KR102503567B1 - 신규한 엔돌리신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 엔돌리신 활성을 지닌 폴리펩타이드 및 서열 번호: 1에 따른 아미노산 서열 및 이의 단편 또는 유도체에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 특히 진단 수단으로서, 화장 물질로서 또는 소독제로서 그람-음성 세균 감염의 처리 또는 예방을 위한 상기 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세균 오염, 특히 그람-음성 오염, 식료품, 식품 가공 장비, 식품 가공 공장, 식료품과 접촉하게 되는 표면, 의료 장치, 병원 및 의사 사무실내 표면의 처리 또는 예방을 위한 상기 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
Description
발명의 분야
본 발명은 엔돌리신 활성(endolysin activity)을 지닌 폴리펩타이드 및 서열 번호: 1에 따른 아미노산 서열 및 이의 단편 또는 유도체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및, 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 그람-음성 세균 감염의 치료 또는 예방용 의약으로서, 진단 수단으로서, 화장품 물질로서 또는 위생처리제로서 사용하기 위한 상기 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 식료품, 식품 가공 장비, 식품 가공 식물, 식료품과 접촉되는 표면, 의료 장치, 병원 및 의사 사무실의 표면의 세균 오염, 특히 그람-음성 오염의 처리 또는 예방용의 상기 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
발명의 배경
세균 병원체에 의해 유발된 생명을 위협하는 사람 감염성 질환은 항생제에 대한 증가된 내성으로 인하여 현재 부분적으로 다시 드러나고 있다. 그람-음성 세균은 약물 내성 병원체의 중요한 부분에 상응하며 감염 질환에 의해 유발된 증가하는 이환율 및 치사율을 초래하는 주요한 공공 보건 위협이 되어 왔다. 많은 노력이 제시되어 왔지만 다중약물-내성 그람-음성 세균의 비율은 전세계적으로 여전히 상승하고 있으며 문제가 커지고 있다. 그람-양성 세균에서 발생한 것과는 대조적으로 다중약물-내성 그람-음성 세균에 대해 구체적으로 개발된 새로운 활성 항생제가 부족 또는 심지어 부재하고 그 결과 팬-약물 내성 단리체(pan-drug resistant isolate), 즉 모든 이용가능한 항생제에 대해 내성인 세균으로 분류된 임상 샘플 및 환경에서 단리된 그람-음성 유기체의 수가 현재 증가하고 있다.
그람-음성 세포벽은 대부분의 항미생물제에 대해 주요 장애가 되는 외부 막으로 구성되어 있다. 약간의 예외로, 외부 막은 인지질(내부 리플렛(inner leaflet)), 지질다당류(LPS)(외부 리플렛) 및 완화 채널(defusing channel)로서 제공되는, 포린(porin)과 같은 단백질, 및 펩티도글리칸에 공유결합되고 내부 리플렛에 고정된(anchored), 지질단백질로 이루어져 있다. LPS는 외부 막의 주요 성분이며 많은 외부 제제에 대한 투과성 장벽을 세균에게 제공한다. LPS는 우세한 환경 상태에 대한 반응시 개질될 수 있다(Nikaido, 2003). 3개의 상이한 영역은 이들의 화학 구조, 생합성, 유전학 및 기능에 따라 구별될 수 있다: i) 지질 A 성분, ii) 코어 영역 및 iii) O-특이적인 다당류 또는 O-측쇄로서 또한 공지된 O-항원. LPS는 거친(R-형, O-항원 부재), 부드러운(S-형, O-항원 존재) 또는 혼합물(SR-형)으로 존재할 수 있다. 전체적인 외부 막 온전성(integrity)은 2개의 주요 안정화력인, LPS 양이온-결합 부위(이온성 상호작용) 및 지질 A 아실 쇄 그룹의 조밀한 소수성 스태킹(stacking)(소수성 상호작용)에 의해 유지되며 항미생물제에 대한 천연 장벽으로서 효율적인 확산 장벽으로서 작용한다. 따라서, 그람-음성 세균에 대해 활성인 새로운 항미생물제에 대한 필요성이 존재한다.
'엔지바이오틱스(enzybiotics)' - '효소' 및 '항생제'의 하이브리드 용어-로서 사용된 엔돌리신은 이러한 필요성을 완벽하게 충족시켰다. 엔돌리신은 모든 이중 가닥 DNA 박테리오파아지에 의해 암호화된 전문화된 펩티도글리칸-분해 효소이다(Young et al., Trends Microbiol. 2000 Mar; 8(3):120-128). 엔돌리신-매개된 작용은 박테리오파아지 복제 주기의 말기에 세균 펩티도글리칸(PG) 층을 분해하고 절충하는 다른 단백질에 의한 조직화되고 조절된 사건(event)이다. 이들의 활성 및 이들이 가수분해하는 결합에 따라, 엔돌리신은 상이한 부류로 나누어질 수 있다: i) N-아세틸글루사민(GlcNAc)의 환원 말단에서 또는 N-아세틸무람산(MurNAc)의 환원 말단에서 글리칸 성분을 절단하는 글리코시다제; ii) 라이틱 트랜스글리코시다제로서 동일한 글리칸 표적을 공유하지만 상이한 말단 생성물을 전달하는 N-아세틸-β-D-무라미다제(흔히 라이소자임 또는 무라미다제로 불림); iii) MurNAc와 L-알라닌 사이의 중요한 아미드 결합의 가수분해를 촉진하여, 줄기 펩타이드로부터 글리칸 가닥을 분리하는 아미다제; 및 iv) 세포 벽을 가교결합하는 줄기 펩타이드내에서 LD- 및 DD-결합을 공격하는 엔도펩티다제 및 카복시펩티다제의 뚜렷한 부류.
엔돌리신의 잠재능이 장기간 동안 알려져 왔지만, 이들의 항세균 용도는 항생제의 성공 및 우월성으로 인하여 무색해졌다. 단지 항생제 내성 세균의 놀라운 출현으로 인하여, 과학 사회 및 사업자가 대체 치료요법으로서 엔돌리신에 있어서 이들의 관심을 불러일으켰다. 2001년에 최초 엔돌리신 연구는 두번째로 남은 14개의 다른 공생하는 무해한 스트렙토코쿠스 중에서 A, C 및 E 그룹 스트렙토코쿠스를 파괴하는 큰 능력을 나타내었다. 외인성으로 첨가된 경우 종-특이적인 방식으로 PG를 신속하게 분해하는 엔돌리신의 이러한 독특한 능력은 연구자들이 거대한 수의 엔돌리신을 단리하여 다른 그람-양성 병원체를 성공적으로 표적화하도록 하였다. 그러나, 그람-음성 세균을 공격하는 엔돌리신은 엔돌리신이 PG에서 작용할 수 있도록 하기 위해 자체적으로 파괴할 수 없는 고도로 보호성인 외막의 존재로 인하여 거의 주목을 받지 못하였다. 그 결과, 병원 및 식품매개 병원체(예컨대, 살모넬라(Salmonella), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈모모나스 종(Pseudomonas spp.), 악시네토박터 종( Acinetobacter spp.))와 같은 그람-음성 세균은 아마도 오늘날 엔돌리신 치료요법에서 가장 중요한 도전대상 중 하나이다.
