CN103119158B - 减少生物膜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用融合蛋白消除、减少或防止细菌生物膜的方法，所述融合蛋白包括与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的内溶素(endolysin)、自溶素(autolysin)或细菌素(bacteriocin)。进一步，本发明涉及用作药物，特别是用于治疗或预防与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌感染的药物、用作诊断手段、消毒剂或者用作化妆物质的融合蛋白。本发明还涉及去除或减少或防止食品、食品加工设备、食品加工厂、要与食品接触的表面、医疗器械(medical devices)、医院和诊所中的表面的与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌污染。进一步，本发明涉及所述融合蛋白作为诊断手段在与细菌生物膜有关的医学、食品或饲料、或环境诊断中的应用。

Description

减少生物膜的方法
本发明涉及利用融合蛋白消除、减少或防止细菌生物膜的方法，所述融合蛋白包括与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的内溶素(endolysin)、自溶素(autolysin)或细菌素(bacteriocin)。进一步，本发明涉及用作药物，特别是用于治疗或预防与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌感染的药物、用作诊断手段、消毒剂或者用作化妆物质的融合蛋白。本发明还涉及去除或减少或防止食品、食品加工设备、食品加工厂、要与食品接触的表面、医疗器械(medical devices)、医院和诊所中的表面的与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌污染。进一步，本发明涉及所述融合蛋白作为诊断手段在与细菌生物膜有关的医学、食品或饲料、或环境诊断中的应用。
内溶素是由噬菌体(或细菌病毒)编码的肽聚糖水解酶。它们在噬菌体增殖裂解周期的晚期基因表达期间被合成，并通过降解细菌肽聚糖介导后代病毒粒子从被感染细胞中释放。它们是β-(1,4)-糖基化酶(溶菌酶)、转糖基酶、酰胺酶或内肽酶。内溶素的抗微生物应用在1991年已经由Gasson所提出(GB2243611)。尽管内溶素的杀伤能力已经久为人知，但是由于抗生素的成功和统治地位，这些酶作为抗菌药物的应用遭到忽视。直到出现了多种抗生素耐药性的细菌之后，用内溶素来对抗人类致病原的这个简单构想才获得了关注。现在迫切需要开发全新类型抗菌剂，而使用内溶素作为“酶抗生素(enzybiotics)”-“酶”和“抗生素”的糅合术语-可以完美地满足这一需求。2001年，Fischetti及同事首次证明了噬菌体C1内溶素对A群链球菌的治疗潜能(Nelson et a1.,2001)。从此之后，许多出版文献确立了内溶素作为一种控制细菌感染，特别是革兰氏阳性细菌感染的有吸引力的并且互补的替代方法。随后，针对其它革兰氏阳性致病原，例如肺炎链球菌(Loeffler et al.,2001)、炭疽芽孢杆菌(Schuch et al.,2002)、无乳链球菌(Cheng et al.,2005)和金黄色葡萄球菌(Rashel et al,2007)，的不同内溶素也被证明具有酶抗生素的效力。现在，内溶素治疗最重要的挑战是革兰氏阴性细菌对内溶素的外源作用不敏感，因为外膜阻止内溶素接近肽聚糖。这一点目前妨碍了内溶素的有效范围扩展到重要的革兰氏阴性致病原。
革兰氏阴性细菌具有以其特征性的不对称双层膜作为标志的外膜。该双层外膜由含有磷脂(主要是磷脂酰乙醇胺)的内层、以及主要由一种糖脂：脂多糖(LPS)构成的外膜所组成。在细菌界中，LPS结构存在极大的多样性，并且LPS的结构可以响应主导性的环境条件而被修饰。LPS层的稳定性和不同LPS分子之间的相互作用主要通过二价离子(Mg2+,Ca2+)与LPS分子的阴离子组分(脂质A和内核中的磷酸基团和KDO的羧基基团)之间的静电作用实现。因此，阳离子结合位点对于外膜的完整性至关重要(Vaara,1992)。多阳离子试剂例如多聚-L-赖氨酸聚合物(至少20个残基)通过置换这些稳定性二价阳离子而提高外膜的透过性。此外，它们还发挥所谓的“自促摄取(self-promoted uptake)”机制(Hancock and Wong,1984)。由于它们的体积庞大，会破坏外膜的正常屏障功能并生成瞬时的裂隙，促进它们自身的摄取(Vaaraand Vaara,1983)。而且，在不存在不饱和脂肪酸的情况下有利于脂质A的致密而有序的包装，该包装形成具有高粘性的刚性结构。这使得它对亲脂分子的透过性降低，并为外膜(OM)提供额外的稳定性。
与革兰氏阴性细菌相反，革兰氏阳性细菌不具有外膜。细胞质膜由厚达25nm的肽聚糖层包围(革兰氏阴性细菌株的厚度仅达5nm)，该肽聚糖层形成细胞壁。革兰氏阳性细菌细胞壁的主要目的是维持细菌形状和对抗细菌细胞的内部压力。肽聚糖，或胞壁质，是由糖和氨基酸构成的多聚物。糖部分由β-(1,4)连接的交替出现的N-乙酰葡糖胺残基和N-乙酰胞壁糖酸残基构成。N-乙酰胞壁酸上附接着3-5个氨基酸的肽链。肽链可以和其他链上的肽链交联，形成3D网状层。肽链可以含有D-和L-氨基酸残基，并且其组成在不同细菌中可以不同。
大多数革兰氏阴性细菌以及许多革兰氏阳性细菌可形成细菌生物膜。生物膜的定义为粘附在表面上的微生物体聚集体或联合体。粘附细菌经常被革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌所产生的细胞外聚合体物质包围或保护，它们。生物膜使得细菌对于抗微生物物质，例如抗生素、消毒剂和细胞壁降解酶非常耐受。此外，生物膜的处理目前并不可行，因为细胞外聚合体物质会保护其自身免于被抗微生物物质、消毒剂或生物膜降解物质降解。
因此，需要有能够消除、减少或防止细菌生物膜的方法。
这个目标可以通过本申请权利要求所限定的主题加以解决。
下面的附图用于例证本发明
图1是显示用于重组产生(POLY)n-gp144((POLY)n-KZ144)的质粒构建的总体流程图。先前，pEXP5CT/POLY-gp144(pEXP5CT/POLY-KZ144)通过TAIL(热不对称交错)PCR(利用BamHI限制位点和5'TAIL引物中的第一多聚阳离子盒子)加以构建。质粒用BamHI线性化、去磷酸化并与一个含有悬垂BamHI末端的盒子连接。这个盒子来自于两个互补寡核苷酸的杂交，并且编码9个带正电荷的残基。在第一和第二盒子之间的连接点处产生一个额外的带正电精氨酸残基和一个丝氨酸。通过重复进行循环类似地构建更长的pEXP5CT/(POLY)n-gp144(pEXP5CT/(POLY)n-KZ144)变体。
图2显示了通过巴斯德毕赤酵母表达和分泌POLY-gp144。将30μl巴斯德毕赤酵母X33表达培养物[培养1天(方形)、3天(三角形)和4天(圆形)后]上清添加到270μl经氯仿可透化的铜绿假单胞菌PAO1p细胞中。缓冲条件为POLY-gp144的最佳酶学条件(KH2PO4/K2HP04)I=120mM pH6.2)。随后，用分光光度法记录光密度。光密度降低表示巴斯德毕赤酵母分泌了胞壁水解酶。作为阴性对照，还包括了不表达质粒的巴斯德毕赤酵母X33(菱形)。
图3图示了未经修饰的phiKZgp144和ELgp188内溶素、经过修饰包含含有9个带正电氨基酸残基的肽的内溶素变体POLY-gp144和POLY-gp188、和经过修饰的包含含有18个带正电氨基酸残基的肽的变体(POLY)2-gp144和(POLY)2-gp188对铜绿假单胞菌PAO1p细胞的抗菌活性。误差棒指示平均值的标准偏差。
图4显示了考马斯染色的SDS-PAGE图片，其显示了未经修饰的内溶素PSP3gp10和其经过修饰的内溶素变体PKPSP3gp10的表达和纯化结果。泳道LMW是大小标记物(LMW ladder)。随后的三个泳道是经过Ni2+亲和色谱后在洗脱缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;500mM咪唑)中纯化蛋白的蛋白级分。泳道FT是穿透部分(flow through)，泳道W是废弃级分(waste fraction)。在纯化蛋白级分中只能见到很少的次级条带，表明重组蛋白的纯度很高(>90%)。
图5A-D图示了未经修饰的PSP3gp10和经过修饰的PKPSP3gp10在不同组合物中在室温并且无振荡下温育之后对数种指数生长过程中的革兰氏阴性细菌的抗菌活性。每种革兰氏阴性细菌用如下的组合物温育30分钟：含有0.5mM EDTA但无内溶素的组合物、含有1.315μM未经修饰的PSP3gp10但无EDTA的组合物、含有1.315μM经过修饰的PKPSP3gp10但无EDTA的组合物、含有1.315μM未经修饰的PSP3gp10和0.5mM EDTA的组合物、含有1.315μM经过修饰的PKPSP3gp10和0.5mM EDTA的组合物。在图5A中，显示了对铜绿假单胞菌PAO1p细胞的抗菌活性，图5B中，显示了对铜绿假单胞菌Br667细胞的抗菌活性，图5C中，显示了对大肠杆菌WK6细胞的抗菌活性，图5D中显示了对鼠伤寒沙门氏菌细胞的抗菌活性。“Δ”给出了PSP3gp10和PKPSP3gp10样品的各自活性之间的差异。误差棒指示平均值的标准偏差。
图6显示了考马斯染色的SDS-PAGE图片，其显示了未经修饰的内溶素P2gp09和其经过修饰的内溶素变体PKP2gp09的表达和纯化结果。泳道LMW是大小标记物(LMW ladder)。随后的三个泳道是经过Ni2+亲和色谱后在洗脱缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;500mM咪唑)中纯化蛋白的蛋白级分。泳道FT是穿透部分(flow through)，泳道W是废弃级分(waste fraction)。在纯化蛋白级分中只能见到很少的次级条带，表明重组蛋白的纯度很高(>95%)。
图7A-F图示了未经修饰的P2gp09和经过修饰的PKP2gp09在不同组合物中在室温并且无振荡下温育之后对数种指数生长过程中的革兰氏阴性细菌的抗菌活性。每种革兰氏阴性细菌用如下的组合物温育30分钟：含有0.5mM EDTA但无内溶素的组合物、含有1.315μM未经修饰的P2gp09但无EDTA的组合物、含有1.315μM经过修饰的PKP2gp09但无EDTA的组合物、含有1.315μM未经修饰的P2gp09和0.5mM EDTA的组合物、含有1.315μM经过修饰的PKP2gp09和0.5mM EDTA的组合物。在图7A中，显示了对铜绿假单胞菌PAO1p细胞的抗菌活性，图7B中，显示了对铜绿假单胞菌Br667细胞的抗菌活性，图7C中，显示了对大肠杆菌WK6细胞的抗菌活性，图7D中显示了对类鼻疽伯克霍尔德氏菌细胞的抗菌活性，图7E中，显示了对恶臭假单胞菌G1细胞的抗菌活性，图7F中，显示了对鼠伤寒沙门氏菌LT2(SGSC N°2317)细胞的抗菌活性。“Δ”给出了P2gp09和PKP2gp09样品的各自活性之间的差异。误差棒指示平均值的标准偏差。
图8显示了考马斯染色的SDS-PAGE图片，其显示了未经修饰的内溶素OBPgpLYS和其经过修饰的内溶素变体PKOBPgpLYS的表达和纯化结果。泳道LMW是大小标记物(LMW ladder)。随后的三个泳道是经过Ni2+亲和色谱后在洗脱缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;500mM咪唑)中纯化蛋白的蛋白级分。泳道FT是穿透部分(flow through)，泳道W是废弃级分(wastefraction)。在纯化蛋白级分中只能见到很少的次级条带，表明重组蛋白的纯度很高(>90%)。
图9A-F图示了未经修饰的OBPgpLYS和经过修饰的PKOBPgpLYS在不同组合物中在室温并且无振荡下温育之后对数种指数生长过程中的革兰氏阴性细菌的抗菌活性。每种革兰氏阴性细菌用如下的组合物温育30分钟：含有0.5mM EDTA但无内溶素的组合物、含有1.315μM未经修饰的OBPgpLYS但无EDTA的组合物、含有1.315μM经过修饰的PKOBPgpLYS但无EDTA的组合物、含有1.315μM未经修饰的OBPgpLYS和0.5mM EDTA的组合物、含有1.315μM经过修饰的PKOBPgpLYS和0.5mM EDTA的组合物。在图9A中，显示了对大肠杆菌WK6细胞的抗菌活性，图9B中，显示了对鼠伤寒沙门氏菌LT2(SGSC N°2317)细胞的抗菌活性，图9C中，显示了对铜绿假单胞菌PAO1p细胞的抗菌活性，图9D中显示了对铜绿假单胞菌Br667细胞的抗菌活性，图9E中，显示了对恶臭假单胞菌G1细胞的抗菌活性，图9F中，显示了对类鼻疽伯克霍尔德氏菌细胞的抗菌活性。“Δ”给出了P2gp09和PKP2gp09样品的各自活性之间的差异。误差棒指示平均值的标准偏差。
图10A和B图示了PolyKZ144(Art-014)对铜绿假单胞菌2573粘液样生长性临床分离株(Source Uniklinikum Regensburg,nichtdefiniert)的生物膜降低活性。使铜绿假单胞菌2573在37°C聚苯乙烯微滴定板上生长至少24小时以形成生物膜。为了将生物膜含量可视化，进行了结晶紫染色。图10A中，用海藻酸裂解酶(10u/ml)或PolyKZ144(50μg/ml)温育生物膜。两种酶的效果与作为对照的未处理的生物膜或经过清洗并用LB-培养基重新温育的生物膜进行比较。图10B中，PolyKZ144的效果与作为对照的未处理的生物膜或经过清洗并用LB-培养基重新温育的生物膜进行比较，并且用非粘液样生长性的大肠杆菌实验室菌株来指示非特异性背景染色。
图11A-G图示了数种融合蛋白对不同革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌菌株的生物膜降低活性。使金黄色葡萄球菌KS13(A和B)、单核细胞增生利斯特氏菌Scott A(C)、鲍氏不动杆菌DSMZ30007(D)、铜绿假单胞菌2572(E，F)和铜绿假单胞菌2573(G)在37°C聚苯乙烯微滴定板上生长至少24小时以形成生物膜。为了将生物膜含量可视化，进行了结晶紫染色。图11A中，用PK-肽(1.25μg/孔)或内溶素Ply2638(25μg/孔)或融合蛋白Ply2638-PK(25μg/孔)温育生物膜。将肽、内溶素和融合蛋白的效果与用LB指示的未处理的生物膜(一份蛋白缓冲液对一份无NaCl的2x LB)进行比较。图11B中，用细菌素溶葡萄球菌酶(18μg/孔)或细菌素变体PK-溶葡萄球菌酶(18μg/孔)温育生物膜。细菌素和细菌素变体的效果与用LB指示的未处理的生物膜(一份蛋白缓冲液对一份无NaCl的2x LB)进行比较。图11C中，用经过修饰的内溶素变体五肽-Ply511(25μg/孔)温育生物膜。经过修饰的内溶素变体的效果与用LB指示的未处理的生物膜(一份蛋白缓冲液对一份无NaCl的2x LB)进行比较。图11D和E中，再用PK-肽(1.25μg/孔)或内溶素OBP(25μg/孔)或经过修饰的内溶素变体PK-OBP(25μg/孔)温育生物膜。肽、内溶素和经过修饰的内溶素变体的效果与用LB指示的未处理的生物膜(一份蛋白缓冲液对一份无NaCl的2x LB)进行比较。图11F和G中，再用内溶素KZ144(50μg/孔)或经过修饰的内溶素变体SMAP29-KZ144(50μg/孔)温育生物膜。将肽、内溶素和经过修饰的内溶素变体的效果与用LB指示的未处理的生物膜(一份蛋白缓冲液对一份无NaCl的2x LB)进行比较。
如这里所使用的，术语“蛋白质”与术语“多肽”同义使用。如这里所使用的，术语“蛋白质”是指按照特定序列通过肽键连接的氨基酸残基的直链聚合物。蛋白质的氨基酸残基可以通过例如共价附接各种基团(如碳水化合物和磷酸)加以修饰。其它物质(例如亚铁血红素或脂质)可以更松散地与多肽链缔合，形成缀合蛋白，它们也被这里所用的术语“蛋白质”所涵盖。已经阐明了多肽链折叠的多种方式，特别是就α螺旋和β-折叠片的存在而言。如这里所用的术语“蛋白质”是指所有四种类型的蛋白质：全α、全β、α/β和α+β。而且，术语“蛋白质”还指复合物，其中该复合物指同聚体(homomer)。
如这里所使用的，术语“融合蛋白”是指由两个核酸序列融合产生的表达产物。这种蛋白可以在例如重组DNA表达系统中产生，或者通过化学交联产生。而且，这里所用的术语“融合蛋白”表示第一氨基酸序列，特别是内溶素、自溶素或细菌素和/或其它肽聚糖水解酶，与第二或进一步的氨基酸序列的融合物。第二或进一步的氨基酸序列优选地是肽，特别是阳离子性、多聚阳离子性、疏水性、两亲性和/或抗微生物肽。优选地，所述第二和/或进一步的氨基酸序列对第一氨基酸序列的任何结构域而言均为外来的，并且与第一氨基酸序列的任何结构域均没有实质的同源性。
