JP2016208985A - バイオフィルムの低減方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法の提供。
【解決手段】本発明は、膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含む融合タンパク質を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法に関する。さらにまた、本発明は、医薬、特に細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌および/もしくはグラム陽性菌感染症の治療もしくは予防のための医薬、診断手段、消毒薬または化粧用物質として使用するための融合タンパク質に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は、膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含む融合タンパク質を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法に関する。さらにまた、本発明は、医薬、特に細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌および/もしくはグラム陽性菌感染症の治療もしくは予防のための医薬、診断手段、消毒薬または化粧用物質として使用するための融合タンパク質に関する。本発明はまた、食品、食品加工装置、食品加工工場、食品と接触する面、医療機器、病院の表面および手術室の表面の細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌および/またはグラム陽性菌汚染の除去または低減または予防にも関する。さらにまた、本発明は、細菌性バイオフィルムと関連する医薬、食品もしくは飼料または環境診断法における診断手段としての前記融合タンパク質の使用に関する。
エンドリシンは、バクテリオファージ(または細菌ウイルス)によってコードされるペプチドグリカン加水分解酵素である。エンドリシンは、ファージ増殖の溶菌サイクルにおいて遺伝子発現中に合成され、細菌のペプチドグリカンの分解によって感染細胞からの子孫ビリオンの放出を媒介する。エンドリシンはβ-(1,4)-グリコシラーゼ(リゾチーム)、トランスグリコシラーゼ、アミダーゼまたはエンドペプチダーゼのいずれかである。エンドリシンの抗菌用途については、すでに1991年にGasson(GB2243611)によって示唆された。エンドリシンの致死能力は、長い間知られてきたが、これらの酵素の抗菌剤としての使用は、抗生物質の成功および優位によって無視された。多剤抗生物質耐性菌の出現後に初めて、エンドリシンを用いてヒト病原体と戦うというこの簡単な概念が興味を持たれるようになった。全く新しいクラスの抗菌剤を開発する切迫したニーズが生じたが、'エンザイバイオティクス(enzybiotics)'('酵素'と'抗生物質'の混種語)として用いられるエンドリシンは、十分にこのニーズを満たした。2001年に、Fischettiおよび共同研究者は、A群溶連菌に対するバクテリオファージC1エンドリシンの治療の可能性を初めて明らかにした(Nelsonら、2001)。それ以来、多くの公表によって、エンドリシンは、細菌感染症、特にグラム陽性菌による感染症を抑制する魅力的かつ相補的な選択肢であることが確認された。続いて、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)(Loefflerら、2001)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)(Schuchら、2002)、S.アガラクチア(S. agalactiae)(Chengら、2005)およびスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)(Rashelら、2007)などの他のグラム陽性病原体に対して、種々のエンドリシンがエンザイバイオティクスとしてのその有効性を証明されている。今日、エンドリシン治療の最も重要な挑戦は、エンドリシンの外因性作用に対するグラム陰性菌の無識別性にある。なぜなら、ペプチドグリカンからのエンドリシンの接近をその外膜が保護するからである。現在、このことにより、重要なグラム陰性病原体に対して有効なエンドリシンの範囲の拡大が妨げられている。
グラム陰性菌は、顕著な特徴として特徴的な非対称二重層を有する外膜を有する。外膜二重層は、リン脂質(主としてホスファチジルエタノールアミン)を含む内側の単層および、主に単一の糖脂質であるリポ多糖(LPS)で構成される外側の単層からなる。細菌界には限りなく多様なLPS構造が存在し、かつそのLPS構造は環境条件の克服に応じて改変されうる。LPS層の安定性および異なるLPS分子間の相互作用は、主に、二価イオン(Mg2+、Ca2+)とLPS分子のアニオン構成要素(リピドAおよび内部コアにおけるリン酸基ならびにKDOのカルボキシル基)との静電相互作用によって達成される。従って、外膜の完全性にはカチオン結合部位が必須である(Vaara、1992)。(少なくとも20残基の)ポリ-L-リジンポリマーなどのポリカチオン性物質は、これらの安定化二価カチオンの置換によって外膜透過性を増加させる。さらに、それらは、いわゆる'自己促進性取り込み'機構を発揮する(HancockおよびWong、1984)。それらのかさ高性のために、それらは外膜の正常なバリア機能を破壊し、一過性の亀裂を生じ、それら自身の取り込みを促進する(VaaraおよびVaara、1983)。さらにまた、リピドAの疎水性部分の高密度で規則正しいパッキングは、不飽和脂肪酸の非存在に助けられて高い粘度を有する堅い構造を形成する。このことにより、親油性分子の透過性が低くなり、外膜(OM)にさらなる安定性が付与される。
グラム陰性菌と対照的に、グラム陽性菌は外膜を持たない。その細胞質膜は、細胞壁を形成する最大25nmの厚さのペプチドグリカン層(グラム陰性菌ではペプチドグリカン層は最大わずか5nmである)によって取り囲まれている。グラム陽性菌の細胞壁の主な目的は、細菌の形状を維持し、細菌細胞内の圧力を打ち消すことである。ペプチドグリカンまたはムレインは、糖およびアミノ酸からなる高分子である。β-(1,4)結合したN-アセチルグルコサミン残基とN-アセチルムラミン酸残基の代替残基からなる糖成分が糖成分を構成する。N-アセチルムラミン酸には、3〜5個のアミノ酸からなるペプチド鎖が結合している。ペプチド鎖は、他の鎖のペプチド鎖に架橋されて3Dメッシュ様層を形成することができる。ペプチド鎖はD-およびL-アミノ酸残基を含むことができ、その組成は細菌の種類によって異なることができる。
大部分のグラム陰性菌および多くのグラム陽性菌は細菌性バイオフィルムを形成する。バイオフィルムは、表面に付着した微生物の凝集体または集合体と定義される。付着細菌は、多くの場合、グラム陰性菌およびグラム陽性菌によって産生される細胞外高分子物質によって囲まれ保護される。細菌は、バイオフィルムによって、抗生物質、消毒薬および細胞壁分解酵素などの抗菌物質にさらに高い耐性を示す。さらに、現在、バイオフィルムの治療は、抗菌物質、消毒薬またはバイオフィルム分解物質による分解に対して細胞外高分子物質がそれ自身を守るため実行不可能である。
従って、細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法が求められている。
本目的は、特許請求の範囲において定義される内容によって解決される。
以下の図により本発明を例示する。
(POLY)n-gp144((POLY)n-KZ144)の組換え産生のためのプラスミド構築物を示す概略図である。あらかじめ、テールPCR(5'テールプライマーにBamHI制限部位および第1ポリカチオンカセットを含む)によってpEXP5CT/POLY-gp144(pEXP5CT/POLY-KZ144)を構築した。BamHIでプラスミドを線状化し、脱リン酸化し、張り出したBamHI末端を含むカセットを連結した。このカセットは、2つの相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに由来し、正に荷電した9つの残基をコードする。第1および第2カセットの間の接合部位に、セリンと共に、さらに1つの正に荷電したアルギニン残基を作る。サイクルを繰り返すことによって、より長いpEXP5CT/(POLY)n-gp144(pEXP5CT/(POLY)n-KZ144)バリアントを同様に構築した。 ピキア・パストリスによるPOLY-gp144の発現および分泌を示す図である。P.パストリスX33発現培養物[1日後(正方形)、3日後(三角形)および4日後(円形)]上清30μl量を、クロロホルム270μlで透過化させたP.エルギノーサPAO1p細胞に加える。緩衝液条件は、POLY-gp144(KH2PO4/K2HP04)I=120mM pH6.2)の最適の酵素条件であった。続いて、分光光度学的に吸光度を記録した。吸光度の低下は、P.パストリスによる溶菌酵素の分泌を示す。陰性対照として、発現プラスミドを含まないP.パストリスX33を含める(菱形)。 シュードモナス・エルギノーサPAO1p細胞に対する、未修飾phiKZgp144およびELgp188エンドリシン、正に荷電した9つのアミノ酸残基を含むペプチドを含む修飾エンドリシンバリアントPOLY-gp144およびPOLY-gp188ならびに正に荷電した18のアミノ酸残基を含むペプチドを含む修飾バリアント(POLY)2-gp144および(POLY)2-gp188の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 図未修飾エンドリシンPSP3gp10およびその修飾エンドリシンバリアントPKPSP3gp10の発現および精製の結果を示すクマシー染色されたSDS-PAGEの写真を示す図である。レーンLMWはサイズマーカー(LMWラダー)に関する。以下の3つのレーンは、Ni2+アフィニティークロマトグラフィー後の、溶出緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;500mMイミダゾール)における精製タンパク質のタンパク質フラクションに関係する。レーンFTはフロースルーに関係し、レーンWは廃棄フラクションに関係する。精製タンパク質フラクションにおいては、微量の二次バンドが認められるだけであり、組換えタンパク質の高純度(>90%)を示している。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、異なる組成物における未修飾PSP3gp10および修飾PKPSP3gp10の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾PSP3gp10を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKPSP3gp10を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾PSP3gp10および0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKPSP3gp10および0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図5Aは、P.エルギノーサPAO1p細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのPSP3gp10およびPKPSP3gp10試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、異なる組成物における未修飾PSP3gp10および修飾PKPSP3gp10の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾PSP3gp10を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKPSP3gp10を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾PSP3gp10および0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKPSP3gp10および0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図5Bは、P.エルギノーサBr667細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのPSP3gp10およびPKPSP3gp10試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、異なる組成物における未修飾PSP3gp10および修飾PKPSP3gp10の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾PSP3gp10を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKPSP3gp10を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾PSP3gp10および0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKPSP3gp10および0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図5Cは、E.コリWK6細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのPSP3gp10およびPKPSP3gp10試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、異なる組成物における未修飾PSP3gp10および修飾PKPSP3gp10の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾PSP3gp10を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKPSP3gp10を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾PSP3gp10および0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKPSP3gp10および0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図5Dは、サルモネラ・ティフィムリウム細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのPSP3gp10およびPKPSP3gp10試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 未修飾エンドリシンP2gp09およびその修飾エンドリシンバリアントPKP2gp09の発現および精製の結果を示すクマシー染色されたSDS-PAGEの写真を示す図である。レーンLMWはサイズマーカー(LMWラダー)に関係する。以下の3つのレーンは、Ni2+アフィニティークロマトグラフィー後の溶出緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;500mMイミダゾール)中の精製タンパク質のタンパク質フラクションに関係する。レーンFTはフロースルーに関係し、レーンWは廃棄フラクションに関係する。精製タンパク質フラクションにおいては、微量の二次バンドが認められるだけであり、組換えタンパク質の高純度(>95%)を示している。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、異なる組成物における未修飾P2gp09および修飾PKP2gp09の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾P2gp09を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKP2gp09を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾P2gp09および0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKP2gp09および0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図7Aは、P.エルギノーサPAO1p細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのP2gp09およびPKP2gp09試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、異なる組成物における未修飾P2gp09および修飾PKP2gp09の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾P2gp09を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKP2gp09を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾P2gp09および0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKP2gp09および0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図7Bは、P.エルギノーサBr667細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのP2gp09およびPKP2gp09試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、異なる組成物における未修飾P2gp09および修飾PKP2gp09の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾P2gp09を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKP2gp09を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾P2gp09および0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKP2gp09および0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図7Cは、E.コリWK6細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのP2gp09およびPKP2gp09試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、異なる組成物における未修飾P2gp09および修飾PKP2gp09の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾P2gp09を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKP2gp09を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾P2gp09および0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKP2gp09および0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図7Dは、バークホルデリア・シュードマレイ細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのP2gp09およびPKP2gp09試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、異なる組成物における未修飾P2gp09および修飾PKP2gp09の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾P2gp09を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKP2gp09を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾P2gp09および0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKP2gp09および0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図7Eは、シュードモナス・プチダG1細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのP2gp09およびPKP2gp09試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、異なる組成物における未修飾P2gp09および修飾PKP2gp09の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾P2gp09を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKP2gp09を含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾P2gp09および0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKP2gp09および0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図7Fは、サルモネラ・ティフィムリウムLT2(SGSC N°2317)細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのP2gp09およびPKP2gp09試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 未修飾エンドリシンOBPgpLYSおよびその修飾エンドリシンバリアントPKOBPgpLYSの発現および精製の結果を示すクマシー染色されたSDS-PAGEの写真である。レーンLMWはサイズマーカー(LMWラダー)に関係する。以下の3つのレーンは、Ni2+アフィニティークロマトグラフィー後の溶出緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;500mMイミダゾール)中の精製タンパク質のタンパク質フラクションに関係する。レーンFTはフロースルーに関係し、レーンWは廃棄フラクションに関係する。精製タンパク質フラクションにおいては、微量の二次バンドが認められるだけであり、組換えタンパク質の高純度(>90%)を示している。