TWI527521B

TWI527521B - 減少生物膜的方法

Info

Publication number: TWI527521B
Application number: TW100114595A
Authority: TW
Inventors: 史帝芬米勒
Original assignee: 利山鐸公司
Priority date: 2010-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2016-04-01
Also published as: KR20130100062A; WO2011134998A1; EA037276B1; JP2013532955A; MX340520B; AU2011247584B2; BR112012026880B1; DK2563916T3; US20170173121A1; US10485854B2; CN103119158A; EP2563916A1; CN103119158B; CA2794603C; AU2011247584A1; HK1183687A1; US20130052182A1; IL222713A0; EP2563916B1; TW201204262A

Description

減少生物膜的方法

本發明涉及消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其依靠包含與具有膜或LPS破壞活性的肽融合的內溶素、自溶素或細菌素的融合蛋白來進行。此外，本發明涉及作為藥物(特別是用於治療或預防與細菌生物膜有關的革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌感染)、作為診斷手段、消毒劑或作為化妝用物質使用的融合蛋白。本發明還涉及除去或減少或阻止食品、食物加工設備、食物加工廠、與食品接觸的表面、醫學裝置、醫院和診所表面的與細菌生物膜有關的革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌污染。此外，本發明涉及所述融合蛋白作為診斷手段在與細菌生物膜有關的醫學、食物或飼料或環境診斷中的用途。

內溶素是由噬菌體(或細菌病毒)編碼的肽聚糖水解酶。它們在噬菌體繁殖的裂解週期中在晚期基因表達過程中合成，而且經由降解細菌肽聚糖來介導後代病毒體自受感染細胞的釋放。它們是β-(1,4)-糖基化酶(溶菌酶)、轉糖基酶、醯胺酶或內肽酶。Gasson(GB2243611)在1991年已經提示了內溶素的抗微生物應用。雖然已經長時間知道內溶素的殺死性能，但這些酶作為抗細菌劑的用途由於抗生素的成功和優勢而被忽視。僅在多抗生素抗性細菌出現後，用內溶素對抗人病原體的此簡單的觀念才受到注意。出現開發完全新種類的抗細菌劑的迫切需要，並且作為“酶生素(enzybiotic)”(“酶”和“抗生素”的雜合術語)使用的內溶素完全滿足此需要。在2001年，Fischetti及同事第一次證明了噬菌體Cl內溶素針對A群鏈球菌的治療潛力(Nelson等,2001)。從那時起，許多出版物已經將內溶素確立為一種用於控制細菌感染，特別是由革蘭氏陽性細菌引起的細菌感染的有吸引力的且互補的備選。隨後，針對其他革蘭氏陽性病原體諸如肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(Loeffler等,2001)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)(Schuch等,2002)、無乳鏈球菌(S. agalactiae)(Cheng等,2005)和金黃色葡萄球菌(Rashel等,2007)的不同內溶素已經證明了其作為酶生素的功效。現在，內溶素療法的最重要的考驗在於革蘭氏陰性細菌對內溶素的外源作用的不敏感性，因為外膜防護內溶素接近肽聚糖。這目前阻止有效的內溶素的範圍擴展至重要的革蘭氏陰性病原體。

革蘭氏陰性細菌擁有外膜，以其特徵性非對稱雙層為標誌。外膜雙層由含有磷脂(主要為磷脂醯乙醇胺)的內部單層和主要由單一糖脂，即脂多糖(LPS)構成的外部單層組成。在細菌界中有極其多樣的LPS結構，而且LPS結構可以回應佔優勢的環境條件而進行修飾。LPS層的穩定性和不同LPS分子間的相互作用主要通過二價離子(Mg²⁺，Ca²⁺)與LPS分子的陰離子組分(脂質A和內部核心中的磷酸根基團和KDO的羧基基團)的靜電相互作用來實現。因此，陽離子結合位點對於外膜的完整性是至關重要的(Vaara,1992)。聚陽離子劑諸如多聚L-賴氨酸聚合物(具有至少20個殘基)通過替換這些穩定化的二價陽離子來提高外膜通透性。另外，它們施加所謂的“自我促進攝取”機制(Hancock和Wong,1984)。由於其龐大，它們破壞外膜的正常屏障功能，而且產生暫態的裂縫，促進其自身攝取(Vaara和Vaara,1983)。此外，脂質A的疏水性模組的密集且有序的包裝(由於缺乏不飽和脂肪酸而得到促進)形成具有高粘度的剛性結構。這使其對親脂性分子不太可透過，而且對外膜(OM)賦予額外的穩定性。

與革蘭氏陰性細菌形成對比，革蘭氏陽性細菌不擁有外膜。細胞質膜圍繞有形成細胞壁的厚達25nm的肽聚糖層(其對於革蘭氏陰性細菌而言僅達5nm)。革蘭氏陽性的細胞壁的主要目的是維持細菌形狀，並抵抗內部細菌細胞壓力。肽聚糖或胞壁質是一種由糖和氨基酸組成的聚合物。糖組分由構成糖組分的β-(1,4)連接的N-乙醯葡糖胺和N-乙醯胞壁酸殘基的交替殘基構成。3至5個氨基酸的肽鏈附著於N-乙醯胞壁酸。肽鏈可以與另一條鏈的肽鏈交聯，形成3D網孔樣層。肽鏈可以含有D-和L-氨基酸殘基，而且組成可以隨不同細菌而變化。

大多數革蘭氏陰性細菌及許多革蘭氏陽性細菌形成細菌生物膜。生物膜定義為粘附於表面的微生物聚集體或聯合體。粘附細菌經常被由革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌所生成的胞外聚合物物質圍繞並保護。由於生物膜，細菌對抗微生物物質，如抗生素、消毒劑和細胞壁降解酶的抗性高得多。另外，由於胞外聚合物物質保護自身免於被抗微生物物質、消毒劑或生物膜降解物質降解，對生物膜的處理目前不可行。

如此，需要消除、減少或阻止細菌生物膜的方法。

本案一實施例提供一種消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，包括a)提供包含與具有膜或LPS破壞活性的肽融合的內溶素、自溶素或細菌素的融合蛋白；及b)使材料、液體、表面或生物學材料與所述融合蛋白接觸。

本案一實施例更提供一種用作藥物以治療與細菌生物膜有關的革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌感染的內溶素變體、自溶素變體或細菌素變體，其包含與具有膜或LPS破壞活性的肽融合的內溶素、自溶素或細菌素。

本案更一實施例提供上述內溶素變體、自溶素變體或細菌素變體用於除去、減少和/或阻止食品、食物加工設備、食物加工廠、與食品接觸的表面、醫學裝置、醫院和診所表面的與細菌生物膜有關的革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌污染的用途。

本案再一實施例提供上述內溶素變體、自溶素變體或細菌素變體作為診斷手段在與細菌生物膜有關的醫學、食物或飼料或環境診斷中、作為消毒劑或化妝用物質的用途。

如本文中所使用的，術語“蛋白質”同義地指術語“多肽”。如本文中所使用的，術語“蛋白質”指特定序列中由肽鍵連接的氨基酸殘基的線性聚合物。可以通過例如多種基團諸如碳水化合物和磷酸根的共價附著來修飾蛋白質的氨基酸殘基。其他物質可以與多肽鏈更鬆散地聯合，諸如血紅素或脂質，產生綴合蛋白質，其也被如本文中所使用的術語“蛋白質”所包含。已經闡明了多肽鏈折疊的多種方式，特別是關於α螺旋和β-折疊片層的存在。如本文中所使用的，術語“蛋白質”指所有四類蛋白質，它們是全α、全β、α/β和α加β。此外，術語“蛋白質”指一種複合物，其中該複合物指同聚體。

如本文中所使用的，術語“融合蛋白”指源自兩種核酸序列融合的表達產物。此類蛋白質可以例如在重組DNA表達系統中或者通過化學交聯來生成。此外，如本文中所使用的，術語“融合蛋白”指第一氨基酸序列，特別是內溶素、自溶素或細菌素和/或其他肽聚糖水解酶與第二或別的氨基酸序列的融合物。優選地，所述第二或別的氨基酸序列是肽，特別是陽離子、聚陽離子、疏水性、雙親性和/或抗微生物肽。優選地，所述第二和/或別的氨基酸序列對於第一氨基酸序列的任何域而言是外來的，而且與第一氨基酸序列的任何域基本上不是同源的。

術語“經修飾的內溶素變體”在本文中與術語“內溶素變體”同義使用。這兩種術語都指包含內溶素和肽，特別是陽離子、聚陽離子、疏水性、雙親性和/或抗微生物肽的融合蛋白。

術語“經修飾的細菌素變體”在本文中與術語“細菌素變體”同義使用。這兩種術語都指包含細菌素和肽，特別是陽離子、聚陽離子、疏水性、雙親性和/或抗微生物肽的融合蛋白。

術語“經修飾的自溶素變體”在本文中與術語“自溶素變體”同義使用。這兩種術語都指包含自溶素和肽，特別是陽離子、聚陽離子、疏水性、雙親性和/或抗微生物肽的融合蛋白。

如本文中所使用的，術語“肽段”指與諸如內溶素、細菌素或自溶素等蛋白質連接的任何種類的肽。具體地，如本文中所使用的，術語“肽段”指陽離子肽、聚陽離子肽、雙親性肽、疏水性肽和/或抗微生物肽。然而，本發明意義上的肽段不指His標籤(優選地His₅標籤、His₆標籤、His₇標籤、His₈標籤、His₉標籤、His₁₀標籤、His₁₁標籤、His₁₂標籤、His₁₆標籤和His₂₀標籤)、Strep標籤、Avi標籤、Myc標籤、Gst標籤、JS標籤、半胱氨酸標籤、FLAG標籤或本領域中已知的其他標籤、硫氧還蛋白或麥芽糖結合蛋白(MBP)。如本文中所使用的，與術語“肽段”形成對比，術語“標籤”指可用於促進多肽表達和/或親和純化、將多肽固定化於表面或者充當標誌物或標記模組以例如通過不同ELISA測定法形式中的抗體結合來檢測多肽的肽，只要使標籤可用于上文所列便利之一的所述功能不是由所述肽的正電荷引起的。然而，根據各自的pH，His₆標籤也可以是帶正電荷的，但是由於它結合固定化的二價陽離子而作為親和純化工具使用，而不作為依照本發明的肽段使用。

如本文中所使用的，術語“肽”指由約2至約100個氨基酸殘基、更優選地約4至約50個氨基酸殘基、更優選地約5至30個氨基酸殘基組成的短肽，其中一個氨基酸殘基的氨基基團與另一個氨基酸殘基的羧基基團通過肽鍵連接。肽可以具有特定功能。肽可以是天然存在的肽或合成設計並生成的肽。肽可以例如通過酶促或化學切割自天然蛋白質衍生或取出，或者可以使用常規的肽合成技術(例如固相合成)或分子生物學技術(參見Sambrook,J.等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))來製備。優選的合成生成的肽是例如陽離子、聚陽離子、雙親性或疏水性肽。優選的天然存在的肽是例如抗微生物肽。

如本文中所使用的，術語“陽離子肽”指具有帶正電荷的氨基酸殘基的肽。優選地，陽離子肽具有9.0或更大的pKa值。通常，陽離子肽的至少4個氨基酸殘基可以是帶正電荷的，例如賴氨酸或精氨酸。“帶正電荷的”指在大約生理學條件具有淨正電荷的氨基酸殘基側鏈。如本文中所使用的，術語“陽離子肽”還指聚陽離子肽。

如本文中所使用的，術語“聚陽離子肽”指合成設計並生成的肽，其主要由帶正電荷的氨基酸殘基，特別是賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸殘基，更優選地賴氨酸和/或精氨酸殘基構成。如果至少約20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95或約100%的氨基酸殘基是帶正電荷的氨基酸殘基，特別是賴氨酸和/或精氨酸殘基，那麼肽主要由帶正電荷的氨基酸殘基構成。不作為帶正電荷的氨基酸殘基的氨基酸殘基可以是帶中性電荷的氨基酸殘基和/或帶負電荷的氨基酸殘基和/或疏水性氨基酸殘基。優選地，不作為帶正電荷的氨基酸殘基的氨基酸殘基是帶中性電荷的氨基酸殘基，特別是絲氨酸和/或甘氨酸。

