、庆大霉素、头孢噻肟、头孢菌素、头孢他啶或亚胺培南。此外，根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白可通过将其与常规的抗细菌剂如抗生素、硫醚抗生素、细菌素或细胞内溶素等组合给药而用于治疗方法。
本发明还涉及包含一个或多个隔室的药物包(pharmaceutical pack)，其中至少一个隔室包含一种或多种根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或一种或多种经下述核酸转化的宿主或根据本发明的组合物，所述核酸包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面本发明涉及制备药物组合物的方法，所述方法包括将可药用的稀释剂、赋形剂或载体与一种或多种根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或一种或多种经下述核酸转化的宿主混合，所述核酸包含编码根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。
在甚至其他方面，本发明的组合物是化妆组合物。几种细菌菌种可导致患者的身体暴露于环境的表面如皮肤的刺激。为了预防此类刺激或者为了消除所述细菌病原体的次要病候(minor manifestation)，可使用特定的化妆制备物，其包含足够量的根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白以降解已经存在或新沉降的病原性革兰氏阴性细菌。
在其他方面，本发明涉及根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白作为诊断手段用于医药、食品或饲料或环境诊断，特别是作为诊断手段用于诊断细菌感染，特别是由革兰氏阴性细菌造成的细菌感染。在此方面，根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白可用作工具以特异性降解病原性细菌，特别是革兰氏阴性病原性细菌。通过根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白使得细菌细胞降解可通过添加去污剂如Triton X-100或其他减弱细菌细胞包膜(envelope)的添加剂如多粘菌素B来支持。需要特定细胞降解作为后续对细菌进行特异性检测的起始步骤，所述检测使用基于核酸的方法如PCR、核酸杂交或NASBA(基于核酸序列的扩增)，免疫方法如IMS、免疫荧光或ELISA技术，或其他依赖于细菌细胞的细胞成分的方法如使用对独特细菌组或种具有特异性的酶测定法(例如，β-半乳糖苷酶之于肠细菌，凝固酶之于凝固酶阳性菌株)。在其他方面，本发明涉及根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白用于处理或防止革兰氏阴性细菌污染食品、食品加工设备、食品加工厂、与食品接触的表面如架子和食品储藏区域以及在所有其他病原性、偶发病原性(facultative pathogenic)或其他不受欢迎的细菌可潜在地感染食品材料情况下，医疗设备和医院和诊所中所有类型的表面时。
具体而言，本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白可预防性地用作消毒剂。所述消毒剂可在手术之前或之后使用，或者例如在血液透析过程中使用。而且，早产婴儿和免疫妥协的个体，或有假体装置需要的那些受试者，可用根据本发明的融合蛋白治疗。所述治疗可为预防性的，或在急性感染过程中进行。在相同背景下，医院内感染，特别是由抗生素抗性菌株如铜绿假单胞菌(FQRP)，不动杆菌属菌种和肠杆菌科如大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌属、哈夫尼菌属、克雷伯氏菌属、摩根氏菌属、变形杆菌属、普罗维登斯菌属、沙雷氏菌属和耶尔森氏菌属菌种造成的感染可预防性地或在急性期中用根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白来治疗。因此，根据本发明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白还可用作与其他可用于消毒溶液的成分如去污剂、tensid、溶剂、抗生素、硫醚抗生素或细菌素组合使用的消毒剂。