这里使用的术语“经过修饰的内溶素变体”与术语“内溶素变体”同义使用。这两个术语均指包含内溶素和肽(特别是阳离子性、多聚阳离子性、疏水性、两亲性和/或抗微生物肽)的融合蛋白。
这里使用的术语“经过修饰的细菌素变体”与术语“细菌素变体”同义使用。这两个术语均指包含细菌素和肽(特别是阳离子性、多聚阳离子性、疏水性、两亲性和/或抗微生物肽)的融合蛋白。
这里使用的术语“经过修饰的自溶素变体”与术语“自溶素素变体”同义使用。这两个术语均指包含内溶素和肽(特别是阳离子性、多聚阳离子性、疏水性、两亲性和/或抗微生物肽)的融合蛋白。
这里使用的术语“肽段”是指任何种类的与蛋白质连接的肽，例如内溶素、细菌素或自溶素。特别地，这里使用的术语“肽段”是指阳离子性肽、多聚阳离子性肽、两亲性肽、疏水性肽、和/或抗微生物肽。然而，本发明意义中的肽段并不是指His-标签，优选地His5-标签、His6-标签、His7-标签、His8-标签、His9-标签、His10-标签、His11-标签、His12-标签、His16-标签和His20-标签、Strep-标签、Avi-标签、Myc-标签、Gst-标签、JS-标签、半胱氨酸-标签、FLAG-标签或其它本领域已知的标签、硫氧还原蛋白或麦芽糖结合蛋白质(MBP)。与这里所用的术语“肽段”相对的术语“标签”是指可用于帮助多肽表达和/或亲和纯化、将多肽固定于表面上、或者充当多肽检测的标记物或标签部分(例如通过在不同ELISA测定形式中的抗体结合)的肽，只要使得该标签可用于上述用途之一的功能不是由所述肽的正电荷导致的。然而，His6-标签，根据具体的pH，也可能是带正电荷的，但由于它可以结合固定的二价阳离子而被用作亲和纯化工具，而并不用作根据本发明的肽段。
这里使用的术语“肽”是指由大约2个-大约100个氨基酸残基，更优选地由大约4个-大约50个氨基酸残基，更优选地大约5个-大约30个氨基酸残基组成的短肽，其中一个氨基酸残基的氨基通过肽键与另一个氨基酸残基的羧基连接。肽可以具有特定的功能。肽可以是天然存在的肽或者合成设计和产生的肽。肽可以是例如通过酶学或化学切割从天然蛋白质衍生或者取出的，或者可以使用常规的肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(见Sambrook,J.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))加以制备。优选的合成产生的肽是例如阳离子性、多聚阳离子性、两亲性或疏水性肽。优选的天然发生的肽是例如抗微生物肽。
如这里所使用的，术语“阳离子性肽”是指具有带正电的氨基酸残基的肽。优选地，阳离子性肽的pKa值为9.0或者更高。典型地，阳离子性肽的至少4个氨基酸残基可以是带正电的，例如赖氨酸或精氨酸。“带正电”是指氨基酸残基的侧链在大约生理条件下具有净正电荷。这里使用的术语“阳离子性肽”也指多聚阳离子性肽。
这里所使用的术语“多聚阳离子性肽”是指合成设计和产生的肽，其主要由带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸残基，更优选赖氨酸和/或精氨酸残基组成。如果至少有大约20,30,40,50,60,70,75,80,85,90,95或大约100%的氨基酸残基是带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基，则称肽是主要由带正电荷氨基酸残基组成的。非带正电荷的氨基酸残基可以是电荷中性氨基酸残基和/或带负电荷氨基酸和/或疏水性氨基酸残基。优选地，非带正电荷氨基酸残基是电荷中性氨基酸残基，特别是丝氨酸和/或甘氨酸。
如这里所使用的，术语“抗微生物肽”(AMP)是指任何天然存在的对例如细菌、病毒、真菌、酵母、支原体和原生动物具有杀微生物和/或抑微生物活性的肽。因此，这里所使用的术语“抗微生物肽”特别指任何具有抗细菌、抗真菌、抗霉菌、抗寄生物、抗原生动物、抗病毒、抗感染、抗传染和/或杀菌、杀藻、杀阿米巴、杀微生物、杀细菌、杀真菌、杀寄生物、杀原生动物、杀原生生物(protozoicidal)性质的肽，特别是sushi肽和防卫素。抗微生物肽可以是RNA酶A超家族的成员、防卫素、cathelicidin、颗粒溶素(granulysin)、组胺素(histatin)、牛皮癣素(psoriasin)、dermicidine或铁调激素(hepcidin)。抗微生物肽可以天然出现在昆虫、鱼、植物、蛛形纲动物、脊椎动物或哺乳动物中。
优选地，抗微生物肽是在昆虫、鱼、植物、蛛形纲动物、脊椎动物或哺乳动物中天然出现的。优选地，抗微生物肽是在如下生物体内天然存在的：萝卜、蚕蛾、狼蛛、蛙类，优选地非洲爪蟾；蛙属动物(Rana frogs)，更优选地牛蛙(Rana catesbeiana)；蟾蜍，优选地亚洲蟾蜍中华大蟾蜍(Bufo fubogargarizans)，蝇类，优选果蝇，更优选黑腹果蝇，埃及伊蚊、蜜蜂、熊蜂，优选牧熊蜂(Bombus pascuorum)，食肉蝇，优选麻蝇(Sarcophaga peregrine)、蝎子、马蹄蟹、鲶鱼，优选淡水鲇(Parasilurus asotus)、牛、猪、绵羊、猪类、牛类(bovine)、猴类和人。
这里所用的术语“sushi肽”是指具有短的共有重复的补体调节蛋白(CCP)。Sushi肽的sushi模块在许多不同蛋白质中发挥蛋白-蛋白互作结构域的功能。含有Sushi结构域的肽已经显示具有抗微生物活性。优选地，sushi肽是天然存在的抗微生物肽。
这里所使用的术语“两亲性肽”是指同时具有亲水和疏水性功能基团的合成肽。优选地，这里所使用的术语“两亲性肽”是指具有确定的排列的亲水和疏水性基团的肽，例如两亲性肽可以是例如α螺旋，沿着螺旋的一侧主要是非极性侧链，沿着其表面的其余部分则是极性残基。
这里所使用的术语“疏水性基团”是指如下的化学基团，例如在水中基本上不溶但在油相中可溶或者在油相中的溶解度高于在水中或水相中的溶解度的氨基酸侧链。在水中，具有疏水性侧链的氨基酸残基彼此相互作用产生一个非水性环境。具有疏水性侧链的氨基酸残基的实例是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基。
这里所使用的术语“内溶素”是指适合于水解细菌细胞壁的酶。“内溶素”包括至少一个具有至少一种如下的活性的“酶活性结构域”(EAD)：内肽酶、N-乙酰-胞壁酰-L丙氨酸-酰胺酶(酰胺酶)、N-乙酰-胞壁质酶、N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶(溶菌酶)或转糖基酶。此外，内溶素还可以含有没有酶活性但与宿主细菌的细胞壁结合的区域，即所谓的CBD(细胞壁结合结构域)。内溶素可以含有一个、两个或更多个CBD。然而，这里所用的术语“内溶素”还指具有至少一个EAD但没有CBD的酶。一般地，细胞壁结合结构域能够与细菌表面上的不同组分结合。优选地，细胞壁结合结构域是肽聚糖结合结构域，并且与细菌的肽聚糖结合。
这里使用的术语“细胞壁”是指形成革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌外层细胞包被、从而保证它们的完整性的所有组分。特别地，这里所用的术语“细胞壁”是指肽聚糖、具有脂多糖的革兰氏阴性细菌的外膜、细菌细胞膜，还指沉积在肽聚糖上的额外层，作为例如荚膜(capsule)、外蛋白层或粘液(slime)。
这里使用的术语“自溶素”是指与内溶素有亲缘关系，但是由细菌编码并且参与例如细胞分裂和细胞壁代谢的酶。自溶素的概述可以参见“Bacterialpeptidoglycan(murein)hydrolases.VollmerW，Joris B,Charlier P，Foster S.FEMS Microbiol Rev.2008Mar;32(2):259-86”。
这里使用的术语“细菌素”是指与能够抑制其它细菌的生长的类蛋白质、类多肽或类肽物质。一些细菌素能够降解细菌细胞壁，例如溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)(降解葡萄球菌属细胞壁)、变溶菌素(Mutanolysin)(降解链球菌细胞壁)和肠球菌素(Enterolysin)(降解肠球菌属细胞壁)。优选地，所述抑制特别地是通过将所述其它细菌吸附到细菌素的特异受体上。一般地，细菌素由微生物产生。然而，这里使用的术语“细菌素”同时表示由微生物产生的分离物形式和合成产生的形式，还表示基本上保持其亲本细菌素的活性但是其序列已通过插入或删除一个或多个氨基酸残基而被改变的变体。
这里所使用的术语“EAD”是指内溶素的酶活性结构域。EAD负责水解细菌的肽聚糖。其显示内溶素的至少一种酶活性。EAD还可以由超过1个酶活性模块构成。这里使用的术语“EAD”与术语“催化结构域”同义使用。
这里所使用的术语“删除”是指从各自的起始序列除去1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。
这里所使用的术语“插入”或“添加”是指向各自的起始序列插入或添加1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。
这里所使用的术语“替换”是指特定位置的氨基酸残基交换成不同的氨基酸残基。
这里所使用的术语“生物膜”是指细菌微生物的聚集物，其中细菌细胞彼此粘附和/或粘附到表面上。这些粘附细胞经常被胞外高分子物质(EPS)基质所覆盖，其是由细胞产生的。生物膜EPS由细胞外DNA、蛋白质和多糖构成。这些生物膜可以在任何有生命或无生命的表面上形成，特别是在固体表面上作为菌落形成和在液体表面上作为菌膜(pellicle)形成。在生物膜中生长的微生物细胞与相同生物体的浮游细胞是生理上是截然不同的。
本发明涉及消除、减少或防止细菌生物膜的方法，包括如下步骤：
a)提供融合蛋白，其包含与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的酶，所述酶具有降解革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌细胞壁的活性；和
b)使材料、液体、表面或生物材料与所述融合蛋白相接触。
优选地，本发明涉及消除、减少或防止细菌生物膜的方法，包括如下步骤：
a)提供融合蛋白，其包含与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的内溶素、自溶素或细菌素；和
b)使材料、液体、表面或生物材料与所述融合蛋白相接触。
根据本发明，术语“提供”融合蛋白是指仅仅取得(taking)或使用(using)根据本发明的融合蛋白，或者指在根据本发明使用之前产生并纯化这种融合蛋白。
优选地，材料是石、岩、土壤、沉积物、食品、饲料或化妆品。优选地，液体是水，例如饮用水，地下水或废水，温泉，海，湖，河，任何类型的水系统，接触镜、假牙、植入物、假体或支具(braces)的清洗和保存溶液。
优选地，生物材料是衍生自或获得自活体，特别是植物和哺乳动物，优选人类，的任何物质，例如细胞、组织、器官、血液、血液组分和体液。优选地，细胞是例如有核细胞或无核细胞。细胞可以衍生自任何器官，特别是肝细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、角质形成细胞、胰岛细胞、干细胞(成年和新生儿的，各种组织或物种来源)、干细胞祖细胞、脐带血细胞、配子(雄性和雌性)、配子祖细胞、成红细胞、成白细胞和成软骨细胞。组织是例如黏膜、神经、肌肉、上皮、结缔和支持组织、口腔软组织和牙齿。器官是例如心脏、心脏瓣膜、眼睛、耳朵、尿道、肺、肝、肾、胆道、前列腺、鼻子、消化道、呼吸道、胃肠道、脑和骨髓。优选的体液是尿液、脑脊液和淋巴液。
优选地，表面是固体生物或非生物表面。优选地表面实例是医疗器械的表面，特别是植入体、假体、导管，例如牙移植物、尿管假体、腹膜和腹膜透析导管、用于血液透析和长期化疗剂给药的留置导管(Hickman导管)、心脏植入体例如起搏器、心脏瓣膜假体、血管辅助装置、合成血管移植物和支架、内部固定装置、经皮缝合和气管和呼吸机管道，以及工业或饮用水系统管道和自然水系统的表面。
生物膜由细菌微生物形成，其中细菌细胞彼此粘附和/或粘附于表面上。由生物膜的细菌微生物分泌的胞外高分子物质(EPS)形成水凝胶，从而形成类似粘液的基质。这种基质还包括气泡和无机颗粒。生物膜EPS由细胞外DNA、蛋白质和多糖构成。除了细菌微生物之外，其它单细胞生物也可以被集合在生物膜中。生物膜可以通过将细菌微生物置于界面上而发生。大多数情况下，生物膜在水表面或者与固相的界面上形成。这些生物膜可以在任何有生命或无生命的表面上形成。一般地，所有的界面均可以产生生物膜。生物膜几乎存在于任何地方，在土壤和沉积物中、在地下水中、在岩上、在沙漠中、在温泉中、在植物和动物表面或体内，特别是在黏膜上。而且，生物膜可以出现在医疗器械上，例如植入体、导管、内窥镜、假体、仪器和装置，也可以出现在化妆物质、食物和饲料中。生物膜还可以和感染有关，因为大多数情况下，细菌微生物形成生物膜可以免于免疫系统破坏。生物膜的形成使得细菌微生物能够长期存活。急性呼吸道感染的一个实例是军团病，其是由于吞入或者吸入从加热或冷却系统的空气或水管道脱落的导致的军团菌-生物膜结块(clump)导致的。另外，许多食物细菌，例如大肠杆菌0157:H7、单核细胞增生利斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、沙门氏菌和空肠弯曲菌可以在食物和装置上形成生物膜，然后它们对杀生物剂、干旱、加热、抗生素和清洁剂高度耐受。会导致植入体、导管和其它医疗装置感染的微生物可以是凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、不动杆菌、奇异变形菌属、铜绿假单胞菌和假丝酵母，它们也与医院的广谱感染有关。人类典型的与生物膜有关的细菌感染是：伤口感染，特别是与糖尿病有关的伤口，扁桃体炎、骨髓炎、细菌性心内膜炎、鼻窦炎、角膜感染、尿道感染、胆道感染、感染性肾结石、尿道炎、前列腺炎、导管感染、中耳感染、牙菌斑形成、牙龈炎、齿根骨膜炎、囊性纤维化病和永久留置装置感染，例如关节假体和心脏瓣膜。
生物膜的存在可以通过各种测试加以确定，例如通过Christensen等,JClin Microbiol22:996-1006(1985)中描述的组织培养板法(TCP)或者通过如前所述的Christensen等,Infect Immun37:318-26(1982)的试管法(TM)，或者通过Freeman等,J Clin Pathol42:872-4(1989)所述的刚果红琼脂法(CRA)。生物膜可以通过使用结晶紫测定加以定量(Peeters等,J Microbiol Methods 72:157-165(2008))。
根据本发明的融合蛋白可以影响形成生物膜的细菌的相互作用，从而使细胞以单个游离细胞转移，然后被所述融合蛋白裂解，结果生物膜被部分或者完全降解。根据本发明的融合蛋白对细菌的影响也可以直接裂解与生物膜有关的细菌，从而使生物膜被部分或者完全降解。而且，根据本发明的融合蛋白可以通过裂解能够与其它细菌形成生物膜的细菌防止细菌生物膜的形成。
根据本发明的融合蛋白优选地涉及内溶素变体、细菌素变体和自溶素变体。
根据本发明的优选融合蛋白包括与具有脂多糖(LPS)或一般而言破坏膜的活性的肽融合的内溶素、自溶素或细菌素。LPS是革兰氏阴性细菌外膜的主要组分。它增加细胞膜的负电荷，并保护膜免于某些类型的化学攻击。在一定程度上，所述LPS也保护革兰氏阴性细菌的膜免于从细菌外部添加的内溶素的破坏。然而，LPS可以被具有破坏LPS的活性的肽，例如带正电荷的肽，所破坏。而且，所述肽可以参与外膜蛋白运输机制，一种结构性外膜蛋白的失稳机制，和/或参与脂质依赖的失稳。本发明的发明人出人意料地发现，具有破坏LPS的活性或者一般而言破坏膜的活性的肽可以促进与所述肽融合的内溶素、自溶素或细菌素穿过革兰氏阴性细菌的外膜。在促进内溶素、自溶素或细菌素穿过细菌外膜之后，细菌的细胞壁会更容易被内溶素破坏或分解，这是因为肽聚糖层被降解后，当细菌的细胞内压力无法再得到对抗时，发生渗透性裂解。革兰氏阳性细菌具有比革兰氏阴性细菌厚得多的肽聚糖层。这里，融合蛋白的膜破坏活性通过作用于细胞质膜而促进细菌的裂解。
因此，本发明涉及通过利用融合蛋白消除、减少或防止细菌生物膜的方法，该融合蛋白包括具有降解革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌细胞壁活性的酶(优选内溶素、自溶素或细菌素)和具有膜破坏活性的肽，其中所述肽融合于酶的N端和/或C端。根据本发明的所述融合蛋白还称作经过修饰的内溶素变体或者简单地称作内溶素变体或者经过修饰的内溶素，经过修饰的自溶素变体或自溶素变体，经过修饰的细菌素或细菌素变体。