如本文中所使用的，術語“抗微生物肽”(AMP)指對例如細菌、病毒、真菌、酵母、枝原體和原生動物具有殺微生物和/或微生物抑制活性的任何天然存在的肽。如此，如本文中所使用的，術語“抗微生物肽”特別指具有抗細菌、抗真菌、抗黴菌、抗寄生物、抗原生動物、抗病毒、抗傳染、抗感染和/或殺菌、殺藻、殺阿米巴(amoebicidal)、殺微生物、殺細菌、殺真菌、殺寄生物、殺原生動物(protozoacidal)、殺原蟲(protozoicidal)特性的任何肽，特別是壽司肽(sushi peptide)和防衛素。抗微生物肽可以是RNA酶A超家族的成員、防衛素、Cathelicidin、粒溶素(granulysin)、富組蛋白(histatin)、Psoriasin、Dermicidine或Hepcidin。抗微生物肽可以天然存在於昆蟲、魚、植物、蜘蛛類、脊椎動物或哺乳動物中。

優選地，抗微生物肽可以天然存在於昆蟲、魚、植物、蜘蛛類、脊椎動物或哺乳動物中。優選地，抗微生物肽可以天然存在於蘿蔔、蠶絲蛾、狼蛛、蛙優選地在非洲爪蟾(Xenopus laevis)中、林蛙(rana frog)更優選地在牛蛙(Rana catesbeiana)中、蟾蜍優選地亞洲蟾蜍中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)中、蠅優選地在果蠅(Drosophila)中更優選地在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中、在埃及伊蚊(Aedes aegypti)中、在蜜蜂中、大黃蜂優選地在牧熊蜂(Bombus pascuorum)中、麻蠅優選地在棕尾別麻蠅(Sarcophaga peregrine)中、蠍、鱟、鯰魚優選地在鯰魚(Parasilurus asotus)中、牛(cow)、豬(pig)、綿羊、豬(porcine)、牛(bovine)、猴和人中。

如本文中所使用的，術語“壽司肽”指具有短共有重複的補體控制蛋白(CCP)。壽司肽的壽司模組在許多不同蛋白質中發揮蛋白質-蛋白質相互作用域的功能。已經顯示了含有壽司域的肽具有抗微生物活性。優選地，壽司肽是天然存在的抗微生物肽。

如本文中所使用的，術語“雙親性肽”指具有親水性和疏水性官能團兩者的合成肽。優選地，如本文中所使用的，術語“雙親性肽”指具有親水性和疏水性基團的限定排列的肽，例如雙親性肽可以是例如α螺旋，主要具有沿著螺旋一側的非極性側鏈和沿著其表面剩餘部分的極性殘基。

如本文中所使用的，術語“疏水性基團”指基本上水不溶性的，但是在油相中可溶的化學基團諸如氨基酸側鏈，其中在油相中的溶解度高於在水中或在水相中的溶解度。在水中，具有疏水性側鏈的氨基酸殘基彼此相互作用以產生非水性環境。具有疏水性側鏈的氨基酸殘基的例子有纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸殘基。

如本文中所使用的，術語“內溶素”指適合於水解細菌細胞壁的酶。“內溶素”包含至少一個“酶活性域”(EAD)，其具有至少一項下列活性：內肽酶、N-乙醯基-胞壁醯-L-丙氨酸-醯胺酶(醯胺酶)、N-乙醯基-胞壁質酶(muramidase,muraminidase)、N-乙醯基-氨基葡萄糖苷酶(溶菌酶)或轉糖基酶。另外，內溶素還可以含有無酶活性，並且結合宿主細菌細胞壁的區域，即所謂的CBD(細胞壁結合域)。內溶素可以含有一個、兩個或更多個CBD。然而，如本文中所使用的，術語“內溶素”還指具有至少一個EAD但無CBD的酶。一般而言，細胞壁結合域能夠結合細菌表面上的不同成分。優選地，細胞壁結合域是肽聚糖結合域，而且結合細菌的肽聚糖。

如本文中所使用的，術語“細胞壁”指形成革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的細胞外殼，並且如此保證其完整性的所有組分。具體地，如本文中所使用的，術語“細胞壁”指肽聚糖、具有脂多糖的革蘭氏陰性細菌的外膜、細菌細胞膜，但是還指別的沉積於肽聚糖上作為例如莢膜、蛋白質外層或粘液的層。

如本文中所使用的，術語“自溶素”指與內溶素有關，但由細菌編碼並牽涉例如細胞分裂和細胞壁代謝的酶。自溶素的概述可以參見“Bacterial peptidoglycan(murein) hydrolases. Vollmer W,Joris B,Charlier P,Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar;32(2):259-86”。

如本文中所使用的，術語“細菌素”指能夠抑制其他細菌生長的蛋白質樣、多肽樣或肽樣物質。一些細菌素能夠降解細菌細胞壁，如溶葡萄球菌素(Lysostaphin)(降解葡萄球菌細胞壁)、變溶菌素(Mutanolysin)(降解鏈球菌細胞壁)和腸溶素(Enterolysin)(降解腸球菌細胞壁)。優選地，所述抑制特異性地依靠所述其他細菌對細菌素特異性受體的吸收。一般地，細菌素由微生物生成。然而，如本文中所使用的，術語“細菌素”指由微生物生成的分離的形式或合成生成的形式兩者，而且還指基本上保留其親本細菌素的活性，但其序列已經通過插入或刪除一個或多個氨基酸殘基來改變的變體。

如本文中所使用的，術語“EAD”指內溶素的酶活性域。EAD負責水解細菌肽聚糖。它展現出內溶素的至少一種酶活性。EAD也可以由超過一種酶活性模組構成。術語“EAD”在本文中與術語“催化域”同義使用。

如本文中所使用的，術語“刪除”指自各自的起始序列除去1、2、3、4、5或更多個氨基酸殘基。

如本文中所使用的，術語“插入”或“添加”指向各自的起始序列插入或添加1、2、3、4、5或更多個氨基酸殘基。

如本文中所使用的，術語“替代”指將位於某個位置的氨基酸殘基交換為不同的氨基酸殘基。如本文中所使用的，術語“生物膜”指細菌微生物的聚集體，其中細菌細胞彼此粘附和/或粘附於表面。這些粘附細胞經常覆蓋有由細胞所生成的胞外聚合物質(EPS)的基質。生物膜EPS由胞外DNA、蛋白質、和多糖構成。這些生物膜可以在任何活的或無生命的表面上，特別地在固體表面上作為菌落和在液體表面上作為菌膜形成。在生物膜中生長的微生物細胞在生理學上與相同微生物的浮游細胞不同。

本發明涉及消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，包括下列步驟：a)提供包含與具有膜或LPS破壞活性的肽融合的酶的融合蛋白，所述酶具有降解革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌的細胞壁的活性；並b)使材料、液體、表面或生物學材料與所述融合蛋白接觸。優選地，本發明涉及消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，包括下列步驟：c)提供包含與具有膜或LPS破壞活性的肽融合的內溶素、自溶素或細菌素的融合蛋白；並d)使材料、液體、表面或生物學材料與所述融合蛋白接觸。術語“提供”依照本發明的融合蛋白指僅取得並使用依照本發明的融合蛋白或者生成並純化此類融合蛋白，之後依照本發明使用。

優選地，材料是石塊、岩石、土壤、沉積物、食物、飼料或化妝品。優選的，液體是水諸如飲用水、地下水或廢水，溫泉、海、湖、河、任何種類的水性系統，隱形眼鏡、假牙、植入物、假體或支具的清潔和貯存溶液。優選地，生物學材料是自活的生物體，特別是植物和哺乳動物，優選地人衍生的或獲得的任何物質，例如細胞、組織、器官、血液、血液組分和體液。優選地，細胞是例如有核細胞或無核細胞。細胞可以自任何器官衍生，特別是肝細胞、平滑肌細胞、內皮細胞、角質形成細胞、胰島細胞、幹細胞(成年的和新生兒的、各種組織、或物種起源)、幹細胞祖細胞、臍帶血細胞、配子(雄性和雌性)、配子祖細胞、成紅血細胞、成白細胞、和成軟骨細胞。組織是例如粘膜、神經、肌肉、上皮、結締和支援組織、口腔軟組織和牙。器官是例如心臟、心瓣膜、眼、耳、尿道、肺、肝、腎、膽道、前列腺、鼻、消化道、呼吸道、胃腸道、腦和骨髓。優選的體液是尿液、腦脊液和淋巴液。

優選地，表面是固體生物學或非生物表面。表面的優選的例子有醫學裝置，特別是植入物、假體、導管，諸如牙科植入物、尿道假體、腹膜膜和腹膜透析導管、用於血液透析和長期施用化療劑的留置導管(Hickman導管)、心臟植入物諸如起搏器、假體心瓣膜、心室輔助裝置、合成的血管移植物和支架、內部固定裝置、經皮縫合物及氣管和呼吸器管道的表面，及工業或飲用水系統管道和天然水生系統的表面。

生物膜由細菌細胞彼此粘附和/或粘附於表面的細菌微生物形成。由生物膜的細菌微生物所分泌的胞外聚合物質(EPS)與水一起形成水凝膠，從而形成粘液樣基質。此基質還可以包含氣泡和無機顆粒。生物膜EPS由胞外DNA、蛋白質、和多糖構成。除細菌微生物外，其他單細胞生物體可以併入生物膜中。生物膜可以通過細菌微生物沉降至介面而發生。生物膜主要在水表面上或在與固相的介面上形成。這些生物膜可以在任何活的或無生命的表面上形成。一般而言，所有介面都可以被生物膜沉降。生物膜幾乎存在於任何地方，在土壤和沉積物中、在地下水中、在岩石上、在沙漠(dessert)中、在溫泉中、在植物和動物之上和之中，特別地在粘膜上。此外，生物膜可以存在於醫學裝置，諸如植入物、導管、內鏡、假體、儀器、和裝置上，但是也存在於化妝品、食物和飼料中。生物膜還可以與感染有關，因為在大多數情況中，細菌微生物形成針對免疫系統受到保護的生物膜。生物膜的形成確保細菌微生物的長期存活。急性呼吸道感染的一個例子是軍團病，其是通過吞下或吸入自加熱或冷卻系統的空氣或水管分離的軍團桿菌生物膜塊引起的。許多食物細菌，如大腸桿菌0157:H7、單核細胞增生利斯特氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、沙門氏菌(Salmonella spp.)和空腸彎曲桿菌(Camphylobacter jejuni)也可以在食物和裝置上形成生物膜，然後，它們對殺生物劑、乾燥、熱、抗生素和清潔試劑高度有抗性。造成植入物、導管和其他醫學裝置感染的微生物可以是凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、不動桿菌(Acinetobacter spp.)、奇異變形菌(Proteus mirabilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginsa)和假絲酵母(Candida spp.)，其還與廣譜的醫院感染有關。人的與生物膜有關的典型細菌感染有：傷口感染特別是與糖尿病有關的傷口、扁桃體炎、骨髓炎、細菌性心內膜炎、鼻竇炎、角膜感染、尿道感染、膽道感染、感染性腎結石、尿道炎、前列腺炎、導管感染、中耳感染、牙斑形成、齦炎、牙周炎、囊性纖維化病、和永久性留置裝置諸如關節假體和心瓣膜的感染。

可以通過多種測試，諸如通過記載於Christensen等,J Clin Microbiol 22:996-1006(1985)的組織培養板法(TCP)，或者通過如先前由Christensen等,Infect Immun 37:318-26(1982)所描述的管法(TM)，或者通過由Freeman等,J Clin Pathol 42:872-4(1989)所描述的剛果紅瓊脂法(CRA)來測定生物膜的存在。可以通過使用結晶紫測定法(Peeters等,J Microbiol Methods 72: 157-165(2008))來量化生物膜。

依照本發明的融合蛋白可以影響形成生物膜的細菌的相互作用，從而將細胞以單個浮游細胞轉移，然後所述單個浮游細胞被所述融合蛋白溶解，因此，然後部分或完全降解生物膜。依照本發明的融合蛋白對細菌的影響也可以直接溶解生物膜中聯合的細菌，並且如此，部分或完全降解生物膜。此外，依照本發明的融合蛋白可以通過溶解能夠與其他細菌一起形成生物膜的細菌來阻止細菌生物膜的形成。