下述实施例解释本发明，但并不视为限定性的。除非另行指出，使用如Sambrock等,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York所述的分子生物学标准方法。
实施例1：PVP-SE1gp146及其N端PK融合的变体PK-PVP-SE1gp146
肠炎沙门氏菌噬菌体PVPSE1的模块性细胞内溶素及其N端PK融合变体PK-PVP-SE1gp146的克隆、表达和纯化
PVP-SE1gp146(236个氨基酸长，MW=25325Da)是来源于肠炎沙门氏菌噬菌体PVPSE1的模块性细胞内溶素，预测为具有一个N端肽聚糖结合结构域(从氨基酸3至39)，和一个属于溶菌酶样家族的C端催化性壳聚糖酶结构域(从氨基酸81至234)(见图1)。
用纯化噬菌体PVPSE1基因组DNA(获自S.Santos博士,Universidade doMinho,Braga,Portugal)作为模板，使用Pfu聚合酶(Fermentas,Ontario,Canada)进行标准PCR反应来扩增编码细胞内溶素PVP-SE1gp146的可读框(ORF146)。使用了下述PCR参数：
Figure BDA00003139637000151
该PCR的正向引物(引物1)和反向引物(引物2)显示于表1。
表1-在ORF146的标准PCR扩增以及在用于对ORF146添加N端PK标签的巢式PCR中使用的引物
Figure BDA00003139637000152
Figure BDA00003139637000161
为了使ORF146的5’端延伸编码多聚阳离子性9聚肽Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-的基因片段，用延伸的5’引物(引物3，SEQ ID NO:11，表1)和标准3’引物(引物2，SEQ ID NO:10，表1)进行巢式PCR(按照与上述PCR相同的参数)。然后遵循制造商提供的TA克隆规程将获得的两个PCR片段连接到可商购的表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中，使得细胞内溶素ORF/蛋白质的3’/C端侧与纯化所需的6x组氨酸标签融合。所得的重组PVP-SE1gp146和PK-PVP-SE1gp146细胞内溶素的DNA的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:7(重组PVPSE1gp146的氨基酸序列)，SEQ ID NO:8(重组PVPSE1gp146的核苷酸序列)，SEQ IDNO:12(重组PK-PVPSE1gp146的DNA序列)，和SEQ ID NO:13(重组PK-PVPSE1gp146的氨基酸序列)。
在指数生长中的大肠杆菌BL21(λDE3)pLysS细胞中用1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)16℃诱导过夜之后进行PVP-SE1gp146/PK-PVP-SE1gp146的重组表达。然后利用
Figure BDA00003139637000163
表达载体所表达的C端6xHis-标签，通过Ni2+亲和色谱(Akta FPLC,GEHealthcare)纯化该细胞内溶素。
Ni2+亲和层析以下述四个步骤进行，均为室温：
1.用10个柱体积的洗涤缓冲液(70mM咪唑，0.5mM NaCl和20mMNaH2PO4-NaOH，pH7.4)以0.5ml/分钟的流速平衡Histrap HP1ml柱(GE Healthcare)。
2.将总裂解物(连同所需的细胞内溶素)以0.5ml/分钟的流速上样于Histrap HP1ml柱。
3.用15个柱体积的洗涤缓冲液以1ml/分钟的流速洗涤柱。
4.用10个柱体积的洗脱缓冲液(500mM咪唑，5mM NaCl和20mMNaH2PO4-NaOH，pH7.4)以0.5ml/分钟的流速从柱洗脱结合的细胞内溶素
重组PVP-SE1gp146/PK-PVP-SE1gp146纯化的产率如表2所示。蛋白浓度是通过在280nm波长的分光光度法确定的。两种蛋白在洗脱缓冲液(20mM NaH2PO4-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；500mM咪唑)中的纯化储液在SDS-PAGE凝胶上目测确定为至少为90%纯(图2)。