발명의 요약
본 발명은 그람-음성 세균에 대해 항미생물 활성을 지닌, 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri) 파아지 CkP1으로부터 단리한, 펩티도글리칸 분해 활성을 지닌 신규한 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 제1 목적은 서열 번호: 1에 따른 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하는 엔돌리신 활성을 지닌 폴리펩타이드를 제공한다. 서열 번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 바람직하게는 서열 번호: 2에 따른 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 바람직한 구현예에서 상기 단편은 서열 번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하며, 이는 바람직하게는 서열 번호: 4의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 여전히 다른 바람직한 구현예에서 상기 유도체는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 3에 따른 아미노산 서열내 결실, 첨가, 삽입 및/또는 치환을 갖는다. 여전히 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드는 N- 또는 C-말단에 막 또는 LPS 파괴 활성을 지닌 펩타이드 스트레치(peptide stretch), 특히, 양이온성 및 다가양이온성 펩타이드를 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 또한 태그(tag), 바람직하게는 His6-태그를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 목적은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 제3 목적은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 제4 목적은 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 제5 목적은 수술 또는 치료요법에 의해 사람 또는 동물 신체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 또는 사람 또는 동물 신체에서 실시된 진단 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 사람 또는 동물과 같은 대상체에서 그람-음성 세균 감염을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 진단 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드와의 생체외(ex vivo)(즉, 대상체의 샘플로부터 확립된 세균 배양물에서 또는 환경으로부터) 접촉시 세균의 분해는 그람-음성 세균의 존재를 나타낸다.
본 발명의 제6 목적은 식료품, 사료 또는 화장품 중 항미생물제로서, 또는 소독제로서 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 다른 바람직한 구현예는 식료품, 식품 가공 장비, 식품 가공 공장, 식료품과 접촉하게 되는 (무생물) 표면, 사료, 사료 가공 장비, 사료 가공 공장, 사료와 접촉하게 되는 (무생물) 표면, 의료 장치, 병원 및 의사의 사무실에서의 (무생물) 표면의 그람-음성 세균 오염을 처치 또는 예방하기 위한, 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
도면의 범례
다음의 도는 본 발명을 설명하기 위해 제공된다.
도 1. BLASTp 및 Pfam 시스템을 사용한 야생형 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri) 엔돌리신 CkP1gp131의 생물정보학 분석. 야생형 파아지 내에서 이들이 나타내는 DNA 및 아미노산 서열은 각각 A) 서열 번호: 2 및 B) 서열 번호: 1이다. 라이소자임-유사 상과의 촉매 도메인(아미노산 1 내지 163, 서열 번호: 3, 밑줄쳐짐)은 개략도(도 1c) 및 서열(도 1a 및 도 1b; 밑줄쳐짐)에서 가시화되어 있다.
도 2. 수개의 그람-음성 세균 병원체에 대한 CkP1gp131의 항세균 활성, 대수적으로 성장하는 세포(
3x107 CFU/ml)를 2시간 동안 및 37℃에서, 20 mM HEPES pH 7.0 속에 재현탁된 50 μg/ml(2.4 μM)의 CkP1gp131와 함께 또는 음성 대조군으로서 HEPES와 함께 항온처리하였다. 항온처리 후, 항세균 효과를 CFU의 수를 정량화함으로써 평가하여 상대적인 불활성화로서 대수 단위(= log10 (N0/Ni); 여기서 N0는 비처리된 세포의 수이고 Ni은 처리 후 세포의 수이다)로 나타내었다. 평균 ± 표준 편차는 n = 3 반복물에 대해 제공된다. CK - 시트로박터 코세리 균주(1 내지 11번); CF - 시트로박터 프레운디이 균주(1 내지 7번); *는 검출 한계 미만(<10 cfu/ml)을 나타낸다.
도 3. CkP1gp131의 항세균 활성: A) 상이한 pH 값 하에서의 활성. B) 상이한 이온 강도하에서의 활성. 2개 농도의 엔돌리신(5 및 50μg/ml)을 시험하였다. 활성은 상대적인 불활성화로서 대수 단위(= log10 (N0/Ni); 여기서 N0는 비처리된 세포의 수이고 Ni는 처리 후 세포의 수이다)로 나타낸다. 평균±표준 편차는 n = 4개의 반복물에 대해 제공된다. *는 검출 한계 미만(<10 CFU/ml)을 나타낸다.
도 4. CkP1gp131의 항세균 활성: A) 상이한 온도하에서의 활성. 2개 농도의 엔돌리신(5 및 50μg/ml)을 시험하였다. 평균±표준 편차는 n=4개의 반복물에 대해 제공된다. B) 30일의 기간에 걸친 활성(50μg/ml). 활성은 상대적인 불활성화를 대수 단위(= log10 (N0/Ni); 여기서 N0는 비처리된 세포의 수이고 Ni는 처리 후 세포의 수이다)로 나타낸다. *는 검출 한계 미만(<10 CFU/ml)을 나타낸다.
다음의 도는 본 발명을 설명하기 위해 제공된다.
도 1. BLASTp 및 Pfam 시스템을 사용한 야생형 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri) 엔돌리신 CkP1gp131의 생물정보학 분석. 야생형 파아지 내에서 이들이 나타내는 DNA 및 아미노산 서열은 각각 A) 서열 번호: 2 및 B) 서열 번호: 1이다. 라이소자임-유사 상과의 촉매 도메인(아미노산 1 내지 163, 서열 번호: 3, 밑줄쳐짐)은 개략도(도 1c) 및 서열(도 1a 및 도 1b; 밑줄쳐짐)에서 가시화되어 있다.
도 2. 수개의 그람-음성 세균 병원체에 대한 CkP1gp131의 항세균 활성, 대수적으로 성장하는 세포(
도 3. CkP1gp131의 항세균 활성: A) 상이한 pH 값 하에서의 활성. B) 상이한 이온 강도하에서의 활성. 2개 농도의 엔돌리신(5 및 50μg/ml)을 시험하였다. 활성은 상대적인 불활성화로서 대수 단위(= log10 (N0/Ni); 여기서 N0는 비처리된 세포의 수이고 Ni는 처리 후 세포의 수이다)로 나타낸다. 평균±표준 편차는 n = 4개의 반복물에 대해 제공된다. *는 검출 한계 미만(<10 CFU/ml)을 나타낸다.
도 4. CkP1gp131의 항세균 활성: A) 상이한 온도하에서의 활성. 2개 농도의 엔돌리신(5 및 50μg/ml)을 시험하였다. 평균±표준 편차는 n=4개의 반복물에 대해 제공된다. B) 30일의 기간에 걸친 활성(50μg/ml). 활성은 상대적인 불활성화를 대수 단위(= log10 (N0/Ni); 여기서 N0는 비처리된 세포의 수이고 Ni는 처리 후 세포의 수이다)로 나타낸다. *는 검출 한계 미만(<10 CFU/ml)을 나타낸다.