優選地，依照本發明的融合蛋白涉及內溶素變體、細菌素變體和自溶素變體。

優選的依照本發明的融合蛋白包含與具有脂多糖(LPS)或一般地膜破壞活性的肽融合的內溶素、自溶素或細菌素。LPS是革蘭氏陰性細菌外膜的一種主要組分。它增加細胞膜的負電荷，而且保護膜免於某些種類的化學攻擊。在一定程度上，所述LPS也保護革蘭氏陰性細菌的膜免於自細菌外部添加的內溶素。然而，具有LPS破壞活性的肽像例如帶正電荷的肽能破壞LPS。此外，所述肽可以牽涉外膜蛋白質轉運機制、結構外膜蛋白的脫穩定化和/或脂質依賴性脫穩定化。本發明的發明人已經驚人地發現了具有LPS破壞活性或一般地膜破壞活性的肽促進與所述肽融合的內溶素、自溶素或細菌素通過革蘭氏陰性細菌的外膜。在內溶素、自溶素或細菌素通過細菌外膜得到促進後，由於降解肽聚糖層，可以通過內溶素更容易地破壞或分解細菌的細胞壁，接著在不能再對抗細菌的內部細胞壓時發生滲透溶胞。革蘭氏陽性細菌比革蘭氏陰性細菌具有厚得多的肽聚糖層。在本文，融合蛋白的膜破壞活性通過對細胞質膜起作用來支持細菌的溶胞。

如此，本發明涉及依靠融合蛋白來消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，所述融合蛋白由具有降解革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌的細胞壁的活性的酶，優選地內溶素、自溶素或細菌素和具有膜破壞活性的肽構成，其中所述肽在N和/或C端與酶融合。依照本發明的所述融合蛋白也稱作經修飾的內溶素變體或僅內溶素變體或經修飾的內溶素、經修飾的自溶素變體或自溶素變體、經修飾的細菌素或細菌素變體。

優選地，融合蛋白的內溶素部分由對革蘭氏陰性細菌特異性的噬菌體編碼，所述革蘭氏陰性細菌諸如包括人或動物的病原性菌株的細菌群、科、屬或種的革蘭氏陰性細菌，如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(埃希氏菌屬(Escherichia)特別是大腸桿菌(E. coli)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)特別是肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、摩根氏菌屬(Morganella)、變形菌屬(Proteus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、耶爾森氏菌屬(Yersinia))、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)(假單胞菌屬(Pseudomonas)特別是銅綠假單胞菌、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas))、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、布魯氏菌屬(Brucella)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、博多特氏菌屬(Bordetella)、軍團菌屬(Legionella)、巴爾通氏體屬(Bartonella)、考克斯氏體屬(Coxiella)、嗜血菌屬(Haemophilus)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、曼海姆氏菌屬(Mannheimia)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、加德納氏菌屬(Gardnerella)、螺旋體科(Spirochaetaceae)(密螺旋體屬(Treponema)和疏螺旋體屬(Borrelia))、鉤端螺旋體科(Leptospiraceae)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、螺菌屬(Spirillum)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)(擬桿菌屬(Bacteroides)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas))、不動桿菌屬(Acinetobacter)特別是鮑氏不動桿菌(A. baumannii)。

在另一個優選的實施方案中，融合蛋白的內溶素由對革蘭氏陽性細菌特異性的噬菌體編碼，所述革蘭氏陽性細菌諸如包括人或動物的病原性菌株的細菌群、科、屬或種的革蘭氏陽性細菌，特別是放線菌門(Actinobacteria)，特別是放線菌綱(Actinobacteridae)，特別是放線菌目(Actinomycetales)，特別是放線菌亞目(Actinomycineae)：放線菌科(Actinomycetaceae)(放線菌屬(Actinomyces)、動彎桿菌屬(Mobiluncus))，棒桿菌亞目(Corynebacterineae)：分枝桿菌科(Mycobacteriaceae)(分枝桿菌屬(Mycobacterium))、諾卡氏菌科(Nocardiaceae)、棒桿菌科(Corynebacteriaceae)，弗蘭克氏菌亞目(Frankineae)：弗蘭克氏菌科(Frankiaceae)，微球菌亞目(Micrococcineae)：短桿菌科(Brevibacteriaceae)和丙酸桿菌科(Propionibacteriaceae)(丙酸桿菌屬(Propionibacterium))和雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)，特別是雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)(雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、鐮刀弧菌屬(Falcivibrio)、加德納氏菌屬(Gardnerella))和其他亞綱：酸微菌亞綱(Acidimicrobidae)、寇里氏桿菌亞綱(Coriobacteridae)、紅色桿菌亞綱(Rubrobacteridae)、球桿菌亞綱(Sphaerobacteridae)；和厚壁菌門(Firmicutes)，特別是芽孢桿菌綱(Bacilli)，特別是芽孢桿菌目(Bacillales)，特別是以下科：芽孢桿菌科(Bacillaceae)(芽孢桿菌屬(Bacillus))、利斯特氏菌科(Listeriaceae)(利斯特氏菌屬(Listeria))、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)(葡萄球菌屬(Staphylococcus)、孿生球菌屬(Gemella)、Jeotgalicoccus屬)和乳桿菌目(Lactobacillales)，特別是以下科：腸球菌科(Enterococcaceae)(腸球菌屬(Enterococcus))、乳桿菌科(Lactobacillaceae)(乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus))、明串珠菌科(Leuconostocaceae)(明串珠菌屬(Leuconostoc))、鏈球菌科(Streptococcaceae)(乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus))和梭菌綱(Clostridia)，特別是以下目：梭菌目(Clostridiales)(梭菌屬(Clostridium)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、月形單胞菌屬(Selenomonas))、鹽厭氧菌目(Halanaerobiales)和熱厭氧桿菌目，和軟壁菌綱(Tenericutes)/柔膜菌綱(Mollicutes)，特別是以下目：枝原體目(Mycoplasmatales)(枝原體屬(Mycoplasma)、尿枝原體屬(Ureaplasma))、蟲原體目(Entomoplasmatales)(螺原體屬(Spiroplasma))、厭氧枝原體目(Anaeroplasmatales)(丹毒絲菌屬(Erysipelothrix))、無膽甾原體目(Acholeplasmatales)(無膽甾原體屬))、Haloplasmatales(Haloplasma)的。在另一個優選的實施方案中，融合蛋白的自溶素或細菌素由革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌編碼，所述革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌諸如包括人或動物的病原性菌株的細菌群、科、屬或種的革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，如上文所列的。

優選地，內溶素部分自如以下表1中所描述的噬菌體或野生型內溶素衍生。

還優選的是自銅綠假單胞菌噬菌體ΦKZ和EL、惡臭假單胞菌噬菌體OBP、噬菌體LUZ24的內溶素、或自沙門氏菌噬菌體、鮑氏不動桿菌噬菌體、大腸桿菌噬菌體P2、大腸桿菌噬菌體N4和K1F及鼠傷寒沙門氏菌噬菌體的T4溶菌酶、gp61胞壁質酶、PSP3內溶素衍生的內溶素部分。

融合蛋白的別的優選的內溶素是利斯特氏菌噬菌體內溶素PlyA118、PlyA500、PlyPSA、PlyA511、PlyP35、PlyP40、葡萄球菌噬菌體Phi 11內溶素、Phi MR11內溶素、LysK、Ply 2638、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)PlyS6、Ply3626、艱難梭菌(Clostridium difficile)：CD27L內溶素、鏈球菌：B30內溶素、噬菌體Dp-1 Pal醯胺酶、C1內溶素、Cpl-1內溶素、PlyGBS、腸球菌：PlyV12、炭疽芽孢桿菌：噬菌體γ內溶素PlyG、丙酸桿菌噬菌體內溶素PA6-gp20。

融合蛋白的優選的自溶素記載於：Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases. Vollmer W,Joris B,Charlier P,Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008年3月；32(2):259-86.電子出版2008年2月11日.綜述。優選的自溶素的例子是At1A自溶素。

優選的細菌素是溶葡萄球菌素(降解葡萄球菌細胞壁)、變溶菌素(降解鏈球菌細胞壁)和腸溶素(降解腸球菌細胞壁)。更優選地，依照本發明的融合蛋白的細菌素包含依照SEQ ID NO: 87的氨基酸序列。融合蛋白的內溶素部分的別的例子選自下組：依照SEQ ID NO: 84的Cp1-1、依照SEQ ID NO: 85的Ply511、依照SEQ ID NO: 86的LysK、依照SEQ ID NO: 88的PA6-gp20、依照SEQ ID NO: 1的phiKZgp144、依照SEQ ID NO: 2的ELgp188、依照SEQ ID NO: 3的沙門氏菌內溶素、依照SEQ ID NO: 4的腸細菌噬菌體T4內溶素、依照SEQ ID NO: 5的鮑氏不動桿菌內溶素、依照SEQ ID NO: 6的大腸桿菌噬菌體K1F內溶素、依照SEQ ID NO: 7的OBPgpLYS、依照SEQ ID NO: 8的PSP3沙門氏菌內溶素(PSP3gp10)、依照SEQ ID NO: 9的大腸桿菌噬菌體P2內溶素(P2gp09)、依照SEQ ID NO: 89的鼠傷寒沙門氏菌噬菌體胞壁質酶STM0016、依照SEQ ID NO: 90的大腸桿菌噬菌體N4胞壁質酶N4-gp61、依照SEQ ID NO:91的N4-gp61截短物和依照SEQ ID NO: 92的Ply 2638。

在本發明的另一個優選的實施方案中，依靠依照本發明的融合蛋白來消除、減少或阻止細菌生物膜的方法包括氨基酸序列的修飾和/或改變。此類改變和/或修飾可以包括突變諸如刪除、插入和添加、替代或其組合和/或氨基酸殘基的化學變化，例如生物素化、乙醯化、PEG化、氨基、SH或羧基基團的化學變化。所述經修飾的和/或經改變的內溶素展現出各自的野生型內溶素的溶解活性。然而，所述活性可以比各自的野生型內溶素的活性高或低。所述活性可以是各自的野生型內溶素活性的約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或約200%或甚至更多。本領域技術人員可以通過本領域中公知的測定法，如例如平板溶解測定法或液體溶解測定法(其記載於例如Briers等,J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533,(2007))來測量活性。依照本發明的融合蛋白的肽可以通過額外的氨基酸殘基(例如由克隆原因所致)與酶，優選地與內溶素、自溶素或細菌素連接。優選地，所述額外的氨基酸殘基可以不受蛋白酶識別和/或切割。優選地，所述肽可以通過至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個額外的氨基酸殘基與酶連接。優選地，依照本發明的融合蛋白的在酶的N端，優選地與內溶素、自溶素或細菌素融合的所述肽進一步包含在其N端的額外的氨基酸。優選地，所述肽包含氨基酸甲硫氨酸(Met)，或甲硫氨酸、甘氨酸和絲氨酸(Met-Gly-Ser)或丙氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸(Ala-Met-Gly)。在另一個優選的實施方案中，肽通過額外的氨基酸殘基，特別是甘氨酸和絲氨酸(Gly-Ser)與酶的N端，優選地與內溶素、自溶素或細菌素連接。在另一個優選的實施方案中，肽通過額外的氨基酸殘基，特別是甘氨酸和絲氨酸(Gly-Ser)與酶的C端連接。

在本發明的一方面，具有膜和/或LPS破壞活性的肽包含帶正電荷的肽，其包含一個或多個帶正電荷的氨基酸，為賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸。優選地，所述肽中的超過80%、優選地超過90%、優選地100%的氨基酸是帶正電荷的氨基酸。有利地，陽離子肽位於融合蛋白的N端和/或C端末端，如此增強後一種蛋白質的陽離子度。在本發明的另一個實施方案中，與酶，優選地與內溶素、自溶素或細菌素融合的陽離子肽長至少5，更優選地至少9個氨基酸。在一個優選的實施方案中，所述肽包含約3至約50，更優選地約5至約20，例如約5至約15個氨基酸殘基，且至少20、30、40、50、60或70%，更優選地至少80%，例如至少90%的所述氨基酸殘基是精氨酸或賴氨酸殘基。在另一個優選的實施方案中，所述肽包含約3至約50，更優選地約5至約20，例如約5至約15個氨基酸殘基，且所述氨基酸殘基是精氨酸或賴氨酸殘基。