表2-280nm分光光度测量确定的每升大肠杆菌表达培养物的纯化重组PVP-SE1gp146/PK-PVP-SE1gp146细胞内溶素的产率。PK修饰变体的产率几乎是未修饰的PVP-SE1gp146的2倍高，这揭示了PK标签对蛋白质表达的稳定化作用。
Figure BDA00003139637000171
实施例2：肠炎沙门氏菌噬菌体内溶素PVPSE1gp146的生化溶胞壁活性的表征和确定
为了定量溶胞壁活性，使用了经过对细胞内溶素活性敏感化的、外膜通透化铜绿假单胞菌PAO1krylov(从State Institute for Genetics of IndustrialMicroorganisms,1st Dorozhnii proezd1,113545Moscow,RussiaPAO1Krylov的V.Krylov教授处获得的PAO1Krylov)细胞底物。在有该底物存在的条件下，创建了PVPSE1gp146在洗脱缓冲液中的酶活性的饱和曲线，显示肽聚糖降解活性(表示为每分钟OD655nm下降)作为一定范围的不同细胞内溶素浓度(以nM表示)的函数(图3)。测量一式三份地进行，底物溶解在对酶活性而言最优的KH2PO4/K2HPO4缓冲液中，其pH7.3，离子强度为80mM。
根据Cheng等人(2004)及Briers等人(2007)对酶活性的定义经过调适后的版本，利用对该饱和曲线的线性部分的最佳线性回归的斜率来确定溶胞壁活性值：
Figure BDA00003139637000172
利用上式，PVPSE1gp146当溶于洗脱缓冲液中时具有15,005,330单位/mM的溶胞壁活性值。
实施例3：与肠炎沙门氏菌噬菌体PVP-SE1的内溶素的N端抗细菌肽融合物
1.抗细菌标签融合的PVP-SE1gp146构建体的克隆、表达和纯化
将PVP-SE1gp146N端融合于一组天然抗细菌肽标签(见表3)以提高其抗革兰氏阴性活性并拓宽其细菌宿主范围。这些标签是基于它们的两亲性、疏水性或多聚阳离子性质以及短的长度被选择和开发出来的。该表包含文献中选出的若干已知的抗细菌肽，它们来源于昆虫、两栖动物或鱼类，并已证明对革兰氏阴性菌株高效率地作用；还有三种设计的抗细菌标签。图4例示了修饰的标签-PVP-SE1gp146变体的一种可能的二维模块性结构。
表3-与PVP-SE1gp146融合的抗细菌肽标签的列表
Figure BDA00003139637000181
除了五肽(PP)标签之外，使用不依赖连接的克隆(LIC)技术(Berrow et al.,2007,A versatile ligation-independent cloning method suitable forhigh-throughput expression screening applications)的经改造的版本将所有抗细菌肽融合于编码PVP-SE1gp146的ORF。因此，利用特别设计的5’正向引物(GGAATGGGGAGCTCCTCCAATGCTGCAATTGCGGAGAT;SEQ ID NO:30)和标准的PVP-SE1gp146反相引物(CGAGGTTAGAACAGATTTTGCCT,SEQID NO:10)对噬菌体OBP的纯的基因组DNA进行巢式PCR，将唯一的Ecl136II限制性位点插入在PVP-SE1gp146编码基因的前方。然后按照生产商的TA克隆操作规程，将该延伸的片段连接到
Figure BDA00003139637000191
表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。将纯质粒在Ecl136II限制性消化中切割一次，并向经切割的质粒中插入杂合的肽盒(通过引物对的杂合生成，见表4)，而没有必要的连接步骤。为了N端五肽标签融合，对纯化的pEXP5-CT/PK-OBPgpLys质粒DNA用编码该五肽的延伸的5’引物(ATGGGATCCTTCTTCGTAGCACCGGGCTCCTCCAATGCTGCAAT,SEQID NO:31;加下划线的是该五肽)进行巢式PCR。通过测序分析验证表达载体中片段的正确插入，然后将构建体导入合适的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达系统中。
表4-用于在与PVP-SE1gp146融合前杂合抗细菌肽标签的引物
Figure BDA00003139637000201