상세한 설명
정의
:
본원에 나타낸 경우, 다음의 용어는 하기 제시된 의미를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩타이드"는 동의어적으로 용어 "단백질"을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩타이드"는 특정 서열내에서 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 선형 중합체를 지칭한다. 단백질의 아미노산 잔기는 예컨대, 탄수화물 및 포스페이트와 같은 다양한 그룹의 공유결합성 부착에 의해 개질시킬 수 있다. 다른 물질은 헴(heme) 또는 지질과 같은 폴리펩타이드 쇄와 보다 느슨하게 회합되어 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩타이드"에 의해 포함된 접합된 단백질을 생성할 수 있다. 폴리펩타이드 쇄가 폴딩(folding)되는 다양한 방식은 특히 알파 나선형 및 베타-플리트 쉬이트(beta-pleated sheet)와 관련하여 유추되어 왔다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩타이드"는 모든-알파, 모든-베타, 알파/베타 및, 알파+베타인 단백질의 모든 4개의 부류를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "펩타이드 스트레치"는 엔도리신과 같은 단백질에 연결된 임의의 종류의 펩타이드를 지칭한다. 그러나, 본 발명의 의미에서 펩타이드 스트레치는 His6-태그, Strep-태그, Avi-태그, Myc-태그, Gst-태그, JS-태그, 시스테인-태그, FLAG-태그 또는 당해 분야에 공지된 다른 태그, 티오레독신 또는 말토즈 결합 단백질(MBP)을 지칭하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "펩타이드 스트레치"와는 대조적으로 용어 "태그"는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 친화성 정제를 촉진시키거나, 폴리펩타이드를 표면에 고정시키거나, 예컨대, 상기 나타낸 촉진 중 하나에 대해 태그가 유용하도록 하는 기능이 상기 펩타이드의 양으로의 하전(positively charge)에 의해 유발되지 않는 한 상이한 ELISA 검정 양식에서 항체 결합에 의해, 폴리펩타이드의 검출용 마커 또는 표지 모이어티(label moiety)로서 제공하는데 유용할 수 있다. 그러나, His6-태그는 각각의 pH에 따라 양으로 하전될 수 있지만, 이는 고정된 2가 양이온에 결합하므로 친화성 정제 도구로서 사용되며 본 발명에 따른 펩타이드 스트레치로서 사용되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "펩타이드 스트레치"는 약 2 내지 10 약 100개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 약 4 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 30개의 아미노산 잔기로 이루어진 짧은 폴리펩타이드 서열을 지칭하며, 여기서 하나의 아미노산 잔기의 아미노 그룹은 펩타이드 결합에 의해 다른 아미노산 잔기의 카복실 그룹에 연결된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "엔돌리신 활성"은 특히 그람-음성 세균의 펩티도글리칸과 같은 세균 펩티도글리칸을 분해함으로써, 세균 세포벽을 가수분해하는 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "야생형" 또는 "wt"는 서열 번호: 1로 나타낸 엔돌리신 CkP1gp131의 아미노산 서열을 지칭한다. 야생형 엔돌리신 CkP1gp131을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 2로 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "결실"은 바람직하게는 각각의 참고 서열과 비교하여 유도체 서열내 1, 2, 3, 4, 5개(또는 심지어 5개 이상)의 연속된 아미노산 또는 핵산 잔기의 부재를 지칭한다. 유도체는 이러한 1개, 2개 이상의 결실을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "삽입"은 각각의 참고 서열과 비교하여 유도체 서열내 1, 2, 3, 4, 5개(또는 심지어 5개 이상)의 연속된 아미노산 또는 핵산 잔기의 추가의 서열내 잔기의 존재를 지칭한다. 본 발명의 유도체는 1개, 2개 이상의 이러한 삽입을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "첨가"는 각각의 참고 서열과 비교하여 N- 및/또는 C-말단에서 1, 2, 3, 4, 5개(또는 심지어 5개 이상)의 연속된 아미노산 또는 핵산 잔기의 추가의 존재를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환"은 참고 서열내 상응하는 위치에서 존재하거나 부재하는 아미노산 또는 핵산 잔기와는 상이한, 유도체 서열의 특정 위치에 위치하는 아미노산 또는 핵산 잔기의 존재를 지칭한다. 본 발명의 유도체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 이러한 치환을 나타낼 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 바람직하게는 이러한 치환은 보존적 치환이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포벽"은 그람-음성 세균의 외부 세포 포위물(enclosure)을 형성함으로써 이들의 통합성을 보증하는 모든 성분을 지칭한다. 특히, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포벽"은 펩티도글리칸, 지질다당류를 지닌 그람-음성 세균의 외부 막, 세균 세포막 뿐만 아니라 예컨대, 캅셀, 외부 단백질 층 또는 점액(slime)과 같은 펩티도글리칸 상에 침착된 추가의 층을 지칭한다.
본 발명은 그람-음성 세균에 대한 신규한 항세균제의 제조시 유용한 시트로박터 코세리 파아지(Citrobacter koweri pharge) CkP1으로부터 단리된, 새로운 엔돌리신에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 서열 번호: 1에 따른 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 서열 번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 서열 번호: 2에 따른 뉴클레오타이드 서열에 의해 바람직하게 암호화된다.
서열 번호: 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 엔돌리신 CkP1gp131은 164개의 아미노산의 길이를 갖는다. 효소 활성 도메인(EAD)(1 내지 163번 아미노산)은 서열 번호: 3에 따른 아미노산 서열 및 서열 번호: 4에 따른 뉴클레오타이드 서열을 지닌 라이소자임-유사 상과 도메인 모티프와 편집(complie)된다.
따라서, 서열 번호: 1의 바람직한 단편은 서열 번호:3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다. 서열 번호: 1의 다른 바람직한 단편은 CkP1gp131의 N-말단 메티오닌을 결여한 폴리펩타이드이다(예컨대, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6 참고). 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 단편은 적어도 80개, 보다 바람직하게는 적어도 100개, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 120개, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 140개, 가장 바람직하게는 적어도 160개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직하게는, 서열 번호: 1의 단편을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 서열을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 서열 번호: 1의 단편을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 야생형 CkP1gp131 엔돌리신(서열 번호: 1)의 분해 활성을 필수적으로 나타낸다. 상기 활성은 바람직하게는 야생형 CkP1gp131 엔돌리신의 활성의 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 약 200%를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호: 1에 따른 아미노산의 유도체인 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 유도체는 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5 및/또는 서열 번호: 6에 따른 아미노산 서열을 필수적으로 포함하지만 추가의 변형 및/또는 변경을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 엔돌리신의 상기 유도체의 상기 변형 및/또는 변경은 돌연변이, 특히 결실, 삽입, 첨가, 치환 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 본 발명에 따른 이러한 유도체는 야생형 CkP1gp131 엔돌리신(서열 번호: 1)의 분해 활성을 필수적으로 나타낸다. 상기 활성은 바람직하게는 야생형 CkP1gp131 엔돌리신의 활성의 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 약 200%를 나타낸다.