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、未修飾OBPgpLYSおよび修飾PKOBPgpLYSの異なる組成物の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾OBPgpLYSを含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKOBPgpLYSを含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾OBPgpLYSおよび0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKOBPgpLYSおよび0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図9Aは、エシェリキア・コリWK6細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのOBPgpLYSおよびPKOBPgpLYS試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、未修飾OBPgpLYSおよび修飾PKOBPgpLYSの異なる組成物の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾OBPgpLYSを含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKOBPgpLYSを含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾OBPgpLYSおよび0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKOBPgpLYSおよび0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図9Bは、サルモネラ・ティフィムリウムLT2(SGSC N°2317)細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのOBPgpLYSおよびPKOBPgpLYS試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、未修飾OBPgpLYSおよび修飾PKOBPgpLYSの異なる組成物の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾OBPgpLYSを含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKOBPgpLYSを含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾OBPgpLYSおよび0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKOBPgpLYSおよび0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図9Cは、シュードモナス・エルギノーサPAO1p細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのOBPgpLYSおよびPKOBPgpLYS試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、未修飾OBPgpLYSおよび修飾PKOBPgpLYSの異なる組成物の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾OBPgpLYSを含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKOBPgpLYSを含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾OBPgpLYSおよび0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKOBPgpLYSおよび0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図9Dは、シュードモナス・エルギノーサBr667細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのOBPgpLYSおよびPKOBPgpLYS試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、未修飾OBPgpLYSおよび修飾PKOBPgpLYSの異なる組成物の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾OBPgpLYSを含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKOBPgpLYSを含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾OBPgpLYSおよび0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKOBPgpLYSおよび0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図9Eは、シュードモナス・プチダG1細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのOBPgpLYSおよびPKOBPgpLYS試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 室温で振盪なしでインキュベートした後の、いくつかの対数的に増殖しているグラム陰性菌に対する、未修飾OBPgpLYSおよび修飾PKOBPgpLYSの異なる組成物の抗菌活性のグラフ表示を示す図である。0.5mM EDTAを含むがエンドリシンを含まない組成物、1.315μM未修飾OBPgpLYSを含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM修飾PKOBPgpLYSを含むがEDTAを含まない組成物、1.315μM未修飾OBPgpLYSおよび0.5mM EDTAを含む組成物ならびに1.315μM修飾PKOBPgpLYSおよび0.5mM EDTAを含む組成物で各種のグラム陰性菌を30分間インキュベートした。図9Fは、バークホルデリア・シュードマレイ細胞に対する抗菌活性を示す。“Δ”は、それぞれのOBPgpLYSおよびPKOBPgpLYS試料間の活性の差異を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 シュードモナス・エルギノーサ2573のムコイド型臨床分離株(Source Uniklinikum Regensburg、nicht naher definiert)に対するPolyKZ144(Art-014)のバイオフィルムの低減活性のグラフ表示を示す図である。ポリスチレンマイクロタイタープレート中、37℃で少なくとも24時間シュードモナス・エルギノーサ2573を増殖させてバイオフィルムを形成させた。バイオフィルム量を視覚化するためにクリスタルバイオレット染色を行った。次いで図10Aにおいて、バイオフィルムをアルギン酸リアーゼ(10u/ml)またはPolyKZ144(50μg/ml)のいずれかと共にインキュベートした。両酵素の効果を、対照として未処理のバイオフィルムまたは洗浄しLB培地中で再インキュベートしたバイオフィルムのいずれかと比較した。 シュードモナス・エルギノーサ2573のムコイド型臨床分離株(Source Uniklinikum Regensburg、nicht naher definiert)に対するPolyKZ144(Art-014)のバイオフィルムの低減活性のグラフ表示を示す図である。ポリスチレンマイクロタイタープレート中、37℃で少なくとも24時間シュードモナス・エルギノーサ2573を増殖させてバイオフィルムを形成させた。バイオフィルム量を視覚化するためにクリスタルバイオレット染色を行った。次いで図10Bにおいて、対照としてPolyKZ144の効果を未処理のバイオフィルムまたは洗浄したLB培地中で再インキュベートしたバイオフィルムのいずれかおよび非ムコイド型E.コリ実験室株が示す非特異的バックグラウンド染色と比較した。 異なるグラム陽性およびグラム陰性細菌株に対するいくつかの融合タンパク質のバイオフィルムの低減活性のグラフ表示を示す図である。スタフィロコッカス・アウレウスKS13を、ポリスチレンマイクロタイタープレート中、37℃で少なくとも24時間増殖させてバイオフィルムを形成させた。バイオフィルム量を視覚化するためにクリスタルバイオレット染色を行った。次いでPK-ペプチド(1.25μg/ウェル)またはエンドリシンPly2638(25μg/ウェル)または融合タンパク質Ply2638-PK(25μg/ウェル)のいずれかと共にバイオフィルムをインキュベートした。ペプチド、エンドリシンおよび融合タンパク質の効果を、LBによって示される未処理のバイオフィルム(タンパク質緩衝液1部に対して2xLB(NaClなし)1部)と比較した。 異なるグラム陽性およびグラム陰性細菌株に対するいくつかの融合タンパク質のバイオフィルムの低減活性のグラフ表示を示す図である。スタフィロコッカス・アウレウスKS13を、ポリスチレンマイクロタイタープレート中、37℃で少なくとも24時間増殖させてバイオフィルムを形成させた。バイオフィルム量を視覚化するためにクリスタルバイオレット染色を行った。次いでバイオフィルムをバクテリオシンリゾスタフィン(18μg/ウェル)またはバクテリオシンバリアントPK-リゾスタフィン(18μg/ウェル)のいずれかと共にインキュベートした。バクテリオシンおよびバクテリオシンバリアントの効果を、LBによって示される未処理のバイオフィルム(タンパク質緩衝液1部に対して2xLB(NaClなし)1部)と比較した。 異なるグラム陽性およびグラム陰性細菌株に対するいくつかの融合タンパク質のバイオフィルムの低減活性のグラフ表示を示す図である。リステリア・モノサイトゲネスScott Aを、ポリスチレンマイクロタイタープレート中、37℃で少なくとも24時間増殖させてバイオフィルムを形成させた。バイオフィルム量を視覚化するためにクリスタルバイオレット染色を行った。次いでバイオフィルムを修飾エンドリシンバリアントペンタペプチド-Ply511(25μg/ウェル)と共にインキュベートした。修飾エンドリシンバリアントの効果を、LBによって示される未処理のバイオフィルム(タンパク質緩衝液1部に対して2xLB(NaClなし)1部)と比較した。 異なるグラム陽性およびグラム陰性細菌株に対するいくつかの融合タンパク質のバイオフィルムの低減活性のグラフ表示を示す図である。アシネトバクター・バウマニーDSMZ30007を、ポリスチレンマイクロタイタープレート中、37℃で少なくとも24時間増殖させてバイオフィルムを形成させた。バイオフィルム量を視覚化するためにクリスタルバイオレット染色を行った。次いでバイオフィルムをPK-ペプチド(1.25μg/ウェル)またはエンドリシンOBP(25μg/ウェル)または修飾エンドリシンバリアントPK-OBP(25μg/ウェル)のいずれかと共にインキュベートした。ペプチド、エンドリシンおよび修飾エンドリシンバリアントの効果を、LBによって示される未処理のバイオフィルム(タンパク質緩衝液1部に対して2xLB(NaClなし)1部)と比較した。 異なるグラム陽性およびグラム陰性細菌株に対するいくつかの融合タンパク質のバイオフィルムの低減活性のグラフ表示を示す図である。シュードモナス・エルギノーサ2572を、ポリスチレンマイクロタイタープレート中、37℃で少なくとも24時間増殖させてバイオフィルムを形成させた。バイオフィルム量を視覚化するためにクリスタルバイオレット染色を行った。次いでバイオフィルムをPK-ペプチド(1.25μg/ウェル)またはエンドリシンOBP(25μg/ウェル)または修飾エンドリシンバリアントPK-OBP(25μg/ウェル)のいずれかと共にインキュベートした。ペプチド、エンドリシンおよび修飾エンドリシンバリアントの効果を、LBによって示される未処理のバイオフィルム(タンパク質緩衝液1部に対して2xLB(NaClなし)1部)と比較した。 異なるグラム陽性およびグラム陰性細菌株に対するいくつかの融合タンパク質のバイオフィルムの低減活性のグラフ表示を示す図である。シュードモナス・エルギノーサ2572を、ポリスチレンマイクロタイタープレート中、37℃で少なくとも24時間増殖させてバイオフィルムを形成させた。バイオフィルム量を視覚化するためにクリスタルバイオレット染色を行った。次いでバイオフィルムをエンドリシンKZ144(50μg/ウェル)または修飾エンドリシンバリアントSMAP29-KZ144(50μg/ウェル)と共にインキュベートした。ペプチド、エンドリシンおよび修飾エンドリシンバリアントの効果を、LBによって示される未処理のバイオフィルム(タンパク質緩衝液1部に対して2xLB(NaClなし)1部)と比較した。 異なるグラム陽性およびグラム陰性細菌株に対するいくつかの融合タンパク質のバイオフィルムの低減活性のグラフ表示を示す図である。シュードモナス・エルギノーサ2573をポリスチレンマイクロタイタープレート中、37℃で少なくとも24時間増殖させてバイオフィルムを形成させた。バイオフィルム量を視覚化するためにクリスタルバイオレット染色を行った。次いでバイオフィルムをエンドリシンKZ144(50μg/ウェル)または修飾エンドリシンバリアントSMAP29-KZ144(50μg/ウェル)と共にインキュベートした。ペプチド、エンドリシンおよび修飾エンドリシンバリアントの効果を、LBによって示される未処理のバイオフィルム(タンパク質緩衝液1部に対して2xLB(NaClなし)1部)と比較した。
本明細書において、用語"タンパク質"は用語"ポリペプチド"と同義で用いられる。本明細書において、用語“タンパク質”は、特定の配列でペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基の線状高分子のことを言う。タンパク質のアミノ酸残基は、炭水化物およびリン酸などの種々の基の共有結合によって修飾されることができる。他の物質、例えばヘムまたは脂質などはポリペプチド鎖とより緩やかに結合して複合タンパク質を生じることができるが、本明細書において、これらもまた用語“タンパク質”に含まれる。ポリペプチド鎖の折り畳み、特にαへリックスおよびβプリーツシートの存在に関しては種々の方式が解明されている。本明細書において、用語“タンパク質”は、全α、全β、α/βおよびαプラスβというタンパク質の4つのクラスのすべてのことを言う。さらに、用語“タンパク質”は、複合体であって、ホモマーである複合体のことを言う。
本明細書において、用語"融合タンパク質"は、2つの核酸配列の融合に由来する発現産物のことを言う。このようなタンパク質は、例えば、組換えDNA発現系において、または化学架橋によって製造できる。さらに、本明細書において、用語“融合タンパク質”は、第1アミノ酸配列、特にエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンおよび/または他のペプチドグリカン加水分解酵素と、第2またはさらなるアミノ酸配列との融合体のことを言う。第2またはさらなるアミノ酸配列は、好ましくはペプチドであり、特にカチオン性、ポリカチオン性、疎水性、両親媒性および/または抗菌ペプチドである。好ましくは、前記第2および/またはさらなるアミノ酸配列は、第1アミノ酸配列の任意のドメインに対して外来性であり、かつ実質的に相同ではない。
本明細書において、用語“修飾エンドリシンバリアント”は用語“エンドリシンバリアント”と同義で用いられる。どちらの用語も、エンドリシンならびにペプチド、特にカチオン性、ポリカチオン性、疎水性、両親媒性および/または抗菌ペプチドを含む融合タンパク質を指す。
本明細書において、用語“修飾バクテリオシンバリアント”は、用語“バクテリオシンバリアント”と同義で用いられる。どちらの用語も、バクテリオシンならびにペプチド、特にカチオン性、ポリカチオン性、疎水性、両親媒性および/または抗菌ペプチドを含む融合タンパク質を指す。
本明細書において、用語“修飾オートリシンバリアント”は用語“オートリシンバリアント”と同義で用いられる。どちらの用語も、オートリシンならびにペプチド、特にカチオン性、ポリカチオン性、疎水性、両親媒性および/または抗菌ペプチドを含む融合タンパク質を指す。
本明細書において、用語“ペプチドストレッチ”は、エンドリシン、バクテリオシンまたはオートリシンなどのタンパク質に結合した任意の種類のペプチドのことを言う。特に、本明細書において、用語“ペプチドストレッチ”は、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、疎水性ペプチドおよび/または抗菌ペプチドのことを言う。しかしながら、本発明の意味において、ペプチドストレッチは、Hisタグ、好ましくはHis5タグ、His6タグ、His7タグ、His8タグ、His9タグ、His10タグ、His11タグ、His12タグ、His16タグおよびHis20タグ、Strepタグ、Aviタグ、Mycタグ、GSTタグ、JSタグ、システインタグ、FLAGタグまたは当該技術分野で公知の他のタグであるチオレドキシンもしくはマルトース結合タンパク質(MBP)を指さない。本明細書において、用語“タグ”は、用語“ペプチドストレッチ”と対照的に、ポリペプチドの発現および/またはアフィニティー精製を容易にするために、ポリペプチドを表面に固定するために、または例えば種々のELISAアッセイフォーマットにおける抗体結合によってポリペプチドを検出するために、マーカーもしくは標識部分として役立つのに有用であることができるペプチドのことを言うが、それはタグを上記の簡便化の1つに有用にさせる機能が前記ペプチドの正電荷によって引き起こされない限りにおいての場合である。しかしながら、His6タグは、それぞれのpHに応じて正に荷電されうるが、それは固定された二価のカチオンに結合するためアフィニティー精製のツールとして用いられるので、本発明のペプチドストレッチとしては用いられない。
本明細書において、用語“ペプチド”は、約2〜約100アミノ酸残基、より好ましくは約4〜約50アミノ酸残基、より好ましくは約5〜30アミノ酸残基からなる短いペプチドであって、アミノ酸残基のアミノ基の1つともう1つのアミノ酸残基のカルボキシル基がペプチド結合によって結合したペプチドのことを言う。ペプチドは特定の機能を有することができる。ペプチドは、天然に存在するペプチドであることもできるし、合成的に設計され製造されるペプチドであることもできる。これらのペプチドは、例えば、酵素的にまたは化学的切断によって天然タンパク質から誘導または除去することもできるし、従来のペプチド合成技術(例えば固相合成)または分子生物学技術(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) を参照のこと)を用いて製造することもできる。合成的に製造される好ましいペプチドは、例えばカチオン性、ポリカチオン性、両性または疎水性ペプチドである。天然に存在する好ましいペプチドは、例えば抗菌ペプチドである。
本明細書において、用語"カチオン性ペプチド"は、正に荷電したアミノ酸残基を有するペプチドのことを言う。好ましくは、カチオン性ペプチドは9.0以上のpKa値を有する。一般的には、カチオン性ペプチドのアミノ酸残基の内少なくとも4つは正に荷電した、例えばリジンまたはアルギニンであることができる。"正に荷電した"とは、およそ生理的条件で正味の正電荷を有するアミノ酸残基の側鎖のことを言う。本明細書において、用語“カチオン性ペプチド”はポリカチオン性ペプチドのことも言う。
本明細書において、用語“ポリカチオン性ペプチド”は、主として正に荷電したアミノ酸残基、特にリジン、アルギニンおよび/またはヒスチジン残基、より好ましくはリジンおよび/またはアルギニン残基から構成される、合成的に設計され製造されたペプチドのことを言う。アミノ酸残基の少なくとも約20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95または約100%が正に荷電したアミノ酸残基、特にリジンおよび/またはアルギニン残基である場合、ペプチドは主として正に荷電したアミノ酸残基から構成される。正に荷電したアミノ酸残基ではないアミノ酸残基は、中性に荷電したアミノ酸残基および/または負に荷電したアミノ酸残基および/または疎水性アミノ酸残基であることができる。好ましくは、正に荷電したアミノ酸残基ではないアミノ酸残基は、中性に荷電したアミノ酸残基、特にセリンおよび/またはグリシンである。
本明細書において、用語"抗菌ペプチド"(AMP)は、細菌、ウイルス、真菌、酵母、マイコプラズマおよび原生動物などに対して殺菌活性および/または静菌活性を有する任意の天然に存在するペプチドのことを言う。従って、本明細書において、用語“抗菌ペプチド”は、特に、抗菌、抗真菌、抗カビ、駆虫、抗原虫、抗ウイルス、抗感染、抗感染症および/または殺菌、殺藻、殺アメーバ、殺菌、殺菌、殺真菌、殺寄生生物、殺原虫、殺原生動物性を有する任意のペプチド、特にsushiペプチドおよびデフェンシンのことを言う。抗菌ペプチドは、RNアーゼAスーパーファミリーのメンバーであるデフェンシン、カテリシジン、グラニュライシン、ヒスタチン、プソリアシン、ダームシジンまたはヘプシジンであることができる。抗菌ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ類、脊椎動物または哺乳動物において天然に存在するものであることができる。
好ましくは、抗菌ペプチドは昆虫、魚、植物、クモ類、脊椎動物または哺乳動物において天然に存在するものであることができる。好ましくは、抗菌ペプチドは、ハツカダイコン、カイコガ、ウルフスパイダー、カエル、好ましくはゼノパス・レービス(Xenopus Laevis)、アカガエル属(Rana)のカエル、より好ましくはラナ・カテスベイアナ(Rana catesbeiana)、ヒキガエル、好ましくはアジアヒキガエルブフォ・ガルガリザンス(Bufo bufo gargarizans)、ハエ、好ましくはドロソフィラ(Drosophila)、より好ましくはドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)、アエデス・アエジプチ(Aedes aegypti)、ミツバチ、マルハナバチ、好ましくはボムブス・パスクオルム(Bombus pascuorum)、ニクバエ、好ましくはサルコファガ・ペレグリン(Sarcophaga peregrine)、サソリ、カブトガニ、ナマズ、好ましくはパラシルルス・アソツス(Parasilurus asotus)、ウシ、ブタ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サルおよびヒトにおいて天然に存在するものであることができる。
本明細書において、用語“sushiペプチド”は、ショートコンセンサスリピートを有する補体制御タンパク質(CCP)のことを言う。sushiペプチドのsushiモジュールは、多くの異なるタンパク質において、タンパク質間相互作用ドメインとして機能する。Sushiドメインを含むペプチドは、抗菌活性を有することが示されている。好ましくは、sushiペプチドは天然に存在する抗菌ペプチドである。
本明細書において、用語"両親媒性ペプチド"は、親水性および疎水性官能基を両方有する合成ペプチドのことを言う。好ましくは、本明細書において、用語“両親媒性ペプチド”は、一定の配置の親水性および疎水性基を有するペプチドのことを言い、例えば両親媒性ペプチドは、例えば、主にαへリックスの1つの面に沿って非極性側鎖を有し、その残りの表面に沿って極性残基を有するαへリックスであることができる。
本明細書において、用語"疎水性基"は、実質的に水不溶性であるが油相には可溶性であり、油相におけるその溶解性が水または水相におけるその溶解性よりも高いアミノ酸側鎖などの化学基のことを言う。水中では、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基は互いに相互作用して非水環境を生じる。疎水性側鎖を有するアミノ酸残基の例は、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリンおよびグリシン残基である。
本明細書において、用語“エンドリシン”は、細菌細胞壁の加水分解に適している酵素のことを言う。“エンドリシン”は、エンドペプチダーゼ、N-アセチルムラモイル-L-アラニンアミダーゼ(アミダーゼ)、N-アセチルムラミダーゼ、N-アセチルグルコサミニダーゼ(リゾチーム)またはトランスグリコシラーゼの活性の少なくとも1つを有する少なくとも1つの“酵素活性ドメイン”(EAD)を含む。さらに、エンドリシンは、酵素的に不活性であり宿主細菌の細胞壁に結合する領域、いわゆるCBD(細胞壁結合ドメイン)を含むこともできる。エンドリシンは1または2以上のCBDを含むことができる。しかしながら、本明細書において、用語“エンドリシン”は、少なくとも1つのEADを有するが、CBDを有さない酵素のことも言う。一般に、細胞壁結合ドメインは、細菌の表面上の異なる成分に結合することができる。好ましくは、細胞壁結合ドメインはペプチドグリカン結合ドメインであり、細菌のペプチドグリカンに結合する。
本明細書において、用語“細胞壁“は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の細胞の外側の囲いを形成し、それと共に細胞の完全性を確実にするすべての成分のことを言う。特に、本明細書において、用語“細胞壁“は、ペプチドグリカン、リポ多糖を有するグラム陰性菌の外膜、細菌細胞膜のことを言うばかりでなく、莢膜、タンパク質外層または粘液などのペプチドグリカン上に沈着した追加の層のことも言う。
本明細書において、用語“オートリシン”は、エンドリシンに関連する酵素であるが、細菌によってコードされ、例えば細胞分裂および細胞壁代謝に関与する酵素のことを言う。オートリシンの概説に関しては、“Bacterial peptidoglycan (murein) hydrolases. Vollmer W, Joris B, Charlier P, Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar;32(2):259-86”において見出される。
本明細書において、用語"バクテリオシン"は、他の細菌の増殖を抑制することができるタンパク質様、ポリペプチド様またはペプチド様物質のことを言う。バクテリオシンには、リゾスタフィン(スタフィロコッカス属(Staphylococcus)の細胞壁の分解)、ムタノリシン(ストレプトコッカス属(Streptococcus)の細胞壁の分解)およびエンテロリシン(エンテロコッカス属(Enterococcus)の細胞壁の分解)のように、細菌細胞壁を分解できるものがある。好ましくは、前記抑制は、特に、バクテリオシンの特異的受容体への前記他の細菌の吸着による。一般に、バクテリオシンは微生物によって産生される。しかしながら、本明細書において、用語“バクテリオシン”は、微生物によって産生され単離された形および合成的に製造された形の両方のことを言い、また、親バクテリオシンの活性を実質的に保持しているが、その配列が1以上のアミノ酸残基が挿入または欠失によって改変されたバリアントのことも言う。