在溶原性培养液(LB)中的指数生长的细胞(OD600nm=0.6)中用1mM异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷诱导来进行标准表达。表达参数如温度、时间和表达菌株等根据具体蛋白质而异，以便使得修饰的细胞内溶素的可溶性表达水平最优(见表5)。为了纯化，收集来自表达培养物(500-600ml)的细胞(4500rpm,30min,4°C)，并在1/25体积的裂解缓冲液(10mM咪唑、20mM NaH2PO4,0.5M NaCl,pH7.4)中重悬。将该悬液冷冻/融解3次，然后超声处理(8x30s,变幅(amplitude)40%，在Vibra CellTM,Sonics,Dandurry,CT,USA上进行)，并通过0.45和0.22μm Durapore膜滤器(Millipore,Billerica,MA,USA)过滤。根据生产商的说明，应用Ni2+亲和层析(HisTrap HP1ml柱，GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)，通过一步法规程完成带His-标签的融合蛋白的纯化。Ni2+亲和层析以后述四个步骤进行，均为室温：
1.用10个柱体积的洗涤缓冲液(视蛋白质而定的咪唑量(60-70mM)，0.5mM NaCl和20mM NaH2PO4-NaOH，pH7.4)以0.5ml/分钟的流速平衡Histrap HP1ml柱(GE Healthcare)。
2.将总裂解物(连同所需的细胞内溶素)以0.5ml/分钟的流速上样于Histrap HP1ml柱。
3.用15个柱体积的洗涤缓冲液以1ml/分钟的流速洗涤柱。
4.用10个柱体积的洗脱缓冲液(500mM咪唑，5mM NaCl和20mMNaH2PO4-NaOH，pH7.4)以0.5ml/分钟的流速从柱洗脱结合的细胞内溶素。
洗涤缓冲液包含低的咪唑浓度，其根据具体蛋白质而异，以确保更高的蛋白质纯度(参见表5)。每升大肠杆菌表达培养物的重组蛋白质总产率也显示于表5当中。数值是通过在280nm波长分光光度法测量的蛋白质浓度和纯化的储液的总体积来确定的。如SDS-PAGE凝胶上目测确定的那样，纯化的储液至少为90%纯的(数据未显示)。
表5-N端融合的PVP-SE1gp146构建体的表达参数和每升表达培养物获得的蛋白质产率。ON=过夜；*=大肠杆菌Codon Plus RIL,AgilentTechnologies Catalog nr.230245,基因型=大肠杆菌B F-ompT hsdS(rB-mB-)dcm+Tetr 
Figure BDA00003139637000212
endA Hte[argU ileY leuW Camr]
Figure BDA00003139637000211
1.N端标签融合的PVP-SE1gp146变体的体外抗细菌活性
为了确定抗细菌标签融合物是否对PVP-SE1gp146的体外抗细菌活性有正面影响，用2种不同的革兰氏阴性细菌：大肠杆菌XL1Blue和食物病原体书伤寒沙门氏菌LT2测试了某些N端标签融合的PVP-SE1gp146变体(对于Artilys2-PVPSE1gp146和Lycotox1-PVPSE1gp146)。为了最优化它们的抗细菌性质，加入少量外膜通透化剂乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)。
将指数生长的革兰氏阴性细菌细胞(OD600nm=0.6)稀释100倍至最终密度为大约106个细胞/ml，并在室温不震荡的条件下与5μM的不同的修饰PVP-SE1gp146变体、以及有和没有0.5mM EDTA-Na2一起温育30分钟。在温育之后，将细胞悬浮液稀释三次，从106细胞/ml开始到105细胞/ml，然后再到104细胞/ml，最后到103细胞/ml的浓度，然后将每个稀释液100μl在LB培养基上铺板。37℃过夜温育之后计数残余的菌落。基于计数得到的细胞数，计算以对数单位计的相对失活化作为抗细菌活性(log10(N0/Ni)，其中N0=未处理的细胞数，Ni=经处理的细胞数，均在温育之后计数)(图6)。
表6-5μM N端标签融合的PVP-SE1gp146变体在无(A)和有(B)0.5mMEDTA-Na2条件下对革兰氏阴性细菌的体外抗细菌活性，与未修饰的PVP-SE1gp146比较.抗细菌活性作为以对数单位计(log10(N0/Ni)，其中N0=未处理的细胞数，Ni=经处理的细胞数，在温育之后计数)的相对失活化来定量。所有样品三次重复。显示了平均值+/-标准偏差。观察到的最大减少依赖于10细胞/ml的检测水平和初始细胞密度。