야생형 CkP1gp131 엔돌리신(서열 번호: 1)의 단편 및 유도체를 포함하는 폴리펩타이드의 활성은 예컨대, (Briers et al., J. Biochem. Biophys 20 Methods 70: 531-533, (2007))에 기술된 플레이트 분해 검정 또는 액체 분해 검정과 같이, 당해 분야의 기술자에 의해 당해 분야에 잘 공지된 검정에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 N-말단 또는 C-말단에 His6-태그, Strep-태그, Avi-태그, Myc-태그, Gst-태그, JS-태그, 시스테인-태그, FLAG-태그 또는 당해 분야에 잘 공지된 다른 태그와 같은 태그를 추가로 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 태그는 C-말단에서 서열 번호: 1, 또는 이의 단편 및/또는 유도체의 서열에 연결된다(예컨대, N-태그-서열 번호: 1-C). 상기 태그는 추가의 아미노산 잔기에 걸쳐 서열 번호: 1, 또는 이의 단편 또는 유도체에 연결될 수 있다. 상기 추가의 아미노산 잔기는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 추가의 아미노산 잔기로 이루어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 태그는 추가의 아미노산 잔기 Leu-Glu 또는 Lys-Gly에 의해 서열 번호: 1, 단편 또는 유도체에 연결된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 7에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 서열 번호: 7에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 서열 번호: 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 비교하여, 서열 번호: 1의 N-말단에 연결된 추가의 His6-태그를 포함한다. 서열 번호: 7에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 바람직하게는 서열 번호: 8에 따른 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 단리된 핵산 분자는 서열 번호: 2, 서열 번호: 4 및/또는 서열 번호: 8에 따른 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 핵산 분자는 서열 번호: 1에 대해 이종인 프로모터를 포함한다.
본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드의 구성적 또는 유도성 발현을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 상기 폴리펩타이드를 발현하는 유전적으로 변형된 적합한 숙주 세포일 수 있다. 상기 숙주 세포는 세균 또는 효모 또는 예컨대, 포유동물 세포, 특히 사람 세포와 같은 동물 세포와 같은 미생물일 수 있다. 본 발명에 따른 숙주 세포는 다세포 유기체의 일부가 아니라 단리되어 있다(예컨대, 무한증식 세포주 등). 본 발명의 일 구현예에서 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포이다. 숙주는 단순히 생물공학적 이유로 인하여, 예컨대, 수율, 용해도, 비용 등으로 인해 선택될 수 있지만 또한 의학적 관점으로부터, 예컨대, 비병원 세균 또는 효모 또는 사람 세포로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 발현을 수득하기 위하여 적합한 숙주 세포를 유전적으로 형질전환시키기 위한 방법에 관한 것이며, 여기서 숙주 세포는 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명에 따른 핵산을 숙주 세포내로 도입함으로써 유전적으로 변형된다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 해독 및 발현은 당해 분야의 기술자에제 잘 공지된 유전 공학 방법에 의해 수득할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드를 발현하는 유전적으로 변형된 적합한 숙주 세포와 같이, 본 발명에 따른 숙주 세포로부터 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 수득하는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 상기 숙주 세포로부터 단리하는 단계를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및/또는 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함하고, 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체와 같은 희석제, 부형제 또는 담체를 추가로 포함하는 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 조성물은 EDTA, TRIS, 락트산, 락토페린, 폴리믹신, 시트르산 및/또는, 예컨대 바아라(Vaara)(Agents that increase the permeability of the outer membrane. Vaara M. Microbiol Rev. 1992 Sep;56(3):395-441)에 기술된 바와 같은 다른 물질과 같은 금속 킬레이터와 같이 그람-음성 세균의 외막을 투과하는 제제를 추가로 포함한다. 상기 언급한 투과제의 조합을 포함하는 조성물이 또한 바람직하다. 약 10 μM 내지 약 100 mM EDTA, 보다 바람직하게는 약 50 μM 내지 약 10 mM EDTA, 보다 바람직하게는 약 0.5 mM 내지 약 10 mM EDTA, 보다 바람직하게는 약 0.5 mM 내지 약 2 mM EDTA, 보다 바람직하게는 약 0.5 mM 내지 약 1 mM EDTA를 포함하는 조성물이 특히 바람직하다. 또한 약 0.5 mM 내지 약 2 mM EDTA, 보다 바람직하게는 약 1 mM EDTA 및 추가로 약 10 내지 약 100 mM TRIS를 포함하는 조성물이 바람직하다.
본 발명은 또한 수술 또는 치료요법에 의해 사람 또는 동물 신체를 치료하는 방법 및 사람 또는 동물 신체에서 실시된 진단 방법에서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 숙주에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 그람-음성 세균과 관련된 장애, 질환 또는 상태의 치료 및/또는 예방을 위한 방법에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주의 용도에 관한 것이다. 특히 장애, 질환 또는 상태는 엔테로박테리아세아에(Enterobactericeae)(에스케리키아, 특히 이. 콜라이(E. coli), 살모넬라, 시겔라(Shigella), 시트로박터(Citrobacter), 에드와드시엘라(Edwardsiella), 엔테로박터(Enterobacter), 하프니아(Hafnia), 클렙시엘라(Klebsiella), 특히 케이. 뉴모니아에(K. pneumoniae), 모르가넬라(Morganella), 프로테우스(Proteus), 프로비덴시아(Providencia), 세라티아(Serratia), 예르시니아(Yersinia)), 슈도모나다세아에(Pseudomonadaceae)(슈도모나스(Pseudomonas), 특히 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)), 부르콜데리아(Burkholderia), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 쉐와넬라(Shewanella), 스핑고모나스(Sphingomonas), 코마모나스(Comamonas), 네이쎄리아(Neisseria), 모락셀라(Moraxella), 비브리오(Vibrio), 아에로모나스(Aeromonas), 브루셀라(Brucella), 프란키셀라(Francisella), 보르데텔라(Bordetella), 레지오넬라(Legionella), 바르토넬라(Bartonella), 콕시엘라(Coxiella), 해모필루스(Haemophilus), 파스퇴렐라(Pasteurella), 만헤이미아(Mannheimia), 악티노바실러스(Actinobacillus), 가르드네렐라(Gardnerella), 스피로차에타세아에(Spirochaetaceae)(트레포네마(Treponema) 및 보렐리아(Borrelia)), 렙토스피라세아에(Leptospiraceae), 캄필로박터(Campylobacter), 헬리코박터(Helicobacter), 스피릴룸(Spirillum), 스트렙토바실러스(Streptobacillus), 박테로이다세아에(Bacteroidaceae)(박테로이데스(Bacteroides), 푸소박테리움(Fusobacterium), 프레보텔라(Prevotella), 포르피로모나스(Porphyromonas)), 악시네토박터(Acinetobacter), 특히 에이, 바우만니이(A. baumannii)와 같은 사람 또는 동물용의 변원성 균주를 포함하는 세균 그룹, 계열, 속 또는 종의 그람-음성 세균에 의해 유발될 수 있다. 특히, 장애, 질환 또는 상태의 치료 및/또는 예방은 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 푸티다, 부르콜데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 이. 콜라이 및/또는 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에 의해 유발될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 치료 및/또는 예방이 요구되는 대상체에서 장애, 질환 또는 상태를 치료하는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 상기 대상체에게 유효량의 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및/또는 휴효량의 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 숙주 또는 유효량의 본 발명에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 대상체는 예를 들면, 사람 또는 동물일 수 있다. 특히 상기 치료 방법은 그람-음성 세균에 의해, 특히 상기 나열한 그람-음성 세균에 의해 유발된 피부, 연조직, 호흡계, 폐, 소화관, 눈, 귀, 치아, 비인두, 구강, 골, 질의 감염, 균혈증 및/또는 심장내막염의 상처의 치료 및/또는 예방용일 수 있다.