本明細書において、用語“EAD”はエンドリシンの酵素活性ドメインのことを言う。EADは、細菌のペプチドグリカンの加水分解に関与する。EADは、エンドリシンの少なくとも1つの酵素活性を示す。EADは、2以上の酵素的に活性なモジュールから構成されることもできる。本明細書においては、用語“EAD”は用語“触媒ドメイン”と同義で用いられる。
本明細書において、用語“欠失”は、それぞれの出発配列からの1、2、3、4、または5以上のアミノ酸残基の除去のことを言う。
本明細書において、用語“挿入”または“付加”は、それぞれの出発配列への1、2、3、4、または5以上のアミノ酸残基の挿入または付加のことを言う。
本明細書において、用語“置換”は、特定の位置に位置するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基との交換のことを言う。
本明細書において、用語“バイオフィルム”は、細菌細胞が互いに付着したかつ/または表面に付着した細菌性微生物の凝集体のことを言う。これらの付着細胞は、多くの場合、その細胞によって産生される細胞外高分子物質(EPS)のマトリックスで覆われている。バイオフィルムのEPSは細胞外DNA、タンパク質および多糖から構成される。これらのバイオフィルムは、任意の生体表面または非生体表面上に、特にコロニーで固体表面上に、また薄膜で液体表面上に形成されることができる。バイオフィルム内で増殖している微生物細胞は、同じ生物体の浮遊細胞とは生理学的に異なる。
本発明は、細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法であって、
a)膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合された、グラム陰性菌および/またはグラム陽性菌の細胞壁の分解活性を有する酵素を含む融合タンパク質を提供し;
b)前記融合タンパク質と物質、液体、表面または生体物質とを接触させる
段階を含む前記方法に関する。
好ましくは、本発明は、細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法であって、c)膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含む融合タンパク質を提供し;
d)前記融合タンパク質と物質、液体、表面または生体物質とを接触させる
段階を含む前記方法に関する。
本発明の融合タンパク質を“提供する”という用語は、本発明の融合タンパク質を単に取り出し使用することか、または本発明の使用の前に前記融合タンパク質を調製し精製することのいずれかを言う。
好ましくは、物質は、石、岩、土壌、堆積物、食物、飼料または化粧品である。好ましくは、液体は、飲料水、地下水もしくは廃水などの水、熱水泉、海、湖、川、任意の種類の水性系、コンタクトレンズ、義歯、インプラント、補装具またはブレースの洗浄液および保存液である。
好ましくは、生体物質は、生体、特に植物および哺乳動物、好ましくはヒトに由来するかまたはそれから得られる任意の物質、例えば細胞、組織、器官、血液、血液成分および体液である。好ましくは、細胞は、例えば有核細胞または無核細胞である。細胞は、任意の器官、特に肝細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、角化細胞、島細胞、幹細胞(成人および新生児、種々の組織または種起源)、幹細胞前駆細胞、臍帯血細胞、配偶子(雌雄の)、配偶子前駆細胞、赤芽球、白芽球ならびに軟骨芽細胞由来であることができる。組織は、例えば粘膜、神経、筋肉、上皮、結合および支持組織、口腔軟組織および歯である。器官は、例えば心臓、心臓弁、眼、耳、尿路、肺、肝臓、腎臓、胆道、前立腺、鼻、消化管、気道、消化管、脳および骨髄である。好ましい体液は、尿、脳脊髄液およびリンパ液である。
好ましくは、表面は、固体の生体表面および非生体表面である。好ましい表面の例には、医療機器、特にインプラント、補装具、カテーテル、例えば歯科インプラント、尿路補装具、腹膜カテーテル、腹膜透析カテーテル、透析および化学療法剤の長期投与のための留置カテーテル(Hickmanカテーテル)、ペースメーカー、人工心臓弁、心補助循環装置、人工血管およびステントなどの心臓インプラント、創内固定器、経皮縫合糸、気管内チューブおよび換気チューブの表面ばかりでなく、工業用水システムまたは飲料水システムの配管および天然水系の表面がある。
バイオフィルムは、細菌細胞が互いに付着したかつ/または表面に付着した細菌性微生物によって形成される。バイオフィルムの細菌性微生物によって排泄される細胞外高分子物質(EPS)は水によってヒドロゲルを形成し、それによって粘液様マトリックスが形成される。このマトリックスは、ガス気泡および無機粒子を含むこともできる。バイオフィルムEPSは細胞外DNA、タンパク質および多糖から構成される。細菌性微生物以外にも、バイオフィルム内に他の単細胞生物体が組み込まれることができる。バイオフィルムは、細菌性微生物の界面への定着によって生じることができる。バイオフィルムは、主として、水面または固相界面に形成される。これらのバイオフィルムは、任意の生体表面または非生体表面上に形成されることができる。一般に、バイオフィルムはすべての界面に定着することができる。バイオフィルムは、ほぼどこにでも存在し、土壌および堆積物中に、地下水中に、岩の上に、デザート中に、熱水泉中に、植物および動物に付着して、またはその内部に、特に粘膜上に存在する。さらに、バイオフィルムは、インプラント、カテーテル、内視鏡、補装具、器械および装置などの医療機器上に生じることもできるし、化粧品、食物および飼料内に生じることもできる。バイオフィルムは感染症と関連する場合もある。なぜなら、ほとんどの場合、細菌性微生物はバイオフィルムを形成して免疫系に対して保護されるからである。バイオフィルムの形成は、細菌性微生物の長期生存を確実にする。急性気道感染症の1例は在郷軍人病であり、これは、暖房装置または冷房装置の空気管または水管から剥離したレジオネラ菌・バイオフィルムの凝集塊の嚥下または吸入によって引き起こされる。E.コリ(E. coli)0157:H7、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、サルモネラ種(Salmonella spp.)およびカンピロバクター・ジェジュニ(Camphylobacter jejuni)などの多くの食品細菌もまた、食品および装置上にバイオフィルムを形成することができ、それと同時にそれらは殺生物剤、乾燥、加熱、抗生物質および洗浄試薬に高度耐性を示す。インプラント、カテーテルおよび他の医療機器の汚染に関与する微生物は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・アウレウス、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、ストレプトコッカス種(Streptococcus spp.)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、アシネトバクター種(Acinetobacter spp.)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginsa)およびカンジダ種(Candida spp.)であることができ、これらはまた、広域スペクトルの院内感染症とも関連している。バイオフィルムと関連する、ヒトにおける典型的な細菌感染症は、創傷感染症、特に糖尿病と関連する創傷、扁桃炎、骨髄炎、細菌性心内膜炎、副鼻腔炎、角膜感染症、尿路感染症、胆道感染症、感染性腎結石、尿道炎、前立腺炎、カテーテル感染症、中耳感染症、歯垢形成、歯肉炎、歯周炎、嚢胞性線維症ならびに、人工関節および心臓弁などの永久留置装置の感染症である。
バイオフィルムの存在は、種々の試験、例えばChristensen et al., J Clin Microbiol 22:996-1006 (1985) に記載されている組織培養プレート法、またはChristensen et al., Infect Immun 37:318-26 (1982) に記述されているチューブ法(TM)、またはFreeman et al., J Clin Pathol 42:872-4 (1989) に記載されているコンゴレッド寒天法によって測定できる。バイオフィルムは、クリスタルバイオレットアッセイ(Peeters et al., J Microbiol Methods 72: 157-165 (2008))を用いて定量できる。
本発明の融合タンパク質は、バイオフィルムを形成する細菌の相互作用に影響し、それによって細胞は単一の浮遊細胞に変換され、次いでそこで前記融合タンパク質によって溶解され、次いでその結果として、バイオフィルムは部分的または完全に分解される。本発明の融合タンパク質の細菌に対する影響によって、バイオフィルム内で結びついている細菌を直接に溶解することもでき、それによってバイオフィルムは部分的または完全に分解される。さらに、本発明の融合タンパク質は、他の細菌によってバイオフィルムを形成することができる細菌を溶解することによって細菌性バイオフィルムの形成を防ぐことができる。
本発明の融合タンパク質は、好ましくは、エンドリシンバリアント、バクテリオシンバリアントおよびオートリシンバリアントに関する。
本発明の好ましい融合タンパク質は、リポ多糖(LPS)破壊活性または一般に膜破壊活性を有するペプチドに融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含む。LPSはグラム陰性菌の外膜の主成分である。LPSは細胞膜の負電荷を増加させ、特定の種類の化学攻撃から膜を保護する。前記LPSは、ある程度は、細菌の外部から加えたエンドリシンからもグラム陰性菌の膜を保護する。しかしながら、LPSは、正に荷電したペプチドなどのLPS破壊活性を有するペプチドによって破壊されることができる。さらに、前記ペプチドは、外膜のタンパク質輸送機構、外膜構造タンパク質の不安定化および/または脂質依存性不安定化に関与することができる。本発明の発明者は、驚くべきことに、LPS破壊活性または一般に膜破壊活性を有するペプチドは、前記ペプチドに融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンの、グラム陰性菌の外膜を介した通過を促進することを見出した。細菌の外膜を介したエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンの通過の促進後に、細菌の細胞壁は、ペプチドグリカン層の分解とそれに続く細菌の細胞内圧がもはや耐えられなくなった時の浸透圧溶解により、エンドリシンによって容易に破壊または分解されることができる。グラム陽性菌はグラム陰性菌よりもかなり厚いペプチドグリカン層を有する。ここで、融合タンパク質の膜破壊活性は、細胞質膜に作用することによって細菌の溶解を助ける。
従って、本発明は、酵素、好ましくはグラム陰性菌および/またはグラム陽性菌の細胞壁の分解活性を有するエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンと、膜破壊活性を有するペプチドとから構成される融合タンパク質であって、前記ペプチドが前記酵素にN末端および/またはC末端で融合された前記融合タンパク質を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法のことを言う。本発明の前記融合タンパク質はまた、修飾エンドリシンバリアントまたは単にエンドリシンバリアントもしくは修飾エンドリシン、修飾オートリシンバリアントもしくはオートリシンバリアント、修飾バクテリオシンもしくはバクテリオシンバリアントとも呼ばれる。
融合タンパク質のエンドリシン部分は、好ましくは、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)(エシェリキア属(Escherichia)、特にE.コリ、サルモネラ属(Salmonella)、シゲラ属(Shigella)、シトロバクター(Citrobacter)、エドワージエラ属(Edwardsiella)、エンテロバクター属(Enterobacter)、ハフニア属(Hafnia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、特にK.ニューモニエ(K.pneumoniae)、モルガネラ属(Morganella)、プロテウス属(Proteus)、プロビデンシア属(Providencia)、セラチア属(Serratia)、エルシニア属(Yersinia))、シュードモナス科(Pseudomonadaceae)(シュードモナス属(Pseudomonas)、特にP.エルギノーサ(P.aeruginosa)、バークホルデリア属(Burkholderia)、ステノトロホモナス属(Stenotrophomonas)、シュワネラ属(Shewanella)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)、コマモナス属(Comamonas))、ナイセリア属(Neisseria)、モラクセラ属(Moraxella)、ビブリオ属(Vibrio)、アエロモナス属(Aeromonas)、ブルセラ属(Brucella)、フランシセラ属(Francisella)、ボルデテラ属(Bordetella)、レジオネラ属(Legionella)、バルトネラ属(Bartonella)、コクシエラ属(Coxiella)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、パスツレラ属(Pasteurella)、マンヘミア属(Mannheimia)、アクチノバチルス属(Actinobacillus)、ガードネレラ属(Gardnerella)、スピロヘータ科(Spirochaetaceae)(トレポネーマ属(Treponema)およびボレリア属(Borrelia))、レプトスピラ科(Leptospiraceae)、カンピロバクター属(Campylobacter)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、スピリルム属(Spirillum)、ストレプトバチルス属(Streptobacillus)、バクテロイデス科(Bacteroidaceae)(バクテロイデス属(Bacteroides)、フソバクテリウム属(Fusobacterium)、プレボテラ属(Prevotella)、ポルフィロモナス属(Porphyromonas))、アシネトバクター属(Acinetobacter)、特にA.バウマニ(A.baumannii)などのヒトまたは動物に病原性を示す株を含む細菌群、科、属または種のグラム陰性菌などのグラム陰性菌に特異的なバクテリオファージによってコードされる。
他の好ましい実施形態において、融合タンパク質のエンドリシンは、グラム陽性菌、特に、放線菌門(Actinobacteria)、特に放線菌綱(Actinobacteridae)、特に放線菌目(Actinomycetales)、特に放線菌亜目(Actinomycineae):放線菌科(Actinomycetaceae)(アクチノミセス属(Actinomyces)、モビルンカス属(Mobiluncus))、コリネバクテリウム科(Corynebacterineae):マイコバクテリウム亜目(Mycobacteriaceae)(マイコバクテリウム属(Mycobacterium))、ノカルジア科(Nocardiaceae)、コリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)、フランキア亜目(Frankineae):フランキア科(Frankiaceae)、ミクロコッカス亜目(Micrococcineae):ブレビバクテリウム科(Brevibacteriaceae)およびプロピオニバクテリウム科(Propionibacteriaceae)(プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium))、ビフィドバクテリウム目(Bifidobacteriales)、特にビフィドバクテリウム科(Bifidobacteriaceae)(ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、ファルシビブリオ属(Falcivibrio)、ガードネレラ属)および他の亜綱:アシドミクロビウム亜綱(Acidimicrobidae)、コリオバクター亜綱(Coriobacteridae)、ルブロバクター亜綱(Rubrobacteridae)、スフェロバクター亜綱(Sphaerobacteridae);およびフィルミクテス門(Firmicutes)、特にバチルス綱(Bacilli)、特にバチルス目(Bacillales)、特にバチルス科(Bacillaceae)(バチルス属(Bacillus))、リステリア科(Listeriaceae)(リステリア属(Listeria))、スタフィロコッカス科(Staphylococcaceae)(スタフィロコッカス属、ゲメラ属(Gemella)、ヨトガリコッカス属(Jeotgalicoccus))およびラクトバチルス目(Lactobacillales)、特にエンテロコッカス科(Enterococcaceae)(エンテロコッカス属)、ラクトバチルス科(Lactobacillaceae)(ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ペディオコッカス属(Pediococcus))、ロイコノストック科(Leuconostocaceae)(ロイコノストック属(Leuconostoc))、ストレプトコッカス科(Streptococcaceae)(ラクトコッカス属(Lactococcus)、ストレプトコッカス属)およびトリジウム綱(Clostridia)、特にクロストリジウム目(Clostridiales)(クロストリジウム属、ペプトストレプトコッカス属(Peptostreptococcus)、セレノモナス属(Selenomonas))、ハロアナエロビウム目(Halanaerobiales)およびサーモアナエロバクター目(Thermoanaerobacterales)およびテネリクテス綱(Tenericutes)/モリクテス綱(Mollicutes)、特にマイコプラズマ目(Mycoplasmatales)(マイコプラズマ属(Mycoplasma)、ウレアプラスマ属(Ureaplasma))、エントモプラズマ目(Entomoplasmatales)(スピロプラズマ属(Spiroplasma))、アナエロプラズマ目(Anaeroplasmatales)(エリシペロスリクス属(Erysipelothrix))、アコレプラズマ目(Acholeplasmatales)(アコレプラズマ属(Acholeplasma))、ハロプラズマ目(Haloplasmatales)(ハロプラズマ属(Haloplasma))の、ヒトまたは動物に病原性を示す株を含む細菌群、科、属または種のグラム陽性菌に特異的なバクテリオファージによってコードされる。
他の好ましい実施形態において、融合タンパク質のオートリシンまたはバクテリオシンは、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば上記のヒトまたは動物に病原性を示す株を含む細菌群、科、属または種のグラム陰性菌またはグラム陽性菌によってコードされる。
好ましくは、エンドリシン部分は、以下の表1に示されるファージまたは野生型エンドリシンに由来する。

シュードモナス・エルギノーサファージΦKZおよびEL、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)ファージOBP、ファージLUZ24のエンドリシン、T4リゾチーム、gp61ムラミダーゼ、PSP3エンドリシンからのエンドリシン、サルモネラファージ、アシネトバクター・バウマニー(Acinetobacter baumannii)ファージ、E.コリファージP2、E.コリファージN4およびK1Fならびにサルモネラ・ティフィムリウムファージのエンドリシンに由来するエンドリシン部分もまた好ましい。
融合タンパク質のさらに好ましいエンドリシンは、リステリアファージエンドリシンPlyA118、PlyA500、PlyPSA、PlyA511、PlyP35、PlyP40、スタフィロコッカスファージφ11エンドリシン、φMR11エンドリシン、LysK、Ply2638、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)lyS6、Ply3626、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile):CD27Lエンドリシン、ストレプトコッカス:B30エンドリシン、ファージDp-1 Palアミダーゼ、C1エンドリシン、Cpl-1エンドリシン、PlyGBS、エンテロコッカス:PlyV12、バチルス・アンスラシス:ファージγエンドリシンPlyG、プロピオニバクテリウムファージエンドリシンPA6-gp20である。
融合タンパク質の好ましいオートリシンは、Bacterial peptidoglycan (murein) hydrolases. Vollmer W, Joris B, Charlier P, Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar;32(2):259-86. Epub 2008 Feb 11. Review に記載されている。好ましいオートリシンの例は、AtlAオートリシンである。
好ましいバクテリオシンは、リゾスタフィン(スタフィロコッカス属の細胞壁を分解する)、ムタノリシン(ストレプトコッカス属の細胞壁を分解する)およびエンテロリシン(エンテロコッカス属の細胞壁を分解する)である。より好ましくは、本発明の融合タンパク質のバクテリオシンは、配列番号87のアミノ酸配列を含む。
融合タンパク質のエンドリシン部分のさらなる例は、配列番号84のCpl-1、配列番号85のPly511、配列番号86のLysK、配列番号88のPA6-gp20、配列番号1のphiKZgp144、配列番号2のELgp188、配列番号3のサルモネラエンドリシン、配列番号4の腸内細菌ファージT4エンドリシン、配列番号5のアシネトバクター・バウマニーエンドリシン、配列番号6のE.コリファージK1Fエンドリシン、配列番号7のOBPgpLYS、配列番号8のPSP3サルモネラエンドリシン(PSP3gp10)、配列番号9のE.コリファージP2エンドリシン(P2gp09)、配列番号89のサルモネラ・ティフィムリウムファージムラミダーゼSTM0016、配列番号90のE.コリファージN4ムラミダーゼN4-gp61、配列番号91のN4-gp61 trunc.および配列番号92のPly2638からなる群から選択される。
本発明の他の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法は、アミノ酸配列の修飾および/または改変を含む。このような改変および/または修飾は、欠失、挿入および付加、置換もしくはそれらの組み合わせなどの変異ならびに/またはビオチン化、アセチル化、PEG化などのアミノ酸残基の化学変化、アミノ基、SH基もしくはカルボキシル基の化学変化を含むことができる。前記修飾および/または改変されたエンドリシンは、それぞれの野生型エンドリシンの溶解活性を示す。しかしながら、前記活性は、それぞれの野生型エンドリシンの活性よりも低い場合も高い場合もある。前記活性は、それぞれの野生型エンドリシンの活性の約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190または約200%であることもできるし、それ以上であることもできる。活性は、当業者に公知のアッセイ、例えば、Briers et al., J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007) などに記載されているプレート溶解アッセイまたは液体溶解アッセイによって測定することができる。
本発明の融合タンパク質のペプチドは、例えばクローニング上の理由により、追加のアミノ酸残基によって酵素、好ましくはエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンに結合されることができる。好ましくは、前記追加のアミノ酸残基はプロテアーゼによって認識および/または切断されることができない。好ましくは、前記ペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10の追加のアミノ酸残基によって酵素に結合されることができる。好ましくは、本発明の融合タンパク質の酵素、好ましくはエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンのN末端に融合されるペプチドは、さらに、そのN末端に追加のアミノ酸を含む。好ましくは、ペプチドは、アミノ酸メチオニン(Met)またはメチオニン、グリシンおよびセリン(Met-Gly-Ser)またはアラニン、メチオニンおよびグリシン(Ala-Met-Gly)を含む。他の好ましい実施形態において、ペプチドは、追加のアミノ酸残基、特にグリシンおよびセリン(Gly-Ser)によって、酵素、好ましくはエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンのN末端に結合される。他の好ましい実施形態において、ペプチドは、追加のアミノ酸残基、特にグリシンおよびセリン(Gly-Ser)によって酵素のC末端に結合される。