優選地，融合蛋白的肽與酶，優選地內溶素、自溶素或細菌素的N端和/或C端融合。在一個具體的優選實施方案中，所述肽僅與酶，優選地內溶素、自溶素或細菌素的N端融合。然而，還優選的是在N端和C端兩者都具有肽的融合蛋白。在N端和C端的所述肽可以是相同或不同的肽。優選地，融合蛋白的肽與酶共價結合。優選地，所述肽由至少5、更優選地至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或至少100個氨基酸殘基組成。特別優選的是包含約5至約100個氨基酸殘基、約5至約50或約5至約30個氨基酸殘基的肽。更優選的是包含約6至約42個氨基酸殘基、約6至約39個氨基酸殘基、約6至約38個氨基酸殘基、約6至約31個氨基酸殘基、約6至約25個氨基酸殘基、約6至約24個氨基酸殘基、約6至約22個氨基酸殘基、約6至約21個氨基酸殘基、約6至約20個氨基酸殘基、約6至約19個氨基酸殘基、約6至約16個氨基酸殘基、約6至約14個氨基酸殘基、約6至約12個氨基酸殘基、約6至約10個氨基酸殘基或約6至約9個氨基酸殘基的肽。在本發明的一方面，肽選自下組：陽離子肽、聚陽離子肽、疏水性肽、抗微生物肽和雙親性肽。

在本發明的一方面，肽是陽離子和/或聚陽離子肽，其包含一個或多個帶正電荷的氨基酸殘基，是賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸，特別是賴氨酸和/或精氨酸。優選地，所述肽中的超過約20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95或99%的氨基酸殘基是帶正電荷的氨基酸殘基，特別是賴氨酸和/或精氨酸殘基。特別優選的是由約100%帶正電荷的氨基酸殘基，特別是精氨酸和/或賴氨酸殘基組成的肽，其中優選地，所述帶正電荷的氨基酸殘基的約60%至約70%是賴氨酸殘基，且所述帶正電荷的氨基酸殘基的約30%至約40%是精氨酸殘基。更優選的是由約100%帶正電荷的氨基酸殘基，特別是精氨酸和/或賴氨酸殘基組成的肽，其中優選地，所述帶正電荷的氨基酸殘基的約64%至約68%是賴氨酸殘基，且所述帶正電荷的氨基酸殘基的約32%至約36%是精氨酸殘基。僅由精氨酸或僅由賴氨酸組成的肽也是優選的。

特別優選的是融合蛋白的陽離子和/或聚陽離子肽，其包含至少一個依照SEQ ID NO: 10(KRKKRK)的基序。特別地，包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個依照SEQ ID NO: 10(KRKKRK)的基序的陽離子肽是優選的。更優選的是包含至少一個KRK基序(lys-arg-lys)，優選地至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33個KRK基序的陽離子肽。

在本發明的另一個優選的實施方案中，所述肽是在帶正電荷的氨基酸殘基，特別是賴氨酸和/或精氨酸殘基外還包含帶中性電荷的氨基酸殘基，特別是甘氨酸和/或絲氨酸殘基的陽離子肽。優選的是由約70%至約100%、或約80%至約95%、或約85%至約90%帶正電荷的氨基酸殘基，特別是賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸殘基，更優選地賴氨酸和/或精氨酸殘基和約0%至約30%、或約5%至約20%、或約10%至約20%帶中性電荷的氨基酸殘基，特別是甘氨酸和/或絲氨酸殘基組成的陽離子肽。優選的是由約4%至約8%絲氨酸殘基、約33%至約36%精氨酸殘基和約56%至約63%賴氨酸殘基組成的肽。特別優選的是包含至少一個依照SEQ ID NO: 32(KRXKR)的基序的肽，其中X是任何與賴氨酸、精氨酸和組氨酸不同的氨基酸。特別優選的是包含至少一個依照SEQ ID NO: 33(KRSKR)的基序的肽。更優選的是包含至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或約20個依照SEQ ID NO: 32(KRXKR)或SEQ ID NO: 33(KRSKR)的基序的陽離子肽。

還優選的是融合蛋白中由約9至約16%甘氨酸殘基、約4至約11%絲氨酸殘基、約26至約32%精氨酸殘基和約47至約55%賴氨酸殘基組成的肽。特別優選的是包含至少一個依照SEQ ID NO: 34(KRGSG)的基序的肽。更優選的是包含至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或約20個依照SEQ ID NO: 34(KRGSG)的基序的陽離子肽。

在本發明的另一個優選的實施方案中，在帶正電荷的氨基酸殘基，特別是賴氨酸和/或精氨酸殘基外，陽離子肽包含疏水性氨基酸殘基，特別是纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸殘基，更優選地丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸殘基。優選的是融合蛋白中由約70%至約100%、或約80%至約95%、或約85%至約90%帶正電荷的氨基酸殘基，特別是賴氨酸和/或精氨酸殘基和約0%至約30%、或約5%至約20%、或約10%至約20%疏水性氨基酸殘基，即纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸殘基，更優選地丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸殘基組成的肽。

特別優選的是融合蛋白中選自由表2中所呈現的下列序列組成的組的肽。

優選地，融合蛋白的肽沒有標籤諸如His標籤、Strep標籤、Avi標籤、Myc標籤、Gst標籤、JS標籤、半胱氨酸標籤、FLAG標籤或本領域中已知的其他標籤，而且沒有硫氧還蛋白或麥芽糖結合蛋白(MBP)。然而，依照本發明的融合蛋白可以另外包含此類標籤。

優選地，融合蛋白的肽具有將依照本發明的融合蛋白引導通過細菌的外膜的功能，但是在不與內溶素、自溶素或細菌素融合的情況中施用時沒有活性或僅具有低活性。將融合蛋白引導通過革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌的外膜的功能是由所述肽的外膜或LPS破壞或透化或脫穩定化活性的潛力所引起的。所述肽的此類外膜或LPS破壞或透化或脫穩定化活性可以在如下的方法中測定：將要處理的細菌細胞在液體培養基中或在瓊脂板上培養。然後，分別以OD600nm光度術測定液體培養基中的細菌細胞濃度或者對瓊脂板上的菌落計數。現在，用依照本發明的融合蛋白處理液體培養基中或平板上的細菌細胞。溫育後，再次以OD600nm光度術測定液體培養基中的細菌細胞濃度或者對瓊脂板上的菌落計數。若融合蛋白展現出此類外膜或LPS破壞或透化或脫穩定化活性，則細菌細胞由於用融合蛋白處理而被溶解，並且如此，液體培養基中的細菌細胞濃度或者瓊脂板上的細菌菌落數目降低。如此，用融合蛋白處理後細菌細胞濃度或細菌菌落數目的降低指明融合蛋白的外膜或LPS破壞或透化或脫穩定化活性。

在本發明的又一個實施方案中，所述肽是包含淨正電荷和50%左右的疏水性氨基酸的抗微生物肽。抗微生物肽是雙親性的，長度為約12至約50個氨基酸殘基。抗微生物肽天然存在於昆蟲、魚、植物、蜘蛛類、脊椎動物或哺乳動物中。優選地，抗微生物肽可以天然存在於蘿蔔、蠶絲蛾、狼蛛、蛙優選地在非洲爪蟾中、林蛙更優選地在牛蛙中、蟾蜍優選地亞洲蟾蜍中華大蟾蜍中、蠅優選地在果蠅中更優選地在黑腹果蠅中、在埃及伊蚊中、在蜜蜂中、大黃蜂優選地在牧熊蜂中、麻蠅優選地在棕尾別麻蠅中、蠍、鱟、鯰魚優選地在鯰魚(Parasilurus asotus)中、牛(cow)、豬(pig)、綿羊、豬(procine)、牛(bovine)、猴和人中。

在另一個優選的實施方案中，融合蛋白的抗微生物肽由約0%至約5%、或約0%至約35%、或約10%至約35%或約15%至約45%、或約20%至約45%帶正電荷的氨基酸殘基，特別是賴氨酸和/或精氨酸殘基和約50%至約80%、或約60%至約80%、或約55%至約75%、或約70%至約90%疏水性氨基酸殘基，即纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸殘基，更優選地丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸殘基組成。

在本發明的另一個優選的實施方案中，融合蛋白的抗微生物肽由約4%至約58%帶正電荷的氨基酸殘基，特別是賴氨酸和/或精氨酸殘基和約33%至約89%疏水性氨基酸殘基，即纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸殘基，更優選地丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸殘基組成。

下表中列出了依照本發明的融合蛋白的抗微生物肽的例子。

在本發明的又一個實施方案中，所述肽是由Ding JL,Li P,Ho B Cell Mol Life Sci. 2008年4月；65(7-8)：1202-19所描述的壽司肽。The Sushi peptides:structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria。特別優選的是依照SEQ ID NO: 133的壽司1肽。

融合蛋白的優選的壽司肽是壽司肽S1和S3及其多重物；FASEB J. 2000年9月；14(12):1801-13。

在本發明的又一個實施方案中，所述肽是疏水性肽，其包含至少90%的疏水性氨基酸殘基，即纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸。在另一個優選的實施方案中，融合蛋白的疏水性肽由約90%至約95%、或約90至約100%、或約95%至約100%的疏水性氨基酸殘基組成，即纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸。

融合蛋白的優選的疏水性肽是具有依照SEQ ID NO: 134的氨基酸序列的Walmagh1和融合蛋白中具有氨基酸序列Phe-Phe-Val-Ala-Pro(SEQ ID NO: 135)的疏水性肽。

在本發明的又一個實施方案中，所述肽是雙親性肽，其包含與纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸的一個或多個疏水性氨基酸殘基組合的賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸的一個或多個帶正電荷的氨基酸殘基。使氨基酸殘基的側鏈定向，以使陽離子和疏水性表面在肽的相對側成簇。優選地，所述肽中的超過約30、40、50、60或70%的氨基酸是帶正電荷的氨基酸。優選地，所述肽中的超過約30、40、50、60或70%的氨基酸殘基是疏水性氨基酸殘基。有利地，雙親性肽在具有細胞壁降解活性的酶的N端和/或C端末端融合，如此提高後一種蛋白質的雙親性。

在本發明的另一個實施方案中，所述肽是由至少5，更優選地至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個氨基酸殘基組成的雙親性肽。在一個優選的實施方案中，雙親性肽的至少約30、40、50、60或70%的所述氨基酸殘基是精氨酸或賴氨酸殘基和/或雙親性肽的至少約30、40、50、60或70%的所述氨基酸殘基是疏水性氨基酸纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸的。

在本發明的另一個優選的實施方案中，所述肽是除帶正電荷的氨基酸殘基，特別是賴氨酸和/或精氨酸殘基外還包含疏水性氨基酸殘基，特別是纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸，更優選地丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸殘基的雙親性肽。優選的是由約10%至約50%、或約20%至約50%、或約30%至約45%或約5%至約30%帶正電荷的氨基酸殘基，特別是賴氨酸和/或精氨酸殘基和約50%至約85%、或約50%至約90%、或約55%至約90%、或約60%至約90%、或約65%至約90%疏水性氨基酸殘基，即纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸殘基，更優選地丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸組成的雙親性肽。在另一個優選的實施方案中，雙親性肽由12%至約50%帶正電荷的氨基酸殘基，特別是賴氨酸和/或精氨酸殘基和約50%至約85%疏水性氨基酸殘基，即纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸殘基，更優選地丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸組成。

融合蛋白的優選的雙親性肽是依照SEQ ID NO: 136的T4溶菌酶的α4螺旋和具有依照SEQ ID NO: 137的氨基酸序列的WLBU2變體和依照SEQ ID NO: 138的Walmagh 2。