본 발명에 따른 치료 방법에서 사용된 투여량 및 투여 경로는 치료될 특정 질환/감염 부위에 의존한다. 투여 경로는 예를 들면, 경구, 국소, 비인두, 비경구, 정맥내, 직장 또는 임의의 다른 투여 경로일 수 있다. 감염 부위(또는 감염될 위험이 있는 부위)에 대한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및/또는 유효량의 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 숙주 또는 본 발명에 따른 조성물의 적용을 위해, 프로테아제, 산화, 면역 반응 등과 같은 환경적 영향으로부터 활성 화합물을 보호하는 제형이 감염 부위에 도달할 때까지 이를 사용할 수 있다. 따라서, 제형은 캅셀제, 당의정, 환제, 좌제, 주사가능한 액제 또는 임의의 다른 의학적으로 합리적인 갈레닉 제형(galenic formulation)일 수 있다. 바람직하게는, 갈레닉 제형은 적합한 담체, 안정화제, 풍미제, 완충제 또는 다른 적합한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면, 국소 적용을 위해 제형은 로션제 또는 플라스터(plaster)일 수 있고, 비인두 적용의 경우 제형은 코로의 분무를 통해 적용될 염수 용액일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는, 치료될(또는 예방될) 감염이 다중내성 세균 균주, 특히 다음의 항생제 중 하나 이상에 대해 내성인 균주에 의해 유발되는 경우, 의학적 치료에 사용된다: 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 세팔로틴, 젠타마이신, 세포탁심, 세팔로스포린, 세프타지딤 또는 이미페넴. 또한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 항생제, 란티바이오틱스, 박테리오신 또는 엔돌리신 등과 같은 통상의 항세균제와 함께 이를 투여함으로써 치료 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 구획을 포함하는 약제학적 팩(pharmaceutical pack)에 관한 것이며, 여기서 적어도 하나의 구획은 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 하나 이상의 숙주 및/또는 본 발명에 따른 조성물을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 약제학적 조성물의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산으로 형질전환된 하나 이상의 숙주와 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 혼합하는 단계를 포함한다.
심지어 추가의 양태에서 본 발명에 따른 조성물은 화장품 조성물이다. 수개의 세균 종은 피부와 같은 환자의 신체 표면에 환경적으로 노출시 자극을 유발할 수 있다. 이러한 자극을 예방하기 위하여 또는 상기 세균 병원체의 작은 만연을 제거하기 위하여, 특수한 화장품 제제를 사용할 수 있으며, 이는 충분한 양의 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함함으로써 기존의 또는 새로이 설정되는 병원성 그람-음성 세균을 분해시킨다.
추가의 양태에서, 본 발명은 의약 진단, 식품 진단, 사료 진단 또는 환경 진단시 진단 수단으로서, 특히 그람-음성 세균에 의해 유발된 세균 감염 또는 오염의 진단을 위한 진단 수단으로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 병원성 세균, 특히 그람-음성 병원성 세균을 구체적으로 분해하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 의한 세균 세포의 분해는 트리톤 X-100과 같은 세제 또는 폴리믹신 B와 같이 세균 세포 엔벨로프(envelope)를 약화시키는 다른 첨가제의 첨가에 의해 뒷받침될 수 있다. 구체적인 세포 분해는 PCR, 핵산 하이브리드화 또는 NASBA(핵산 서열 기반한 증폭)와 같은 핵산 기반 방법, IMS, 면역형광성 또는 ELISA 기술과 같은 면역학적 방법, 또는 구별된 세균 그룹 또는 종에 대해 특이적인 단백질(예컨대, 엔테로박터의 경우 β-갈락토시다제, 코아굴라제 양성 균주에 대한 코아굴라제)을 사용하는 효소 검정과 같은 세균 세포의 세포 성분에 의존하는 다른 방법을 사용하여 세균을 후속적인 특이적인 검출하기 위한 초기 단계로서 요구된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 식료품, 식품 가공 장비, 식품 가공 공장, 선반 및 식품을 두는 구역(food deposit area)과 같은 식료품과 접촉하게 되는 (무생물) 표면 및 모든 다른 상황의 그람-음성 세균 오염의 처치 또는 예방을 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이며, 여기서 병원성, 조건적 병원성(facultative pathogenic) 또는 다른 바람직하지 않은 세균은 식품 물질을 잠재적으로 감염시킬 수 있다. 유사하게, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 식료품, 식품 가공 장비, 식품 가공 공장, 선반 및 식품을 두는 구역과 같은 식료품과 접촉하게 되는 (무생물) 표면 및 모든 다른 상황의 그람-음성 세균 오염의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있고, 여기서 병원성, 조건적 병원성 또는 다른 바람직하지 않은 세균은 식품 물질에 잠재적으로 만연할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 또한 병원 및 의사 사무실에서 의료 장치 및 모든 종류의 (무생물) 표면의 그람-음성 세균 오염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 폴리펩타이드는 소독제로서 예방적으로 사용될 수 있다. 이러한 소독제는 수술 전 또는 후에, 또는 예를 들면, 혈액투석 동안에 사용될 수 있다. 더욱이, 미숙아 및 면역약화된 개인(immunocompromised person), 또는 보철 장치가 필요한 대상체는 본 발명에 따른 폴리펩타이드로 치료할 수 있다. 이러한 치료는 예방적으로 또는 급성 감염 동안 이루어질 수 있다. 동일한 맥락에서, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(FQRP), 악시네토박터(Acinetobacter) 종 및 엔테로박테리아세아에, 예컨대, 이. 콜라이(E.coli), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 시트로박터(Citrobacter), 에드놔드시엘라(Edwardsiella), 엔테로박터(Enterobacter), 하프니아(Hafnia), 크렙시엘라(Klebsiella), 모르가넬라(Morganella), 프로테우스(Proteus), 프로비덴시아(Providencia), 세라티아(Serratia) 및 예르시니아(Yersinia) 종과 같은 항생제 내성 균주에 의한 병원내 감염은 본 발명의 폴리펩타이드를 사용하여 예방학적으로 또는 급성 상 동안 처리될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 세제, 계면활성제, 용매, 항생제, 란티바이오틱스, 또는 박테리오신과 같은 살균 용액으로서 사용될 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명을 설명하지만 개시내용 또는 첨부된 청구범위로 한정되는 것으로 고려되지 않는다. 달리 나타내지 않는 한, 분자 생물학적 표준 방법이 예컨대, Sambrock et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold 15 Spring Harbor, New York에 기술된 바와 같이 사용되었다.