本発明の一側面において、膜破壊活性および/またはLPS破壊活性を有するペプチドは、正に荷電したアミノ酸、リジン、アルギニンおよび/またはヒスチジンを含む正に荷電したペプチドを1以上含む。好ましくは、前記ペプチドにおいて、80%を超える、好ましくは90%を超える、好ましくは100%のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸である。好都合には、カチオン性ペプチドは、融合タンパク質のN末端および/またはC末端に位置し、それによって後者のタンパク質のカチオン性が増加する。本発明の他の実施形態において、酵素、好ましくはエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンに融合されるカチオン性ペプチドは、少なくとも5、より好ましくは少なくとも9アミノ酸長である。
好ましい実施形態において、前記ペプチドは、約3〜約50、より好ましくは約5〜約20、例えば約5〜約15アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の少なくとも20、30、40、50、60または70%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも90%はアルギニンまたはリジン残基のいずれかである。他の好ましい実施形態において、前記ペプチドは約3〜約50、より好ましくは約5〜約20、例えば約5〜約15アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基はアルギニンまたはリジン残基のいずれかである。
好ましくは、融合タンパク質のペプチドは、酵素、好ましくはエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンのN末端および/またはC末端に融合される。特に好ましい実施形態において、前記ペプチドは、酵素、好ましくはエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンのN末端にのみ融合される。しかしながら、N末端およびC末端の両方にペプチドを有する融合タンパク質もまた好ましい。N末端およびC末端における前記ペプチドは、同一ペプチドであることも、異なるペプチドであることもできる。
融合タンパク質のペプチドは、好ましくは、酵素に共有結合される。好ましくは、前記ペプチドは少なくとも5アミノ酸残基からなり、より好ましくは少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または少なくとも100アミノ酸残基からなる。約5〜約100アミノ酸残基、約5〜約50アミノ酸残基または約5〜約30アミノ酸残基を含むペプチドが特に好ましい。約6〜約42アミノ酸残基、約6〜約39アミノ酸残基、約6〜約38アミノ酸残基、約6〜約31アミノ酸残基、約6〜約25アミノ酸残基、約6〜約24アミノ酸残基、約6〜約22アミノ酸残基、約6〜約21アミノ酸残基、約6〜約20アミノ酸残基、約6〜約19アミノ酸残基、約6〜約16アミノ酸残基、約6〜約14アミノ酸残基、約6〜約12アミノ酸残基、約6〜約10アミノ酸残基または約6〜約9アミノ酸残基を含むペプチドがより好ましい。
本発明の一側面において、ペプチドはカチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、抗菌ペプチドおよび両親媒性ペプチドの群から選択される。
本発明の一側面において、ペプチドは、リジン、アルギニンおよび/またはヒスチジンの、特にリジンおよび/またはアルギニンの、正に荷電したアミノ酸残基を1以上含むカチオン性および/またはポリカチオン性ペプチドである。好ましくは、前記ペプチドにおいて、約20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95または99%を超えるアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基、特にリジンおよび/またはアルギニン残基である。約100%の正に荷電したアミノ酸残基、特にアルギニンおよび/またはリジン残基であって、好ましくは前記正に荷電したアミノ酸残基の約60%〜約70%がリジン残基であり、前記正に荷電したアミノ酸残基の約30%〜約40%がアルギニン残基である前記アミノ酸残基からなるペプチドが特に好ましい。約100%の正に荷電したアミノ酸残基、特にアルギニンおよび/またはリジン残基であって、好ましくは前記正に荷電したアミノ酸残基の約64%〜約68%がリジンであり、前記正に荷電したアミノ酸残基の約32%〜約36%がアルギニンである前記アミノ酸残基からなるペプチドがより好ましい。アルギニンのみまたはリジンのみからなるペプチドもまた好ましい。
配列番号10のモチーフ(KRKKRK)を少なくとも1つ含む融合タンパク質のカチオン性および/またはポリカチオン性ペプチドが特に好ましい。特に、配列番号10のモチーフ(KRKKRK)を少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16または17含むカチオン性ペプチドが好ましい。少なくとも1つのKRKモチーフ(lys-arg-lys)、このましくは少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32または33のKRKモチーフを含むカチオン性ペプチドがより好ましい。
本発明の他の好ましい実施形態において、ペプチドは、正に荷電したアミノ酸残基、特にリジンおよび/またはアルギニン残基に加えて中性に荷電したアミノ酸残基、特にグリシンおよび/またはセリン残基を含むカチオン性ペプチドである。約70%〜約100%または約80%〜約95%または約85%〜約90%の正に荷電したアミノ酸残基、特にリジン、アルギニンおよび/またはヒスチジン残基からなるカチオン性ペプチド、より好ましくはリジンおよび/またはアルギニン残基ならびに約0%〜約30%または約5%〜約20%または約10%〜約20%の中性に荷電したアミノ酸残基、特にグリシンおよび/またはセリン残基からなるカチオン性ペプチドが好ましい。約4%〜約8%のセリン残基、約33%〜約36%のアルギニン残基および約56%〜約63%のリジン残基からなるペプチドが好ましい。配列番号32のモチーフ(KRXKR)(式中、Xはリジン、アルギニンおよびヒスチジン以外の任意の他のアミノ酸である)を少なくとも1つ含むペプチドが特に好ましい。配列番号33のモチーフ(KRSKR)を少なくとも1つ含むペプチドが特に好ましい。配列番号32(KRXKR)または配列番号33(KRSKR)のモチーフを少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または約20含むカチオン性ペプチドがより好ましい。
約9〜約16%のグリシン残基、約4〜約11%のセリン残基、約26〜約32%のアルギニン残基および約47〜約55%のリジン残基からなる、融合タンパク質のペプチドもまた好ましい。配列番号34のモチーフ(KRGSG)を少なくとも1つ含むペプチドが特に好ましい。配列番号34のモチーフ(KRGSG)を少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または約20含むカチオン性ペプチドがより好ましい。
本発明の他の好ましい実施形態において、カチオン性ペプチドは、正に荷電したアミノ酸残基、特にリジンおよび/またはアルギニン残基に加えて、疎水性アミノ酸残基、特にバリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリンおよびグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよび/またはトリプトファン残基を含む。約70%〜約100%または約80%〜約95%または約85%〜約90%の正に荷電したアミノ酸残基、特にリジンおよび/またはアルギニン残基ならびに約0%〜約30%または約5%〜約20%または約10%〜約20%の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリンおよびグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよび/またはトリプトファン残基からなる融合タンパク質のカチオン性ペプチドが好ましい。
以下の表2に示した配列からなる群から選択される融合タンパク質のペプチドが特に好ましい。
表２：
好ましくは、融合タンパク質のペプチドは、Hisタグ、Strepタグ、Aviタグ、Mycタグ、GSTタグ、JSタグ、システインタグ、FLAGタグまたは当該技術分野で公知の他のタグなどのタグでもなく、また、チオレドキシンまたはマルトース結合タンパク質(MBP)でもない。しかしながら、本発明の融合タンパク質は、このようなタグ(単数または複数)をさらに含むことができる。
好ましくは、融合タンパク質のペプチドは、本発明の融合タンパク質に細菌の外膜を通過させる機能を有するが、エンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンに融合されないで投与された場合、活性をほとんど示さない。融合タンパク質にグラム陰性菌および/またはグラム陽性菌の外膜を通過させる機能は、前記ペプチドの潜在的な外膜またはLPSの破壊、透過化または不安定化活性によって引き起こされる。このような、前記ペプチドの潜在的な外膜またはLPSの破壊、透過化または不安定化活性は、以下の方法によって測定できる:処理される細菌細胞を液体培地中または寒天平板上で培養する。次いで、それぞれ、液体培地中の細菌細胞濃度をOD600nmで光度測定するか、または寒天平板上のコロニーを計測する。次に、液体培地中またはプレート上の細菌細胞を本発明の融合タンパク質で処理する。インキュベーション後、再度、液体培地中の細菌細胞濃度をOD600nmで光度測定するか、または寒天平板上のコロニーを計測する。融合タンパク質がこのような外膜またはLPSの破壊、透過化または不安定化活性を示す場合、融合タンパク質での処理によって細菌細胞は溶解し、従って、液体培地中の細菌細胞濃度または寒天プレート上の細菌コロニー数は減少する。従って、融合タンパク質での処理後の細菌細胞濃度または細菌コロニー数の減少は、融合タンパク質の、外膜またはLPSの破壊、透過化または不安定化活性を示している。
本発明の他の実施形態において、ペプチドは、正の正味電荷およびおよそ50%の疎水性アミノ酸を含む抗菌ペプチドである。抗菌ペプチドは両親媒性であり、約12〜約50アミノ酸残基長を有する。抗菌ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ類、脊椎動物または哺乳動物において天然に存在する。好ましくは、抗菌ペプチドは、ハツカダイコン、カイコガ、ウルフスパイダー、カエル、好ましくはゼノパス・レービス、アカガエル属のカエル、より好ましくはラナ・カテスベイアナ、ヒキガエル、好ましくはアジアヒキガエルブフォ・ガルガリザンス、ハエ、好ましくはドロソフィラ、より好ましくはドロソフィラ・メラノガスター、アエデス・アエジプチ、ミツバチ、マルハナバチ、好ましくはボムブス・パスクオルム、ニクバエ、好ましくはサルコファガ・ペレグリン、サソリ、カブトガニ、ナマズ、好ましくはパラシルルス・アソツス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サルおよびヒトにおいて天然に存在することができる。
他の好ましい実施形態において、融合タンパク質の抗菌ペプチドは、約0%〜約5%または約0%〜約35%または約10%〜約35%または約15%〜約45%または約20%〜約45%の正に荷電したアミノ酸残基、特にリジンおよび/またはアルギニン残基ならびに約50%〜約80%または約60%〜約80%または約55%〜約75%、または約70%〜約90%の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリンおよびグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよび/またはトリプトファン残基からなる。
本発明の他の好ましい実施形態において、融合タンパク質の抗菌ペプチドは、約4%〜約58%の正に荷電したアミノ酸残基、特にリジンおよび/またはアルギニン残基ならびに約33%〜約89%の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリンおよびグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよび/またはトリプトファン残基からなる。
本発明の融合タンパク質の抗菌ペプチドの例を以下の表に示す。
表３：

本発明の他の実施形態において、ペプチドは、Ding JL, Li P, Ho B Cell Mol Life Sci. 2008 Apr;65(7-8):1202-19. The Sushi peptides: structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria. に記載されているsushiペプチドである。特に好ましいものは、配列番号133のsushi1ペプチドである。
好ましい融合タンパク質のsushiペプチドは、sushiペプチドS1およびS3ならびにそれらの複数体(multiples)である(FASEB J. 2000 Sep;14(12):1801-13)。
本発明の他の実施形態において、ペプチドは、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリンおよび/またはグリシンの疎水性アミノ酸残基を少なくとも90%含む疎水性ペプチドである。他の好ましい実施形態において、融合タンパク質の疎水性ペプチドは、約90%〜約95%または約90〜約100%または約95%〜約100%のバリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリンおよび/またはグリシンの疎水性アミノ酸残基からなる。
融合タンパク質の好ましい疎水性ペプチドは、配列番号134のアミノ酸配列を有するWalmagh1およびアミノ酸配列Phe-Phe-Val-Ala-Pro(配列番号135)を有する、融合タンパク質の疎水性ペプチドである。
本発明の他の実施形態において、ペプチドは、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリンおよび/またはグリシンの疎水性アミノ酸残基の1以上に結合したリジン、アルギニンおよび/またはヒスチジンの、正に荷電したアミノ酸残基の1以上を含む両親媒性ペプチドである。アミノ酸残基の側鎖は、カチオン性表面と疎水性表面がペプチドの反対側にクラスターを形成するように配置される。好ましくは、前記ペプチドにおいて、約30、40、50、60または70%を超えるアミノ酸は正に荷電したアミノ酸である。好ましくは、前記ペプチドにおいて、約30、40、50、60または70%を超えるアミノ酸残基は疎水性アミノ酸残基である。好都合には、両親媒性ペプチドは、細胞壁分解活性を有する酵素のN末端および/またはC末端で融合され、それによって後者のタンパク質の両親媒性が増加する。
本発明の他の実施形態において、ペプチドは、少なくとも5、より好ましくは少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50アミノ酸残基からなる両親媒性ペプチドである。好ましい実施形態において、前記両親媒性ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも約30、40、50、60または70%は、アルギニンまたはリジン残基のいずれかであり、かつ/または前記両親媒性ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも約30、40、50、60または70%は、疎水性アミノ酸バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリンおよび/またはグリシンである。
本発明の他の好ましい実施形態において、ペプチドは、正に荷電したアミノ酸残基、特にリジンおよび/またはアルギニン残基に加えて、疎水性アミノ酸残基、特にバリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリンおよびグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよび/またはトリプトファン残基を含む両親媒性ペプチドである。約10%〜約50%または約20%〜約50%または約30%〜約45%または約5%〜約30%の、正に荷電したアミノ酸残基、特にリジンおよび/またはアルギニン残基ならびに約50%〜約85%または約50%〜約90%または約55%〜約90%または約60%〜約90%または約65%〜約90%の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリンおよびグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、および/またはトリプトファン残基からなる両親媒性ペプチドが好ましい。他の好ましい実施形態において、両親媒性ペプチドは、12%〜約50%の、正に荷電したアミノ酸残基、特にリジンおよび/またはアルギニン残基ならびに約50%〜約85%の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリンおよびグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、および/またはトリプトファン残基からなる。
融合タンパク質の好ましい両親媒性ペプチドは、配列番号136のT4リゾチームのα4-へリックスおよび配列番号137のアミノ酸配列を有するWLBU2-バリアントおよび配列番号138のWalmagh2である。
本発明の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、配列番号10〜30、32〜34および93〜138のペプチドならびにエンドリシン配列番号1〜9、84〜86および88〜92または配列番号87のバクテリオシンからなる。好ましい実施形態において、融合タンパク質は、配列番号10〜30、32〜34および93〜138のペプチド群から選択されるペプチド並びに配列番号1〜9、84〜86および88〜92のエンドリシン群から選択されるエンドリシンまたは配列番号87のバクテリオシンを含む。
表4に示す以下の融合タンパク質からなる群から選択される融合タンパク質が特に好ましい。
表４：

本発明の融合タンパク質、例えば特に、配列番号35〜49、53、57、61〜64、66〜78および139〜142の特に好ましい融合タンパク質は、N末端にメチオニンをさらに含むことができる。
本発明の融合タンパク質、例えば特に、配列番号35〜49、53、57、61〜64、66〜78および139〜142の特に好ましい融合タンパク質は、タグ、例えば精製のためのタグをさらに含むことができる。His6タグ、好ましくは融合タンパク質のC末端におけるHis6タグが好ましい。前記タグは、例えばクローニング上の理由によって、追加のアミノ酸残基によって融合タンパク質に結合されることができる。好ましくは、前記タグは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10の追加のアミノ酸残基によって融合タンパク質に結合されることができる。好ましい実施形態において、融合タンパク質は、追加のアミノ酸残基、リジンおよびグリシン(Lys-Gly)またはロイシンおよびグルタミン酸(Leu-Glu)によって融合タンパク質にC末端で結合したHis6タグを含む。好ましくは、前記追加のアミノ酸残基は、プロテアーゼによって認識または切断されることができない。他の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、追加のアミノ酸残基、リジンおよびグリシン(Lys-Gly)またはロイシンおよびグルタミン酸(Leu-Glu)によって融合タンパク質にN末端で結合したHis6タグを含む。他の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、追加のアミノ酸残基、リジンおよびグリシン(Lys-Gly)またはロイシンおよびグルタミン酸(Leu-Glu)によって、酵素、好ましくはエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンにN末端およびC末端で結合したHis6タグを含む。
特に、下記の実施例で用いられる融合タンパク質が好ましい。実施例で用いられる配列番号35〜42、53、57および61の融合タンパク質は、追加のアミノ酸残基、リジンおよびグリシン(Lys-Gly)によって融合タンパク質にC末端で結合したHis6タグを含む。実施例で用いられる配列番号43〜49、75、139、141および142の融合タンパク質は、追加のアミノ酸残基、ロイシンおよびグルタミン酸(Leu-Glu)によってそれぞれの融合タンパク質にC末端で結合したHis6タグを含む。
融合タンパク質は、例えば、Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual に記載されている標準的クローニング技術を用いて少なくとも2つの核酸配列を結合させることによって構築される。このようなタンパク質は、例えば組換えDNA発現系において産生されることができる。本発明のこのような融合タンパク質は、エンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンおよびそれぞれのペプチドのための核酸を融合させることによって得ることができる。
融合タンパク質は、細菌における発現に毒性を示すか、タンパク質分解によって均一ではない場合があるので、他の追加のタンパク質に融合または結合されたこれらの融合タンパク質を発現する戦略もある。これらの他の追加のタンパク質の例は、E.コリにおいて毒性の抗菌ペプチドの発現を媒介することが示されたチオレドキシンである(TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4 from multiple joined genes in Escherichia coli. Zhou L, Zhao Z, Li B, Cai Y, Zhang S. Protein Expr Purif. 2009 Apr;64(2):225-230)。
融合タンパク質の抗菌機能のために、タンパク質切断によって追加の融合タンパク質を除去することが必要な場合がある。pET32発現系(Novagen社)のような市販キットは、使用されるプロテアーゼに応じて、MGSからAMGS(配列番号31)へのように、例えば、融合体のN末端が導入されたエンテロキナーゼ切断部位から生じる残留アラニン残基などを改変することが必要な場合がある。
本発明の他の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質のペプチドは、アミノ酸配列の修飾および/または改変を含む。このような改変および/または修飾は、欠失、挿入および付加、置換もしくはそれらの組み合わせなどの変異ならびに/またはビオチン化、アセチル化、PEG化などのアミノ酸残基の化学変化、アミノ基、SH基もしくはカルボキシル基の化学変化を含むことができる。
本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法に関する。本発明はさらに、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。前記ベクターは、前記本発明の融合タンパク質の構成発現または誘導発現を提供することができる。
融合タンパク質は、前記融合タンパク質を発現するように遺伝子改変された適切な宿主細胞などの微生物から得ることができる。前記宿主細胞は、細菌または酵母または真菌などの微生物、あるいは動物細胞、例えば哺乳動物細胞、特にヒト細胞であることができる。本発明の一実施形態において、酵母細胞はピキア・パストリス(Pichia pastoris)細胞である。宿主は、単に収量、溶解性、費用などのバイオテクノロジー上の理由によって選択することもできるし、非病原性細菌または酵母、ヒト細胞などの医学的視点から選択することもできる。