融合蛋白的内溶素部分优选地由特异针对革兰氏阴性细菌的噬菌体编码，例如包括对人或动物的致病原株的细菌群、科、属或种的革兰氏阴性细菌，例如肠杆菌科(埃希菌属，特别是大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌、哈夫尼菌属、克雷伯氏菌属特别是肺炎克雷伯氏菌、摩根氏菌属、变形菌属、普罗威登斯菌属、沙雷氏菌属、耶尔森氏菌属)，假单胞菌科(假单胞菌属，特别是铜绿假单胞菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、寡氧单胞菌属、希瓦氏菌属、鞘氨醇单胞菌属、丛毛单胞属)，奈瑟氏菌属、莫拉氏菌属、弧菌属、气单胞菌属、布鲁氏菌属、弗朗西丝氏菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴尔通氏体属、考克斯氏体属、嗜血菌属、巴斯德氏菌属、曼氏杆菌属、放线杆菌属、加德纳氏菌属、螺旋体科(密螺旋体属和疏螺旋体属)、钩端螺旋体科、弯曲杆菌属、螺杆菌属、螺菌属、链杆菌属、拟杆菌科(拟杆菌属、梭杆菌属、普雷沃氏菌属、卟啉单胞菌属)，不动杆菌属，特别是鲍氏不动杆菌。
在另一个优选的实施方案中，融合蛋白的内溶素由特异针对革兰氏阳性细菌的噬菌体编码，例如包括对人或动物的致病株的细菌群、科、属或种的革兰氏阴性细菌，特别是放线菌门，特别是放线菌纲，特别是放线菌科：放线菌科(放线菌属、动弯杆菌属)，棒杆菌亚目：分枝杆菌科(分枝杆菌属)、诺卡氏菌科、棒杆菌科，弗兰克氏菌亚目：弗兰克氏菌科，微球菌亚目：棒状杆菌科和丙酸杆菌科(丙酸杆菌属)和双歧杆菌目，特别是双歧杆菌科(双歧杆菌属、镰刀弧菌属、加德纳氏菌属)和其它亚纲：酸微菌亚纲、Coriobacteridae、红色杆菌亚纲、球形杆菌亚纲；和厚壁菌门，特别是杆菌纲，特别是杆菌目，特别是如下的科：杆菌科(杆菌属)、利斯特氏菌科(利斯特氏菌属)、球菌科(葡萄球菌属、孪生球菌属、Jeotgalicoccus)和乳杆菌目，特别是如下的科：肠球菌科(肠球菌)、乳杆菌科(乳杆菌属、片球菌属)、明串珠菌科(明串珠菌属)、链球菌属(乳酸球菌、链球菌)和梭菌纲，特备是如下的目：梭菌目(梭菌属、消化链球菌属、新月形单胞菌属)，盐厌氧菌目和Thermoanaerobacterales，和柔膜菌纲/软皮体纲，特别是如下的目：支原体目(支原体、解脲支原体)、虫原体目(螺原体)、厌氧浆菌目(丹毒丝菌属)、无胆甾浆菌目(无胆甾浆菌属)、无胆甾原体目(无胆甾原体属)。
在另一个优选的实施方案中，融合蛋白的自溶素或细菌素由革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌编码，例如包括对人或动物的致病菌株的细菌群、科、属或种的革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌，如上面列出的。
优选地，内溶素部分源自于如下面表1中列出的噬菌体或野生型内溶素：
同样优选的是，内溶素部分衍生自：铜绿假单胞菌噬菌体ΦKZ和EL的内溶素、恶臭假单胞菌噬菌体OBP的内溶素、噬菌体LUZ24的内溶素、或T4溶菌酶、gp61胞壁质酶、PSP3内溶素、沙门氏菌噬菌体的内溶素、鲍氏不动杆菌噬菌体的内溶素、大肠杆菌噬菌体P2的内溶素、大肠杆菌噬菌体N4和K1F的内溶素、和鼠伤寒沙门氏菌噬菌体的内溶素。
进一步优选的融合蛋白的内溶素是利斯特氏菌噬菌体内溶素PlyA118、PlyA500、PlyPSA、PlyA511、PlyP35、PlyP40，葡萄球菌噬菌体Phi11内溶素、Phi MR11内溶素、LysK、Ply2638、产气荚膜梭菌(Clostrium perfringens)PlyS6、Ply3626，艰难梭菌:CD27L内溶素，链球菌:B30内溶素、噬菌体Dp-1Pal酰胺酶、C1内溶素、Cpl-1内溶素、PlyGBS，肠球菌:PlyV12，炭疽芽孢杆菌:噬菌体γ内溶素PlyG、丙酸杆菌噬菌体内溶素PA6-gp20。
优选的融合蛋白的自溶素在下列文献中有描述：Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases.Vollmer W，Joris B,Charlier P，Foster S.FEMS MicrobiolRev.2008Mar;32(2):259-86.Epub2008Feb11.综述。优选的自溶素的一个实例是AtlA自溶素。
优选的细菌素是溶葡萄球菌素(Lysostaphin)(降解葡萄球菌细胞壁)、变溶菌素(降解链球菌细胞壁)和溶肠球菌酶(Enterolysin)(降解肠球菌细胞壁)。更优选地，根据本发明的融合蛋白的细菌素包含根据SEQ ID NO:87的氨基酸序列。
融合蛋白内溶素部分的进一步实例选自下组：根据SEQ ID NO:84的Cpl-1,根据SEQ ID NO:85的Ply511,根据SEQ ID NO:86的LysK,根据SEQ ID NO:88的PA6-gp20,根据SEQ ID NO:1的phiKZgp144,根据SEQID NO:2的ELgp188，根据SEQ ID NO:3的沙门氏菌内溶素,根据SEQ IDNO:4的肠杆菌噬菌体T4内溶素,根据SEQ ID NO:5的鲍氏不动杆菌内溶素,根据SEQ ID NO:6的大肠杆菌噬菌体K1F内溶素,根据SEQ ID NO:7的OBPgpLYS,根据SEQ ID NO:8的PSP3沙门氏菌内溶素(PSP3gp10),根据SEQ ID NO:9的大肠杆菌噬菌体P2内溶素(P2gp09),根据SEQ ID NO:89的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体胞壁质酶STM0016,根据SEQ ID NO:90的大肠杆菌噬菌体N4胞壁质酶N4-gp61,根据SEQ ID NO:92的N4-gp61trunc.根据SEQ ID NO:91和Ply2638。
在本发明的另一个优选实施方案中，通过利用根据本发明的融合蛋白消除、减少或防止细菌生物膜的方法包括对氨基酸序列的修饰和/或改变。这些改变和/或修饰可以包括突变，例如删除、插入和添加、替换或其组合，和/或氨基酸残基的化学改变，例如生物素化、乙酰化、PEG化、氨基-、SH-或羧基的化学变化。所述经过修饰和/或改变的内溶素显示各自野生型内溶素的裂解活性。然而，所述活性可以比各自野生型内溶素的活性更高或者更低。所述活性可以是各自野生型内溶素活性的大约10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190或大约200%，或者甚至更高。活性可以由本领域的技术人员通过本领域众所周知的方法加以测量，例如平板裂解测定或者液体裂解测定，这两种方法在例如Briers et al.,J.Biochem.Biophys Methods 70:531-533,(2007)中有描述。
根据本发明的融合蛋白的肽可能藉由额外的氨基酸残基(例如出于克隆的原因)与酶(优选内溶素、自溶素或细菌素)连接。优选地，所述额外的氨基酸残基不会被蛋白酶识别和/或切割。优选地，所述肽可以藉由至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外氨基酸残基与酶连接。优选地，根据本发明的融合蛋白中与酶(优选内溶素、自溶素或细菌素)的N端融合的肽在其N端进一步包括额外的氨基酸。优选地，肽包括氨基酸甲硫氨酸(Met)，或者甲硫氨酸、甘氨酸和丝氨酸(Met-Gly-Ser)或者丙氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸(Ala-Met-Gly)。在另一个优选的实施方案中，肽通过额外的氨基酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸(Gly-Ser)与酶(优选内溶素、自溶素或细菌素)的N端连接。在另一个优选的实施方案中，肽通过额外的氨基酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸(Gly-Ser)与酶的C端连接。
在本发明的一个方面中，具有破坏膜和/或LPS的活性的肽包括带正电的肽，其包括一个或多个带正电荷的氨基酸：赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸。优选地，所述肽中超过80%，优选地超过90%，优选地100%的氨基酸是带正电荷的氨基酸。有利地，阳离子性肽位于融合蛋白的N端和/或C端，从而提高后者蛋白的阳离子度(cationicity)。在本发明的另一个实施方案中，与酶(优选内溶素、自溶素或细菌素)融合的阳离子性肽的长度为至少5个氨基酸，更优选地至少9个氨基酸。
在一个优选实施方案中，所述肽包括大约3-大约50个，更优选地大约5-大约20个，例如大约5-大约15个氨基酸残基，并且所述氨基酸残基的至少20、30、40、50、60或70%，更优选地至少80%，例如至少90%是精氨酸或赖氨酸残基。在另一个优选的实施方案中，所述肽包括大约3-大约50个，更优选地大约5-大约20个，例如大约5-大约15个氨基酸残基，并且所述氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸残基。
优选地，融合蛋白的肽与酶(优选内溶素、自溶素或细菌素)的N端和/或C端融合。在一个特别优选的实施方案中，所述肽仅与酶(优选内溶素、自溶素或细菌素)的N端融合。然而，在N端和C端上都有肽的融合蛋白也是优选的。所述N端和C端上的肽可以是相同的或者是不同的肽。
融合蛋白的所述肽优选地共价结合于所述酶。优选地，所述肽由至少5个，更优选地，至少6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99或至少100个氨基酸残基组成。特别优选地，肽包括大约5-大约100个氨基酸残基，大约5-大约50个或者大约5-大约30个氨基酸残基。更优选地，肽包括大约6-大约42个氨基酸残基，大约6-大约39个氨基酸残基，大约6-大约38个氨基酸残基，大约6-大约31个氨基酸残基，大约6-大约25个氨基酸残基，大约6-大约24个氨基酸残基，大约6-大约22个氨基酸残基，大约6-大约21个氨基酸残基，大约6-大约20个氨基酸残基，大约6-大约19个氨基酸残基，大约6-大约16个氨基酸残基，大约6-大约14个氨基酸残基，大约6-大约12个氨基酸残基，大约6-大约10个氨基酸残基，或者大约6-大约9个氨基酸残基。
在本发明的一个方面中，肽从阳离子性肽、多聚阳离子性肽、疏水性肽、抗微生物肽和两亲性肽中选出。
在本发明的一个方面中，肽是阳离子和/或多聚阳离子性肽，其包括一个或多个带正电荷的氨基酸残基赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸，特别是赖氨酸和/或精氨酸。优选地，所述肽中有超过大约20,30,40,50,60,70,75,80,85,90,95或99%的氨基酸残基是带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基。特别优选的是大约100%由带正电荷氨基酸残基(特别是精氨酸和/或赖氨酸残基)组成的肽，其中优选地大约60%-大约70%的所述带正电荷氨基酸残基是赖氨酸残基，大约30%-大约40%的所述带正电荷氨基酸残基是精氨酸残基。更优选地，肽大约100%由带正电氨基酸残基(特别是精氨酸和/或赖氨酸残基)组成，其中优选地大约64%-大约68%的所述带正电荷氨基酸残基是赖氨酸残基，大约32%-大约36%的所述带正电荷氨基酸残基是精氨酸。仅由精氨酸或仅由赖氨酸组成的肽也是优选的。
特别优选地，融合蛋白的阳离子和/或多聚阳离子性肽包括至少一个根据SEQ ID NO:10(KRKKRK)的基序。特别地，阳离子性肽优选地包括至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16或17个根据SEQ ID NO:10(KRKKRK)的基序。更优选地，阳离子性肽包括至少一个KRK基序(lys-arg-lys)，优选地至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32或33个KRK基序。
在本发明的另一个优选实施方案中，肽是阳离子性肽，它除了带正电荷氨基酸残基(特别是赖氨酸和/或精氨酸)之外，还包括电荷中性氨基酸残基，特别是甘氨酸和/或丝氨酸残基。优选地，阳离子性肽的组成为：大约70%-大约100%，或者大约80%-大约95%，或者大约85%-大约90%为带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸残基，更优选赖氨酸和/或精氨酸残基；大约0%-大约30%，或者大约5%-大约20%，或者大约10%-大约20%为电荷中性氨基酸残基，特别是甘氨酸和/或丝氨酸残基。优选地，肽由大约4%-大约8%的丝氨酸残基、大约33%-大约36%的精氨酸残基和大约56%-大约63%的赖氨酸残基组成。特别优选地，肽包括至少一个根据SEQID NO:32(KRXKR)的基序，其中X是除赖氨酸、精氨酸和组氨酸之外的任何氨基酸。特别优选地，肽包括至少一个根据SEQ ID NO:33(KRSKR)的基序。更优选地，阳离子性肽包括至少大约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或大约20个根据SEQ ID NO:32(KRXKR)或SEQ ID NO:33(KRSKR)的基序。
同样优选地，融合蛋白的肽由大约9-大约16%甘氨酸残基、大约4-大约11%丝氨酸残基、大约26-大约32%精氨酸残基和大约47-大约55%赖氨酸残基组成。特别优选地，肽包括至少一个根据SEQ ID NO:34(KRGSG)的基序。更优选地，阳离子性肽包括至少大约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或大约20个根据SEQ ID NO:34(KRGSG)的基序。
在本发明的另一个优选实施方案中，除了带正电荷氨基酸残基(特别是赖氨酸和/或精氨酸)之外，阳离子性肽还包括疏水性氨基酸残基，特别是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和/或色氨酸残基。优选地，融合蛋白的阳离子性肽的组成为：大约70%-大约100%，或者大约80%-大约95%，或者大约85%-大约90%带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基；和大约0%-大约30%，或者大约5%-大约20%，或者大约10%-大约20%疏水性氨基酸残基，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更优选地丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和/或色氨酸残基。
特别优选地，融合蛋白的肽从由表2中给出的下述序列构成的组中选出。
表2：
优选地，融合蛋白的肽不是标签，例如His-标签、Strep-标签、Avi-标签、Myc-标签、Gst-标签、JS-标签、半胱氨酸-标签、FLAG-标签或其它现有技术已知的标签，并且不是硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白(MBP)。然而，根据本发明的融合蛋白可以还包含此类标签。
优选地，融合蛋白的肽具有引导根据本发明的融合蛋白穿过细菌外膜的功能，但是当它未融合于内溶素、自溶素或细菌素时施用则没有或者只有很低的活性。引导融合蛋白穿过革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌外膜的功能是由于所述肽的破坏外膜或LPS、或使外膜或LPS可透化、或使外膜或LPS失稳定的潜能导致的。肽的这种破坏外膜或LPS、使外膜或LPS可透化、或使外膜或LPS失稳定的活性可以用如下的方法加以确定：将待处理的细菌细胞在液体培养基或琼脂平板上培养。然后分别用光度计测量600nm的OD来确定液体培养基中的细菌细胞浓度或者计数琼脂平板上的菌落数。现在，用根据本发明的融合蛋白处理液体培养基中或平板上的细菌细胞。温育之后，再次用光度计测量600nm的OD确定液体培养基中的细菌细胞浓度，或者计数琼脂平板上的菌落数。如果融合蛋白显示这种外膜或LPS破坏或可透化或失稳定活性，则细菌细胞会由于融合蛋白的处理而被裂解，从而液体培养基中的细菌细胞浓度或琼脂平板上细菌克隆的数目会减少。这样，用融合蛋白处理之后细菌细胞浓度或细菌菌落数目的减少表明融合蛋白具有外膜或LPS破坏或渗透或失稳定活性。