在本發明的一個優選的實施方案中，融合蛋白由依照SEQ ID NO: 10至30、32至34和93至138的肽和依照SEQ ID NO: 1至9、84至86和88至92的內溶素或依照SEQ ID NO: 87的細菌素組成。在一個優選的實施方案中，融合蛋白包含選自依照SEQ ID NO: 10至30、32至34和93至138的肽的組的肽和選自依照SEQ ID NO: 1至9、84至86和88至92的內溶素的組的內溶素或依照SEQ ID NO: 87的細菌素。

特別優選的是選自由表4中所呈現的下列融合蛋白組成的組的融合蛋白。

依照本發明的融合蛋白，並且如此具體地特別優選的依照SEQ ID NO: 35至49、53、57、61至64、66至78和139至142的融合蛋白可以額外包含在N端的甲硫氨酸。

依照本發明的融合蛋白，並且如此具體地特別優選的依照SEQ ID NO: 35至49、53、57、61至64、66至78和139至142的融合蛋白可以額外包含供例如純化用的標籤。優選的是His₆標籤，優選地在融合蛋白的C端。所述標籤可以通過額外的氨基酸殘基(例如由克隆原因所致)與融合蛋白連接。優選地，所述標籤可以通過至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個額外的氨基酸殘基與融合蛋白連接。在一個優選的實施方案中，融合蛋白包含在其C端通過額外的氨基酸殘基賴氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)或亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)與融合蛋白連接的His₆標籤。優選地，所述額外的氨基酸殘基可以不受蛋白酶識別或切割。在另一個優選的實施方案中，融合蛋白包含在其N端通過額外的氨基酸殘基賴氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)或亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)與融合蛋白連接的His₆標籤。在另一個優選的實施方案中，融合蛋白包含在其N端和C端通過額外的氨基酸殘基賴氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)或亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)與酶，優選地內溶素、自溶素或細菌素連接的His₆標籤。

特別地，優選如下文所描述的實施例中所使用的融合蛋白。如實施例中所使用的依照SEQ ID NO: 35至42、53、57和61的融合蛋白包含在C端通過額外的氨基酸殘基賴氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)與融合蛋白連接的His₆標籤。如實施例中所使用的依照SEQ ID NO: 43至49、75、139、141和142的融合蛋白包含在C端通過額外的氨基酸殘基亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)與各自的融合蛋白連接的His₆標籤。

使用標準的克隆技術通過連接至少兩種核酸序列來構建融合蛋白，如例如由Sambrook等2001,Molecular Cloning: A Laboratory Manual所描述的。可以例如在重組DNA表達系統中生成此類蛋白質。可以通過將內溶素、自溶素或細菌素和各自的肽的核酸融合來獲得依照本發明的此類融合蛋白。

因為一些融合蛋白可以在細菌中表達後是有毒性的，或者由於蛋白質降解而並不同質，所以策略可以是表達與其他額外的蛋白質融合或連接的這些融合蛋白。這些其他額外的蛋白質的例子有硫氧還蛋白，其顯示為在大腸桿菌仲介導毒性抗微生物肽的表達(TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4 from multiple joined genes in Escherichia coli. Zhou L,Zhao Z,Li B,Cai Y,Zhang S. Protein Expr Purif. 2009年4月；64(2):225-230)。

對於融合蛋白的抗微生物功能，可能有必要通過蛋白水解切割來除去額外的融合蛋白。商品化試劑盒，如pET32表達系統(Novagen)可能需要根據所使用的蛋白酶來修飾例如融合物的N端，如從MGS修飾為AMGS(SEQ ID NO: 31)，若剩餘的丙氨酸殘基源自引入的腸激酶切割位點的話。

在本發明的另一個優選的實施方案中，依照本發明的融合蛋白的肽包括氨基酸序列的修飾和/或改變。此類改變和/或修飾可以包括突變諸如刪除、插入和添加、替代或其組合和/或氨基酸殘基的化學變化，例如生物素化、乙醯化、PEG化、氨基、SH或羧基基團的化學變化。

本發明進一步涉及依靠編碼依照本發明的融合蛋白的分離的核酸分子來消除、減少或阻止細菌生物膜的方法。本發明進一步涉及包含依照本發明的核酸分子的載體。所述載體可以提供依照本發明的所述融合蛋白的組成性或誘導型表達。

融合蛋白可以自微生物，諸如表達所述融合蛋白的經遺傳修飾的合適的宿主細胞獲得。所述宿主細胞可以是微生物諸如細菌或酵母或真菌或動物細胞，如例如哺乳動物細胞，特別是人細胞。在本發明的一個實施方案中，酵母細胞是巴斯德畢赤酵母細胞。宿主可以僅由於生物技術原因，例如產率、溶解度、成本等而進行選擇，但是也可以從醫學觀點，例如非病理性細菌或酵母、人細胞進行選擇。

在又一方面，本發明涉及依靠包含依照本發明的融合蛋白和/或經包含編碼依照本發明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或載體轉化的宿主的組合物，優選地藥物組合物來消除、減少或阻止細菌生物膜的方法。

在本發明的一個優選的實施方案中，依靠組合物來消除、減少或阻止細菌生物膜的方法另外包括使革蘭氏陰性細菌的外膜透化的藥劑，諸如金屬螯合劑例如EDTA、TRIS、乳酸、乳鐵蛋白、多粘菌素、檸檬酸和/或其他物質，如例如由Vaara(Agents that increase the permeability of the outer membrane. Vaara M. Microbiol Rev. 1992年9月；56(3):395-441)所描述的。還優選的是包含上文所提及的透化劑的組合的組合物。特別優選的是包含約10μM至約100mM EDTA，更優選地約50μM至約10mM EDTA，更優選地約0.5mM至約10mM EDTA，更優選地約0.5mM至約2mM EDTA，更優選地約0.5mM至1mM EDTA的組合物。然而，包含約10μM至約0.5mM EDTA的組合物也是優選的。還優選的是包含約0.5mM至約2mM EDTA，更優選地約1mM EDTA和另外約10至約100mM TRIS的組合物。

本發明還涉及依靠作為藥物使用的依照本發明的融合蛋白和/或經包含編碼依照本發明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸轉化的宿主來消除、減少或阻止細菌生物膜的方法。

在又一方面，本發明涉及依照本發明的融合蛋白和/或經包含下述核酸分子的載體轉化的宿主用於消除、減少或阻止細菌生物膜的用途，所述核酸分子包含編碼依照本發明的融合蛋白的核苷酸序列。優選的是的如下的用途，其中生成生物膜的細菌引起對植物、動物和/或人有害的病症、疾病或狀況。優選的是如下的用途，其中生成生物膜的細菌可以是包含人或動物的病原性菌株的細菌群、科、屬或種的革蘭氏陰性細菌，如腸桿菌科(埃希氏菌屬特別是大腸桿菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、愛德華氏菌屬、腸桿菌屬、哈夫尼菌屬、克雷伯氏菌屬特別是肺炎克雷伯氏菌、摩根氏菌屬、變形菌屬、普羅威登斯菌屬、沙雷氏菌屬、耶爾森氏菌屬)、假單胞菌科(假單胞菌屬特別是銅綠假單胞菌、伯克霍爾德氏菌屬、寡養單胞菌屬、希瓦氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、叢毛單胞菌屬)、奈瑟氏球菌屬、莫拉氏菌屬、弧菌屬、氣單胞菌屬、布魯氏菌屬、弗朗西絲氏菌屬、博多特氏菌屬、軍團菌屬、巴爾通氏體屬、考克斯氏體屬、嗜血菌屬、巴斯德氏菌屬、曼海姆氏菌屬、放線桿菌屬、加德納氏菌屬、螺旋體科(密螺旋體屬和疏螺旋體屬)、鉤端螺旋體科、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、螺菌屬、鏈桿菌屬、擬桿菌科(擬桿菌屬、梭桿菌屬、普雷沃氏菌屬、卟啉單胞菌屬)、不動桿菌屬特別是鮑氏不動桿菌。優選地，所述病症、疾病或狀況可以由假單胞菌屬特別是銅綠假單胞菌和/或惡臭假單胞菌、伯克霍爾德氏菌屬特別是類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomallei)和/或茄伯克霍爾德氏菌(Burkholderia solanacearum)、沙門氏菌屬特別是鼠傷寒沙門氏菌和/或腸炎沙門氏菌、不動桿菌屬特別是鮑氏不動桿菌、大腸桿菌和/或克雷伯氏菌屬特別是肺炎克雷伯氏菌引起。特別地，病症、疾病或狀況的治療和/或預防可以由包含人或動物的病原性菌株的細菌群、科、屬或種的革蘭氏陽性細菌引起：如單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、變異鏈球菌(Streptococcus mutans)、馬鏈球菌(Streptococcus equi)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)、瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)、鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、白喉棒桿菌(Corynebacterium diphteriae)、肺炎枝原體(Mycoplasma pneumoniae)、放線菌屬(Actinomyces)。

在一個優選的實施方案中，融合蛋白，優選地內溶素變體、自溶素變體或細菌素變體在又一方面，本發明涉及在需要治療和/或預防的受試者中治療與細菌生物膜有關的病症、疾病或狀況的方法，該方法包括對所述受試者施用有效量的依照本發明的融合蛋白和/或有效量的經下述核酸轉化的宿主或依照本發明的組合物，所述核酸包含編碼依照本發明的融合蛋白的核苷酸序列。受試者可以是人或動物。

優選地，所述治療方法可以用於治療和/或預防由與細菌生物膜有關的革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌，特別是如上文所列的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌引起的感染。特別地，所述治療方法可以用於治療和/或預防由與細菌生物膜有關的革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌，特別是如上文所列的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌引起的皮膚、軟組織、呼吸系統、肺、消化道、眼、耳、牙、鼻咽、口、骨、陰道、菌血症傷口的感染和/或心內膜炎。

在依照本發明的治療或預防方法中使用的施用劑量和路徑取決於要治療的特定疾病/感染部位。施用路徑可以是例如口服、表面、鼻咽、胃腸外、吸入、靜脈內、肌肉內、鞘內、脊柱內、支氣管內、肺內、骨內、心內、關節內、直腸、陰道或任何其他施用路徑。在一個優選的實施方案中，將融合蛋白表面應用於生物學材料，優選地皮膚，特別是哺乳動物的，優選地人的。在一個優選的實施方案中，將融合蛋白系統應用於生物學材料，優選地血液，特別是哺乳動物的，優選地人的。

對於將依照本發明的融合蛋白和/或有效量的經下述核酸轉化的宿主或依照本發明的組合物應用於感染部位(或有感染危險的部位)，可以使用保護活性化合物免于環境影響諸如蛋白酶、氧化、免疫應答等，直至它達到感染部位的配製劑，所述核酸包含編碼依照本發明的融合蛋白的核苷酸序列。因此，配製劑可以是膠囊、糖衣片、丸劑、粉劑、栓劑、乳劑、懸浮液、凝膠劑、洗劑、乳膏、藥膏、可注射溶液、糖漿劑、噴霧、吸入劑或任何其他醫學合理的蓋倫配製劑。優選地，蓋倫配製劑可以包含合適的載體、穩定劑、調味劑、緩衝劑或其他合適的試劑。例如，對於表面應用，配製劑可以是洗劑、乳膏、凝膠劑、藥膏或硬膏劑，對於鼻咽應用，配製劑可以是要經由噴霧向鼻應用的鹽水溶液。對於口服施用，在治療和/或預防特定感染部位(例如在腸中)的情況中，可以有必要保護依照本發明的融合蛋白免於胃腸道的苛刻消化環境，直至達到感染部位。如此，可以使用細菌作為載體，其倖免於胃中的消化初始步驟，而且其隨後將依照本發明的融合蛋白分泌入腸環境中。

在一個具體的實施方案中，本發明涉及依照本發明的融合蛋白和/或經包含下述核酸分子的載體轉化的宿主在製造用於治療和/或預防由與細菌生物膜有關的革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌感染引起的病症、疾病或狀況的藥物中的用途，所述核酸分子包含編碼依照本發明的融合蛋白的核苷酸序列。一個優選的實施方案涉及與抗生素組合或在抗生素外，依照本發明的融合蛋白在製造用於治療和/或預防由與細菌生物膜有關的革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌感染引起的病症、疾病或狀況的藥物的用途。