他の側面において、本発明は、本発明の融合タンパク質を含む組成物、好ましくは医薬組成物および/または本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子もしくはベクターによって形質転換された宿主を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法に関する。
本発明の好ましい実施形態において、組成物を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法は、例えばVaara (Agents that increase the permeability of the outer membrane. Vaara M. Microbiol Rev. 1992 Sep;56(3):395-441)によって記載されたEDTA、トリス、乳酸、ラクトフェリン、ポリミキシン、クエン酸および/または他の物質などの金属キレート化剤などのグラム陰性菌外膜の透過化剤をさらに含む。前記の透過化剤の組み合わせを含む組成物もまた好ましい。約10μM〜約100mM EDTA、より好ましくは約50μM〜約10mM EDTA、より好ましくは約0.5mM〜約10mM EDTA、より好ましくは約0.5mM〜約2mM EDTA、より好ましくは約0.5mM〜1mM EDTAを含む組成物が特に好ましい。しかしながら、約10μM〜約0.5mM EDTAを含む組成物もまた好ましい。約0.5mM〜約2mM EDTA、より好ましくは約1mM EDTAおよびさらに約10〜約100mMトリスを含む組成物もまた好ましい。
本発明はまた、本発明の融合タンパク質および/または医薬として使用するための本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって形質転換された宿主を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法に関する。
他の側面において、本発明は、本発明の融合タンパク質および/または細菌性バイオフィルムの除去、低減および予防のための本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクターによって形質転換された宿主の使用に関する。バイオフィルムを生成する細菌が植物、動物および/またはヒトに有害な障害、疾患または状態を引き起こす場合の使用が好ましい。バイオフィルムを生成する細菌が、腸内細菌科(エシェリキア属、特にE.コリ、サルモネラ属、シゲラ属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、ハフニア属、クレブシエラ属、特にK.ニューモニエ、モルガネラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、セラチア属、エルシニア属)、シュードモナス科(シュードモナス属、特にP.エルギノーサ、バークホルデリア属、ステノトロホモナス属、シュワネラ属、スフィンゴモナス属、コマモナス属)、ナイセリア属、モラクセラ属、ビブリオ属、アエロモナス属、ブルセラ属、フランシセラ属、ボルデテラ属、レジオネラ属、バルトネラ属、コクシエラ属、ヘモフィルス属、パスツレラ属、マンヘミア属、アクチノバチルス属、ガードネレラ属、スピロヘータ科(トレポネーマ属およびボレリア属)、レプトスピラ科、カンピロバクター属、ヘリコバクター属、スピリルム属、ストレプトバチルス属、バクテロイデス科(バクテロイデス属、フソバクテリウム属、プレボテラ属、ポルフィロモナス属)、アシネトバクター属、特にA.バウマニなどのヒトまたは動物に病原性を示す株を含む細菌群、科、属または種のグラム陰性菌である場合の使用が好ましい。好ましくは、前記障害、疾患または状態は、シュードモナス属、特にシュードモナス・エルギノーサおよび/またはシュードモナス・プチダ、バークホルデリア属、特にバークホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)および/またはバークホルデリア・ソラナセラム(Burkholderia solanacearum)、サルモネラ属、特にサルモネラ・ティフィムリウムおよび/またはサルモネラ・エンテリティデス(Salmonella Enteritidis)、アシネトバクター属、特にアシネトバクター・バウマニー、エシェリキア・コリおよび/またはクレブシエラ属、特にクレブシエラ・ニューモニエによって引き起こされることができる。特に、障害、疾患または状態の治療および/または予防は、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・アウレウス、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、クロストリジウム・パーフリンジェンス、バチルス・アンスラシス、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphteriae)、マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae)、アクチノミセス属などのヒトまたは動物に病原性を示す株を含む細菌群、科、属または種のグラム陽性菌によって引き起こされることができる。
好ましい実施形態において、融合タンパク質は、好ましくはエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントである。
他の側面において、本発明は、治療および/または予防を必要とする被験者における細菌性バイオフィルムと関連する障害、疾患または状態の治療方法であって、本発明の融合タンパク質の有効量および/または本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列もしくは本発明の組成物を含む核酸によって形質転換された宿主の有効量を前記被験者に投与することを含む前記方法に関する。被験者はヒトまたは動物であることができる。
好ましくは、前記治療方法は、細菌性バイオフィルム、特に上記のグラム陰性菌およびグラム陽性菌による細菌性バイオフィルムと関連する、グラム陰性菌および/またはグラム陽性菌によって引き起こされる感染症の治療および/または予防方法であることができる。特に、前記治療方法は、細菌性バイオフィルム、特に上記のグラム陰性菌およびグラム陽性菌による細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌および/またはグラム陽性菌によって引き起こされる皮膚、軟部組織、呼吸器系、肺、消化管、眼、耳、歯、上咽頭、口、骨、膣、創傷の感染症、菌血症および/または心内膜炎の治療および/または予防方法であることができる。
本発明の治療または予防方法に用いられる用量および投与経路は、治療される特定の疾患/感染部位に依存する。投与経路は、例えば、経口、局所、上咽頭、非経口、吸入、静脈内、筋肉内、鞘内、髄腔内、気管支腔内、肺内、骨内、心内、関節内、直腸内、膣内または任意の他の投与経路であることができる。好ましい実施形態において、融合タンパク質は、生体物質、好ましくは皮膚、特に哺乳動物、好ましくはヒトの皮膚に局所投与される。好ましい実施形態において、融合タンパク質は、生体物質、好ましくは血液、特に哺乳動物、好ましくはヒトの血液に全身投与される。
本発明の融合タンパク質および/または本発明の融合タンパク質もしくは本発明の組成物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって形質転換された宿主の有効量を感染部位(または感染危険部位)に投与するために、それが感染部位に到達するまで、プロテアーゼ、酸化、免疫応答などなどの環境の影響から活性化合物を保護する製剤を使用することができる。従って、製剤は、カプセル、糖衣錠、ピル、粉末、座剤、乳剤、懸濁液、ゲル、ローション、クリーム、軟膏、注射液、シロップ、スプレー、吸入製剤または任意の他の医学的に合理的なガレン製剤であることができる。好ましくは、ガレン製剤は、適切な担体、安定剤、風味剤、緩衝液または他の適切な試薬を含むことができる。例えば、局所投与のために、製剤はローション、クリーム、ゲル、軟膏またはばんそうこうであることができ、上咽頭投与のために、製剤は、スプレーによって鼻に投与される生理食塩溶液であることができる。特定の感染部位例えば腸内部位の治療および/または予防の場合における経口投与のために、本発明の融合タンパク質が感染部位に到達するまで、消化管の過酷な消化環境からそれを保護することが必要な場合がある。胃における消化の第1段階を生き延び、後に腸管環境に本発明の融合タンパク質を分泌する細菌を担体として用いることができる。
特定の実施形態において、本発明は、細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌および/またはグラム陽性菌感染症によって引き起こされる障害、疾患または状態の治療および/または予防のための医薬の製造における、本発明の融合タンパク質および/または本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクターによって形質転換された宿主の使用に関する。好ましい実施形態は、抗生物質との組み合わせまたはそれへの添加における、細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌および/またはグラム陽性菌感染症によって引き起こされる障害、疾患または状態の治療および/または予防のための医薬の製造における本発明の融合タンパク質の使用に関する。
特定の実施形態において、本発明は、細菌性バイオフィルムと関連するシュードモナス属、特にシュードモナス・エルギノーサによって引き起こされる障害、疾患または状態、特に、腸管感染症、特に乳児における腸管感染症、髄膜感染症、例えば出血性髄膜炎、中耳感染症、皮膚(壊疽性膿皮症)、特に熱傷、尿路、鼻炎、菌血症性肺炎、特に患者が嚢胞性線維症または白血病などの血液悪性腫瘍を患っているか、あるいは免疫抑制療法、敗血症、特に長期静脈内カテーテル法、尿路カテーテル法、侵襲性外科手術および重篤な熱傷による好中球減少症を患っている場合の菌血症性肺炎、心内膜炎、特に患者が静脈内薬物使用者であるか、開心術による合併症を有する患者の場合の心内膜炎、高破壊性眼内感染症、特に汚染された眼科溶液の使用もしくは重篤な顔面熱傷後の高破壊性眼内感染症、離断性骨端炎、特に汚染された衣類による重篤な外傷もしくは穿刺創の結果としての離断性骨端炎の治療および/または予防のための医薬の製造における本発明の融合タンパク質および/または本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクターによって形質転換された宿主の使用に関する。
本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特にホイットモーア病、慢性肺炎、敗血症、特に患者が外傷による皮膚損傷を有する場合の敗血症は、細菌性バイオフィルムと関連するバークホルデリア・シュードマレイによって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特に、急性胃腸炎および局所化膿症、特に骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎および特にサルモネラ・ティフィムリウム髄膜炎によって引き起こされ、特に患者が2歳未満である場合の胆嚢炎は、細菌性バイオフィルムと関連するサルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella thyphimurium)およびサルモネラ・エンテリティデスによって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特にチフスは、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)によって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特にパラチフスは、サルモネラ・パラチフィ(Salmonell paratyphi)によって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特に気管支炎、肺炎、創傷感染症および敗血症、特に静脈内カテーテル法の結果としての敗血症は、細菌性バイオフィルムと関連するアシネトバクター・バウマニーによって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特に、腸管外感染症、特に虫垂炎、化膿性胆嚢炎、腹膜炎、化膿性髄膜炎および尿路感染症、小腸内E.コリ感染症、特に流行性腸炎ならびに赤痢、敗血症、エンテロトキセミア、乳腺炎および赤痢と同様な感染症は、細菌性バイオフィルムと関連するエシェリキア・コリによって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特に肺炎、菌血症、髄膜炎および尿路感染症は、細菌性バイオフィルムと関連するクレブシエラ・ニューモニエによって引き起こされる。特定の実施形態において、本発明は、リステリア・モノサイトゲネスによって引き起こされる障害、疾患または状態、特に敗血性乳児肉芽腫症(新生児のリステリア症)、単核球症、結膜炎、髄膜炎、敗血性肉芽腫症および妊娠女性のリステリア症の治療および/または予防のための医薬の製造における、本発明の融合タンパク質および/または本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクターによって形質転換された宿主の使用に関する。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特に膿皮症、特に毛包炎、せつ、よう、汗腺膿瘍および天疱瘡ならびに熱傷様皮膚症候群などの皮膚感染症はスタフィロコッカス・アウレウスによって引き起こされる。熱傷様皮膚症候群は、3つの臨床像:剥脱性皮膚炎、伝染性水疱性膿痂疹および紅斑紅皮症を示す場合がある。さらに、スタフィロコッカス・アウレウスによって引き起こされる障害、疾患または状態は、スタフィロコッカス肺炎、ホスピタリズム、特に外科的創傷感染症、産褥乳腺炎および小腸結腸炎ならびに食中毒である。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特に扁桃炎、咽頭炎、猩紅熱、丹毒、リウマチ熱および急性糸球体腎炎はストレプトコッカス・ピオゲネスによって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特に肺炎、匐行性角膜潰瘍、中耳炎、髄膜炎、腹膜炎、乳様突起炎および骨髄炎はストレプトコッカス・ニューモニエによって引き起こされる。
本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特にガス壊疽、壊疽性腸炎および食中毒はクロストリジウム・パーフリンジェンスによって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特にボツリヌス中毒はクロストリジウム・ボツリヌムによって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特に偽膜性腸炎はクロストリジウム・ディフィシルによって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特に皮膚炭疽、吸入炭疽および胃腸炭疽はバチルス・アンスラシスによって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、例えば院内感染症および心内膜炎などはエンテロコッカス・フェカリスまたはE.フェシウム(E. faecium)によって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特に食中毒、気管支肺炎、敗血症および髄膜炎はバチルス・セレウスによって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態は、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・パラツベルクローシス(Mycobacterium paratuberculosis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス、特にツベルクローシスによって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特に肺炎、上気道疾患、および鼓膜炎はマイコプラズマ・ニューモニエによって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特にヒト、畜牛、ネコおよびイヌにおける放線菌症はアクチノミセス属によって引き起こされる。本発明の他の特定の実施形態において、障害、疾患または状態、特に扁桃腺、鼻、上咽頭または中耳の局所ジフテリア、喉頭、気管および気管支の進行性ジフテリア、毒性または悪性ジフテリア、皮膚および創傷ジフテリアはコリネバクテリウム・ジフテリエによって引き起こされる。
本発明の融合タンパク質を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法は、細菌性バイオフィルム内に侵入し、細菌性バイオフィルムを除去、低減および予防する可能性を提供する。
本発明の融合タンパク質を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法は、以下の感染症:創傷感染症、特に糖尿と関連する病創傷、扁桃炎、骨髄炎、細菌性心内膜炎、副鼻腔炎、角膜感染症、尿路感染症、胆道感染症、感染性腎結石、尿道炎、前立腺炎、カテーテル感染症、中耳感染症、歯垢形成、歯肉炎、歯周炎、嚢胞性線維症ならびに人工関節および心臓弁などの永久留置装置の感染症の治療および/または予防方法であることができる。
本発明の融合タンパク質を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減および予防の他の好ましい実施形態は、カテーテル、インプラントおよび医療機器、特に器械、装置、内視鏡、歯科機器、透析装置、例えば腹膜透析カテーテル、ペースメーカー、気管内挿入管、音声補助装置、脳脊髄液シャント、静脈カテーテル、人工心臓弁および人工関節の汚染およびコロニー形成などの、外来物と関連する感染症の治療および/または予防方法であることができる。
本発明の融合タンパク質を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減および予防の他の好ましい実施形態において、細菌性バイオフィルムは、スタフィロコッカス・エピデルミデス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・アウレウス、シュードモナス・エルギノーサ、エシェリキア・コリおよびカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)によって形成される。
本発明の融合タンパク質を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減および予防の他の好ましい実施形態は、医療、農業および工業環境、特に病院の配水管、水、配管、換気、建築暖房、空調、油田、化粧品および医薬における汚染の予防または除去のためであることができる。
本発明の融合タンパク質を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減および予防の他の好ましい実施形態は、特に冷却回路、水処理施設、家庭給湯システム、発電所、自動車製造システムおよび装置、顔料、オイルおよびガスにおける生物腐食の予防のためであることができる。
本発明の融合タンパク質を用いる細菌性バイオフィルムの除去、低減および予防の他の好ましい実施形態は、生物付着、特に潜水物体、船、プラットフォーム、ブイ、海事分野における科学目的または監視目的のためのセンサーシステムにおける生物付着の予防のためであることができる。
本発明の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、治療または予防される感染症が、細菌性バイオフィルムと関連する多剤耐性細菌株、特に以下の抗生物質:ストレプトマイシン、テトラサイクリン、セファロチン、ゲンタマイシン、セフォタキシム、セファロスポリン、セフタジジムまたはイミペネムの1以上に対する耐性株によって引き起こされるときの内科的治療に用いられる。
さらにまた、本発明の方法または使用において、融合タンパク質、好ましくはエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントは、従来の抗菌剤、例えば抗生物質、ランチビオティックス、バクテリオシンまたはエンドリシンと組み合わせて、またはそれに添加して、使用、添加または投与することができる。他の好ましい実施形態において、本発明の方法および使用において、融合タンパク質と同時に、融合タンパク質の投与または添加の後もしくは前に抗生物質が添加、使用または投与される。
本発明の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、以下の抗生物質:β-ラクタム、アミノグリコシド、フルオロキノロン、マクロライド、ノボビオシン、リファンピシン、オキサゾリジノン、フシジン酸、ムピロシン、プロイロムチリン、ダプトマイシン、バンコマイシン、テトラサイクリン、スルホンアミド、クロラムフェニコール、トリメトプリム、ホスホマイシン、サイクロセリンおよびポリミキシンの少なくとも1つと組み合わせて使用または投与することができる。
本発明の他の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、以下の抗生物質:β-ラクタム、アミノグリコシド、フルオロキノロン、マクロライド、ノボビオシン、リファンピシン、オキサゾリジノン、フシジン酸、ムピロシン、プロイロムチリン、ダプトマイシン、バンコマイシン、テトラサイクリン、スルホンアミド、クロラムフェニコール、トリメトプリム、ホスホマイシンおよびサイクロセリンの少なくとも1つと組み合わせてそれを投与することによって、スタフィロコッカス・アウレウスの細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法に用いることができる。
本発明の他の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、以下の抗生物質:β-ラクタム、アミノグリコシド、フルオロキノロン、テトラサイクリン、スルホンアミド、クロラムフェニコール、トリメトプリム、ホスホマイシン、サイクロセリンおよびポリミキシンの少なくとも1つと組み合わせてそれを投与することによって、エシェリキア・コリの細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法に用いることができる。
本発明の他の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、以下の抗生物質:β-ラクタム、アミノグリコシド、フルオロキノロンおよびポリミキシンの少なくとも1つと組み合わせてそれを投与することによって、シュードモナス・エルギノーサの細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法に用いることができる。
本発明はまた、1以上のコンパートメントを含む、細菌性バイオフィルムの除去、低減および予防に使用するための製剤パックであって、少なくとも1つのコンパートメントが、1以上の本発明の融合タンパク質および/または本発明の融合タンパク質もしくは本発明の組成物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって形質転換された1以上の宿主を含む前記製剤パックに関する。
他の側面において、本発明は、細菌性バイオフィルムの除去、低減および予防に使用するための医薬組成物の製造プロセスであって、1以上の本発明の融合タンパク質および/または本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって形質転換された1以上の宿主と、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤または担体とを混合することを含む前記プロセスに関する。
よりさらなる側面において、本発明の組成物は、細菌性バイオフィルムの除去、低減および予防に使用するための化粧品組成物である。いくつかの細菌種は、皮膚などの患者の身体の環境露出面に刺激を引き起こすことができる。このような刺激を防ぐために、または前記病原菌の軽症の症状発現を除去するために、既存のまたは新たに定着した病原性グラム陰性菌および/またはグラム陽性菌を分解するのに十分な量の本発明の融合タンパク質を含む特別な化粧品を用いることができる。