在本发明的一个进一步的实施方案中，肽是这样的抗微生物肽，其带净正电荷，并包含大约50%的疏水性氨基酸。所述抗微生物肽是两亲性的，长度为大约12-大约50个氨基酸残基。所述抗微生物肽在昆虫、鱼类、植物、蛛形动物、脊椎动物或哺乳动物中天然存在。优选地，抗微生物肽是在如下生物体内天然存在的：萝卜、蚕蛾、狼蛛、蛙类，优选地非洲爪蟾；蛙属动物(Rana frogs)，更优选地牛蛙(Rana catesbeiana)；蟾蜍，优选地亚洲蟾蜍中华大蟾蜍(Bufo fubo gargarizans)，蝇类，优选果蝇，更优选黑腹果蝇，埃及伊蚊、蜜蜂、熊蜂，优选牧熊蜂(Bombus pascuorum)，食肉蝇，优选麻蝇(Sarcophaga peregrine)、蝎子、马蹄蟹、鲶鱼，优选淡水鲇(Parasilurus asotus)、牛、猪、绵羊、猪类、牛类(bovine)、猴类和人。
在另一个优选实施方案中，融合蛋白的抗微生物肽的组成为：大约0%-大约5%，或者大约0%-大约35%，或者大约10%-大约35%，或者大约15%-大约45%，或者大约20%-大约45%带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基；和大约50%-大约80%，或者大约60%-大约80%，或者大约55%-大约75%，或者大约70%-大约90%疏水性氨基酸残基，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更优选地丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和/或色氨酸残基。
在本发明的另一个优选实施方案中，融合蛋白的抗微生物肽的组成为：大约4%-大约58%带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基，和大约33%-大约89%疏水性氨基酸残基，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更优选地丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和/或色氨酸残基。
在下面的表中列出了根据本发明的融合蛋白的抗微生物肽的例子。
表3：
在本发明的一个进一步的实施方案中，肽是在Ding JL,Li P,Ho B CellMol Life Sci.2008Apr;65(7-8):1202-19.“The Sushi peptides:structuralcharacterization and mode of action against Gram-negative bacteria”中描述的sushi肽。特别优选的是根据SEQ ID NO:133的sushi1肽。
融合蛋白优选的sushi肽是sushi肽S1和S3及其多倍体(multiples)；FASEB J.2000Sep;14(12):1801-13。
在本发明的一个进一步的实施方案中，肽是疏水性肽，其包括至少90%的疏水性氨基酸残基，如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白的疏水性肽由大约90%-大约95%，或者大约90%-大约100%，或者大约95%-大约100%的疏水性氨基酸残基构成，如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸。
融合蛋白的优选疏水性肽是Walmagh1，其具有根据SEQ ID NO:134的氨基酸序列，融合蛋白的疏水性肽具有Phe-Phe-Val-Ala-Pro(SEQ ID NO:135)的氨基酸序列。
在本发明的一个进一步的实施方案中，肽是两亲性肽，其包括一个或多个带正电荷氨基酸残基赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸，与一个或多个疏水性氨基酸残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸组合。氨基酸残基的侧链的定向使阳离子性表面和疏水性表面集中在肽的相对侧。优选地，所述肽中超过大约30、40、50、60或70%的氨基酸是带正电荷氨基酸。优选地，所述肽中超过大约30、40、50、60或70%的氨基酸残基是疏水性氨基酸残基。有利地，两亲性肽融合在具有细胞壁降解活性的酶的N端和/或C端，从而提高后者蛋白的两亲性。
在本发明的另一个实施方案中，肽是两亲性肽，由至少5个，更优选地至少6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50个氨基酸残基组成。在优选的实施方案中，两亲性肽的所述氨基酸残基有至少大约30、40、50、60或70%是精氨酸或赖氨酸残基，和/或两亲性肽的所述氨基酸残基有至少大约30、40、50、60或70%是疏水性氨基酸残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸。
在本发明的另一个优选实施方案中，肽是两亲性肽，其除了带正电荷氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基之外，还包括疏水性氨基酸残基，特别是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和/或色氨酸残基。优选地，两亲性肽的组成为：大约10%-大约50%，或者大约20%-大约50%，或者大约30%-大约45%，或者大约5%-大约30%的带正电荷氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基，和大约50%-大约85%，或者大约50%-大约90%，或者大约55%-大约90%，或者大约60%-大约90%，或者大约65%-大约90%疏水性氨基酸残基，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，半胱氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，苏氨酸，丝氨酸，脯氨酸和甘氨酸残基，更优选丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸和/或色氨酸残基。在另一个优选实施方案中，两亲性肽的组成为12%-大约50%带正电荷氨基酸，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基，和大约50%-大约85%疏水性氨基酸残基，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，半胱氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，苏氨酸，丝氨酸，脯氨酸和甘氨酸残基，更优选地丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸和/或色氨酸残基。
优选地，融合蛋白的两亲性肽是根据SEQ ID NO:136的T4溶菌酶4-螺旋和具有根据SEQ ID NO:137的氨基酸序列的WLBU2变体和根据SEQID NO:138的Walmagh2。
在本发明的一个优选实施方案中，融合蛋白由根据SEQ ID NO:10-30,32-34和93-138的肽和根据SEQ ID NO:1-9,84-86和88-92的内溶素或根据SEQ ID NO:87的细菌素组成。在一个优选实施方案中，融合蛋白包括从根据SEQ ID NO:10-30,32-34和93-138的肽中选出的肽和从根据SEQ ID NO:1-9,84-86和88-92的内溶素中选出的内溶素或根据SEQ ID NO:87的细菌素构成。
特别优选地，融合蛋白从下列表4中提供的融合蛋白中选出。
表4：
根据本发明的融合蛋白，例如尤其是根据SEQ ID NO:35-49,53,57,61-64,66-78和139-142的特别优选的融合蛋白，可以在N端额外地包含甲硫氨酸。
根据本发明的融合蛋白，例如尤其是根据SEQ ID NO:35-49,53,57,61-64,66-78和139-142的特别优选的融合蛋白，可以额外地包含标签，例如用于纯化的标签。优选的是His6-标签，优选地位于融合蛋白的C端。所述标签可以通过额外的氨基酸残基与融合蛋白连接，例如由于克隆的原因。优选地，所述标签可以通过至少1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个额外氨基酸残基与融合蛋白连接。在一个优选的实施方案中，所述融合蛋白在其C端包含His6-标签，其通过额外的氨基酸残基赖氨酸与甘氨酸(Lys-Gly)或亮氨酸与谷氨酸(Leu-Glu)与融合蛋白连接。优选地，所述额外氨基酸残基不会被蛋白酶识别或切割。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白在其N端包含His6-标签，其通过额外的氨基酸残基赖氨酸与甘氨酸(Lys-Gly)或亮氨酸与谷氨酸(Leu-Glu)与融合蛋白连接。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白在其N端和C端包含His6-标签，其通过额外的氨基酸残基赖氨酸与甘氨酸(Lys-Gly)或亮氨酸与谷氨酸(Leu-Glu)与酶(优选为内溶素、自溶素或细菌素)连接。
具体地，在下文所描述的实施例中使用的融合蛋白是优选的。如实施例中使用的根据SEQ ID NO:35-42,53,57和61的融合蛋白在C端包含His6-标签，其通过额外的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)与融合蛋白连接。如实施例中使用的根据SEQ ID NO:43-49,75,139,141和142的融合蛋白在C端包含His6-标签，其通过额外的氨基酸残基亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)与融合蛋白连接。
融合蛋白是通过使用标准克隆技术，例如Sambrook等.2001,分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)所述，将至少两个核酸序列连接在一起而构建的。这种蛋白可以在例如重组DNA表达系统中产生。根据本发明的这种融合蛋白可以通过将内溶素、自溶素或细菌素的核酸与各自的肽融合而获得。
由于一些融合蛋白在细菌内表达时会有毒性或者由于蛋白降解而不均一，所以可能会采用将这些融合蛋白与其它额外的蛋白融合或连接的策略，。这些其他额外蛋白的实例是硫氧还蛋白，已有人显示其在大肠杆菌中介导毒性抗微生物肽的表达(TrxA mediating fusion expression of antimicrobialpeptide CM4 from multiple joined genes in Escherichia coli.Zhou L,Zhao Z,LiB,CaiY,Zhang S.Protein Expr Purif.2009Apr;64(2):225-230)。
为了融合蛋白的抗微生物功能，可能需要通过蛋白酶切割除去额外的融合蛋白。可商购的试剂盒如pET32表达系统(Novagen)可能需要根据所用的蛋白酶对例如融合蛋白的N端进行修饰，例如从MGS变成AMGS(SEQ IDNO:31)，其中残余的丙氨酸残基缘于所引入的肠激酶切割位点。
在本发明另一个优选实施方案中，根据本发明的融合蛋白的肽包括氨基酸序列的修饰和/或改变。这些改变和/或修饰可以包括氨基酸残基的突变，例如删除、插入和添加、取代或其组合，和/或化学改变，例如生物素化、乙酰化、PEG化、氨基-、SH-或羧基基团的化学改变。
本发明进一步涉及通过编码根据本发明的融合蛋白的分离的核酸分子消除、减少或防止细菌生物膜的方法。本发明进一步涉及包括根据本发明的核酸分子的载体。所述载体可以提供所述的根据本发明的融合蛋白的组成型或可诱导表达。
融合蛋白可以获自微生物，例如表达所述融合蛋白的遗传修饰的合适宿主细胞。所述宿主可以是微生物，例如细菌或酵母或真菌或者动物细胞，例如哺乳动物细胞，特别是人细胞。在本发明的一个实施方案中，酵母细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。宿主可以仅仅基于生物技术原因进行选择，例如产量、溶解度、成本等，但是也可以从医学观点加以选择，例如非致病性细菌或酵母、人细胞。
在一个进一步的方面中，本发明涉及通过组合物，优选药物组合物，来消除、减少或防止细菌生物膜的方法，所述组合物包含根据本发明的融合蛋白和/或用包含编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体转化的宿主。
在本发明的一个优选实施方案中，通过组合物消除、减少或防止细菌生物膜的方法包括使革兰氏阴性细菌的外膜可透化的额外作用剂，例如金属螯合物如EDTA、TRIS、乳酸、乳铁蛋白、多粘菌素、柠檬酸和/或其它物质，如Vaara所描述的(Agents that increase the permeability of the outer membrane.Vaara M.Microbiol Rev.1992Sep;56(3):395-441)。另外优选的组合物包括上述可透化剂的组合。特别优选的组合物包括大约10μM-大约100mM EDTA，更优选大约50μM-大约10mM EDTA，更优选大约0.5mM-大约10mMEDTA，更优选地大约0.5mM-大约2mM EDTA，更优选地大约0.5mM-大约1mM EDTA。然而，包括大约10μM-大约0.5mM EDTA的组合物也是优选的。同样优选的组合物包括大约0.5mM-大约2mM EDTA，更优选地大约1mM EDTA，和额外的大约10-大约100mM TRIS。
本发明还涉及通过用作药物的根据本发明的融合蛋白和/或用包括编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸转化的宿主消除、减少或防止细菌生物膜的方法。
在进一步的方面中，本发明涉及根据本发明的融合蛋白和/或用包括编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子的载体转化的宿主消除、减少和防止细菌生物膜的用途。在优选的用途中，产生生物膜的细菌导致对植物、动物和/或人类有害的病症、疾病或状况。在优选的用途中，产生生物膜的细菌可以是包括对人和动物的致病株的细菌群、科、属或种的革兰氏阴性细菌，如肠杆菌科(埃希菌属，特别是大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌、哈夫尼菌属、克雷伯氏菌属特别是肺炎克雷伯氏菌、摩根氏菌属、变形菌属、普罗威登斯菌属、沙雷氏菌属、耶尔森氏菌属)，假单胞菌科(假单胞菌属，特别是铜绿假单胞菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、寡氧单胞菌属、希瓦氏菌属、鞘氨醇单胞菌属、丛毛单胞属)，奈瑟氏菌属、莫拉氏菌属、弧菌属、气单胞菌属、布鲁氏菌属、弗朗西丝氏菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴尔通氏体属、考克斯氏体属、嗜血菌属、巴斯德氏菌属、曼氏杆菌属、放线杆菌属、加德纳氏菌属、螺旋体科(密螺旋体属和疏螺旋体属)、钩端螺旋体科、弯曲杆菌属、螺杆菌属、螺菌属、链杆菌属、拟杆菌科(拟杆菌属、梭杆菌属、普雷沃氏菌属、卟啉单胞菌属)，不动杆菌属，特别是鲍氏不动杆菌。优选地所述病症、疾病或状况可以是由假单胞菌导致的，特别是铜绿假单胞菌和/或恶臭假单胞菌，布克氏菌，特别是类鼻疽伯克霍尔德氏菌和/或茄青枯布克氏菌，沙门氏菌，特别是鼠伤寒沙门氏菌和/或肠炎沙门菌，不动杆菌，特别是鲍氏不动杆菌、大肠杆菌和/或克雷伯氏菌，特别是肺炎克雷伯氏菌。特别地，病症、疾病或状况的治疗和/或预防可以是由包括对人或动物的致病株的细菌群、科、属或种的革兰氏阳性细菌导致的，如单核细胞增生利斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、变异链球菌、马链球菌、艰难梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、疮疱丙酸杆菌、鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、肺炎支原体、放线菌属。
在一个优选的实施方案中，融合蛋白，优选地内溶素变体、自溶素变体或细菌素变体