실시예
실시예 1. 시트로박터 코세리(
Citrobacter
koseri) 파아지
CkP1Cl의 엔돌리신 CkP1gp131의 클로닝, 발현 및 정제
CkP1gp131(164개 아미노산 길이, MW = 18609 Da; 서열 번호: 1)은 라이소자임-유사 상과 촉매 도메인(아미노산 1 내지 163번으로부터; 서열 번호: 3)을 지닌 것으로 예측된 시트로박터 코세리 파아지 CkP1으로부터 기원하는 구형 엔돌리신이다(참고:도 1).
파아지 CkP1의 정제된 게놈성 DNA는 다음의 PCR 매개변수를 사용하여 KAPA HiFi 폴리머라제(Kapa Biosystems)를 사용한 표준 PCR 반응에서 엔돌리신 CkP1gp131을 암호화하는 개방 판독 프레임 ORF131의 증폭을 위한 주형(template)으로서 사용되었다:
출발: 95℃, 2분; 이어서 35 주기의 [98℃(20초) → 60℃(15초) → 72 ℃(20초)], 이어서 72℃(5분) 및 4℃로 냉각 및 저장.
엔돌리신 CkP1gp131을 암호화하는 ORF131의 표준 PCR 증폭 동안 사용된 프라이머는 다음과 같다:
ORF131 상방 프라이머(forward primer) 5' gggCATATGAACATTTTTAAAATGCTTCG 3' (서열 번호: 9)
ORF131 역방 프라이머(reverse primer) 5' gggGGATCCTCATTTATATGCGTTCCATG 3' (서열 번호: 10)
수득된 PCR 단편을 이후에 시판되는 pET28a 발현 벡터(Novagen) 내에서 연결하였다. 재조합 CkP1gp131에 대한 수득된 아미노산 및 DNA 서열은 각각 서열 번호: 7 및 서열 번호: 8에 나타낸다.
CkP1gp131의 재조합 발현은 37℃에서 4시간의 기간 동안 0.5 mM IPTG(이소프로필티오갈락토시드)를 사용한 유도 후 대수적으로 성장하는 이. 콜라이 BL21(λDE3) 세포에서 수행하였다. 이후에, 엔돌리신을 pET28a 발현 벡터에 의해 암호화된, N-말단 6xHis-태그를 사용하여, 정제하기 위한 HisTrapTM HP 1 ml 컬럼(GE Healthcare)에 쌓여진 Ni2+-NTA 수지에 적용하였다. 정제 방법은 4개의 단계를 포함하였다:
1. 평형 단계 - 10 mL의 세척 완충액(25 mM 이미다졸, 0.5 mM NaCl 및 20 mM NaH2P04 - pH 7.4 농도에서 NaOH).
2. 로딩 단계(Loading step) - 세척 완충액(25 mM 이미다졸, 0.5 mM NaCl 및 20 mM NaH2P04 - pH 7.4 농도에서 NaOH).
3. 세척 단계 - 10 mL의 세척 완충액(25 mM 이미다졸, 0.5 mM NaCl 및 20 mM NaH2P04 - pH 7.4 농도에서 NaOH).
4. 용출 단계 - 2 mL의 용출 완충액(250 mM 이미다졸, 0.5 mM NaCl 및 20 mM NaH2P04 - pH 7.4 농도에서 NaOH).
CkP1gp131(MW = 20772 Da)의 용출된 단백질 분획을 표준 변성 SDS-PAGE 겔(도 2)로 가시화하여, 95%보다 더 우수한 순도를 달성하였다. 단백질을 10 mM HEPES 속에서 pH 7.0(Maxi GeBAflex-튜브 투석 키트 사용 - Gene Bio-Application L.T.D)에서 투석하고 농도를 표준물로서 소 혈청 알부민을 사용하여 BCATM 단백질 검정 키트(Thermo Scientific)로 측정하였다. 이. 콜라이 발현 배양물 리터당 37.2 mg의 발현 수율을 수득하였다.
실시예 2. 그람-음성 병원성 세균의 패널에 대한 시트로박터 코세리 파아지CKP1
엔돌리신
(
서열 번호: 7
)의 항세균 효과
항세균 효과를 평가하기 위하여, 모든 항세균 실험을 10 mM HEPES(7.0의 pH) 속에서 중간-대수 상 세포에 대한 50 μg/ml의 재조합 CkP1gp131(서열 번호: 7)을 사용하여 수행하고 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다(도 3).
대수 단위(= log10 (N0/Ni)(여기서 N0는 처리되지 않은 세포의 수(음성 대조군에서)이고 Ni는 항온처리 후 계수된 처리된 세포의 수이다)의 상대적인 불활성화를 사용하여 항세균 활성을 정량화하였다. 평균±표준 편차는 n = 4개의 반복물에 대해 제공된다.
상기 제형을 사용하여, CkP1gp131은 모든 시험한 그람-음성 세균에 대해 1 내지 >5 logs(<100 cfu/ml의 검출 한계에 도달함) 범위의 항세균 활성을 지닌다.
실시예 3. 다양한 pH 조건 하에서 시트로박터 코세리에 대한 시트로박터 코세리 파아지 CKP1
엔돌리신(서열 번호: 7)의 항세균 효과
대수적으로 성장하는 씨. 코세리 세포(
3x109 CFU/ml)는 20 mM의 상이한 완충액 시스템: 시트르산나트륨(pH 6); HEPES(pH 7-8) 및 붕산(pH 9)내로 100x 희석시켰다. 반응은 50 μL의 세포를 50 μL의 재조합 엔돌리신(또는 음성 대조군으로서 헤르페스 완충액)과 혼합하여 시작함으로써 5 또는 50 μg/ml의 말기 농도를 갖도록 하였다. 2시간 동안 항온처리 후, 항세균 효과를 CFE의 수를 정량화함으로써 평가하고 대수 단위(= log10 (N0/Ni)(여기서 N0는 처리되지 않은 세포의 수이고 Ni는 처리 후 세포의 수이다)의 상대적인 불활성화로 나타내었다.
실시예 4. 다양한 이온 강도 조건 하에서 시트로박터 코세리에 대한 시트로박터 코세리 파아지 CKP1
엔돌리신
(
서열 번호: 7
)의 항세균 효과
대수적으로 성장하는 씨. 코세리 세포(
3x109 CFU/ml)를 20 mM의 HEPES pH 7로 100x 희석시키고 5 또는 50 μg/ml의 엔돌리신(말기 농도)과 함께 2시간 동안 증가하는 양의 NaCl(0 내지 500 mM)과 함께 항온처리하였다. 2시간 동안 항온처리한 후, 항세균 효과를 CFU의 수를 정량화함으로써 평가하고 대수 단위(= log10 (N0/Ni)(여기서 N0는 처리되지 않은 세포의 수이고 Ni는 처리 후 세포의 수이다)의 상대적인 불활성화로 나타내었다.