在一個具體的實施方案中，本發明涉及依照本發明的融合蛋白和/或經包含下述核酸分子的載體轉化的宿主在製造用於治療和/或預防由與細菌生物膜有關的假單胞菌，特別是銅綠假單胞菌引起的病症、疾病或狀況的藥物在的用途，所述核酸分子包含編碼依照本發明的融合蛋白的核苷酸序列，所述病症、疾病或狀況特別是腸感染特別在嬰兒中、腦脊膜的感染例如出血性腦膜炎(meningitis haemorrhagica)、中耳、皮膚(壞疽性臁瘡(Ecthyma gangraenosum))特別是燒傷、尿道的感染、鼻炎、菌血症肺炎(bacteremic pneumonia)特別地其中患者患有囊性纖維化病或血液學惡性腫瘤諸如白血病或者患有來自免疫抑制療法的嗜中性粒細胞減少症(neutropenia)、敗血症特別是由於長期靜脈內或尿導管插入、侵入性手術規程和重度燒傷、心內膜炎特別地其中患者是靜脈內藥物使用者或具有來自開放心臟手術的併發症的患者、高度破壞性眼部感染特別地在使用受污染的眼科學溶液後或重度面部燒傷、骨軟骨炎特別地由於重度創傷或經由受污染衣服的穿剌傷口。

在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由與細菌生物膜有關的類鼻疽伯克霍爾德氏菌引起的，特別是惠特莫爾氏病(Whitmore’s Disease)、慢性肺炎、敗血症特別地其中患者具有受外傷的皮膚損傷。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由與細菌生物膜有關的鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌引起的，特別是急性胃腸炎和局部化膿過程，特別是骨髓炎、心內膜炎、膽囊炎，且特別是由鼠傷寒沙門氏菌腦膜炎引起的，特別地其中患者小於2歲齡。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由傷寒沙門氏菌引起的，特別是傷寒(typus)。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由副傷寒沙門氏菌(Salmonell paratyphi)引起的，特別是副傷寒(paratyphus)。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由與細菌生物膜有關的鮑氏不動桿菌引起的，特別是支氣管炎、肺炎、傷口感染和敗血症，特別是由於靜脈內導管插入。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由與細菌生物膜有關的大腸桿菌引起的，特別是腸外感染，特別是闌尾炎、化膿性膽囊炎、腹膜炎、化膿性腦膜炎和尿道感染、腸內大腸桿菌感染，特別是流行性腸炎，和與痢疾相似的傳染病、敗血症、腸毒血病(enterotoxemia)、乳腺炎和痢疾。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由與細菌生物膜有關的肺炎克雷伯氏菌引起的，特別是肺炎、菌血症、腦膜炎和尿道感染。在一個具體的實施方案中，本發明涉及依照本發明的融合蛋白和/或經包含下述核酸分子的載體轉化的宿主在製造用於治療和/或預防由單核細胞增生利斯特氏菌引起的病症、疾病或狀況，特別是嬰兒膿毒性肉芽腫病(Granulomatosis infantiseptica)(新生兒利斯特菌病)、單核細胞增多症(mononucleosis)、結膜炎、腦膜炎、膿毒性肉芽腫病(granulomatosis septica)和孕婦利斯特菌病的藥物中的用途，所述核酸分子包含編碼依照本發明的融合蛋白的核苷酸序列。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由金黃色葡萄球菌引起的，特別是皮膚感染，如膿皮病(pyoderma)，特別是毛囊炎、癤、癰、汗腺膿腫和天皰瘡，及如鱗狀皮膚綜合征(scaled skin syndrome)。鱗狀皮膚綜合征可以以三個臨床現象出現：剝脫性皮炎(dermatitis exfoliativa)、大皰性膿皰病(impetigo bullosa)和猩紅熱樣紅皮病(scarlatiniform erythroderma)。此外，由金黃色葡萄球菌引起的病症、疾病或狀況是葡萄球菌肺炎、醫院不衛生狀態特別是手術傷口感染、產褥期乳腺炎(mastitis puerperalis)和小腸結腸炎(enterokolitis)、和食物中毒。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由釀膿鏈球菌引起的，特別是扁桃體炎、咽炎、猩紅、丹毒、風濕熱和急性腎小球腎炎。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由肺炎鏈球菌引起的，特別是肺炎、匐行性角膜潰瘍(ulcus serpens corneae)、中耳炎、腦膜炎、腹膜炎、乳突炎和骨髓炎。

在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由產氣莢膜梭菌引起的，特別是氣性壞疽、潰瘍性壞死性腸炎(enteritis necroticans ulcerosa)和食物中毒。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由肉毒梭菌引起的，特別是肉毒中毒。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由艱難梭菌引起的，特別是假膜性小腸結腸炎。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由炭疽芽孢桿菌引起的，特別是皮膚炭疽、吸入炭疽、和胃腸炭疽。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由糞腸球菌或屎腸球菌引起的，如醫院內感染、和心內膜炎。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由蠟狀芽胞桿菌引起的，特別是食物中毒、支氣管肺炎、敗血病和腦膜炎。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由鳥分枝桿菌、副結核分枝桿菌(Mycobacterium paratuberculosis)和結核分枝桿菌引起的，特別是結核病。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由肺炎枝原體引起的，特別是肺炎、上呼吸道疾病和鼓膜炎症。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由放線菌引起的，特別是人、牛、貓和犬中的放線菌病。在本發明的另一個具體的實施方案中，所述病症、疾病或狀況是由白喉棒桿菌引起的，特別是扁桃體、鼻、鼻咽或中耳的局部白喉，喉、氣管和支氣管的進行性白喉，毒性或惡性白喉，皮膚和傷口白喉。依靠依照本發明的融合蛋白來消除、減少或阻止細菌生物膜的方法提供了侵入細菌生物膜中，並且消除、減少和阻止細菌生物膜的可能性。

依靠依照本發明的融合蛋白來消除、減少或阻止細菌生物膜的方法可以用於治療和/或預防下列感染：傷口感染，特別是與糖尿病有關的傷口、扁桃體炎、骨髓炎、細菌性心內膜炎、鼻竇炎、角膜感染、尿道感染、膽道感染、感染性腎結石、尿道炎、前列腺炎、導管感染、中耳感染、牙斑形成、齦炎、牙周炎、囊性纖維化病、和永久性留置裝置諸如關節假體和心瓣膜的感染。

在依靠依照本發明的融合蛋白來消除、減少或阻止細菌生物膜的另一個優選的實施方案中可以用於治療和/或預防與外來事物有關的感染，如導管、植入物和醫學裝置，特別是儀器、裝置、內鏡、牙科裝置、透析設備，如腹膜透析導管、起搏器、氣管導管、聲音假體(voiceprothesis)、腦脊液分流器、靜脈導管、人造心瓣膜和關節假體的污染和定殖。

在依靠依照本發明的融合蛋白來消除、減少或阻止細菌生物膜的另一個優選的實施方案中，細菌生物膜是由表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和白色假絲酵母(Candida albicans)形成的。

在依靠依照本發明的融合蛋白來消除、減少或阻止細菌生物膜的另一個優選的實施方案中可以用於阻止和/或除去健康護理、農業、和工業裝置中，特別是在醫院的水管中、在水、管道、通風、建築物供暖、空調、油井、化妝品和藥物中的污染。

在依靠依照本發明的融合蛋白來消除、減少或阻止細菌生物膜的另一個優選的實施方案中可以用於預防生物侵蝕(biocorrision)，特別是在冷卻回路、水處理廠、家用熱水系統、電廠、用於汽車、電腦、顏料、油和氣(gas)的生產系統和機器中。在依靠依照本發明的融合蛋白來消除、減少或阻止細菌生物膜的另一個優選的實施方案中可以用於預防生物汙著，特別是在出於海事領域中的科學或監視目的的水下目標、船、平臺、浮標、感測器系統上。

在本發明的一個優選的實施方案中，若要治療或預防的感染是由與細菌生物膜有關的多抗性細菌菌株，特別是由對下列一種或多種抗生素有抗性的菌株引起的：鏈黴素、四環素、頭孢噻吩(cephalothin)、慶大黴素(gentamicin)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢菌素(cephalosporin)、頭孢他啶(ceftazidime)或亞胺培南(imipenem)，則使用依照本發明的融合蛋白進行醫學處理。此外，在本發明的方法或用途中，可以與常規的抗細菌劑組合或在常規的抗細菌劑外使用、添加或施用融合蛋白，優選地內溶素變體、自溶素變體或細菌素變體，所述抗細菌劑諸如抗生素、硫醚抗生素(lantibiotics)、細菌素或內溶素。在另一個優選的實施方案中，在依照本發明的方法和用途中與融合蛋白同時、在施用或添加融合蛋白後或前添加、使用或施用抗生素。

在本發明的一個優選的實施方案中，可以與下列至少一種抗生素組合使用或施用融合蛋白：β-內醯胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類(fluoroquinolones)、大環內酯類、新生黴素、利福平(rifampicin)、噁唑烷酮類(oxazolidinones)、梭鏈孢酸(fusidic acid)、莫匹羅星(mupirocin)、截短側耳素(pleuromutilin)、達托黴素(daptomycin)、萬古黴素、四環素、磺胺類、氯黴素、甲氧苄啶(trimetoprim)、磷黴素(fosfomycin)、環絲氨酸(cycloserine)和多粘菌素(polymyxin)。在本發明的另一個優選的實施方案中，融合蛋白可以在消除、減少或阻止金黃色葡萄球菌的細菌生物膜的方法中使用，所述方法通過將其與下列至少一種抗生素組合施用來進行：β-內醯胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、大環內酯類、新生黴素、利福平、噁唑烷酮類、梭鏈孢酸、莫匹羅星、截短側耳素、達托黴素、萬古黴素、四環素、磺胺類、氯黴素、甲氧苄啶、磷黴素和環絲氨酸。在本發明的另一個優選的實施方案中，融合蛋白可以在消除、減少或阻止大腸桿菌的細菌生物膜的方法中使用，所述方法通過將其與下列至少一種抗生素組合施用來進行：β-內醯胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環素、磺胺類、氯黴素、甲氧苄啶、磷黴素、環絲氨酸和多粘菌素。

在本發明的另一個優選的實施方案中，融合蛋白可以在消除、減少或阻止銅綠假單胞菌的細菌生物膜的方法中使用，所述方法通過將其與下列至少一種抗生素組合施用來進行：β-內醯胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類和多粘菌素。

本發明還涉及供消除、減少和阻止細菌生物膜使用的藥物包，其包含一個或多個區室，其中至少一個區室包含一種或多種依照本發明的融合蛋白和/或一種或多種經下述核酸轉化的宿主或依照本發明的組合物，所述核酸包含編碼依照本發明的融合蛋白的核苷酸序列。在另一方面，本發明涉及製備供消除、減少和阻止細菌生物膜使用的藥物組合物的方法，所述方法包括混合一種或多種依照本發明的融合蛋白和/或一種或多種經下述核酸轉化的宿主與藥學可接受稀釋劑、賦形劑或載體，所述核酸包含編碼依照本發明的融合蛋白的核苷酸序列。

在甚至又一方面，依照本發明的組合物是供消除、減少和阻止細菌生物膜使用的化妝用組合物。數種細菌物種可以在患者身體的環境暴露表面諸如皮膚上引起刺激。為了預防此類刺激或者為了消除所述細菌病原體的輕微表現，可以採用特殊的化妝用製品，其包含足夠量的依照本發明的融合蛋白以降解已經存在的或新近沉降的病原性革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌。

在又一方面，本發明涉及在醫學、食物或飼料或環境診斷學中作為診斷手段，特別是作為用於診斷特別由與細菌生物膜有關的革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌引起的細菌感染的診斷手段使用的依照本發明的融合蛋白。在此方面，可以使用依照本發明的融合蛋白作為特異性降解與細菌生物膜有關的病原性細菌，特別是革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性病原性細菌的工具。可以通過添加去污劑如Triton X-100或削弱細菌細胞包膜的其他添加劑如多粘菌素B來支持依照本發明的融合蛋白對細菌細胞的降解。需要特定的細胞降解作為初始步驟，以隨後特異性檢測細菌，其使用基於核酸的方法如PCR、核酸雜交或NASBA(基於核酸序列的擴增)、免疫學方法如IMS、免疫螢光或ELISA技術、或其他依賴於細菌細胞的細胞內容物的方法如使用對獨特的細菌群或物種特異性的蛋白質(例如對於腸細菌為β-半乳糖苷酶，對於凝固酶陽性菌株為凝固酶)的酶測定法進行。