A)
B)
Figure BDA00003139637000222
在没有外膜通透化剂EDTA时，在鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌中仅能检测到低水平的抗细菌活性。在包含EDTA的样品中可以观察到更强的抗细菌活性。具有Artilysin2修饰的融合蛋白具有针对鼠伤寒沙门氏菌的良好抗细菌活性。然而，该活性在未修饰的变体PVP-SE1gp146的范围之内。具有Lycotoxin1修饰的融合蛋白的针对鼠伤寒沙门氏菌的抗细菌活性进一步提高。该Lycotoxin融合蛋白和Artilysin2融合蛋白对大肠杆菌也具有抗细菌活性，其中该活性与针对鼠伤寒沙门氏菌的抗细菌活性相比在更低的水平。
实施例4：重组PVP-SE1gp146及其PK融合变体PK-PVP-SE1gp146的热稳定性
温度在PVP-SE1gp146/PK-PVP-SE1gp146的稳定性中起主要作用，因此在它们的酶活性或溶胞壁活性中也起主要作用。升高温度可容易地打断蛋白质的三维结构中的氢键和非极性疏水相互作用，导致蛋白质变性及其酶功能的部分丧失。为了考察PVP-SE1gp146和PK-PVP-SE1gp146的热稳定性，将这两种细胞内溶素在Biometra T3000热循环仪(
Figure BDA00003139637000231
Germany)中不同温度下(42,50,60,70,80,90和100°C)温育不同的时间间隔(42和50℃为1、2、3、4、8和24小时，从50至100℃为1小时内每10分钟(each10minutes during1hours)。在热温育之后，将30μl的每个经温育的样品加入270μl经过外膜通透化的铜绿假单胞菌PAO1(PAO1Krylov，获自V.Krylov教授，State Institute for Genetics ofIndustrial Microorganisms,1st Dorozhnii proezd1,113545Moscow,Russia)细胞底物(Lavigne et al.,2004**)，追踪作为时间函数的光密度(OD655nm)。将每个样品一式三份地温育和测试。根据Briers等人(2007)***的文章，基于OD655nm/时间曲线来定量每个样品的酶活性或溶胞壁活性，并表示为相对于未加热的参比样品在时间0的活性(=100%活性)的百分比。图5中显示了在42℃和50℃下在24小时的时间间隔内温育的结果。选择42℃的值是因为其模拟发热的体温条件，而50℃是热不稳定蛋白质变性的临界温度。
PVP-SE1gp146和PK-PVP-SE1gp146在42℃都是热稳定的(图5A)，即使在24h温育后亦然。甚至在50℃(图5B)，PVP-SE1gp146的溶胞壁活性经过24h的时间段也没有显著改变。相反，PK-PVP-SE1gp146在8和24h时间点之间丧失了其初始活性的30%，这可能是由于PK标签的存在所致。在42℃温育2h以及50℃温育3h之后，PK-PVP-SE1gp146的溶胞壁活性甚至显著上升。可能的是，更高的温度最初可抑制因PK修饰导致的活性减少；该效应随着温育时间增加而减小。
由于PVP-SE1gp146在50℃24h之后仍然显示完全的活性，还测定了PVP-SE1gp146/PK-PVP-SE1gp146在50-100℃的更高温度下，分别在1h和40min的温育时间内的热稳定性(图6)。在0、20、40和60分钟的时间点测量了PVP-SE1gp146的活性(图6A)，在0、20、30和40分钟的时间点测量了PK-PVP-SE1gp146的活性(图6B)。
图6A显示PVP-SE1gp146在80℃温育1h后仍然保持其最大活性，但在100℃，20分钟的短时间温育即足以将其活性降低超过80%。如上述图5所描述的，在高于50℃的各温度，PK-PVP-SE1gp146的活性逐渐降低。在80℃温育30分钟后该细胞内溶素已经几乎丧失其全部活性。
这些结果突出了未修饰的PVP-SE1gp146的强热稳定性，使得它成为用于食品保鲜“围栏法”(hurdle approach)的引人注目的候选者。温和热处理与PVP-SE1gp146的组合可以用来高效率地减少食品病原体而不损失食品产品的质量。