실시예 5. 다양한 온도 조건 하에서 시트로박터 코세리에 대한 시트로박터 코세리 파아지 CKP1
엔돌리신
(서열 번호: 7)의 항세균 효과
대수적으로 성장하는 씨. 코세리 세포를 20 mM의 HEPES 완충액, pH 7.0; 0 mM NaCl을 사용하여 엔돌리신과 함께 항온처리하였다. 2시간 동안 항온처리한 후, 항세균 효과를 CFU의 수를 정량화함으로써 평가하고 대수 단위(= log10 (N0/Ni)i)(여기서 N0는 처리되지 않은 세포의 수이고 Ni는 처리 후 세포의 수이다)의 상대적인 불활성화로 나타내었다.
실시예 6. 시간에 따른 시트로박터 코세리에 대한 시트로박터 코세리 파아지 CKP1 엔돌리신(서열 번호: 7)의 항세균 효과
엔돌리신(서열 번호: 7)을 37℃에서 수일 동안 20 mM Hepes pH 7.0 완충액 속에서 유지시켰다. a) 0, 5, 10, 20 및 30일째에, 50 μg/ml의 엔돌리신을 a) 대수적으로 성장하는 씨. 코세리 세포(
3x107 CFU/ml)에 대해 37℃에서 2시간 동안 음성 대조군으로서 HEPES를 다시 사용하여 시험하였다. 항온처리 후, 항세균 효과를 CFU의 수의 정량화로 평가하고 대수 단위(= log10 (N0/Ni)(여기서 N0는 처리되지 않은 세포의 수이고 Ni는 처리 후 세포의 수이다)의 상대적인 불활성화로 나타내었다.
0, 5, 10, 20 및 30일째에, 동일한 샘플을 원- 및 근-UV 영역(190 내지 260 nm)에서 원편광 이색성 스펙트럼(circular dichroism spectra)에서 분석하였다. 유의적인 제2 구조 변화가 관찰되지 않았으므로, 엔돌리신은 매우 안정한 것으로 입증하였다. 따라서, CD 열 안정성 분석은 엔돌리신 활성이 37℃에서 1개월 후 여전히 존재함을 입증한다.
본 발명의 다른 구현예는 본원에 개시된 본 발명의 명세서 및 실시를 고려함으로써 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 본 명세서 및 실시예는 예로서만 고려되며, 본 발명의 실제 영역 및 취지는 다음의 청구범위에 의해 나타나는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> UNIVERSIDADE DO MINHO
<120> NOVEL ENDOLYSIN
<130> IP20193674DE
<150> EP16204770.8
<151> 2016-12-16
<160> 10
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 164
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Endolysin derived from Citrobacter Koseri phage CkP1
<400> 1
Met Asn Ile Phe Lys Met Leu Arg Ile Asp Glu Gly Tyr Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ile Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Phe Trp Thr Ile Gly Ile Gly His Leu
20 25 30
Leu Thr Arg Asp Pro Ser Leu Glu Val Ala Lys Arg Glu Leu Asp Lys
35 40 45
Leu Val Gly Arg Lys Cys Asn Gly Gln Ile Thr Gln Ser Glu Ala Glu
50 55 60
Lys Ile Phe Ala Asp Asp Val Asp Lys Ala Ile Asn Gly Ile Lys Lys
65 70 75 80
Asn Ala Ser Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Gly Asp Asp Pro
85 90 95
Arg Gln Ala Ala Leu Ile Asn Met Val Phe Gln Met Gly Val Ala Gly
100 105 110
Val Ala Gly Phe Thr Asn Ser Met Arg Met Val Lys Glu Lys Arg Trp
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Val Asn Leu Ala Gln Ser Lys Trp Tyr Arg Gln Thr
130 135 140
Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val Ile Glu Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ala Tyr Lys
<210> 2
<211> 492
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Endolysin derived from Citrobacter Koseri phage CkP1
<400> 2
atgaacattt ttaaaatgct tcgtatcgat gaaggatacg attctaaaat ctataaagat 60
accgaagggt tttggactat cggtatcggt caccttttaa ctcgcgaccc ttctcttgaa 120
gtagccaaaa gagaacttga taaactcgtt gggcgtaagt gcaacggtca aatcactcag 180
tcggaagcag aaaagatttt cgctgatgat gttgataaag ctattaatgg aatcaagaaa 240
aacgcttctc tgaaaccggt ttatgattct cttgatggag atgatccgcg tcaagctgca 300
ctcatcaata tggtatttca aatgggtgta gctggtgtag ctggcttcac taattctatg 360
agaatggtaa aagaaaaacg ttgggctgat gcagctgtaa atttagctca atcaaaatgg 420
tatcgtcaaa ctccgaatcg cgctaaacga gtaattgaaa cattccgcac tggaacatgg 480
aacgcatata aa 492
<210> 3
<211> 163
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Catalytic domain of endolysin derived from Citrobacter Koseri
phage CkP1
<400> 3
Met Asn Ile Phe Lys Met Leu Arg Ile Asp Glu Gly Tyr Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ile Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Phe Trp Thr Ile Gly Ile Gly His Leu
20 25 30
Leu Thr Arg Asp Pro Ser Leu Glu Val Ala Lys Arg Glu Leu Asp Lys
35 40 45
Leu Val Gly Arg Lys Cys Asn Gly Gln Ile Thr Gln Ser Glu Ala Glu
50 55 60
Lys Ile Phe Ala Asp Asp Val Asp Lys Ala Ile Asn Gly Ile Lys Lys
65 70 75 80
Asn Ala Ser Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Gly Asp Asp Pro
85 90 95
Arg Gln Ala Ala Leu Ile Asn Met Val Phe Gln Met Gly Val Ala Gly
100 105 110
Val Ala Gly Phe Thr Asn Ser Met Arg Met Val Lys Glu Lys Arg Trp
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Val Asn Leu Ala Gln Ser Lys Trp Tyr Arg Gln Thr
130 135 140
Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val Ile Glu Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ala Tyr
<210> 4
<211> 489
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Catalytic domain of endolysin derived from Citrobacter Koseri
phage CkP1
<400> 4
atgaacattt ttaaaatgct tcgtatcgat gaaggatacg attctaaaat ctataaagat 60
accgaagggt tttggactat cggtatcggt caccttttaa ctcgcgaccc ttctcttgaa 120
gtagccaaaa gagaacttga taaactcgtt gggcgtaagt gcaacggtca aatcactcag 180
tcggaagcag aaaagatttt cgctgatgat gttgataaag ctattaatgg aatcaagaaa 240
aacgcttctc tgaaaccggt ttatgattct cttgatggag atgatccgcg tcaagctgca 300
ctcatcaata tggtatttca aatgggtgta gctggtgtag ctggcttcac taattctatg 360
agaatggtaa aagaaaaacg ttgggctgat gcagctgtaa atttagctca atcaaaatgg 420
tatcgtcaaa ctccgaatcg cgctaaacga gtaattgaaa cattccgcac tggaacatgg 480
aacgcatat 489
<210> 5
<211> 163
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Endolysin derived from Citrobacter Koseri phage CkP1 w/o
N-terminal methionine
<400> 5
Asn Ile Phe Lys Met Leu Arg Ile Asp Glu Gly Tyr Asp Ser Lys Ile
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Phe Trp Thr Ile Gly Ile Gly His Leu Leu
20 25 30
Thr Arg Asp Pro Ser Leu Glu Val Ala Lys Arg Glu Leu Asp Lys Leu
35 40 45
Val Gly Arg Lys Cys Asn Gly Gln Ile Thr Gln Ser Glu Ala Glu Lys
50 55 60
Ile Phe Ala Asp Asp Val Asp Lys Ala Ile Asn Gly Ile Lys Lys Asn