他の側面において、本発明は、医薬、食品もしくは飼料または環境診断法における診断手段、具体的には、特に細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌および/またはグラム陽性菌によって引き起こされる細菌感染症の診断法のための診断手段として使用するための本発明の融合タンパク質に関する。この点において、本発明の融合タンパク質は、細菌性バイオフィルムと関連する病原菌、特にグラム陰性菌および/またはグラム陽性病原菌を特異的に分解するツールとして用いることができる。本発明の融合タンパク質による細菌細胞の分解は、トリトンX-100のような界面活性剤または、ポリミキシンBのような細菌細胞エンベロープを弱める他の添加剤の添加によって補助することができる。特異的細胞分解は、PCR、核酸ハイブリダイゼーションもしくはNASBA(核酸配列ベース増幅)などの核酸に基づいた方法、IMS、免疫蛍光法もしくはELISA技術などの免疫学的方法または、異なる細菌群もしくは種に特異的なタンパク質(例えば腸内細菌にはβ-ガラクトシダーゼ、コアグラーゼ陽性株にはコアグラーゼ)を用いる酵素アッセイなどの細菌細胞の細胞含量に依存する他の方法を用いる、その後の細菌の特異的検出のための最初のステップとして必要である。
他の側面において、本発明は、食品、食品加工装置、食品加工工場、棚および食品保管領域などの食品と接触する面の、ならびに、病原性細菌、通性病原性細菌または他の望ましくない細菌が食材、医療機器ならびに病院および手術室におけるすべての種類の表面にはびこる恐れがある場合のすべての他の状況における、細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌および/またはグラム陽性菌汚染の除去、低減および/または予防のための本発明の融合タンパク質の使用に関する。
特に、本発明の融合タンパク質は、消毒剤として細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法に予防的に用いることができる。前記消毒剤は、手術の前後、または例えば透析中に用いることができる。さらに、未熟児および免疫不全者、または人工装具が必要な被験者は、本発明の融合タンパク質で治療することができる。前記治療は、予防的に行うこともできるし、急性感染中に行うこともできる。同様な状況において、院内感染症、特にシュードモナス・エルギノーサ(FQRP)、アシネトバクター種および腸内細菌科、例えばE.コリ、サルモネラ、シゲラ、シトロバクター、エドワージエラ、エンテロバクター、ハフニア、クレブシエラ、モルガネラ、プロテウス、プロビデンシア、セラチアおよびエルシニア種などの抗生物質耐性株;メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカリス、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・ニューモニエ、プロピオニバクテリウム・アクネス、多剤耐性マイコバクテリウム・ツベルクローシスによる院内感染症は、本発明の融合タンパク質によって予防的に治療することもできるし、急性期に治療することもできる。従って、本発明の融合タンパク質は、細菌性バイオフィルムを除去、低減および予防するための消毒薬として、消毒液中に界面活性剤、テンシド(tensid)、溶媒、抗生物質、ランチビオティックスまたはバクテリオシンなどの他の有用な成分と組み合わせて用いることもできる。
病院、口腔外科、獣医、台所または浴室などにおける消毒薬として、細菌性バイオフィルムを除去、低減または予防するための本発明の融合タンパク質の使用のために、融合タンパク質を、流体、粉末、ゲルなどの形態の組成物として、またはウェットティッシュもしくは消毒シート製品の成分として調製することができる。前記組成物は、さらに、そのそれぞれの使用および形態に適した担体、添加剤、希釈剤および/または賦形剤を含むこともできるし、融合タンパク質の抗菌活性を増強するEDTAまたは薬剤などの抗菌活性を助ける薬剤もまた含むこともできる。融合タンパク質はまた、アルコール、アルデヒド、酸化剤、フェノール、第四級アンモニウム化合物または紫外光などの通常の消毒剤と共に用いることもできる。表面、物体および/または装置などを消毒するために、前記表面、物体および/または装置に融合タンパク質を塗布することができる。例えば、布またはぼろきれなどの任意の手段を用いて消毒成分で濡らすことによって、あるいはスプレー、注入によって塗布することができる。十分な抗菌活性を得るために、それぞれの塗布および”反応時間“に応じて、種々の濃度で融合タンパク質を用いることができる。
他の側面において、本発明は、食品添加物としての本発明の融合タンパク質の使用に関する。
本発明のさらなる適用の範囲は、下記の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、この詳細な説明から、本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は当業者に明らかになると考えられることから、例示としてのみ提供されることを理解すべきである。前述の一般的な記載および以下の詳細な説明は、共にただ例示および説明のためのものであり、特許請求される本発明を限定するものではないことを理解すべきである。
以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものと考えてはならない。特記しない限り、例えば、Sambrock et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York に記載されているような分子生物学の標準法を用いた。
［実施例１］
修飾phiKZgp144およびELgpgp188エンドリシンバリアントのクローニング、発現および精製
配列番号1に示したphiKZgp144および配列番号2に示したELgp188は、N末端ペプチドグリカン結合ドメインおよびC末端触媒ドメインを有するシュードモナス・エルギノーサファージφKZおよびEL由来のモジュラーエンドリシンである(Briersら、2007)。
phiKZgp144およびELgp188のオープンリーディングフレーム(ORF)のPCR増幅のために、標準5'プライマー(phiKZgp144のために5’ATGAAAGTATTACGCAAA3’(配列番号83);ELgp188のために5’ATGAACTTCCGGACGAAG3’(配列番号65))ならびに配列番号81の82の標準3'プライマー(phiKZgp144のためにTTTTCTATGTGCTGCAAC(配列番号81);ELgp188のためにATACGAAAT AACGTGACGA(配列番号82))を用いた。phiKZgp144またはELgp188をコードするオープンリーディングフレームの5’末端を、正に荷電した9つの残基(Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys:配列番号11)をコードする遺伝子フラグメントで伸長するために、伸長した5'プライマー(phiKZgp144のために5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAA CGCAAAAAAGTATTACGCAAAG3’(配列番号79);ELgp188のために5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAA CGCAAAAACTTCCGGACGAAG3’(配列番号80))ならびに配列番号81および82の標準3'プライマーを用いるテールPCRを利用した。製造業者のプロトコルに従って、PCR産物をpEXP5CT/TOPO(登録商標)発現ベクター(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州、米国)にクローニングした。tRNAの枯渇を避け、フレームシフトのリスク(リジンのために利用可能なトリプレットはAAAおよびAAGの2つのみであり、長いA-ストレッチを生じる)を抑えるために、リジントリプレットに加えてアルギニントリプレットを組み込んだ。設計されたBamHI制限部位への追加のポリカチオン性カセットの挿入により、余分のカチオン性残基でテールが長くなる。この挿入により、各連結部位にアルギニンおよびセリンのトリプレットが生じる(図1)。最大4つまでのポリカチオン性ペプチドをphiKZgp144およびELgp188の両方に融合させ、(POLY)n-gp144または(POLY)n-gp188(n=1、2、3、4)と呼んだ。それぞれは、N末端に9、19、29および39の正に荷電したアミノ酸残基を含む。かくして、E.コリBL21(DE3)pLysS細胞内で以下の構築物を発現させた(37℃で対数的に増殖している細胞、1mM IPTGを用いて誘導、37℃で4時間発現):
修飾エンドリシンバリアントPOLY-gp144(配列番号35)、(POLY)2-gp144(配列番号36)、POLY-gp188(配列番号39)および(POLY)2-gp188(配列番号40)をさらなる研究に用いた。C末端6xHisタグを用いるNi2+アフィニティークロマトグラフィーによって前記タンパク質を精製した(1ml His-トラップNi-NTAカラムを用いるAkta Fast Protein Liquid Chromatography)。E.コリ発現培養物1リットル当たりの全収量を、タンパク質濃度の分光光度測定および精製原液の全量によって測定した。高純度を確実にするために、gpl44誘導体(50mMイミダゾール)と比較してよりストリンジェントな条件下(65mMイミダゾール)でgp188誘導体の精製を行った。E.コリ発現培養物1リットル当たりの全収量を表5に示す。
表5-E.coli発現培養物1リットル当たりのエンドリシン誘導体の組換え体精製収量
精製原液は〜90%の純度であった。POLY-誘導体の精製溶液の質量スペクトル分析により、微量のE.コリ50Sリボソームサブユニットタンパク質L2および16S rRNAウリジン-516シュードウリジル酸合成酵素の存在が明らかとなった。すべてのphiKZgp144誘導体は多量体形成を示したが、これはβ-メルカプトエタノールの添加によって単量体に変換することができた。このことは、分子間ジスルフィド結合が多量体化を引き起こすことを示している。
［実施例２］
修飾phiKZgp144およびELgp188バリアントの抗菌活性
対数的に増殖している(〜106/ml)P.エルギノーサPAO1p細胞(Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202)を100倍希釈し(最終密度は〜106/ml)、緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5Mイミダゾール)中、100μg/mlの最終濃度で、各10μgの未透析タンパク質(未修飾エンドリシン、phiKZgp144(配列番号1)およびELpg188(配列番号2)ならびに修飾エンドリシンバリアント、POLY-gp144(配列番号35)、(POLY)2-gp144(配列番号36)、POLY-gp188(配列番号39)および(POLY)2-gp188(配列番号40)と共に室温でインキュベートした。1時間後、細胞浮遊液をPBS緩衝液で希釈し(10e-5、10e-4および10e-3)、プレーティングした(標準LB培地、終夜37℃でインキュベートした)。さらに、PBS緩衝液中に細胞を含む陰性対照をプレーティングした。終夜インキュベーション後に、残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、相対的不活化(%)(=100-(Ni/No)*l00:N0=未処理細胞数;Ni=処理細胞数)として対数単位(=log10N0/Ni)で抗菌活性を算出した(表6)。すべての試料を6連で行った。平均値/標準偏差を示す。スチューデントt検定を用いて統計解析を行った。
未修飾エンドリシン、phiKZgp144およびELgp188は、陰性対照と比較して細胞数を有意には減少させない。この観察は、グラム陰性菌の細胞壁を分解するエンドリシンのバリアとしての外膜の有効性を明らかにしている。対照的に、表6に示すように、修飾エンドリシン、POLY-gp144、(POLY)2-gp144、POLY-gp188および(POLY)2-gp188とのインキュベーションは、細菌細胞数(POLY-gp144では99.85±0.09%、POLY-gp188では98.0±0.2%)の有意な減少(α=0.05)を引き起こす。ポリカチオン性ペプチドの長さの増加は、特にphiKZgp144の場合において、さらに抗菌活性を増強させる傾向がある((POLY)2-gp144では、1時間以内に99.98±0.02%または3.7±0.3対数単位までの減少が達成される)。さらに、phiKZgp144の修飾エンドリシンは、ELgp188の修飾エンドリシンよりも高い抗菌活性を有することが実験により明らかとなった。
表6-未修飾ならびに修飾phiKZgp144およびELgp188エンドリシンバリアントの抗菌効果
従って、本実施例により、phiKZgp144(配列番号1)のN末端に9つのカチオン性残基の短いペプチドの添加によって、すでに、1時間以内に細胞のほぼ99.9%を殺すのに十分であることが明らかとなった。ポリ-L-リジンは固有の抗菌活性を有しているが、これまでは、この特性は少なくとも20残基のポリマーでやっともたらされていたに過ぎない(VaaraおよびVaara、1983a、1983b)。しかしながら、ポリカチオン性ペプチドとエンドリシンの協調作用は細胞を殺す。
さらなる実験において、修飾エンドリシンPOLY-gp144を、50mM KH2P04/K2HP04(pH7)に対して透析し、前述の未透析タンパク質溶液の代わりに用いた。それによって、不活化レベルは、さらに、2.9±0.3対数単位から3.9±0.2対数単位まで上昇した。
［実施例３］
非毒性の組換え産生のための宿主としてのピキア・パストリスにおける修飾phiKZgp144およびELgp188バリアントの発現
POLY-gp144(配列番号35)をコードするオープンリーディングフレームをpPICZαAシャトルベクター(Invitrogen社)にクローニングし、続いてこれを相同組換えによってP.パストリス(P.pastoris)のゲノムに組み込んだ(製造業者の指示に従って;P.パストリスX33細胞、Invitrogen社)。BMMY培地中でメタノール(1%)によって遺伝子発現を誘導し、1、3および4日後に酵素活性の存在に関して上清を分析した。そのために、P.パストリス発現培養物30μl量の上清を、クロロホルムで透過化させたP.エルギノーサPAO1p細胞(Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202) 270μlに、1、3および4日後に加えた(緩衝液条件:KH2PO4/K2HP04 I=120mM pH6.2)。続いて、分光光度学的に吸光度を記録した(図2)。吸光度の低下は、P.パストリスによる溶菌酵素の分泌を示す。陰性対照として、発現プラスミドを含まないP.パストリスX33を含めた。このように、上清試料の添加による基質の溶解は、P.パストリスによるPOLY-gp144(配列番号35)の組換え産生および分泌の成功の尺度である。1日後、わずかな酵素活性を検出できた。最大活性は3日後に観察された。なぜなら、4日後に上清における活性の有意な増加が観察されなかったからである。P.パストリスの細胞密度に対する毒作用は認められなかった。
P.パストリスによる発現中、ベクターのα分泌シグナルは、周囲の媒質への組換えタンパク質の分泌を引き起こすが、限られた数の他のタンパク質が分泌されるだけなので、これにより精製が容易になる。オープンリーディングフレームの5’末端におけるBamHI制限部位により、追加のポリカチオン性ペプチドをコードするさらなるカセットの付加が可能になる。
［実施例４］
異なるポリカチオン性ペプチドを有するさらなる修飾エンドリシンphiKZgp144バリアント ポリカチオン性ペプチドの潜在能を試験および比較するために、タンパク質のN末端に異なるポリカチオン性ペプチドを有するphiKZgp144および他のエンドリシンのバリアントをコードする遺伝子を合成した。ペプチドの変化は、リンカー配列の長さ、組成および挿入に関する。一方では、N末端KRKモチーフ複数体を有するさらなるポリカチオン性ペプチドを産生させた。他方では、アルギニン(R)またはリジン(K)のみからなるポリカチオン性ペプチドを産生させた。さらに、長いポリカチオン性ペプチドの翻訳を促進するために、リンカー配列を含むポリカチオン性ペプチドを産生させた。
異なる産物をpET32b発現ベクター(Novagen社、ダルムシュタット、ドイツ)にクローニングした。E.コリ宿主に対するポリカチオン性ペプチドの潜在的毒性を抑えるために、pET32bを用いた。ベクターにコードされる融合タンパク質(チオレドキシン)は、ポリカチオン性ペプチドをマスクし、精製プロセス中に除去されることができる。
従って、E.コリBL21(DE3)細胞において、37℃でOD600nmの吸光度が0.6に達するまで、以下の修飾エンドリシンバリアントを発現させた。次いで、1mM IPTG(最終濃度)を用いてタンパク質発現を誘導し、発現を4時間行った。次いで、6000gで20分間の遠心分離によってE.コリ細胞を採取し、S-tag精製キット(Novagen社、ダルムシュタット、ドイツ)に従って細胞破壊およびタンパク質精製を行った。
すべてのタンパク質は、S-TAG1(登録商標)rEK精製キット(Novagen社、ダルムシュタット、ドイツ)を用いて精製した。pET32bベクターを用いて発現されたタンパク質は宿主に対して毒性ではなく、産生タンパク質が高収量で得られた。精製原液は高純度を示した。
対数増殖期の (〜106/ml) P. エルギノーサ PAO1p 細胞(Burn wound isolate, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202) を100倍希釈し(最終密度は〜106/ml)、緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5Mイミダゾール)中、100μg/mlの最終濃度で上記のように各10μgの未透析タンパク質と共に室温でインキュベートした。1時間後、細胞浮遊液を1:100に希釈し、LB上にプレーティングした。さらに、緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5Mイミダゾール)を用いて陰性対照をプレーティングした。37℃での終夜インキュベーション後に残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、相対的不活化(%)(=100-(Ni/No)*l00:N0=未処理細胞数;Ni=処理細胞数)として抗菌活性を算出した(表7)。すべての試料を少なくとも4連で行った。
表7-未修飾ならびに修飾phiKZgp144およびELgp188エンドリシンの抗菌効果
未修飾phiKZgp144は、陰性対照と比較して細胞数を有意には減少させない。それ以上に、N末端KRKモチーフ複数体のポリカチオン性ペプチドを有する修飾phiKZgp144バリアントは、抗菌効果を著しく増強する。しかしながら、リジンまたはアルギニンのホモマーペプチドを有するバリアントもまた、測定されるように、未修飾phiKZgp144と比較して細胞の有意な減少を示す。さらに、38アミノ酸残基のポリカチオン性ペプチドを有し、リンカー配列を含むバリアントもまた、抗菌効果を著しく増強する。
［実施例５］
サルモネラ・ティフィムリウムファージPSP3の修飾エンドリシンバリアント
配列番号8のPSP3gp10は、サルモネラ・ティフィムリウムファージPSP3に由来する165アミノ酸残基の球状エンドリシンであり、λ様ムラミダーゼ触媒ドメインを有する。BLASTpおよびPfam分析によって予測されるように、PSP3gp10エンドリシンは、アミノ酸残基約34〜アミノ酸残基約152の範囲にその触媒ドメインを含む。
鋳型としてファージPSP3の精製ゲノムDNAを用い、以下のPCRパラメータを用いて、ホットスタートTaqポリメラーゼPCR反応(Qiagen社、ドイツ)でPSP3gp10のオープンリーディングフレーム(ORF)を増幅した。
前記PCRのために、標準5'プライマー(5’ATGGGATCCCCGGTCATTAATACTCACCAG3’(配列番号50))および標準3'プライマー(5’TGCCATCACCCCGCCAGCCGTG3’(配列番号51))を用いた。ポリカチオン性9マーペプチドLys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys(配列番号11)をコードする遺伝子フラグメントで、PSP3gp10をコードするORFの5’末端を伸長するために、伸長した5'プライマー(5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAA GAAACGCAAACCGGTCATTAATACTCACCAG3’(配列番号52))および配列番号51の標準3'プライマーを用いるテールPCR(同じパラメータを用いるホットスタートTaqポリメラーゼPCR)を利用した。元の未修飾PSP3gp10 PCRフラグメントおよびPK伸長フラグメントの両方を、製造業者のTAクローニングプロトコルに従って、pEXP5CT/TOPO(登録商標)発現ベクター(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州、米国)に連結した。
対数的に増殖しているE.コリBL21(λDE3)pLysS細胞(Invitrogen社)において、1mM IPTG(イソプロピルチオガラクトシド)を用いての誘導後に、37℃で4時間、配列番号8のPSP3gp10および配列番号53のPKPSP3gp10の組換え発現を行う。pEXP5CT/TOPO(登録商標)発現ベクターによってコードされるC末端6xHisタグを用いて、Ni2+アフィニティークロマトグラフィー(Akta FPLC、GE Healthcare社)によって両方のタンパク質を精製した。その後の4段階において、すべて室温で、Ni2+アフィニティークロマトグラフィーを行う:
1.流速0.5ml/分での、洗浄緩衝液(60mMイミダゾール、0.5mM NaClおよび20mM NaH2P04-NaOH pH7.4)10カラム体積を用いるHistrap HP 1mlカラム(GE HEALTHCARE社)の平衡化。
2.流速0.5ml/分での、Histrap HP 1mlカラムへの全溶解物(所望のエンドリシンを有する)のローディング。
3.流速1ml/分での、洗浄緩衝液15カラム体積を用いるカラムの洗浄。
4.流速0.5ml/分での、溶出緩衝液(500mMイミダゾール、5mM NaClおよび20mM NaH2P04-NaOH pH7.4)10カラム体積を用いる、カラムからの結合エンドリシンの溶離。
E.コリ発現培養物1リットル当たりの、両方の精製組換えタンパク質の全収量を表8に示す。波長280nmにおける精製原液のタンパク質濃度および全量の分光光度測定によって数値を測定した。溶出緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;500mMイミダゾール)中の、それぞれPSP3gp10およびPKPSP3gp10からなる精製原液は、SDS-PAGEゲルにおいて視覚的に測定するとき、少なくとも純度90%であった。
表8-E.coli発現培養物1リットル当たりの精製組換えPSP3gp10エンドリシンおよびその修飾バリアントPKPSP3gp10の収量
配列番号53のPKPSP3gp10エンドリシンの抗グラム陰性菌スペクトルを測定するために、臨床分離株P.エルギノーサ株PAO1pおよびBr667、エシェリキア・コリWK6ならびにサルモネラ・ティフィムリウムに対して1.315μM PKPSP3gp10エンドリシンおよび0,5mM EDTAの組み合わせを試験した(表9を参照のこと)。対数的に増殖している細菌細胞(0.6のOD600nm)を100倍希釈して最終密度約106/mlにし、各株を、未修飾エンドリシンPSP2gp10(配列番号8)および修飾エンドリシンPKPSP3gp10(配列番号53)と共に、それぞれ0.5mM EDTAの有り無しの組み合わせで、30分間室温で振盪なしでインキュベートした。インキュベーションのために、各エンドリシンを緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5Mイミダゾール)中で用い、エンドリシン最終濃度1.315μMでインキュベーションを行った。対照として、0.5mM EDTA(上記で概要を述べたものと同じ緩衝液で)を含むがエンドリシンを含まない各株もまた30分間インキュベートした。
表9-用いられたグラム陰性株のリスト
*Pirnay JP et al. (2003). Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa colonization in a burn unit: persistence of a multidrug-resistant clone and a silver sulfadiazine-resistant clone. J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202.