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本领域技术人员通过考虑本说明书和实施本说明书公开的发明，将容易想到本发明的其他实施方案。本说明书和实施例应被视为仅是例示性的，本发明的真实范围和精髓由下述权利要求来示明。
Figure IDA00003139637900011
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Figure IDA00003139637900091
Figure IDA00003139637900101

Claims (19)

1.具有细胞内溶素活性的多肽，其包含依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或其片段或衍生物。
2.依照权利要求1的多肽，其中所述片段包含依照SEQ ID NO:3和/或5的氨基酸序列。
3.依照SEQ ID NO:1或2的多肽，其中所述衍生物在依照SEQ ID NO:1、3和/或5的氨基酸序列中具有缺失、添加、插入和/或取代。
4.依照权利要求1-3的多肽，其中所述多肽在N端或C端与具有破坏膜或LPS活性的肽段融合。
5.依照前述任一项权利要求的多肽，其还包含标签，优选His6标签。
6.依照权利要求5的多肽，其中所述多肽包含依照SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
7.一种融合蛋白，其包含依照前述任一项权利要求的多肽以及在N端或C端融合于所述多肽的肽段，其中所述肽段是阳离子性肽、多聚阳离子性肽、两亲肽、寿司肽、防卫素、疏水性肽和/或抗微生物肽。
8.依照权利要求7的融合蛋白，其中所述肽段包含约5至约100个氨基酸残基，尤其是约5个至50个氨基酸残基，尤其是约5个至30个氨基酸残基。
9.依照权利要求7或8的融合蛋白，其中所述阳离子性和/或多聚阳离子性肽段包含选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸残基的至少一个氨基酸残基，尤其是其中所述肽段中包含的至少约70%的氨基酸残基是精氨酸、组氨酸和/或赖氨酸残基，尤其是精氨酸和/或赖氨酸残基。
10.依照权利要求7的融合蛋白，其中所述两亲肽包含至少一个选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基的荷正电的氨基酸残基，与至少一个选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基的疏水性氨基酸残基组合，尤其是其中所述两亲肽中的至少约70%的所述氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸残基，而所述两亲肽中的至少约30%的所述氨基酸残基为缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸或甘氨酸残基。
11.依照权利要求7的融合蛋白，其中所述肽段包含依照SEQ ID NO:14-19的氨基酸序列。
12.依照权利要求7的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含依照SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
13.分离的核酸分子，其编码依照权利要求1-6中任一项的多肽或依照权利要求7-12中任一项的融合蛋白。
14.包含依照权利要求13的核酸分子的载体。
15.包含依照权利要求13的核酸分子或依照权利要求14的载体的宿主细胞。
16.依照权利要求1-6中任一项的多肽或依照权利要求7-12中任一项的融合蛋白，用于人医学、动物医学或诊断物质，作为食物中或化妆品上的抗微生物剂，作为消毒剂或在环境领域中使用。
17.依照权利要求1-6中任一项的多肽或依照权利要求7-12中任一项的融合蛋白，用作治疗或预防革兰氏阴性细菌感染的药物。
18.依照权利要求1-6中任一项的多肽或依照权利要求7-12中任一项的融合蛋白用于处理或防止食品、食品加工设备、食品加工工厂、与食品接触的表面、医疗设备、医院及诊所中的表面的革兰氏阴性细菌污染的用途。
19.药物组合物，其包含依照权利要求1-6中任一项的多肽或依照权利要求7-12中任一项的融合蛋白。
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