在又一方面，本發明涉及依照本發明的融合蛋白用於除去、減少和/或阻止食品、食物加工設備、食物加工廠、與食品接觸的表面諸如架子和食物保藏區和所有其他位置(其中病原性、兼性病原性或其他不想要的細菌能潛在地侵染食物材料)、醫學裝置和醫院和診所的所有種類表面的與細菌生物膜有關的革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌污染的用途。

特別地，本發明的融合蛋白可以在消除、減少或阻止細菌生物膜的方法中作為消毒劑預防性使用。所述消毒劑可以在手術前或後，或者例如在血液透析過程中使用。此外，可以用依照本發明的融合蛋白處理未成熟兒和免疫受損個人，或那些需要假體裝置的受試者。所述處理可以是預防性的或在急性感染期間。在相同背景中，醫院內感染(特別由抗生素抗性菌株如銅綠假單胞菌(FQRP)、不動桿菌物種和腸桿菌科諸如大腸桿菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、愛德華氏菌屬、腸桿菌屬、哈夫尼菌屬、克雷伯氏菌屬、摩根氏菌屬、變形菌屬、普羅威登斯菌屬、沙雷氏菌屬和耶爾森氏菌屬物種；甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌、萬古黴素抗性糞腸球菌、萬古黴素抗性屎腸球菌、肺炎鏈球菌、瘡皰丙酸桿菌、多藥物抗性結核分枝桿菌引起的)可以用本發明的融合蛋白預防性地或在急性階段期間處理。因此，還可以與其他可用於消毒溶液的成分如去污劑、Tensids、溶劑、抗生素、硫醚抗生素、或細菌素組合使用依照本發明的融合蛋白作為消毒劑來消除、減少和阻止細菌生物膜。

對於依照本發明的融合蛋白在例如醫院、牙外科、獸醫、廚房或浴室中作為消毒劑用於消除、減少或阻止細菌生物膜的用途，可以在例如液體、粉末、凝膠形式的組合物、或濕巾或消毒薄片產品的成分中製備融合蛋白。所述組合物可以另外包含分別適合於其各自的用途和形式的載體、添加劑、稀釋劑和/或賦形劑，而且還包含支持抗微生物活性的藥劑，如EDTA或增強融合蛋白的抗微生物活性的藥劑。融合蛋白還可以與常見的消毒劑藥劑，如乙醇、乙醛、氧化劑、Phenolics、季銨化合物或UV光一起使用。為了對例如表面、物體和/或裝置消毒，可以將融合蛋白應用於所述表面、物體和/或裝置上。可以例如通過用任何手段諸如布或抹布弄濕消毒化合物，通過噴霧、噴散來發生應用。融合蛋白可以以不同濃度使用，這取決於各自的應用和意圖獲得完全抗微生物活性的“反應時間”。在又一方面，本發明涉及依照本發明的融合蛋白作為食物添加劑的用途。

本發明實用性的進一步的範圍從下文給出的詳細描述看會變得顯而易見，然而，應當理解詳細的描述和具體的實施例雖然指明本發明的優選的實施方案，但其僅作為例示給出，因為在本發明的精神和範圍內的各種變化和修飾從此詳細描述看對於本領域技術人員會變得顯而易見。應當理解，前述一般性描述和下文詳述的描述兩者都僅是例示性和解釋性的，而並不如所要求保護的那樣限制本發明。以下實施例解釋本發明，但不認為是限制性的。除非不同地指明，使用分子生物學標準方法，如例如由Sambrock等,1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York所描述的。實施例1：經修飾的phiKZgp144和ELgpgp188內溶素變體的克隆、表達和純化。

如SEQ ID NO: 1中所描繪的phiKZgp144和如SEQ ID NO: 2中所描繪的ELgp188是源自銅綠假單胞菌噬菌體φKZ和EL的模組內溶素，其具有N端肽聚糖結合和C端催化域(Briers等,2007)。

為了擴增phiKZgp144和ELgp188的可讀框(ORF)，應用PCR標準的5’引物(對於phiKZgp144：5’ATGAAAGTATTACGCAAA 3’(SEQ ID NO: 83)；對於ELgp188：5’ATGAACTTCCGGACGAAG 3’(SEQ ID NO: 65))和依照SEQ ID NO: 81和82的標準的3’引物(對於phiKZgp144：TTTTCTATGTGCTGCAAC(SEQ ID NO: 81)；對於ELgp188: ATACGAAAT AACGTGACGA(SEQ ID NO: 82))。為了用編碼9個帶正電荷的殘基(Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys SEQ ID NO: 11)的基因片段延伸編碼phiKZgp144或ELgp188的可讀框的5’端，用延伸的5’引物(對於phiKZgp144：5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAAAGTATTAC GCAAAG 3’(SEQ ID NO 79)；對於ELgp188: 5’ATGGGATCCAAACGCAA GAAACGTAAGAAACGCAAAAACTTCCGGACGAAG 3’ (SEQ ID NO: 80))和依照SEQ ID NO: 81和82的標準的3’引物應用尾部PCR。在pEXP5CT/TOPO表達載體(Invitrogen,Carlsbad,CA，,SA)中依照製造商的方案克隆PCR產物。除賴氨酸三聯體外，引入精氨酸三聯體以避免tRNA消耗，並降低移碼風險(賴氨酸唯一的兩種可用的三聯體是AAA和AAG，導致長的A區段)。將額外的聚陽離子盒插入設計的BamHI限制性位點中以額外的陽離子殘基延長尾部。此插入物在每個接合位點處創建精氨酸和絲氨酸三聯體(圖1)。將多至4個聚陽離子肽與phiKZgp144和ELgp188兩者融合，稱作(POLY)ⁿ-gp144或(POLY)ⁿ-gp188(n=1,2,3,4)，其在N端中分別包含9、19、29和39個帶正電荷的氨基酸殘基。因而，在大腸桿菌BL21(DE3) pLysS細胞中表達下列構建體(於37℃指數培養細胞，使用1mM IPTG誘導，於37℃表達4小時)：

已經使用經修飾的內溶素變體POLY-gp144(SEQ ID NO: 35)、(POLY)²-gp144(SEQ ID NO: 36)、POLY-gp188(SEQ ID NO: 39)和(POLY)²-gp188(SEQ ID NO: 40)來進一步調查。使用C端6xHis標籤通過Ni²⁺親和層析(使用1mlHis-trap Ni-NTA柱的Akta快速蛋白質液相層析)來純化所述蛋白質。通過用分光光度法測量純化的儲備溶液的蛋白質濃度和總體積來測定每升大腸桿菌表達培養物的總收率。與gp144衍生物(50mM咪唑)相比，在更嚴格的條件(65mM咪唑)下實施gp188衍生物的純化以確保高純度。表5中顯示了每升大腸桿菌表達培養物的總收率。

純化的儲備溶液是約90%純的。對POLY衍生物的純化溶液的質譜分析揭示大腸桿菌50S核糖體亞基蛋白L2和16S rRNA尿苷-516假尿苷酸合酶的痕跡。所有phiKZgp144衍生物都顯示多聚體形成，其可以通過添加β-巰基乙醇轉變成單體，這指明二硫化物間的鍵引起多聚化。

實施例2：經修飾的phiKZgp144和ELgp188變體的抗細菌活性

將指數期(約10⁶/ml)銅綠假單胞菌PAO1p細胞(Pirnay JP等(2003),J Clin Microbiol.,41(3):1192-1202)稀釋100x(終密度是約10⁶/ml)，並於室溫與緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；0.5M咪唑)中終濃度100μg/ml的各10μg未透析的蛋白質(未修飾的內溶素phiKZgp144(SEQ ID NO: 1)和ELpg188(SEQ ID NO: 2)和經修飾的內溶素變體POLY-gp144(SEQ ID NO:35)、(POLY)²-gp144(SEQ ID NO: 36)、POLY-gp188(SEQ ID NO: 39)和(POLY)²-gp188(SEQ ID NO: 40)一起溫育。1小時後，將細胞懸浮液在PBS緩衝液中稀釋(10e-5、10e-4和10e-3)，並鋪板(標準的LB培養基，于37℃溫育過夜)。另外，將在PBS緩衝液中含有細胞的陰性對照鋪板。在過夜溫育後對殘留的菌落計數。基於計數的細胞數目，計算抗細菌活性，其為相對滅活(%)(=100-(N_i/N_o)*100，其中N₀=未處理的細胞數目，且N_i=經處理的細胞數目)並按對數單位計(=log₁₀N₀/N_i)(表6)。所有樣品重複六次。呈現平均值/標準偏差。使用Student氏t檢驗來實施統計學分析。

與陰性對照相比，未修飾的內溶素phiKZgp144和ELgp188沒有顯著降低細胞數目。此觀察結果例示外膜作為內溶素降解革蘭氏陰性細菌細胞壁的屏障的功效。比較而言，如表6中所顯示的，與經修飾的內溶素POLY-gp144、(POLY)²-gp144、POLY-gp188和(POLY)²-gp188一起溫育引起細菌細胞數目的顯著降低(α=0.05)(對於POLY-gp144為99.85±0.09%，而對於POLY-gp188為98.0±0.2%)。聚陽離子肽的長度增加進一步趨於加強抗細菌活性，尤其在phiKZgp144的情況中(對於(POLY)²-gp144，在1小時內達到多至99.98±0.02%或3.7±0.3個對數單位的降低)。

此外，實驗表明phiKZgp144的經修飾的內溶素比ELgp188的經修飾的內溶素具有更高的抗細菌活性。

如此，實施例表明，phiKZgp144(SEQ ID NO: 1)在N端添加9個陽離子殘基的短肽已經足以在1小時內殺死幾乎99.9%的細胞。多聚-L-賴氨酸也具有固有的抗細菌活性，雖然迄今為止，此特性僅歸於至少20個殘基的聚合物(Vaara和Vaara,1983a,1983b)。然而，聚陽離子肽和內溶素的協同作用殺死細胞。

在進一步的實驗中，將經修飾的內溶素POLY-gp144透析至50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄ pH 7，並代替未透析的蛋白質溶液使用，如上文所描述的。由此，滅活水平從2.9±0.3個對數單位額外升高至3.9±0.2個對數單位。實施例3：經修飾的phiKZgp144和ELgp188變體在作為宿主的巴斯德畢赤酵母中的表達以進行無毒性重組生成將編碼POLY-gp144(SEQ ID NO: 35)的可讀框在pPICZαA穿梭載體(Invitrogen)中克隆，隨後通過同源重組在巴斯德畢赤酵母基因組中整合(如製造商所指示的；巴斯德畢赤酵母X33細胞，Invitrogen)。在BMMY培養基中用甲醇(1%)誘導基因表達，並在1、3和4天后對上清液分析酶活性的存在。因此，在1、3和4天后，將30μl量的巴斯德畢赤酵母表達培養物上清液添加至270μl經氯仿透化的銅綠假單胞菌PAO1p細胞(Pirnay JP等(2003),J Clin Microbiol.,41(3):1192-1202)(緩衝液條件：KH₂PO₄/K₂HPO₄ I=120mM pH 6.2)。隨後，用分光光度法記錄光密度(圖2)。光密度的下降指明巴斯德畢赤酵母分泌胞壁質水解酶。作為陰性對照，包括沒有表達質粒的巴斯德畢赤酵母X33。如此，添加上清液樣品後的底物溶解是巴斯德畢赤酵母成功重組生成和分泌POLY-gp144(SEQ ID NO: 35)的測量。1天后，可以檢測出有限的酶活性。在3天后觀察到最大活性，因為在第4天時沒有觀察到上清液中活性的顯著升高。沒有觀察到對巴斯德畢赤酵母細胞密度的毒性影響。

在巴斯德畢赤酵母表達過程中，載體的α分泌信號引起重組蛋白分泌至周圍的培養液，這容許簡化純化，因為僅分泌有限數目的其他蛋白質。在可讀框的5’端中的BamHI限制性位點使得能夠添加更多編碼額外聚陽離子肽的盒。