インキュベーション後、細胞浮遊液を3回希釈し(それぞれ105-104-103細胞/ml)、各希釈液100μlをLB培地上にプレーティングした。37℃での終夜インキュベーション後に残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、対数単位での相対的不活化(=log10N0/Ni:N0=未処理細胞数;Ni=処理細胞数)として抗菌活性を算出した(表10)。
表10-異なる対数的に増殖しているグラム陰性種に対する、EDTA-Na2の有無による未修飾エンドリシン(PSP3gp10)およびその修飾エンドリシンバリアント(PKPSP3gp10)の抗菌活性
すべての試料を3連で行った。平均値+/-標準偏差を示す。観察される最大減少は、10細胞/mlの検出レベルおよび最初の細胞密度に依存する。PAO1pに関しては、未修飾PSP3gp10エンドリシンおよびその修飾バリアントPKPSP3gp10の両方に対してEDTAは相乗的に作用する。
［実施例６］
エシェリキア・コリファージP2の修飾エンドリシンバリアント
配列番号9のP2gp09は、エシェリキア・コリファージP2に由来する165アミノ酸残基の球状エンドリシンであり、λ様ムラミダーゼ触媒ドメインを有する。BLASTpおよびPfam分析によって予測されるように、P2gp09エンドリシンは、アミノ酸残基約34〜アミノ酸残基約152の範囲にその触媒ドメインを含む。
鋳型としてファージP2の精製ゲノムDNAを用い、以下のPCRパラメータを用いて、Pfuポリメラーゼ(Fermentas社)を用いる標準PCR反応でP2gp09のオープンリーディングフレーム(ORF)を増幅した。
前記PCRのために、標準5'プライマー(5’ATGGGATCCCCGGTAATTAACACGCATC3’(配列番号54))および標準3'プライマー(5’AGCCGGTACGCCGCCAGCGGTACGC3’(配列番号55))を用いた。ポリカチオン性9マーペプチドLys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys(配列番号11)をコードする遺伝子フラグメントで、P2gp09をコードするORFの5’末端を伸長するために、伸長した5'プライマー(5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGC AAACCGGTAATTAACACGCATC3’(配列番号56)および配列番号55の標準3'プライマーを用いるテールPCR(上記標準PCRと同じパラメータを用いて)を利用した。元の未修飾P2gp09 PCRフラグメントおよびPK伸長フラグメントの両方を、製造業者のTAクローニングプロトコルに従って、pEXP5CT/TOPO(登録商標)発現ベクター(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州、米国)に連結した。
対数的に増殖しているE.コリBL21(λDE3)pLysS細胞(Invitrogen社)において、1mM IPTG(イソプロピルチオガラクトシド)を用いての誘導後に、37℃で4時間、配列番号9のP2gp09および配列番号57のPKP2gp09の組換え発現を行う。pEXP5CT/TOPO(登録商標)発現ベクターによってコードされるC末端6xHisタグを用いて、Ni2+アフィニティークロマトグラフィー(Akta FPLC、GE Healthcare社)によって両方のタンパク質を精製した。その後の4段階において、すべて室温で、Ni2+アフィニティークロマトグラフィーを行う:
1.流速0.5ml/分での、洗浄緩衝液(60mMイミダゾール、0.5mM NaClおよび20mM NaH2P04-NaOH pH7.4)10カラム体積を用いるHistrap HP 1mlカラム(GE HEALTHCARE社)の平衡化。
2.流速0.5ml/分での、Histrap HP 1mlカラムへの全溶解物(所望のエンドリシンを有する)のローディング。
3.流速1ml/分での、洗浄緩衝液15カラム体積を用いるカラムの洗浄。
4.流速0.5ml/分での、溶出緩衝液(500mMイミダゾール、5mM NaClおよび20mM NaH2P04-NaOH pH7.4)10カラム体積を用いる、カラムからの結合エンドリシンの溶離。
E.コリ発現培養物1リットル当たりの、両方の精製組換えタンパク質の全収量を表11に示す。波長280nmにおける精製原液のタンパク質濃度および全量の分光光度測定によって数値を測定した。溶出緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;500mMイミダゾール)中の、それぞれP2gp09およびPKP2gp09からなる精製原液は、SDS-PAGEゲルにおいて視覚的に測定するとき、少なくとも純度95%であった。
表11-E.coli発現培養物1リットル当たりの精製組換えP2gp09エンドリシンおよびそのPK-修飾誘導体PKP2gp09の収量
配列番号57のPK2gp09エンドリシンの抗グラム陰性菌スペクトルを測定するために、臨床分離株P.エルギノーサ株PAO1pおよびBr667、バークホルデリア・シュードマレイ、シュードモナス・プチダG1ならびにエシェリキア・コリWK6に対して、1.315μM PK2gp09エンドリシンおよび0,5mM EDTAの組み合わせを試験した(表13を参照のこと)。対数的に増殖している細菌細胞(0.6のOD600nm)を100倍希釈して最終密度約106/mlにし、各株を、未修飾エンドリシンP2gp09(配列番号9)および修飾エンドリシンPKP2gp09(配列番号57)と共に、それぞれ0.5mM EDTAの有り無しの組み合わせで、30分間室温で振盪なしでインキュベートした。インキュベーションのために、各エンドリシンを緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5Mイミダゾール)中で用い、エンドリシン最終濃度1.315μMでインキュベーションを行った。対照として、0.5mM EDTA(上記で概要を述べたものと同じ緩衝液で)を含むがエンドリシンを含まない各株もまた30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞浮遊液を3回希釈し(それぞれ105-104-103細胞/ml)、各希釈液100μlをLB培地上にプレーティングした。37℃での終夜インキュベーション後に残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、対数単位での相対的不活化(=log10N0/Ni:N0=未処理細胞数;Ni=処理細胞数、共にインキュベーション後に計測した)として抗菌活性を算出した(表12)。
表12-対数的に増殖している異なるグラム陰性種に対する、EDTA-Na2の有無による未修飾エンドリシン(P2gp09)およびその修飾エンドリシンバリアント(P2gp09)の抗菌活性
すべての試料を3連で行った。平均値+/-標準偏差を示す。観察される最大減少は、10細胞/mlの検出レベルおよび最初の細胞密度に依存する。
表13-用いられたグラム陰性株のリスト
*Pirnay JP et al., (2003). Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa colonization in a burn unit: persistence of a multidrug-resistant clone and a silver sulfadiazine-resistant clone. J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202.
［実施例７］
シュードモナス・プチダファージOBPの修飾エンドリシンバリアント
配列番号7のOBPgpLYSは、推定上のN末端ペプチドグリカン結合ドメインおよびC末端触媒キチナーゼドメインを有するシュードモナス・プチダファージOBPに由来する328アミノ酸残基のモジュラーエンドリシンである。BLASTpおよびPfam分析によって予測されるように、OBPgpLYSエンドリシンは、アミノ酸残基約126〜アミノ酸残基約292の範囲にその触媒ドメインを含み、アミノ酸残基約7〜96の範囲にN末端ペプチドグリカン結合ドメインを含む。
鋳型としてファージOBPの精製ゲノムDNAを用い、以下のPCRパラメータを用いて、Pfuポリメラーゼ(Fermentas社、オンタリオ、カナダ)を用いる標準PCR反応でOBPgpLYSのオープンリーディングフレーム(ORF)を増幅した:
従って、標準5'プライマー(5’ATGAAAAATAGCGAGAAGAAT3’(配列番号58))および標準3'プライマー(5’AACTATTCCGAGTGCTTTCTTTGT3’(配列番号59))を用いた。ポリカチオン性9マーペプチドLys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-(配列番号11)をコードする遺伝子フラグメントで、OBPgpLYSをコードするORFの5’末端を伸長するために、伸長した5'プライマー(5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAAAAATAGCGAG AAGAAT3’(配列番号60))および配列番号59の標準3'プライマーを用いるテールPCR(上記標準PCRと同じパラメータを用いて)を利用した。元の未修飾OBPgpLYS PCRフラグメントおよび伸長したフラグメントの両方を、製造業者のTAクローニングプロトコルに従って、pEXP5CT/TOPO(登録商標)発現ベクター(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州、米国)に連結した。
対数的に増殖しているE.コリBL21(λDE3)pLysS細胞(Invitrogen社)において、1mM IPTG(イソプロピルチオガラクトシド)を用いての誘導後に、37℃で4時間、配列番号7のOBPgpLYSおよび配列番号61のPKOBPgpLYSの組換え発現を行う。pEXP5CT/TOPO(登録商標)発現ベクターによってコードされるC末端6xHisタグを用いて、Ni2+アフィニティークロマトグラフィー(Akta FPLC、GE Healthcare社)によって両方のタンパク質を精製した。その後の4段階において、すべて室温で、Ni2+アフィニティークロマトグラフィーを行う:
1.流速0.5ml/分での、洗浄緩衝液(60mMイミダゾール、0.5mM NaClおよび20mM NaH2P04-NaOH pH7.4)10カラム体積を用いるHistrap HP 1mlカラム(GE HEALTHCARE社)の平衡化。
2.流速0.5ml/分での、Histrap HP 1mlカラムへの全溶解物(所望のエンドリシンを有する)のローディング。
3.流速1ml/分での、洗浄緩衝液15カラム体積を用いるカラムの洗浄。
4.流速0.5ml/分での、溶出緩衝液(500mMイミダゾール、5mM NaClおよび20mM NaH2P04-NaOH pH7.4)10カラム体積を用いる、カラムからの結合エンドリシンの溶離。
E.コリ発現培養物1リットル当たりの、両方の精製組換えタンパク質の全収量を表14に示す。波長280nmにおける精製原液のタンパク質濃度および全量の分光光度測定によって数値を測定した。溶出緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;500mMイミダゾール)中の、それぞれOBPgpLYSおよびPKOBPgpLYSからなる精製原液は、SDS-PAGEゲルにおいて視覚的に測定するとき、少なくとも純度90%であった。
表14-E.coli発現培養物1リットル当たりの精製組換えOBPgpLYSエンドリシンおよびそのPK-修飾誘導体PKOBPgpLYSの収量
配列番号61のPKOBPgpLYSエンドリシンの抗グラム陰性菌スペクトルを測定するために、臨床多剤耐性株P.エルギノーサBr667、シュードモナス・プチダG1(ファージOBPの宿主)および一連の他のグラム陰性病原体(エシェリキア・コリWK6、サルモネラ・ティフィムリウムLT2およびバークホルデリア・シュードマレイ)に対して1.315μM OBPgpLYSエンドリシンおよび0,5mM EDTAの組み合わせを試験した(表16を参照のこと)。対数的に増殖している細菌細胞(0.6のOD600nm)を100倍希釈して最終密度約106/mlにし、各株を、未修飾エンドリシンOBPgpLYS(配列番号7)および修飾エンドリシンPKOBPgpLYS(配列番号61)と共に、それぞれ0.5mM EDTAの有り無しの組み合わせで、30分間室温で振盪なしでインキュベートした。インキュベーションのために、各エンドリシンを緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5Mイミダゾール)中で用い、エンドリシン最終濃度1.313μMでインキュベーションを行った。対照として、0.5mM EDTA(上記で概要を述べたものと同じ緩衝液で)を含むがエンドリシンを含まない各株もまた30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞浮遊液を3回希釈し(それぞれ105-104-103細胞/ml)、各希釈液100μlをLB培地上にプレーティングした。37℃での終夜インキュベーション後に残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、対数単位での相対的不活化(=log10N0/Ni:N0=未処理細胞数;Ni=処理細胞数、共にインキュベーション後に計測した)として抗菌活性を算出した(表15)。すべての試料を3連で行った。平均値+/-標準偏差を示す。観察される最大減少は、10細胞/mlの検出レベルおよび最初の細胞密度に依存する。
表15-対数的に増殖している異なるグラム陰性種に対する、EDTA-Na2の有無による未修飾エンドリシン(OBPgpLYS)およびその修飾エンドリシンバリアント(PKOBPgpLYS)の抗菌活性
表16-用いられたグラム陰性株のリスト
*Pirnay JP, De Vos D, Cochez C, Bilocq F, Pirson J, Struelens M, Duinslaeger L, Cornelis P, Zizi M, Vanderkelen A. (2003). Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa colonization in a burn unit: persistence of a multidrug-resistant clone and a silver sulfadiazine-resistant clone. J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202.