在进一步的方面中，本发明涉及对需要治疗和/或预防的受试者中与细菌生物膜有关的病症、疾病或状况进行治疗的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的根据本发明的融合蛋白和/或有效量的用包括编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸转化的宿主或者根据本发明的组合物。该受试者可以是人或动物。
优选地，所述治疗方法可以用于治疗和/或预防由与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌导致的感染，特别是由上面列举的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌导致的感染。特别地，所述治疗方法可用于治疗和/或预防由与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌，特别是上面列出的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌导致的皮肤、软组织、呼吸系统、肺、消化道、眼、耳、牙齿、鼻咽、口、骨、阴道感染，伤口感染，菌血症和/或心内膜炎。
在根据本发明的治疗或预防方法中使用的剂量和施用途径取决于待处理的具体疾病/感染部位。施用途径可以是例如经口、局部、鼻咽、胃肠外、吸入、静脉内、肌内、鞘内、脊柱内、支气管内、肺内、骨内、心内、关节内、直肠、阴道或任何其它施用途径。在优选的实施方案中，融合蛋白被局部施加到生物材料上，优选皮肤上，特别是哺乳动物，优选人的皮肤上。在优选的实施方案中，融合蛋白被系统地施加到生物材料，优选血液中，特别是哺乳动物，优选人的血液中。
为了将根据本发明的融合蛋白和/或有效量的用包括编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸转化的宿主或者根据本发明的组合物施加到感染部位(或者有被感染危险的部位)，可以使用保护活性组分在到达感染部位之前不受环境影响(例如蛋白酶、氧化、免疫应答等)的制剂。因此，制剂可以是胶囊、糖衣丸、药片、粉末、栓剂、乳液、悬浮剂、凝胶、洗液、乳霜、油膏、注射液、糖浆、喷雾剂、吸入剂或任何其它医学上恰当的盖伦制剂。优选地，盖伦制剂可以包括合适的担载体、稳定化剂、调味剂、缓冲液或其它合适的试剂。例如，对于局部施用，制剂可以是洗液、乳膏、凝胶、油膏或膏药，对于鼻咽施用，制剂可以是可通过向鼻腔喷雾施用的盐水溶液。对于口服施用，在治疗和/或预防特定的感染部位(例如小肠)的情况下，可能有必要保护根据本发明的融合蛋白在到达感染部位之前不会被胃肠道的严酷消化环境所破坏。因此，可以使用细菌作为担载体，其可以在胃内的初始消化步骤中存活并随后将根据本发明的融合蛋白分泌到小肠环境中。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及使用根据本发明的融合蛋白和/或用包括编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子的载体转化的宿主在制造用于治疗和/或预防由与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌感染导致的病症、疾病或状况的药物中的用途。一个优选的实施方案涉及使用根据本发明的融合蛋白在制造用于和抗生素组合或作为抗生素的附加治疗由与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌感染导致的病症、疾病或状况的药物中的用途。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及使用根据本发明的融合蛋白和/或用包括编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子的载体转化的宿主在制造用于治疗和/或预防由与细菌生物膜有关的铜绿假单胞菌属(特别是由铜绿假单胞菌)感染导致的病症、疾病或状况的药物中的用途，所述病症、疾病或状况尤其是小肠感染，特别是在婴儿的小肠感染，脑膜感染如出血性脑膜炎，中耳感染，皮肤(坏疽性深脓疱)特别是烧伤、尿道的感染，鼻炎，菌血症肺炎，特别是其中患者正患有囊性纤维化病或血液恶性肿瘤如白血病，或者患有由于免疫抑制治疗导致的嗜中性白细胞减少症，败血症，特别是由于长期静脉内或尿道插管、侵入性外科手术操作和严重烧伤导致的败血症，心内膜炎，特别是当患者是静脉内吸毒者或者患有开心手术综合征的场合，高破坏性眼感染，特别是使用了被污染的眼用溶液或严重面部烧伤之后，骨软骨炎，特别是由于严重创伤或者由被污染的衣物导致的刺伤所导致的骨软骨炎。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述病症、疾病或状况是由与细菌生物膜有关的类鼻疽伯克霍尔德氏菌导致的，特别是惠特莫尔病、慢性肺炎、败血症，特别是患者具有外伤性皮肤损伤的场合。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由与细菌生物膜有关的鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门菌导致的，特别是急性胃肠炎和局部化脓性过程，特别是骨髓炎、心内膜炎、胆囊炎，特别是由于鼠伤寒沙门氏菌脑膜炎导致的，特别是患者小于2岁的场合。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由伤寒沙门氏菌导致的，特别是伤寒(typus)。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由副伤寒沙门氏菌导致的，特别是副伤寒(paratyphus)。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由与细菌生物膜有关的鲍氏不动杆菌导致的，特别是支气管炎、肺炎、伤口感染和败血症，特别是由于静脉内插管导致的败血症。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由与细菌生物膜有关的大肠杆菌导致的，特别是肠道外感染，特别是阑尾炎、化脓性胆囊炎、腹膜炎、化脓性脑膜炎和尿道感染，肠道内大肠杆菌感染，特别是流行性肠炎，和类似于痢疾、败血症、肠毒血症、乳腺炎和痢疾的传染病。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由与细菌生物膜有关的肺炎克雷伯氏菌导致的，特别是肺炎、菌血症、脑膜炎和尿道感染。在一个具体的实施方案中，本发明涉及根据本发明的融合蛋白和/或用包括编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子的载体转化的宿主制造用于治疗和/或预防由单核细胞增生利斯特氏菌导致的病症、疾病或状况的药物中的用途，所述病症、疾病或状况特别是婴儿脓毒性肉芽肿病(Granulomatosis infantiseptica)(新生儿李斯特杆菌病)、单核细胞增多症、结膜炎、脑膜炎、脓毒性肉芽肿和孕妇李斯特杆菌病。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由金黄色葡萄球菌导致的，特别是皮肤感染，如脓皮病，特别是毛囊炎、疔疮、痈、汗腺脓肿和天疱疮，和类似的鳞屑(scaled)皮肤综合征。皮肤综合征可以在三种临床图景中出现：剥脱样皮炎、大疱性脓疱疮和猩红热样红皮病。而且，由金黄色葡萄球菌导致的病症、疾病或状况是金黄色葡萄球菌肺炎、住院症(hospitalism)，特别是手术伤口感染、产褥期乳腺炎(mastitis puerperalis)和小肠结肠炎(enterokolitis)，和食物中毒。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由酿脓链球菌导致的，特别是扁桃体炎、咽炎、猩红热、丹毒热、风湿热和急性肾小球肾炎。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由肺炎链球菌导致的，特别是肺炎、匐行性角膜溃疡、中耳炎、脑膜炎、腹膜炎、乳突炎和骨髓炎。
在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由产气荚膜梭菌导致的，特别是气性坏疽、坏死性溃疡性肠炎(enteritis necroticans ulcerosa)和食物中毒。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由肉毒梭菌导致的，特别是肉毒中毒。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由艰难梭菌导致的，特别是假膜小肠结肠炎(pseudomembranoes enterokolitis)。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由炭疽芽孢杆菌导致的，特别是皮肤炭疽、吸入性炭疽和胃肠道炭疽。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由粪肠球菌或屎肠球菌导致的，例如医院内感染和心内膜炎。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由蜡状芽孢杆菌导致的，特别是食物中毒、支气管肺炎、败血症和脑膜炎。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)和结核分枝杆菌导致的，特别是结核病。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由肺炎支原体导致的，特别是肺炎、上呼吸道疾病和耳鼓炎症。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由放线菌属(Actinomyces)导致的，特别是人、牛、猫和犬的放线菌病。在本发明的另一个具体实施方案中，病症、疾病或状况是由白喉棒状杆菌导致的，特别是扁桃体、鼻、鼻咽或中耳的局限性白喉，喉、气管、支气管的进行性白喉，毒性或恶性白喉、皮肤或伤口白喉。
利用根据本发明的融合蛋白消除、减少或防止细菌生物膜的方法为侵入细菌生物膜内部并消除、减少和防止细菌生物膜提供了可能性。
利用根据本发明的融合蛋白消除、减少或防止细菌生物膜的方法可以用于治疗和/或预防如下的感染：伤口感染，特别是与糖尿病有关的伤口，扁桃体炎、骨髓炎、细菌性心内膜炎、鼻窦炎、角膜感染、尿道感染、胆道感染、感染性肾结石、尿道炎、前列腺炎、导管感染、中耳感染、牙菌斑形成、牙龈炎、齿根骨膜炎、囊性纤维化病和永久留置装置(例如关节假体和心脏瓣膜)的感染。
在利用根据本发明的融合蛋白消除、减少和防止细菌生物膜的另一个优选实施方案中，可以用于治疗和/或预防与外来物质有关的感染，例如如下物质的污染和定植(colonisation)：导管、植入体和医疗装置，特别是仪器、设备、内窥镜、牙科装置、透析装置，如腹膜透析导管、起搏器、气管内导管、声音假体、脑脊液分流器、静脉插管、人工心脏瓣膜和关节假体。
在利用根据本发明的融合蛋白消除、减少和防止细菌生物膜的另一个优选实施方案中，细菌生物膜由表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和白色假丝酵母形成。
在利用根据本发明的融合蛋白消除、减少和防止细菌生物膜的另一个优选实施方案中，可用于防止或除去卫生保健、农业和工业场所中的污染，特别是医院水管道、水、水管设备、通风设备、建筑采暖设备、空调、油井、化妆品和药物中的污染。
在利用根据本发明的融合蛋白消除、减少和防止细菌生物膜的另一个优选实施方案中，可用于防止生物腐蚀，特别是在冷却循环系统、水处理工厂、家庭热水系统、发电站、汽车生产系统和机器、计算机、颜料、油气中的生物腐蚀。
在利用根据本发明的融合蛋白消除、减少和防止细菌生物膜的另一个优选实施方案中，可用于防止生物污着，特别是在海底物体、船舶、平台、浮标、用于海事领域科学或监视目的的传感系统。
在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的融合蛋白用于医疗，如果待治疗或预防的感染是由于与细菌生物膜有关的多耐药菌株导致的，特别是由耐受一种或多种如下抗生素的菌株导致的：链霉素、四环素、头孢噻吩、庆大霉素、头孢噻肟、头孢菌素、头孢唑肟或亚胺培南。
而且，在本发明的方法或用途中，所述融合蛋白(优选内溶素变体、自溶素变体或细菌素变体)可以与常规抗菌剂(例如抗生素、羊毛硫抗生素、细菌素或内溶素)组合或在常规的抗菌剂之外进一步使用、添加或施用。在另一个优选的实施方案中，在根据本发明的方法或用途中，与和融合蛋白同时或者在施加或添加融合蛋白之后或之前添加、使用或施用抗生素。
在本发明的优选实施方案中，所述融合蛋白可以和至少一种如下的抗生素组合使用或施用：β-内酰胺、氨基糖苷类、氟喹诺酮、大环内酯类、新生霉素、利福平、恶唑烷酮类、夫西地酸、莫匹罗星、侧耳素、达托霉素、万古霉素、四环素、磺胺类、氯霉素、氯羟吡啶(trimetoprim)、磷霉素、环丝氨酸和多粘菌素。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述融合蛋白可以在消除、减少或防止金黄色葡萄球菌的细菌生物膜的方法中使用，通过将其与至少一种如下的抗生素组合施用：β-内酰胺、氨基糖苷类、氟喹诺酮、大环内酯类、新生霉素、利福平、恶唑烷酮类、夫西地酸、莫匹罗星、侧耳素、达托霉素、万古霉素、四环素、磺胺类、氯霉素、氯羟吡啶(trimetoprim)、磷霉素和环丝氨酸。
在本发明的另一个优选实施方案中，融合蛋白可以在消除、减少或防止大肠杆菌的细菌生物膜的方法中使用，通过将其与至少一种如下的抗生素组合施用：β-内酰胺、氨基糖苷类、氟喹诺酮、四环素、磺胺类、氯霉素、氯羟吡啶(trimetoprim)、磷霉素、环丝氨酸和多粘菌素。
在本发明的另一个优选实施方案中，融合蛋白可以在消除、减少或防止铜绿假单胞菌的细菌生物膜的方法中使用，通过将其与至少一种如下的抗生素组合施用：β-内酰胺、氨基糖苷类、氟喹诺酮和多粘菌素。
本发明还涉及用于消除、减少或防止细菌生物膜的药包，其包括一个或多个隔室，其中至少一个隔室包括一种或多种根据本发明的融合蛋白和/或一种或多种用包括编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸转化的宿主或者根据本发明的组合物。
在另一个方面中，本发明涉及制备用于消除、减少或防止细菌生物膜的药物组合物的方法，所述方法包括将一种或多种根据本发明的融合蛋白和/或一种或多种用包括编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸转化的宿主与可药用的稀释剂、赋形剂或载体混合。
在更进一步的方面中，根据本发明的组合物是用于消除、减少和防止细菌生物膜的化妆组合物。若干细菌物种会在患者身体的暴露于环境的表面，例如皮肤上造成刺激。为了防止这种刺激或者为了消除所述细菌致病原的微小表现，可以采用专用化妆物质制备物，其包括足够量的根据本发明的融合蛋白，以降解已经存在或者新定居的病原性革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌。
在进一步的方面中，本发明涉及使用根据本发明的融合蛋白作为医学、食品或饲料、或者环境诊断中的诊断手段，特别地作为诊断由特别是与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌导致的细菌感染的诊断手段的应用。在这个方面中，根据本发明的融合蛋白可以用作工具来特异降解与细菌生物膜有关的病原性细菌，特别是革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性病原细菌。通过添加去污剂如Triton X-100或其它削弱细菌细胞外被的添加剂如多粘菌素B，可以支持根据本发明的融合蛋白对细菌细胞的降解。特异性细胞降解作为后续的特异性细菌检测的初始步骤是必需的；所述的特异性细菌检测使用基于核酸的方法如PCR、核酸杂交或NASBA(基于核酸序列的扩增)，免疫学方法如IMS、免疫荧光或ELISA技术，或者其它依赖于细菌细胞的细胞内容物的方法，如使用特异针对不同细菌群或物种的蛋白的酶学测定(例如针对肠细菌的β-半乳糖苷酶，针对凝固酶阳性菌的凝固酶)。
在进一步的方面中，本发明涉及使用根据本发明的融合蛋白除去、减少和/或防止食品、食品加工设备、食品加工厂、与食物接触的表面如货架和食品存放区域、以及所有其它病原性、兼性病原性或其它不期望的细菌有可能孳生于食材的情形、医疗装置、以及医院和诊所(surgeries)中所有种类的表面上的与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌污染的用途。