65 70 75 80
Ala Ser Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Gly Asp Asp Pro Arg
85 90 95
Gln Ala Ala Leu Ile Asn Met Val Phe Gln Met Gly Val Ala Gly Val
100 105 110
Ala Gly Phe Thr Asn Ser Met Arg Met Val Lys Glu Lys Arg Trp Ala
115 120 125
Asp Ala Ala Val Asn Leu Ala Gln Ser Lys Trp Tyr Arg Gln Thr Pro
130 135 140
Asn Arg Ala Lys Arg Val Ile Glu Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asn
145 150 155 160
Ala Tyr Lys
<210> 6
<211> 162
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Catalytic domain of endolysin derived from Citrobacter Koseri
phage CkP1 w/o N-terminal methionine
<400> 6
Asn Ile Phe Lys Met Leu Arg Ile Asp Glu Gly Tyr Asp Ser Lys Ile
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Phe Trp Thr Ile Gly Ile Gly His Leu Leu
20 25 30
Thr Arg Asp Pro Ser Leu Glu Val Ala Lys Arg Glu Leu Asp Lys Leu
35 40 45
Val Gly Arg Lys Cys Asn Gly Gln Ile Thr Gln Ser Glu Ala Glu Lys
50 55 60
Ile Phe Ala Asp Asp Val Asp Lys Ala Ile Asn Gly Ile Lys Lys Asn
65 70 75 80
Ala Ser Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Gly Asp Asp Pro Arg
85 90 95
Gln Ala Ala Leu Ile Asn Met Val Phe Gln Met Gly Val Ala Gly Val
100 105 110
Ala Gly Phe Thr Asn Ser Met Arg Met Val Lys Glu Lys Arg Trp Ala
115 120 125
Asp Ala Ala Val Asn Leu Ala Gln Ser Lys Trp Tyr Arg Gln Thr Pro
130 135 140
Asn Arg Ala Lys Arg Val Ile Glu Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asn
145 150 155 160
Ala Tyr
<210> 7
<211> 184
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Recombninant endolysin derived from Citrobacter Koseri phage CkP1
including N-terminal HisTag
<400> 7
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Asn Ile Phe Lys Met Leu Arg Ile Asp Glu Gly
20 25 30
Tyr Asp Ser Lys Ile Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Phe Trp Thr Ile Gly
35 40 45
Ile Gly His Leu Leu Thr Arg Asp Pro Ser Leu Glu Val Ala Lys Arg
50 55 60
Glu Leu Asp Lys Leu Val Gly Arg Lys Cys Asn Gly Gln Ile Thr Gln
65 70 75 80
Ser Glu Ala Glu Lys Ile Phe Ala Asp Asp Val Asp Lys Ala Ile Asn
85 90 95
Gly Ile Lys Lys Asn Ala Ser Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp
100 105 110
Gly Asp Asp Pro Arg Gln Ala Ala Leu Ile Asn Met Val Phe Gln Met
115 120 125
Gly Val Ala Gly Val Ala Gly Phe Thr Asn Ser Met Arg Met Val Lys
130 135 140
Glu Lys Arg Trp Ala Asp Ala Ala Val Asn Leu Ala Gln Ser Lys Trp
145 150 155 160
Tyr Arg Gln Thr Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val Ile Glu Thr Phe Arg
165 170 175
Thr Gly Thr Trp Asn Ala Tyr Lys
180
<210> 8
<211> 552
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Recombninant endolysin derived from Citrobacter Koseri phage CkP1
including N-terminal HisTag
<400> 8
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgaacattt ttaaaatgct tcgtatcgat gaaggatacg attctaaaat ctataaagat 120
accgaagggt tttggactat cggtatcggt caccttttaa ctcgcgaccc ttctcttgaa 180
gtagccaaaa gagaacttga taaactcgtt gggcgtaagt gcaacggtca aatcactcag 240
tcggaagcag aaaagatttt cgctgatgat gttgataaag ctattaatgg aatcaagaaa 300
aacgcttctc tgaaaccggt ttatgattct cttgatggag atgatccgcg tcaagctgca 360
ctcatcaata tggtatttca aatgggtgta gctggtgtag ctggcttcac taattctatg 420
agaatggtaa aagaaaaacg ttgggctgat gcagctgtaa atttagctca atcaaaatgg 480
tatcgtcaaa ctccgaatcg cgctaaacga gtaattgaaa cattccgcac tggaacatgg 540
aacgcatata aa 552
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ORF131 forward primer
<400> 9
gggcatatga acatttttaa aatgcttcg 29
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ORF131 reverse primer
<400> 10
gggggatcct catttatatg cgttccatg 29
Claims (14)
- 서열 번호: 1에 따른 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하는 폴리펩타이드로, 상기 유도체는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 3의 아미노산 서열 내 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환을 갖는 아미노산이고, 상기 단편은 서열번호: 3, 서열 번호: 5, 또는 서열 번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것인, 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 단편이 서열 번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리펩타이드가 N- 또는 C-말단에서 막 또는 LPS 파괴 활성을 갖는 펩타이드 스트레치(peptide stretch)에 융합된 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 태그(tag)를 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, His6-태그를 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리펩타이드가 엔돌리신 활성을 갖는 폴리펩타이드.
- 제1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자.
- 제7항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
- 제7항에 따른 핵산 분자 또는 제8항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 수술(surgery) 또는 치료법(therapy)에 의해 사람 또는 동물의 신체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 또는 사람 또는 동물의 신체에서 실시되는 진단 방법에 사용하기 위한, 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 식품, 사료 또는 화장품 속의 항미생물제로서, 또는 살균제로서의 사용을 위한 것인, 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 그람-음성 세균 감염의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 것인, 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 식료품의, 식품 가공 장비의, 식품 가공 공장의, 식료품과 접촉하게 되는 표면의, 사료의, 사료 가공 장비의, 사료 가공 공장의, 사료와 접촉하게 되는 표면의, 의료 장치의, 병원 및 의사의 사무실에서의 표면의 그람-음성 세균 오염(gram-negative bacterial contamination)의 처리(treatment) 또는 예방(prevention)을 위한 것인, 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 따른 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로, 그람-음성 세균 감염의 치료 또는 예방 을 위한 것인 약제학적 조성물.
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