OBPgpLYS処理の全般的有効性は種に依存するが、表16の結果は、0,5mM EDTAの非存在下および存在下の両方において、試験したすべての細菌種に対して、未修飾OBPgpLYSと比較して、PKOBPgpLYSの追加効果を示す。シュードモナスおよびバークホルデリア種に関しては、PKOBPgpLYS活性に対するEDTAとの明確な相乗効果が観察される。
［実施例８］
OBPgpLYSおよびPKOBPgpLYSの抗菌活性に対する異なるEDTA濃度の効果
未修飾および修飾エンドリシンの抗菌活性に対するEDTAの影響を測定するために、異なる濃度のEDTAおよびエンドリシンを用いて、シュードモナス・エルギノーサPAO1p細胞(Pirnay JP et al. J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202 (2003))に対して未修飾OBPgpLYSエンドリシン(配列番号7)およびPKOBPgpLYSエンドリシン(配列番号61)の抗菌活性を試験した。対数的に増殖している細菌細胞(0.6のOD600nm)を100倍希釈して最終密度約106/mlにし、未修飾エンドリシンOBPgpLYS(配列番号7)および修飾エンドリシンPKOBPgpLYS(配列番号61)と共に30分間室温で振盪なしでインキュベートした。インキュベーションのために、各エンドリシンを、緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5Mイミダゾール)中、エンドリシンの最終濃度0.013μM、0.131μMおよび1.315μMで用いた。それに関して、以下の異なるEDTA濃度:0mM、0.05mM、0.5mMおよび10mMを用いた。対照として、エンドリシンを加えないで、代わりに緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5Mイミダゾール)を加えた試料1つもまた30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞浮遊液を3回希釈し(それぞれ105-104-103細胞/ml)、各希釈液100μlをLB培地上にプレーティングした。37℃での終夜インキュベーション後に残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、対数単位での相対的不活化(=log10N0/Ni:N0=未処理細胞数;Ni=処理細胞数、共にインキュベーション後に計測した)として抗菌活性を算出した(表17)。すべての試料を3連で行った。平均値+/-標準偏差を示す。観察される最大減少(5.69対数単位)は、10細胞/mlの検出レベルおよび最初の細胞密度に依存する。“Δ”は、OBPgpLYSおよびPKOBPgpLYS試料それぞれの間の活性の差異を示す。
表17-対数的に増殖しているPseudomonas aeruginosa PAO1p細胞に対する、異なるEDTA濃度と組み合わせての、未修飾エンドリシン(OBPgpLYS)およびその修飾エンドリシンバリアント(PKOBPgpLYS)の抗菌活性
表17に示すように、未修飾エンドリシンOBPgpLYSは、陰性対照と比較して、1.315μMでは2.5対数単位を超えて、0.013μMでは+/-1対数単位で細胞数を有意に減少させる。修飾エンドリシンPKOBPgpLYSは、対数的に増殖しているPAO1p細胞に対して、さらなる0.5対数単位の減少をもたらす。PKOBPgpLYSと、0.5および10mM EDTAの濃度での外膜を透過化させるEDTA-Na2とを組み合わせることによって、観察される抗菌効果を5.69対数単位の減少(検出レベル以下)にまで増強することができる。未修飾OBPgpLYSとPK-修飾OBPgpLYSとの間の活性の差異は、添加するエンドリシン量を増加させることによって大きくなる(0.013〜1.315μMエンドリシン)。
［実施例９］
異なるグラム陰性菌に対する修飾phiKZgp144バリアントの抗菌活性
ポリカチオン性ペプチドphiKZgp144および他のエンドリシンのバリアントの潜在能を試験し、比較するために、タンパク質のN末端にポリカチオン性ペプチドを有するコード遺伝子を合成した。
pET32b発現ベクター(Novagen社、ダルムシュタット、ドイツ)に異なる産物をクローニングした。E.コリ宿主に対するポリカチオン性ペプチドに対する潜在的毒性を抑えるためにpET32bを用いた。ベクターにコードされる融合タンパク質(チオレドキシン)は、ポリカチオン性ペプチドをマスクし、精製プロセス中に除去することができる。
smi01(YP_001712536)およびKRK9_smi01(配列番号75)をコードする遺伝子を全合成し(Entelechon社、レーゲンスブルク、ドイツ)、pET32bにクローニングした。
従って、吸光度OD600nmが0.6に達するまで、37℃でE.コリBL21(DE3)細胞において、以下の修飾エンドリシンバリアントを発現させた:smi01(YP_001712536)、KRK9_smi01(配列番号75)、phiKZgp144(配列番号1)、pKKZ144pET32b(配列番号43)およびPOLYKZ144(配列番号35)。1mM IPTG(最終濃度)でタンパク質発現を誘導し、発現を4時間行った。次いで、6000g、20分間の遠心分離によってE.コリ細胞を採取し、S-TAG(登録商標)rEK精製キット(Novagen社、ダルムシュタット、ドイツ)を用いて細胞破壊およびタンパク質精製を行った。pET32bベクターを使用して発現されたタンパク質は宿主に対して毒性ではなく、高収量の産生タンパク質が得られた。精製原液は高純度を示した。
試験のために、かつ比較のための参照として、実施例1の記載に従ってphiKZgp144およびPOLYgp144を合成し、精製した。
P.エルギノーサPAO1p(熱傷創傷分離株、Queen Astrid病院、ブリュッセル; Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202)、アシネトバクター・バウマニー(DSMZ 30007)またはバークホルデリア・ソラナセラム(Prof. C. Michielsによって提供された分離株)の対数増殖期の(〜106/ml)増殖細胞を100倍希釈し(最終密度〜106/ml)、緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5Mイミダゾール)中100μg/mlの最終濃度で、上記の未透析タンパク質各10μgと共に室温でインキュベートした。1時間後、細胞浮遊液を1:100に希釈し、LB上にプレーティングした。さらに、緩衝液(20mM NaH2P04-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;0.5Mイミダゾール)を用いて陰性対照をプレーティングした。37℃での終夜インキュベーション後に残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、相対的不活化(%)(=100-(Ni/No)*l00:N0=未処理細胞数;Ni=処理細胞数)として抗菌活性を算出した(表18)。すべての試料を少なくとも4連で行った。
表18-異なる細菌種に対する異なる修飾エンドリシンバリアント(括弧内はNCBI番号)の抗菌効果
未修飾エンドリシン、phiKZgp144およびsmi01(YP_001712536)は、陰性対照と比較して有意に細胞数を減少させない。この観察は、さらに、グラム陰性菌の細胞壁を分解するエンドリシンのバリアとしての外膜の有効性を示している。対照的に、表18に示すように、修飾エンドリシンKRK9_smi01、pKKZ144pET32bおよびPOLY-gp144とのインキュベーションは、アシネトバクター・バウマニー(KRK_smi01に対して50%;pKKZ144pET32bに対して99.9%)、シュードモナス・エルギノーサ(pKKZ144pET32bに対して90〜99.9%)およびバークホルデリア・ソラナセラム(POLYKZ144に対して90〜99.9%)に対して細菌細胞数の有意な減少を引き起こす。
これらの実験は、他のエンドリシンに対するカチオン性/ポリカチオン性融合アプローチの適用性を明らかにしている。さらに、本実験は、修飾エンドリシンが種々の細菌に対して活性であることを明らかにした。
［実施例１０］
シュードモナス・エルギノーサバイオフィルムの低減
本実験において、シュードモナス・エルギノーサ2572株および2573株のバイオフィルムに対する修飾エンドリシンバリアントSMAP29-KZ144およびPK-OBPならびにエンドリシンOBPおよびKZ144ならびにペプチドPKの抗菌活性を試験した。
バイオフィルムの低減は、クリスタルバイオレットアッセイ(Peeters et al., J Microbiol Methods 72: 157-165 (2008))を用いて定量した。
バイオフィルム形成:
シュードモナス・エルギノーサ2572のムコイド株(患者分離株)、シュードモナス・エルギノーサ2573ならびに非ムコイドE.コリBL21(DE3)の終夜液体培養物をOD600=0.1まで希釈した。ポリスチレン96ウェルプレートに培養物100μl/ウェルで接種した。37℃でのインキュベーション4時間後、上清を捨て、付着細菌を生理食塩水(PS)100μlを用いて洗浄した。接種したウェルに液体LB培地100μlを充填し、さらに24時間インキュベートした。上清を捨てた後、発達したバイオフィルムをPS100μlで再度洗浄した。
バイオフィルム処理:
50μg/ウェルのPKKZ144または20u/ウェルのアルギン酸リアーゼまたは50μg/ウェルのSMAP29-KZ144およびKZ144または25μg/ウェルのPK-OBPおよびOBPまたは1,25μgのPK-ペプチド(すべて500mM NaClを含む緩衝液中)1部に対して2xLB(NaClなし)培地1部で希釈して用いてバイオフィルムを処理し、12時間インキュベートした。未処理のシリーズを陰性対照として行った(タンパク質緩衝液1部に対して2xLB(NaClなし)1部)。上清を捨てた後、発達したバイオフィルムをPS100μlで再度洗浄した。
バイオフィルム定量:
洗浄したバイオフィルムをメタノール300μlで固定し(99%;15分)、風乾した。0.3%クリスタルバイオレット100μlを用いて染色を行った。20分後、ウェルを水道水ですすぎ、33%酢酸300μlを用いて、バイオフィルムの細胞外マトリックスから結合クリスタルバイオレットを溶解した。20分後、1:10希釈を行って、吸収(590nm)を測定した。
アルギン酸リアーゼで処理した接種物または未処理の接種物と比較して、PKKZ144を用いた場合にバイオフィルムの著しい低減が検出されたことが統計解析により示された。PKKZ144を用いた場合、非ムコイドE.コリ実験室株のレベルまでバイオフィルムを低減させることが可能であった。
修飾エンドリシンバリアントSMAP29-KZ144およびPK-OBPもまた、エンドリシンOBPおよびKZ144と比較して、シュードモナス・エルギノーサバイオフィルムの著しい低減を示した。これに反して、PK-ペプチドは、シュードモナス・エルギノーサバイオフィルムの形成を促進すると思われる。
［実施例１１］
アシネトバクター・バウマニーバイオフィルムの低減
本実験において、アシネトバクター・バウマニーDSMZ30007株のバイオフィルムに対して、修飾エンドリシンバリアントPK-OBP、エンドリシンOBPおよびペプチドPKの抗菌活性を試験した。
クリスタルバイオレットアッセイ(Peeters et al., J Microbiol Methods 72: 157-165 (2008)) を用いてバイオフィルムの低減を定量した。
実施例10の記載に従って、バイオフィルムの形成、処理および定量を行った。
修飾エンドリシンバリアントPK-OBPは、エンドリシンOBPと比較して、アシネトバクター・バウマニーバイオフィルムの著しい低減を示した。これに反して、PK-ペプチドは、アシネトバクター・バウマニーバイオフィルムの形成を促進すると思われる。
［実施例１２］
スタフィロコッカス・アウレウスバイオフィルムの低減
本実験において、スタフィロコッカス・アウレウスKS13株のバイオフィルムに対するPly2638-PKおよびPK-リゾスタフィンの融合タンパク質、酵素リゾスタフィンおよびPly2638ならびにペプチドPKの抗菌活性を試験した。
クリスタルバイオレットアッセイ(Peeters et al., J Microbiol Methods 72: 157-165 (2008)) を用いてバイオフィルムの低減を定量した。
実施例10の記載に従って、バイオフィルムの形成、処理および定量を行った。ただし、バイオフィルムの処理には、25μg/ウェルのPly2638A-PKおよびPly2638Aまたは18μg/ウェルのPK-リゾスタフィンおよびリゾスタフィンまたは1,25μgのPK-ペプチドを用いた。
融合タンパク質PK-リゾスタフィンおよびPK-Ply2638は、酵素リゾスタフィンおよびPly2638と比較して、スタフィロコッカス・アウレウスバイオフィルムの著しい低減を示した。これに反して、PK-ペプチドは、スタフィロコッカス・アウレウスバイオフィルムの形成を促進すると思われる。
［実施例１３］
リステリア・モノサイトゲネスバイオフィルムの低減
本実験において、リステリア・モノサイトゲネスScottA株のバイオフィルムに対して、修飾エンドリシンバリアントペンタペプチド-Ply511の抗菌活性を試験した。
クリスタルバイオレットアッセイ(Peeters et al., J Microbiol Methods 72: 157-165 (2008)) を用いてバイオフィルムの低減を定量した。
実施例10の記載に従ってバイオフィルムの形成、処理および定量を行った。ただし、バイオフィルムの処理には、25μg/ウェルのペンタペプチド-Ply511を用いた。
修飾エンドリシンバリアントPK-Ply511は、リステリア・モノサイトゲネスバイオフィルムの著しい低減を示した。
次に、本発明の態様を示す。
１. 細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法であって、
a)膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含む融合タンパク質を提供し;
b)前記融合タンパク質と物質、液体、表面または生体物質とを接触させる
ことを含む前記方法。
２. エンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンに融合される前記ペプチドが、長さ6〜39アミノ酸残基を有する合成または天然に存在するペプチドである、上記1に記載の方法。
３. エンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンに融合される前記ペプチドが、合成カチオン性、合成ポリカチオン性、合成疎水性、合成両親媒性または天然に存在する抗菌ペプチドである、上記1または2に記載の方法。
４. 前記ペプチドが、エンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンのN末端および/またはC末端に融合され、特にエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンのN末端に融合される、上記1〜3のいずれか1つに記載の方法。
５. 前記エンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンが、グラム陰性菌および/またはグラム陽性菌の細胞壁の分解活性、特に腸内細菌科(エシェリキア属、特にE.コリ、サルモネラ属、シゲラ属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、ハフニア属、クレブシエラ属、特にK.ニューモニエ、モルガネラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、セラチア属、エルシニア属)、シュードモナス科(シュードモナス属、特にP.エルギノーサ、バークホルデリア、ステノトロホモナス属、シュワネラ属、スフィンゴモナス属、コマモナス属)、ナイセリア属、モラクセラ属、ビブリオ属、アエロモナス属、ブルセラ属、フランシセラ属、ボルデテラ属、レジオネラ属、バルトネラ属、コクシエラ属、ヘモフィルス属、パスツレラ属、マンヘミア属、アクチノバチルス属、ガードネレラ属、スピロヘータ科(トレポネーマ属およびボレリア属)、レプトスピラ科、カンピロバクター属、ヘリコバクター属、スピリルム属、ストレプトバチルス属、バクテロイデス科(バクテロイデス属、フソバクテリウム属、プレボテラ属、ポルフィロモナス属)、アシネトバクター属、特にA.バウマニからなる群から選択されるグラム陰性菌の細胞壁の分解活性を有し、ここでグラム陽性菌が、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・アウレウス、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・エクイ、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、バチルス・アンスラシス、バチルス・セレウス、プロピオニバクテリウム・アクネス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、コリネバクテリウム・ジフテリエ、マイコプラズマ・ニューモニエ、アクチノミセス属からなる群から選択される、上記1〜4のいずれか1つに記載の方法。
６. 前記エンドリシンが、配列番号1のphiKZgp144、配列番号2のELgp188、配列番号3のサルモネラエンドリシン、配列番号4の腸内細菌ファージT4エンドリシン、配列番号5のアシネトバクター・バウマニーエンドリシン、配列番号6のE.コリファージK1Fエンドリシン、配列番号7のOBPgpLys、配列番号8のPSP3サルモネラエンドリシン、配列番号9のE.コリファージP2エンドリシン、配列番号85のPly511、配列番号92のPly2638からなる群から選択されるかまたは、前記バクテリオシンが配列番号87である、上記1〜5のいずれか1つに記載の方法。
７. カチオン性/ポリカチオン性ペプチドが配列番号10〜30および32〜34のアミノ酸配列を示すか、または抗菌ペプチドが配列番号93〜133のアミノ酸配列を示すか、または疎水性ペプチドが配列番号134および135のアミノ酸配列を示すか、または両親媒性ペプチドが配列番号136〜138のアミノ酸配列を示す、上記1〜6のいずれか1つに記載の方法。
８. 前記エンドリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントが、配列番号35〜49、53、57、62〜64、66〜78および139〜142からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記1〜7のいずれか1つに記載の方法。
９. 融合タンパク質に接触する物質が、石、岩、土壌、堆積物、食物、飼料または化粧品である、上記1〜8のいずれか1つに記載の方法。
１０. 融合タンパク質に接触する液体が、水、特に飲料水、地下水もしくは廃水、熱水泉、海、湖、川、任意の種類の水性系、コンタクトレンズ、義歯、インプラント、補装具またはブレースの洗浄液および保存液である、上記1〜9のいずれか1つに記載の方法。
１１. 融合タンパク質に接触する液体が、生体、特に植物および哺乳動物、好ましくはヒトに由来するかまたはそれから得られる任意の物質である、上記1〜10のいずれか1つに記載の方法。
１２. 融合タンパク質に接触する液体が、医療機器、工業用水システムまたは飲料水システムの配管および天然水系の表面である、上記1〜11のいずれか1つに記載の方法。
１３. 融合タンパク質と組み合わせて、またはそれに添加して抗生物質を添加することができる、上記1〜12のいずれか1つに記載の方法。
１４. 細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌および/またはグラム陽性菌感染症の治療薬として使用するための、膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含むエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアント。
１５. 抗生物質と組み合わせて、またはそれに添加してエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントが用いられる、上記14記載の使用のためのエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアント。
１６. 食品、食品加工装置、食品加工工場、食品と接触する面、医療機器、病院または手術室における表面の細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌および/またはグラム陽性菌汚染の除去、低減および/または予防のための、膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含むエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントの使用。
１７. 細菌性バイオフィルムと関連する医薬、食品もしくは飼料の診断法または環境診断法における診断手段、消毒薬または化粧用物質としての、膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含むエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントの使用。
１８. エンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントが、抗生物質と組み合わせて、またはそれに添加して用いられる、上記16および17に記載の使用。

Claims (4)

  1. 細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法であって、
    a)膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含む融合タンパク質を提供し;
    b)前記融合タンパク質と物質、液体、表面または生体物質とを接触させる
    ことを含む前記方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
  2. 細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌および/またはグラム陽性菌感染症の治療のための、膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含むエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントを含む医薬組成物。
  3. 食品、食品加工装置、食品加工工場、食品と接触する面、医療機器、病院または手術室における表面の細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌および/またはグラム陽性菌汚染の除去、低減および/または予防のための、膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含むエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントの使用。
  4. 細菌性バイオフィルムと関連する医薬、食品もしくは飼料の診断法または環境診断法における診断手段、消毒薬または化粧用物質としての、膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含むエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントの使用。
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