特别地，本发明的融合蛋白可以作为消毒剂(sanitizing agent)预防性地用于消除、减少或防止细菌生物膜的方法中。所述消毒剂可以在手术之前或之后使用，或者例如在血液透析期间使用。而且，可以用根据本发明的融合蛋白处理早产儿和免疫低下的人、或者需要假体装置的受试者。所述治疗或处理可以是预防性的，或者可以在急性感染期间进行。在相同的语境下，医院内感染，特别是被抗生素耐药菌株如铜绿假单胞菌(FQRP)、不动杆菌和肠杆菌如大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌、哈夫尼菌属、克雷伯氏菌属、摩根氏菌属、变形菌属、普罗威登斯菌属、沙雷氏菌属和耶尔森氏菌属；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素粪肠球菌、耐万古霉素屎肠球菌、肺炎链球菌、疮疱丙酸杆菌、多耐药性结核分枝杆菌的感染，可以用本发明的融合蛋白进行预防性治疗或处理或者在急性期进行治疗或处理。因此，根据本发明的融合蛋白可以作为消毒剂使用，来消除、减少和防止细菌生物膜，也可以和其它可用在消毒液中的成分，如去污剂、表面活性剂(tensids)、溶剂、抗生素、羊毛硫抗生素或细菌素组合使用。
为了将根据本发明的融合蛋白作为消毒剂用于消除、减少或防止细菌生物膜，例如在医院、牙科诊所、兽医、厨房或浴室中使用，融合蛋白可以被制备在组合物中，处于例如液体、粉末、凝胶的形式，或者作为湿纸巾或消毒片产品(disinfection sheet product)的组分。所述组合物为了其各自的用途和形式可以额外地包括合适的担载体、添加剂、稀释剂和/或赋形剂，也可以包括支持抗微生物活性的作用剂如EDTA，或可以提高融合蛋白的抗微生物活性的作用剂。融合蛋白还可以和常用的消毒剂一起使用，如醇、醛、氧化剂、酚、季铵盐化合物或紫外光。为了对例如表面、物体和/或设备进行消毒，可以将融合蛋白施加到所述表面、物体和/或设备上。该施加可以通过例如用任何手段如布或碎布将消毒组合物润湿，通过喷雾、倾倒来进行。融合蛋白可以按照不同的浓度加以使用，这取决于各自的应用，以及为获得完全的抗微生物活性而意图的“反应时间”。
在一个进一步的方面中，本发明涉及使用根据本发明的融合蛋白作为食品添加剂的用途。
本发明进一步的可用范围可以从下文中给出的详细说明书中变得显而易见，然而应当理解，详细说明书和具体的实施例尽管指示了本发明的优选实施方案，但是仅仅是作为举例给出的，因为本领域的技术人员可以从这些详细的说明书中显见本发明精神和范围内的各种改变和修饰。应当理解，前述的一般描述和下文的详细描述都只是举例和解释性的，不对由权利要求限定的本发明构成限制。
下面的实施例解释了本发明，但是不应认为具有限制性。除非另外指出，否则所用的分子生物学标准方法如例如Sambrock等,1989,分子克隆：实验室手册，第二版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition),ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，New York所述。
实施例1：经过修饰的phiKZgp144和ELgpgp188内溶素变体的克隆、表达 和纯化
如SEQ ID NO:1所示的phiKZgp144和如SEQ ID NO:2所示的ELgp188是模式内溶素，来源于铜绿假单胞菌噬菌体和EL，具有N端肽聚糖结合结构域和C端催化结构域(Briers et al.,2007)。
为了扩增phiKZgp144和ELgp188的开放阅读框(ORF)，使用PCR方法，采用标准5'引物(对于phiKZgp144是5’ATGAAAGTATTACGCAAA3’(SEQID NO:83);对于ELgp188是5’ATGAACTTCCGGACGAAG3’(SEQ ID NO:65))和根据SEQ ID NO:81和82的标准3'引物(对于phiKZgp144是TTTTCTATGTGCTGCAAC(SEQ ID NO:81);对于ELgp188是ATACGAAATAACGTGACGA(SEQ ID NO:82))。为了使得编码phiKZgp144或ELgp188开放阅读框的5'端延长一个编码9个带正电荷残基(Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys–SEQ ID NO:11)的基因片段，采用TAIL PCR，利用延伸的5'引物(对于phiKZgp144是5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAAAGTATTACGCAAAG3’(SEQ ID NO79);对于ELgp188是5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAACTTCCGGACGAAG3’(SEQ ID NO:80))和根据SEQ ID NO:81和82的标准3'引物。根据制造商的操作规程将PCR产物克隆在pEXP5CT/表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。除了赖氨酸三联体密码子还纳入了精氨酸三联体密码子，以避免tRNA耗竭并降低移框的风险(赖氨酸的唯一两个可用的三联体密码子是AAA和AAG，导致长的A片段)。将额外的多聚阳离子盒子插入到设计的BamHI限制位点处，使尾巴延长额外的阳离子残基。该插入在每个连接位点产生一个精氨酸和丝氨酸三联体密码子(图1)。将最多4个多聚阳离子性肽与phiKZgp144和ELgp188融合，分别命名为(POLY)n-gp144或(POLY)n-gp188(n=1,2,3,4)，它们在N端分别包括9、19、29和39个带正电荷的氨基酸残基。相应地，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞中表达如下的构建体(37°C指数生长的细胞，用1mM IPTG诱导，在37°C表达4h)：
融合蛋白 SEQ ID NO: 带正电荷氨基酸残基数目
POLY-gp144 SEQ ID NO:35 9
(POLY)2-gp144 SEQ ID NO:36 19
(POLY)3-gp144 SEQ ID NO:37 29
(POLY)4-gp144 SEQ ID NO:38 39
POLY-gp188 SEQ ID NO:39 9
(POLY)2-gp188 SEQ ID NO:40 19
(POLY)3-gp188 SEQ ID NO:41 29
(POLY)4-gp188 SEQ ID NO:42 39
经过修饰的内溶素变体POLY-gp144(SEQ ID NO:35),(POLY)2-gp144(SEQ ID NO:36),POLY-gp188(SEQ ID NO:39)和(POLY)2-gp188(SEQ IDNO:40)已被用于进一步的研究。所述蛋白质利用C端6xHis-标签通过Ni2+亲和色谱(使用1ml His-trap Ni-NTA柱进行Akta快速蛋白液相色谱)进行纯化。通过分光光度测量蛋白浓度和纯化储液的总体积确定每升大肠杆菌表达培养物的总产量。gp188衍生物的纯化(65mM咪唑)在比gpl44衍生物(50mM咪唑)更严格的条件下进行，以保证高纯度。每升大肠杆菌表达培养物的总产量如表5所示。
表5-每升大肠杆菌表达培养物中重组纯化的内溶素衍生物的总产量
纯化的储液纯度为～90%。POLY衍生的纯化液的质谱分析显示有痕量的大肠杆菌50S核糖体亚单位蛋白L2和16S rRNA尿苷-516假尿苷酸合酶。所有phiKZgp144衍生物均显示有多聚体形成，其可以通过添加β-巯基乙醇转化为单体，这提示：间二硫键(interdisulde bond)导致多聚化。
实施例2：经过修饰的phiKZgp144和ELgp188变体的抗微生物活性
将指数生长的(~106/ml)铜绿假单胞菌PAO1p细胞(Pirnay JP et al.(2003),J Clin Microbiol.,41(3):1192-1202)稀释100x(最终密度为～106/ml)，并在室温下与10μg每种未透析蛋白(未经修饰的内溶素phiKZgp144(SEQ IDNO:1)和ELpg188(SEQ ID NO:2)和经过修饰的内溶素变体POLY-gp144(SEQ ID NO:35),(POLY)2-gp144(SEQ ID NO:36),POLY-gp188(SEQ ID NO:39)和(POLY)2-gp188(SEQ ID NO:40))(在缓冲液(20mM NaH2P04-NaOHpH7.4;0.5M NaCl;0.5M咪唑)中、终浓度为100μg/ml)温育。1小时后，将细胞悬液在PBS中稀释(10e-5,10e-4和10e-3)并涂板(标准LB培养基，37°C过夜温育)。此外，涂板含有PBS缓冲液中的细胞的阴性对照。过夜温育后计数剩余菌落。根据计数的细胞数目计算抗微生物活性，用相对失活(%)(=100-(Ni/N0)*100，N0=未处理细胞的数目，Ni=经处理细胞的数目)和对数单位(=log10N0/Ni)表示(表6)。所有样品重复6次。用平均值/标准偏差表示。用Student's t检验进行统计分析。
与阴性对照相比，未经修饰的内溶素phiKZgp144和ELgp188没有显著减少细胞数目。这个观察结果证明了外膜作为屏障阻碍内溶素降解革兰氏阴性细菌细胞壁的效力。相反，如图6所示，用经过修饰的内溶素POLY-gp144,(POLY)2-gp144,POLY-gp188and(POLY)2-gp188温育导致细菌细胞数目显著减少(α=0.05)(对于POLY-gp144是99.85±0.09%，对于POLY-gp188是98.0±0.2%)。多聚阳离子性肽长度的增加趋向于进一步增强抗细菌活性，特别是对于phiKZgp144((POLY)2-gp144在1小时内实现了高达99.98±0.02%或3.7±0.3对数单位的降低)。而且，实验证明，经过修饰的phiKZgp144内溶素比经过修饰的ELgp188内溶素具有更高的抗细菌活性。
表6-未修饰的和经修饰的phiKZgp144和ELgp188变体内溶素的抗细菌效果
因此，实验证明，向phiKZgp144(SEQ ID NO:1)的N端添加9个阳离子残基的短肽已经足以在1小时内杀死几乎99.9%的细胞。多聚L-赖氨酸也具有内在的抗细菌活性，尽管迄今为止仅认为至少20个残基的聚合物具有这种性质(Vaara and Vaara,1983a,1983b)。然而，多聚阳离子性肽和内溶素的协调作用可以杀死细胞。
在进一步的实验中，将经过修饰的内溶素POLY-gp144对50mMKH2P04/K2HP04pH7透析，并代替上述未经透析的蛋白溶液使用。这样，失活水平从2.9±0.3对数单位进一步增加到3.9±0.2对数单位。
实施例3：以巴斯德毕赤酵母作为无毒性重组生产的宿主表达经过修饰的 phiKZgp144和ELgp188变体
将编码POLY-gp144(SEQ ID NO:35)的开放阅读框克隆在pPICZoA穿梭载体(Invitrogen)中，随后通过同源重组(如制造商所述;巴斯德毕赤酵母X33细胞,Invitrogen)将该载体整合在巴斯德毕赤酵母基因组中。在BMMY培养基中用甲醇(1%)诱导基因表达，1、3和4天后对上清液进行分析，检查是否存在酶活性。因此，1、3和4天后将30μl巴斯德毕赤酵母表达培养物上清加入到用270μl经氯仿可透化的铜绿假单胞菌PAO1p细胞(Pirnay JPet al.(2003),J Clin Microbiol.,41(3):1192-1202)(缓冲条件:KH2PO4/K2HP04I=120mM pH6.2)中。随后，用分光光度法记录光密度(图2)。光密度降低表明巴斯德毕赤酵母分泌了胞壁水解酶。作为阴性对照，包括没有表达质粒的巴斯德毕赤酵母X33。因此，在添加上清样品时的底物裂解是巴斯德毕赤酵母成功重组产生和分泌POLY-gp144(SEQ ID NO:35)的量度。1天后，可以检测到有限的酶活性。最大活性在3天后观察到，因为在第4天没有观察到上清液活性有显著增加。没有观察到对巴斯德毕赤酵母细胞有毒性作用。
在通过巴斯德毕赤酵母进行表达期间，载体的α-分泌信号导致重组蛋白被分泌到周围介质中，这使得纯化变得简单，因为只有有限种类的其它蛋白被分泌。开放阅读框5'端的BamHI限制位点容许添加更多编码额外多聚阳离子性肽的盒子。
实施例4：具有不同多聚阳离子性肽的进一步修饰的内溶素phiKZgp144变 体
为了检测和比较多聚阳离子性肽的潜力，合成了在蛋白的N端具有不同多聚阳离子性肽的多种phiKZgp144及其它内溶素编码基因的变体。肽的变化涉及长度、组成和接头序列的插入。一方面，产生了在N端具有多个KRK基序的进一步的多聚阳离子性肽。另一方面，产生了仅由精氨酸(R)或赖氨酸(K)构成的多聚阳离子性肽。而且，为了提高长的多聚阳离子性肽的翻译，产生了包含接头序列的多聚阳离子性肽。
将不同产物克隆在pET32b表达载体(Novagen,Darmstadt,Germany)中。使用pET32b是为了减少多聚阳离子性肽对大肠杆菌宿主的潜在毒性。载体编码的一种融合蛋白(硫氧还蛋白)可掩盖多聚阳离子性肽，并可以在纯化过程中除去。
相应地，在37°C在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达如下的经过修饰的内溶素变体，直到光密度达到OD600nm=0.6。然后，用1mM IPTG(终浓度)诱导蛋白表达，并且表达持续4个小时。然后通过6000g离心20min收集大肠杆菌细胞，细胞破碎和蛋白纯化按照S-Tag纯化试剂盒(Novagen,Darmstadt,Germany)实施：
所有的蛋白用S-TagTMrEK纯化试剂盒(Novagen,Darmstadt,Germany)纯化。使用pET32b载体，表达的蛋白对宿主没有毒性，从而导致产生的蛋白的产量高。纯化的储液显示高纯度。
将指数生长(~106/ml)的铜绿假单胞菌PAO1p细胞(烧伤分离株，QueenAstrid Hospital，Brussels;Pirnay JP et al.(2003),J Clin Microbiol.,41(3):1192-1202)稀释100x(终密度为～106/ml)，在室温与如上列出的未透析蛋白各10μg(在缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5M咪唑)中终浓度为100μg/ml)温育。1小时后，将细胞悬液1:100稀释，涂布在LB上。此外，用缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5M咪唑)涂布阴性对照。37°C过夜温育后计数剩余菌落数。根据计数的细胞数目计算抗细菌活性，用相对失活(%)(=100-(Ni/N0)*100，N0=未处理细胞的数目，Ni=经处理细胞的数目)表示(表7)。所有样品至少重复4次。
表7-未修饰的和经修饰的内溶素phiKZgp144和ELgp188的抗微生物效果
与阴性对照相比，未修饰的内溶素phiKZgp144没有显著减少细胞数目。除此之外，具有N端多重KRK基序多聚阳离子性肽的经修饰phiKZgp144变体可极大地提高抗微生物效果。然而，测量结果显示，与未经修饰的phiKZgp144相比，具有赖氨酸或精氨酸同聚物肽的变体也可显著减少细胞数目。而且，具有38个氨基酸残基的多聚阳离子性肽并包含接头序列的变体也可极大地提高抗微生物效果。
实施例5：鼠伤寒沙门氏菌噬菌体PSP3的经修饰内溶素变体
根据SEQ ID NO:8的PSP3gp10是来自于鼠伤寒沙门氏菌噬菌体PSP3的具有165个氨基酸残基的球状内溶素，具有一个催化性λ样胞壁质酶结构域。如BLASTp和Pfam分析所预测的，PSP3gp10内溶素在其大约氨基酸残基34-大约氨基酸残基152的范围内包含其催化结构域。
利用热启动Taq聚合酶PCR反应(Hot Start Taq polymerase PCR reaction,Qiagen,Germany)使用纯化的噬菌体PSP3基因组DNA作为模板扩增PSP3gp10的开放阅读框(ORF)，采用如下的PCR参数：
对于所述PCR，使用标准的5'引物(5’ATGGGATCCCCGGTCATTAATACTCACCAG3’(SEQ ID NO:50))和标准的3'引物(5’TGCCATCACCCCGCCAGCCGTG3’(SEQ ID NO:51))。为了使编码PSP3gp10的ORF的5'端延长一个编码多聚阳离子9-聚体肽Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys(SEQ ID NO:11)的基因片段，进行TAILPCR(热启动Taq聚合酶PCR，使用相同的参数)，使用延伸5'引物(5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAA
GAAACGCAAACCGGTCATTAATACTCACCAG3’(SEQ ID NO:52))和根据SEQ ID NO:51的标准3'引物。通过遵循制造商的TA克隆方案将原始的未经修饰的PSP3gp10PCR片段和PK延长的片段均连接在pEXP5CT/表达载体中(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。
在指数生长的大肠杆菌BL21(λDE3)pLysS细胞(Invitrogen)中，用1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)37°C诱导4小时后进行根据SEQ ID NO:8的PSP3gp10和根据SEQ ID NO:53的PKPSP3gp10的重组表达。两种蛋白均通过Ni2+亲和色谱(Akta FPLC,GE Healthcare)利用由pEXP5CT/表达载体编码的C端6xHis-标签加以纯化。Ni2+亲和色谱的分4个后续步骤，均在室温下进行：
1.用10倍柱体积的清洗缓冲液(60mM咪唑,0.5mM NaCl和20mMNaH2P04-NaOH，pH7.4)以0.5ml/min的流速平衡Histrap HP 1ml柱子(GE Healthcare)。
2.以0.5ml/min的流速将总裂解物(含有需要的内溶素)加载在Histrap HP1ml柱子上。
3.用15倍柱体积的清洗缓冲液以1ml/min的流速清洗柱子。
4.用10倍柱体积的洗脱缓冲液(500mM咪唑,5mM NaCl和20mMNaH2P04-NaOH，pH7.4)以0.5ml/min的流速将结合的内溶素从柱子上洗脱下来。
表8显示了每升大肠杆菌表达培养物中两种纯化重组蛋白的总产量。数值通过用分光光度法测量280nm波长下的蛋白浓度和纯化储液的总体积加以确定。纯化的储液分别由洗脱缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5MNaCl;500mM咪唑)中的PSP3gp10和PKPSP3gp10构成，SDS-PAGE凝胶上肉眼观察确定纯度为至少90%。
表8-每升大肠杆菌表达培养物中纯化重组PSP3gp10内溶素及其修饰变体PKPSP3gp10的产量
为了确定根据SEQ ID NO:53的PKPSP3gp10内溶素的抗革兰氏阴性细菌谱，用临床的铜绿假单胞菌菌株PAO1p和Br667、大肠杆菌WK6和鼠伤寒沙门氏菌测试1.315μM PKPSP3gp10内溶素和0.5mM EDTA的组合(见表9)。将每个菌株的指数生长的细菌细胞(OD600nm=0.6)稀释100倍，使终密度为大约106/ml，分别与或者不与0.5mM EDTA组合在室温下与未经修饰的内溶素PSP2gp10(SEQ ID NO:8)和经过修饰的内溶素PKPSP3gp10(SEQ IDNO:53)一起不振荡温育30分钟。对于温育，每种内溶素在缓冲液(20mMNaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5M咪唑)中使用，并且温育在1.315μM的内溶素终浓度下进行。作为对照，还将每种菌株用0.5mM EDTA(与上面列出相同的缓冲液)但没有内溶素的条件温育30分钟。
表9-所用革兰氏阴性菌株列表
*Pirnay JP et al.(2003).Molecular epidemiology of Pseudomonasaeruginosa colonization in a burn unit:persistence of a multidrug-resistant cloneand a silver sulfadiazine-resistant clone.J Clin Microbiol.,41(3):1192-1202.
温育后，将细胞悬液稀释3次(分别为105-104-103细胞/ml)，并将100μl每种稀释液涂布在LB培养基上。37°C过夜温育后计数剩余菌落数。根据计数的细胞数目计算抗细菌活性，用相对失活(%)(=100-(Ni/N0)*100，N0=未处理细胞的数目，Ni=经处理细胞的数目)表示(表10)。
表10-未经修饰的内溶素(PSP3gp10)及其修饰的内溶素变体(PKPSP3gp10)在有或无EDTA-Na2的条件下对不同的指数生长的革兰氏阴性物种的抗细菌活性
所有的样品重复3次。用平均值+/-标准偏差显示。所观察到的最大减少取决于10个细胞/ml的检测水平和最初的细胞密度。对于PAO1p，EDTA与未经修饰的PSP3gp10内溶素及其修饰的变体PKPSP3gp10有协同作用。
实施例6：大肠杆菌噬菌体P2的经修饰内溶素变体
根据SEQ ID NO:9的P2gp09是一种源自于大肠杆菌噬菌体P2的球状内溶素，长度为165个氨基酸残基，具有一个催化性λ样胞壁质酶结构域。如BLASTp和Pfam分析所预测的，P2gp09内溶素在其大约氨基酸残基34-大约氨基酸残基152的范围内包含其催化结构域。
利用标准PCR反应使用Pfu聚合酶(Fermentas)用纯化的噬菌体P2基因组DNA作为模板扩增P2gp09的开放阅读框(ORF)，采用如下的PCR参数：
对于所述PCR，使用标准的5'引物(5’ATGGGATCCCCGGTAATTAACACGCATC3’(SEQ ID NO:54))和标准的3'引物(5’AGCCGGTACGCCGCCAGCGGTACGC3’(SEQ ID NO:55))。为了将编码P2gp09的ORF的5'端延长一个编码多聚阳离子9-聚体肽Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-LysLys-Arg-Lys(SEQ ID NO:11)的基因片段，进行TAILPCR(使用与上述标准PCR相同的参数)，使用延伸5'引物(5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGC
AAACCGGTAATTAACACGCATC3’(SEQ ID NO:56)和根据SEQ ID NO:55的标准3'引物。通过遵循制造商的TA克隆方案将原始的未经修饰的P2gp09PCR片段和延长的片段均连接在pEXP5CT/表达载体中(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。
在指数生长的大肠杆菌BL21(λDE3)pLysS细胞(Invitrogen)中，用1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)37°C诱导4小时后，进行根据SEQ ID NO:9的P2gp09和根据SEQ ID NO:57的PKP2gp09的重组表达。两种蛋白均通过Ni2+亲和色谱(Akta FPLC,GE Healthcare)使用由pEXP5CT/表达载体编码的C端6xHis-标签加以纯化。Ni2+亲和色谱分4个后续步骤，均在室温下实施：
1.用10倍柱体积的清洗缓冲液(60mM咪唑,0.5mM NaCl和20mMNaH2P04-NaOH，pH7.4)以0.5ml/min的流速平衡Histrap HP 1ml柱子(GE Healthcare)。
2.以0.5ml/min的流速将总裂解物(含有需要的内溶素)加载在Histrap HP1ml柱子上。
3.用15倍柱体积的清洗缓冲液以1ml/min的流速清洗柱子。
4.用10倍柱体积的洗脱缓冲液(500mM咪唑,5mM NaCl和20mMNaH2P04-NaOH，pH7.4)以0.5ml/min的流速将结合的内溶素从柱子上洗脱下来。
表11显示了每升大肠杆菌表达培养物中两种纯化重组蛋白的总产量。数值通过用分光光度法测量280nm波长下的蛋白浓度和纯化储液的总体积加以确定。纯化的储液分别由处于洗脱缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;500mM咪唑)中的P2gp09和PKP2gp09构成，在SDS-PAGE凝胶上肉眼观察确定纯度为至少95%。
表11-每升大肠杆菌表达培养物中纯化的重组P2gp09内溶素及其PK修饰变体PKP2gp09的产量
为了确定根据SEQ ID NO:57的PK2gp09内溶素的抗革兰氏阴性菌谱，测试1.315μM PK2gp09内溶素和0.5mM EDTA的组合对临床的铜绿假单胞菌菌株PAO1p和Br667、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、恶臭假单胞菌G1，以及大肠杆菌WK6的作用(见表13)。将每个菌株的指数生长的细菌细胞(OD600nm=0.6)稀释100倍，使终密度为大约106/ml，在室温下、与或者不与0.5mM EDTA组合，与未经修饰的内溶素P2gp09(SEQ ID NO:9)和经过修饰的内溶素PKP2gp09(SEQ ID NO:57)一起不振荡温育30分钟。对于温育，每种内溶素在缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5M咪唑)中使用，并且在1.315μM的内溶素终浓度下进行温育。作为对照，每种菌株也在0.5mM EDTA(与上面列出相同的缓冲液)但没有内溶素的条件下温育30分钟。温育后，将细胞悬液稀释三次(分别为105-104-103细胞/ml)，并将100μl的每种稀释液涂布在LB培养基上。37°C过夜温育后计数剩余菌落数。根据计数的细胞数目计算抗细菌活性，用以对数单位计的相对失活(=log10N0/Ni，N0=未处理细胞的数目，Ni=经处理细胞的数目，均在温育之后计数)表示(表12)。
表12-未经修饰的内溶素(P2gp09)及其修饰的内溶素变体(P2gp09)在有或无EDTA-Na2的条件下对不同的指数生长的革兰氏阴性物种的抗细菌活性
所有样品重复三次。用平均值+/-标准偏差表示。所观察到的最大减少取决于10个细胞/ml的检测水平和最初的细胞密度。
表13-所用的革兰氏阴性菌株列表
*Pirnay JP et al.,(2003).Molecular epidemiology of Pseudomonasaeruginosa colonization in a burn unit:persistence of a multidrug-resistant cloneand a silver sulfadiazine-resistant clone.JClinMicrobiol.,41(3):1192-1202.
实施例7：恶臭假单胞菌噬菌体OBP的经修饰内溶素变体
根据SEQ ID NO:7的OBPgpLYS是源自于恶臭假单胞菌噬菌体OBP的328个氨基酸残基的模式内溶素(modular endolysin)，具有推定的N端肽聚糖结合结构域和C端催化性几丁质酶结构域。如BLASTp和Pfam分析所预测的，OBPgpLYS内溶素在其大约氨基酸残基126--292的范围内包含其催化结构域，并在大约氨基酸残基7-96的范围内包含其N端肽聚糖结合结构域。
用纯化的噬菌体OBP基因组DNA作为模板，利用标准PCR反应使用Pfu聚合酶(Fermentas,Ontario,Canada)扩增OBPgpLYS的开放阅读框(ORF)，采用如下的PCR参数：
因此，使用标准的5'引物(5’ATGAAAAATAGCGAGAAGAAT3’(SEQID NO:58))和标准的3'引物(5’AACTATTCCGAGTGCTTTCTTTGT3’(SEQID NO:59))。为了将编码OBPgpLYS的ORF的5'端延长一个编码多聚阳离子9-聚体肽Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys(SEQ ID NO:11)的基因片段，进行TAIL PCR(使用与上述标准PCR相同的参数)，使用延伸5'引物(5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAAAAATAGCGAGAAGAAT3’(SEQ ID NO:60))和根据SEQ ID NO:59的标准3'引物。通过遵循制造商的TA克隆方案将原始的未经修饰的OBPgpLYS PCR片段和延长的片段均连接在pEXP5CT/表达载体中(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。
在指数生长的大肠杆菌BL21(λDE3)pLysS细胞(Invitrogen)中用1mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)37°C诱导4小时后，进行根据SEQ ID NO:7的OBPgpLYS和根据SEQ ID NO:61的PKOBPgpLYS的重组表达。两种蛋白均通过Ni2+亲和色谱(Akta FPLC,GE Healthcare)使用由pEXP5CT/表达载体编码的C端6xHis-标签加以纯化。Ni2+亲和色谱分4个后续步骤，均在室温下进行：
1.用10倍柱体积的清洗缓冲液(60mM咪唑,0.5mM NaCl和20mMNaH2P04-NaOH，pH7.4)以0.5ml/min的流速平衡Histrap HP 1ml柱子(GE Healthcare)。
2.以0.5ml/min的流速将总裂解物(含有需要的内溶素)加载在Histrap HP1ml柱子上。
3.用15倍柱体积的清洗缓冲液以1ml/min的流速清洗柱子。
4.用10倍柱体积的洗脱缓冲液(500mM咪唑,5mM NaCl和20mMNaH2P04-NaOH，pH7.4)以0.5ml/min的流速将结合的内溶素从柱子上洗脱下来。
表14显示了每升大肠杆菌表达培养物中两种纯化重组蛋白的总产量。数值通过用分光光度法测量280nm波长下的蛋白浓度和纯化储液的总体积加以确定。纯化的储液分别由处于洗脱缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;500mM咪唑)中的OBPgpLYS和PKOBPgpLYS构成，SDS-PAGE凝胶上肉眼观察确定纯度为至少90%。
表14-每升大肠杆菌表达培养物中纯化的重组OBPgpLYS内溶素及其PK修饰的衍生物PKOBPgpLYS的产量
为了确定根据SEQ ID NO:61的PKOBPgpLYS内溶素的抗革兰氏阴性菌谱，测试1.315μM PK OBPgpLYS内溶素和0.5mM EDTA的组合对临床多耐药性铜绿假单胞菌菌株Br667、恶臭假单胞菌G1(噬菌体OBP的宿主)和一系列其它革兰氏阴性致病原(大肠杆菌WK6、鼠伤寒沙门氏菌LT2和类鼻疽伯克霍尔德氏菌)的作用(见表16)。将每个菌株的指数生长的细菌细胞(OD600nm=0.6)稀释100倍，使终密度为大约106/ml，在室温下，与或不与0.5mM EDTA组合的条件下，与未经修饰的内溶素OBPgpLYS(SEQ ID NO:7)和经过修饰的内溶素PKOBPgpLYS(SEQ ID NO:61)一起不振荡温育30分钟。对于温育，每种内溶素在缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5MNaCl;0.5M咪唑)中使用，并且在1.315μM的内溶素终浓度下进行温育。作为对照，每种菌株也在0.5mM EDTA(与上面列出相同的缓冲液)但没有内溶素的条件下温育30分钟。温育后，将细胞悬液稀释三次(分别为105-104-103细胞/ml)，并将100μl每种稀释液涂布在LB培养基上。37°C过夜温育后计数剩余菌落。根据计数的细胞数目计算抗微生物活性，用以对数单位计的相对失活(=log10N0/Ni，N0=未处理细胞的数目，Ni=处理细胞的数目，均在温育之后计数)表示(表15)。所有样品重复3次。用平均值+/-标准偏差表示。所观察到的最大降低取决于10个细胞/ml的检测水平和最初的细胞密度。
表15–未经修饰的内溶素(OBPgpLYS)及其修饰的内溶素变体(PKOBPgpLYS)在有或无EDTA-Na2的条件下对不同的指数生长的革兰氏阴性物种的抗细菌活性
表16–所用的革兰氏阴性菌株列表
*PirnayJP，De Vos D,Cochez C,Bilocq F,Pirson J,Struelens M,Duinslaeger L,Cornelis P，Zizi M,Vanderkelen A.(2003).Molecular epidemiology of Pseudomonasaeruginosa colonization in a burn unit:persistence of a multidrug-resistant clone and asilver sulfadiazine-resistant clone.J Clin Microbiol.,41(3):1192-1202.
尽管OBPgpLYS处理的总体效力是依赖于物种的，但是表16的结果显示，与未经修饰的OBPgpLYS相比，PKOBPgpLYS对所有测试的细菌物种在有无0.5mM EDTA存在下均有增加的(added)效果。对于假单胞菌属和伯克霍尔德氏菌属物种，可以观察到PKOBPgpLYS活性与EDTA明显的协同效应。
实施例8：不同EDTA浓度对OBPgpLYS和PKOBPgpLYS抗细菌活性的影 响
为了确定EDTA对未经修饰的和经过修饰的内溶素的抗细菌活性的影响，用铜绿假单胞菌PAO1p细胞(Pirnay JP et al.J Clin Microbiol.,41(3):1192-1202(2003))用不同浓度的EDTA和内溶素对未经修饰的OBPgpLYS内溶素(SEQ ID NO:7)和PKOBPgpLYS内溶素(SEQ ID NO:61)的抗细菌活性进行测试。将指数生长的细菌细胞(OD600nm＝0.6)稀释100倍，使终密度为大约106/ml，在室温下与或者不与0.5mM EDTA组合，与未经修饰的内溶素OBPgpLYS(SEQ ID NO:7)和经过修饰的内溶素PKOBPgpLYS(SEQ ID NO:61)一起不振荡温育30分钟。对于温育，每种内溶素在缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5M咪唑)中使用，内溶素终浓度为0.013μM、0.131μM和1.315μM。借此，使用如下的不同EDTA浓度：0mM,0.05mM,0.5mM和10mM。作为对照，还将一个样品用没有内溶素的缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5M咪唑)温育30分钟。温育后，将细胞悬液稀释三次(分别为105-104-103细胞/ml)，并将100μl每种稀释液涂布在LB培养基上。37°C过夜温育后计数剩余菌落数。根据计数的细胞数目计算抗细菌活性，用以对数单位计的相对失活(=log10N0/Ni，N0=未处理细胞的数目，Ni=经处理细胞的数目，均在温育之后计数)表示(表17)。所有样品重复3次。用平均值+/-标准偏差表示。所观察到的最大降低(5.69个log单位)取决于10个细胞/ml的检测水平和最初的细胞密度。“Δ”给出了各个OBPgpLYS和PKOBPgpLYS样品之间的活性差异。
表17–未经修饰的内溶素(OBPgpLYS)及其修饰的内溶素变体(PKOBPgpLYS)与不同浓度的EDTA组合对指数生长的铜绿假单胞菌PAO1p细胞的抗细菌活性
如表17所示，与阴性对照相比，未经修饰的内溶素OBPgpLYS在1.315μM可显著减少细胞数目超过2.5个对数单位，在0.013μM减少+/-1个对数单位。经过修饰的内溶素PKOBPgpLYS对于指数生长的PAO1p细胞导致更多0.5个对数单位的减少。通过将PKOBPgpLYS与0.5和10mM EDTA浓度的外膜可透化剂EDTA-Na2组合，可以将观察到的抗细菌效果增加到5.69个对数单位的降低(低于检测水平)。通过增加所添加的内溶素的量(0.013–1.315μM内溶素)可以增加未修饰的OBPgpLYS与PK-修饰的OBPgpLYS之间的活性差异。
实施例9：经过修饰的phiKZgp144变体对不同的革兰氏阴性细菌的抗细菌 活性
为了检测和比较phiKZgp144和其它内溶素的多聚阳离子性肽变体的潜力，合成了在蛋白的N端具有多聚阳离子性肽的编码基因。
在pET32b表达载体(Novagen,Darmstadt,Germany)中克隆不同的产物。使用pET32b是为了减少多聚阳离子性肽对大肠杆菌宿主的潜在毒性。载体编码的一种融合蛋白(硫氧还原蛋白)可掩盖多聚阳离子性肽，并可以在纯化过程期间去除。
全合成编码smi01(YP_001712536)和KRK9_smi01(SEQ ID NO:75)的基因(Entelechon,Regensburg,Germany)并将它们克隆到pET32b中。
相应地，在37°C在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达如下的经过修饰的内溶素变体，直到光密度达到OD600nm=0.6：smi01(YP_001712536),KRK9_smi01(SEQ ID NO:75),phiKZgp144(SEQ ID NO:1),pKKZ144pET32b(SEQ ID NO:43)和POLYKZ144(SEQ ID NO:35)。用1mMIPTG(终浓度)诱导蛋白表达并表达4个小时。然后通过6000g离心20min收集大肠杆菌细胞，并用S-TagTM rEK纯化试剂盒(Novagen,Darmstadt,Germany)进行细胞破碎和蛋白纯化。使用pET32b载体，所表达的蛋白对宿主无毒性，并使所产生的蛋白产量高。纯化的储液显示高纯度。
为了测试和作为比较的参考，如实施例1所述地合成了phiKZgp144和POLYgp144并进行纯化。
将指数生长的(~106/ml)铜绿假单胞菌PAO1p(烧伤伤口分离株,QueenAstrid Hospital,Brussels;Pirnay JP et al.(2003),J Clin Microbiol.,41(3):1192-1202)、鲍氏不动杆菌(DSMZ30007)或茄伯克霍尔德菌(Burkholderia solanaceum)(由C.Michiels提供的分离株)细菌细胞稀释100倍(最终密度～106/ml)，在室温下与如上列出的未透析蛋白各10μg温育(在缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5M咪唑)中终浓度为100μg/ml)。1小时后，将细胞悬液1∶100稀释，涂布在LB上。此外，用缓冲液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5M咪唑)涂布阴性对照。37°C过夜温育后计数剩余菌落数。根据计数的细胞数目计算抗细菌活性，用相对失活(%)(=100-(Ni/N0)*100，N0=未处理细胞的数目，Ni=处理细胞的数目)表示(表18)。所有样品至少重复4次。
表18–不同的经过修饰的内溶素变体(括号中的NCBI数字)对不同细菌物种的抗细菌效果
蛋白 细菌物种 降低[%]
smi01(YP_001712536) 鲍氏不动杆菌DSMZ 30007 0
KRK9_smi01 鲍氏不动杆菌DSMZ 30007 50
phiKZgp144 铜绿假单胞菌 0
pKKZ144pET32b 铜绿假单胞菌 99-99,9
phiKZgp144 鲍氏不动杆菌DSMZ 30007 0
pKKZ144pET32b 鲍氏不动杆菌DSMZ 30007 99,9
phiKZgp144 茄伯克霍尔德菌 0
POLYKZ144 茄伯克霍尔德菌 99-99,9
与阴性对照相比，未经修饰的内溶素phiKZgp144和smi01(YP_001712536)没有显著减少细胞数目。这个观察结果再次证明了外膜作为屏障阻止内溶素降解革兰氏阴性细菌细胞壁的效力。与之对照的是，如表18所示，用经过修饰的内溶素KRK9_smi01,pKKZ144pET32b和POLY-gp144温育对鲍氏不动杆菌(KRK_smi01为50%;pKKZ144pET32b为99.9%),对铜绿假单胞菌(pKKZ144pET32b为90-99.9%)，以及对茄伯克霍尔德菌(POLYKZ144为90-99.9%)可导致细菌细胞数目显著减少。
这些实验证明了阳离子/多聚阳离子融合方法可应用于其它内溶素。而且，实验证明了经过修饰的内溶素对多种细菌均有活性。
实施例10：减少铜绿假单胞菌生物膜
在本实验中，对经修饰的内溶素变体SMAP29-KZ144和PK-OBP、内溶素OBP和KZ144、以及肽PK测试了针对铜绿假单胞菌菌株2572和2573的生物膜的抗微生物活性。
生物膜减少用结晶紫测定加以定量(Peeters et al.,J Microbiol Methods72:157-165(2008))。
生物膜形成：
将粘液性菌株铜绿假单胞菌2572(患者分离株)和铜绿假单胞菌2573以及非粘液性大肠杆菌BL21(DE3)的过夜液体培养物稀释成OD600=0.1。在聚苯乙烯96孔板中接种100μl培养物/孔。37°C温育4h后，弃去上清，用100μl生理盐水(PS)清洗粘附的细菌。对接种孔加入100μl液体LB培养基，并再温育24h。弃去上清后，再次用100μl PS清洗产生的生物膜。
生物膜处理：
生物膜用50μg/孔PKKZ144或20u/孔海藻酸裂合酶或50μg/孔SMAP29-KZ144和KZ144或25μg/孔PK-OBP和OBP或1.25μgPK-肽(全部置于含500mM NaCl的缓冲液中)处理，用1份对1份2x LB培养基(无NaCl)稀释，温育12h。未处理的系列作为阴性对照(1份蛋白缓冲液对1份无NaCl的2x LB)。弃去上清液之后，再次用100μl PS清洗产生的生物膜。
生物膜定量：
经过清洗的生物膜用300μl甲醇固定(99%;15min)并风干。用100μl0.3%结晶紫进行染色。20min后，用自来水漂洗孔，并用300μl33%乙酸将结合的结晶紫从生物膜的细胞外基质中溶出。20min后，1:10进行稀释，并测量吸光度(590nm)。
统计学分析显示，与海藻酸裂合酶处理的或未经处理的接种物相比，使用PKKZ144大大减少了可检测到的生物膜。使用PKKZ144，有可能将生物膜水平减少到非粘液性大肠杆菌实验室菌株水平。
另外，与内溶素OBP和KZ144相比，经过修饰的内溶素变体SMAP29-KZ144和PK-OBP可以大大减少铜绿假单胞菌生物膜。相反地，PK-肽似乎会增强铜绿假单胞菌生物膜的形成。
实施例11：鲍氏不动杆菌生物膜的减少
在本实验中，对经修饰的内溶素变体PK-OBP、内溶素OBP、以及PK肽测试了针对鲍氏不动杆菌菌株DSMZ30007的生物膜的抗微生物活性。
生物膜减少用结晶紫测定加以定量(Peeters et al.,J Microbiol Methods72:157-165(2008))。
生物膜形成、处理和定量如实施例10中所述进行。
与内溶素OBP相比，经过修饰的内溶素变体PK-OBP显示大大减少鲍氏不动杆菌生物膜。相反，PK-肽似乎会增强鲍氏不动杆菌生物膜的形成。
实施例12：金黄色葡萄球菌生物膜的减少
在本实验中，对融合蛋白Ply2638-PK和PK-溶葡萄球菌素、酶溶葡萄球菌素和Ply2638、以及PK肽测试了针对金黄色葡萄球菌菌株KS13的生物膜的抗微生物活性。
生物膜减少用结晶紫测定加以定量(Peeters et al.,J Microbiol Methods72:157-165(2008))。
生物膜形成、处理和定量的实施如实施例10中所述。只是在生物膜处理中，使用25μg/孔Ply2638A-PK和Ply2638A或18μg/孔PK-溶葡萄球菌素和溶葡萄球菌素或1.25μg PK-肽。
与溶葡萄球菌素和Ply2638等酶相比，融合蛋白PK-溶葡萄球菌素和PK-Ply2638显示了金黄色葡萄球菌生物膜的大大减少。相反地，PK-肽似乎会增强金黄色葡萄球菌生物膜的形成。
实施例13：单核细胞增生利斯特氏菌生物膜的减少
在本实验中，对经过修饰的内溶素变体五肽-Ply511测试了针对单核细胞增生利斯特氏菌菌株ScottA的生物膜的抗微生物活性。
生物膜减少用结晶紫测定加以定量(Peeters et al.,J Microbiol Methods72:157-165(2008))。
生物膜形成、处理和定量的实施如实施例10中所述。只是在生物膜处理中，使用25μg/孔五肽-Ply511。
经过修饰的内溶素变体PK-Ply511显示了单核细胞增生利斯特氏菌生物膜的大大减少。

Claims (14)

1.一种消除或减少细菌生物膜的方法，包括：
a)提供融合蛋白，所述融合蛋白包含与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的内溶素或溶葡萄球菌素；和
b)使材料、液体、表面或生物材料与所述融合蛋白相接触，
其中所述方法不用于人或动物体的疾病治疗目的，
其中所述细菌生物膜是由铜绿假单胞菌细菌、鲍氏不动杆菌细菌、金黄色葡萄球菌细菌、或单核细胞增生利斯特氏菌细菌形成的，且
其中若所述细菌生物膜是由铜绿假单胞菌细菌形成的，则所述融合蛋白包含根据SEQ ID NO:1的phiKZgp144的内溶素和根据SEQ ID NO:94的具有破坏膜或LPS的活性的肽，或根据SEQ ID NO:7的OBPgpLys的内溶素和根据SEQ ID NO:11的具有破坏膜或LPS的活性的肽；
其中若所述细菌生物膜是由鲍氏不动杆菌细菌形成的，则所述融合蛋白包含根据SEQ ID NO:7的内溶素OBPgpLys和根据SEQ ID NO:11的具有破坏膜或LPS的活性的肽；
其中若所述细菌生物膜是由金黄色葡萄球菌细菌形成的，则所述融合蛋白包含根据SEQ ID NO:92的内溶素Ply2638或根据SEQ ID NO:87的溶葡萄球菌素和根据SEQ ID NO:11的具有破坏膜或LPS的活性的肽，或
其中若所述细菌生物膜是由单核细胞增生利斯特氏菌细菌形成的，则所述融合蛋白包含根据SEQ ID NO:85的内溶素Ply511和根据SEQ ID NO:135的具有破坏膜或LPS的活性的肽。
2.根据权利要求1的方法，其中所述肽与内溶素的N-和/或C-端融合。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述融合蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:35,61和139-142。
4.根据权利要求1或2的方法，其中与所述融合蛋白接触的材料是石、土壤、食品、饲料或化妆品。
5.根据权利要求1或2的方法，其中与所述融合蛋白接触的材料是岩。
6.根据权利要求1或2的方法，其中与所述融合蛋白接触的材料是沉积物。
7.根据权利要求1的方法，其中与所述融合蛋白接触的液体是水。
8.根据权利要求7的方法，其中所述水是任何种类的水系统、接触镜、假牙、移植物、假体或支具的清洗和保存溶液。
9.根据权利要求8的方法，其中所述水系统是废水，温泉，海，湖，或河流。
10.根据权利要求7的方法，其中所述水是饮用水。
11.根据权利要求7的方法，其中所述水是地下水。
12.根据权利要求1或2的方法，其中与所述融合蛋白接触的液体是衍生自或获自活生物体的任何液体。
13.根据权利要求1或2的方法，其中与所述融合蛋白接触的表面是医疗器械的表面、工业或饮用水系统管道的表面、或自然水系统的表面。
14.根据权利要求1或2的方法，其中可以与所述融合蛋白组合添加或在融合蛋白之外进一步添加抗生素。
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