實施例4：具有不同聚陽離子肽的別的經修飾的內溶素phiKZgp144變體

為了測試並比較phiKZgp144和其他內溶素的聚陽離子肽變體的潛力，合成編碼基因，其在蛋白質的N端末端具有不同聚陽離子肽。肽變異關注長度、組成和接頭序列的插入。在一方面，生成具有N端多個KRK基序的別的聚陽離子肽。另一方面，生成僅由精氨酸(R)或賴氨酸(K)組成的聚陽離子肽。此外，為了增強長的聚陽離子肽的翻譯，生成包含接頭序列的聚陽離子肽。

將不同產物在pET32b表達載體(Novagen,Darmstadt,德國)中克隆。使用pET32b來降低聚陽離子肽對大腸桿菌宿主的潛在毒性。載體編碼的融合蛋白(硫氧還蛋白)掩飾聚陽離子肽，並且可以在純化方法過程中消除。因而，在大腸桿菌BL21(DE3)細胞中於37℃表達下列經修飾的內溶素變體，直至達到光密度OD600nm=0.6。然後，用1mM IPTG(終濃度)誘導蛋白質表達，並將表達實施4小時。然後，通過以6000g離心20分鐘來收穫大腸桿菌細胞，並依照S標籤純化試劑盒(Novagen,Darmstadt,德國)來實施細胞破壞和蛋白質純化：

使用S-Tag^TM rEK純化試劑盒(Novagen,Darmstadt,德國)來純化所有蛋白質。使用pET32b載體，表達的蛋白質對於宿主而言是無毒性的，導致所生成蛋白質的高產率。純化的儲備溶液顯示高純度。

將指數期(約10⁶/ml)銅綠假單胞菌PAO1p細胞(燒傷創面隔離群，Queen Astrid醫院,Brussels;Pirnay JP等(2003),J Clin Microbiol.,41(3):1192-1202)稀釋100 x(終密度是約10⁶/ml)，並於室溫與緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；0.5M咪唑)中終濃度100μg/ml的各10μg如上文所列的未透析的蛋白質一起溫育。1小時後，將細胞懸浮液稀釋1:100，並在LB上鋪板。另外，使用緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；0.5M咪唑)來將陰性對照鋪板。在於37℃過夜溫育後對殘留的菌落計數。基於計數的細胞數目，計算抗細菌活性，其為相對滅活(%)(=100-(N_i/N_o)*100，其中N₀=未處理的細胞數目，且N_i=經處理的細胞數目)(表7)。所有樣品至少重複四次。

與陰性對照相比，未修飾的phiKZgp144沒有顯著降低細胞數目。除此之外，帶有N端的多個KRK基序的聚陽離子肽的經修飾的phiKZgp144變體極大地增強抗微生物效果。然而，與未修飾的phiKZgp144相比，具有賴氨酸或精氨酸的同聚體肽的變體也顯示細胞的顯著減少，如測量的。此外，具有38個氨基酸殘基的聚陽離子肽且包含接頭序列的變體也極大地增強抗微生物效果。

實施例5：鼠傷寒沙門氏菌噬菌體PSP3的經修飾的內溶素變體

依照SEQ ID NO: 8的PSP3gp10是一種源自鼠傷寒沙門氏菌噬菌體PSP3的具有165個氨基酸殘基的球狀內溶素，其具有催化性λ樣胞壁質酶域。如通過BLASTp和Pfam分析所預測的，PSP3gp10內溶素包含範圍為約氨基酸殘基34至約氨基酸殘基152的其催化域。

使用下列PCR參數，在熱啟動Taq聚合酶PCR反應(Qiagen,德國)中使用噬菌體PSP3的純化的基因組DNA作為範本來擴增PSP3gp10的可讀框(ORF)：

對於所述PCR，使用標準的5’引物(5’ATGGGATCCCCGGTCATTAATAC TCACCAG 3’(SEQ ID NO: 50))和標準的3’引物(5’TGCCATCACCCCGCCA GCCGTG 3’(SEQ ID NO: 51))。為了延伸編碼PSP3gp10的ORF的5’端，用編碼聚陽離子9聚物肽Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys(SEQ ID NO: 11)的基因片段延伸的5’引物(5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAA CGCAAACCGGTCATTAATACTCACCAG 3’(SEQ ID NO: 52))和依照SEQ ID NO: 51的標準的3’引物應用尾部PCR(用相同參數進行的熱啟動Taq聚合酶PCR)。通過遵循製造商的TA克隆方案來將初始的未修飾的PSP3gp10 PCR片段和PK延伸的片段兩者在pEXP5CT/TOPO表達載體(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中連接。

在於37℃用1mM IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導一段4小時的時間後在指數生長的大腸桿菌BL21(λDE3)pLysS細胞(Invitrogen)中實施依照SEQ ID NO: 8的PSP3gp10和依照SEQ ID NO: 53的PKPSP3gp10的重組表達。使用由pEXP5CT/表達載體編碼的C端6xHis標籤通過Ni²⁺親和層析(Akta FPLC,GE Healthcare)來純化這兩種蛋白質。在4個隨後的步驟中實施Ni²⁺親和層析，均於室溫進行：1.　以流速0.5ml/分鐘用10個柱體積的清洗緩衝液(60mM咪唑、0.5mM NaCl和20mM NaH₂PO₄-NaOH，pH 7.4)平衡Histrap HP 1ml柱(GE Healthcare)。2.　以流速0.5ml/分鐘將總體溶胞物(具有想要的內溶素)載入於Histrap HP 1ml柱上。3.　以流速1ml/分鐘用15個柱體積的清洗緩衝液洗柱。

4.　以流速0.5ml/分鐘用10個柱體積的洗脫緩衝液(500mM咪唑、5mM NaCl和20mM NaH₂PO₄-NaOH，pH 7.4)自該柱洗脫結合的內溶素。

表8中顯示了每升大腸桿菌表達培養物的這兩種純化的重組蛋白的總收率。通過以波長280nm用分光光度法測量純化的儲備溶液的蛋白質濃度和總體積來測定數值。分別由洗脫緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；500mM咪唑)中的PSP3gp10和PKPSP3gp10組成的純化的儲備溶液是至少90%純的，如在SDS-PAGE凝膠上視覺測定的。

為了測定依照SEQ ID NO: 53的PKPSP3gp10內溶素的抗革蘭氏陰性譜，對臨床銅綠假單胞菌菌株PAO1p和Br667、大腸桿菌WK6、和鼠傷寒沙門氏菌(參見表9)測試1.315μM PKPSP3gp10內溶素和0,5mM EDTA的組合。將指數生長的細菌細胞(OD_600nm為0.6)稀釋100倍至終密度約10⁶/ml每種菌株，將其於室溫在不搖動的情況中與各自不與和與0.5mM EDTA組合的未修飾的內溶素PSP2gp10(SEQ ID NO: 8)和經修飾的內溶素PKPSP3gp10(SEQ ID NO: 53)一起溫育30分鐘。對於溫育，將內溶素各自在緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；0.5M咪唑)中使用，並以終濃度1.315μM的內溶素進行溫育。作為對照，還將每種菌株與0.5mM EDTA(在與上文所概述相同的緩衝液中)但無內溶素一起溫育30分鐘。

溫育後，將細胞懸浮液稀釋三次(分別為10⁵-10⁴-10³個細胞/ml)，並將100μl每種稀釋物在LB培養基上鋪出。在於37℃過夜溫育後對殘留的菌落計數。基於計數的細胞數目，計算抗細菌活性，其為按對數單位計的相對滅活(=log₁₀N₀/N_i，其中N₀=未處理的細胞數目，且N_i=經處理的細胞數目)(表10)。

將所有樣品重複三次。呈現平均值+/-標準偏差。觀察到的最大降低取決於10個細胞/ml的檢測水準和初始細胞密度。對於PAO1p，EDTA與未修飾的PSP3gp10內溶素及其經修飾的變體PKPSP3gp10兩者協同起作用。

實施例6：大腸桿菌噬菌體P2的經修飾的內溶素變體

依照SEQ ID NO: 9的P2gp09是一種源自大腸桿菌噬菌體P2的165個氨基酸殘基的球狀內溶素，其具有催化性λ樣胞壁質酶域。如通過BLASTp和Pfam分析所預測的，P2gp09內溶素包含範圍為約氨基酸殘基34至約氨基酸殘基152的其催化域。

使用下列PCR參數，在用Pfu聚合酶(Fermentas)的標準PCR反應中使用噬菌體P2的純化的基因組DNA作為範本來擴增P2gp09的可讀框(ORF)：

對於所述PCR，使用標準的5’引物(5’ATGGGATCCCCGGTAATTAACACGCATC 3’(SEQ ID NO: 54))和標準的3’引物(5’AGCCGGTACGCCGCCAGCGGTACGC 3’(SEQ ID NO: 55))。為了用編碼聚陽離子9聚物肽Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys(SEQ ID NO: 11)的基因片段延伸編碼P2gp09的ORF的5’端，用延伸的5’引物(5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAACCGGTAATTAACACGCATC 3’(SEQ ID NO: 56)和依照SEQ ID NO: 55的標準的3’引物應用尾部PCR(與上文的標準PCR具有相同參數)。通過遵循製造商的TA克隆方案來將初始的未修飾的P2gp09 PCR片段和延伸的片段兩者在表達載體(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中連接。在於37℃用1mM IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導一段4小時的時間後在指數生長的大腸桿菌BL21(λ DE3)pLysS細胞(Invitrogen)中實施依照SEQ ID NO: 9的P2gp09和依照SEQ ID NO: 57的PKP2gp09的重組表達。使用由表達載體編碼的C端6xHis標籤通過Ni²⁺親和層析(Akta FPLC,GE Healthcare)來純化這兩種蛋白質。在4個隨後的步驟中實施Ni²⁺親和層析，均於室溫進行：1.　以流速0.5ml/分鐘用10個柱體積的清洗緩衝液(60mM咪唑、0.5mM NaCl和20mM NaH₂PO₄-NaOH，pH 7.4)平衡Histrap HP 1ml柱(GE Healthcare)。2.　以流速0.5ml/分鐘將總體溶胞物(具有想要的內溶素)載入於Histrap HP 1ml柱上。3.　以流速1ml/分鐘用15個柱體積的清洗緩衝液洗柱。4.　以流速0.5ml/分鐘用10個柱體積的洗脫緩衝液(500mM咪唑、5mM NaCl和20mM NaH₂PO₄-NaOH，pH 7.4)自該柱洗脫結合的內溶素。

表11中顯示了每升大腸桿菌表達培養物的這兩種純化的重組蛋白的總收率。通過以波長280nm用分光光度法測量純化的儲備溶液的蛋白質濃度和總體積來測定數值。分別由洗脫緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；500mM咪唑)中的P2gp09和PKP2gp09組成的純化的儲備溶液是至少95%純的，如在SDS-PAGE凝膠上視覺測定的。

為了測定依照SEQ ID NO: 57的PK2gp09內溶素的抗革蘭氏陰性譜，對臨床銅綠假單胞菌菌株PAO1p和Br667、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、惡臭假單胞菌G1和大腸桿菌WK6(參見表13)測試1.315μM PK2gp09內溶素和0,5mM EDTA的組合。將指數生長的細菌細胞(OD_600nm為0.6)稀釋100倍至終密度約10⁶/ml每種菌株，將其於室溫在不搖動的情況中與各自不與和與0.5mM EDTA組合的未修飾的內溶素P2gp09(SEQ ID NO: 9)和經修飾的內溶素PKP2gp09(SEQ ID NO: 57)一起溫育30分鐘。對於溫育，將內溶素各自在緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；0.5M咪唑)中使用，並以終濃度1.315μM的內溶素進行溫育。作為對照，還將每種菌株與0.5mM EDTA(在與上文所概述相同的緩衝液中)但無內溶素一起溫育30分鐘。溫育後，將細胞懸浮液稀釋三次(分別為10⁵-10⁴-10³個細胞/ml)，並將100μl每種稀釋物在LB培養基上鋪出。在於37℃過夜溫育後對殘留的菌落計數。基於計數的細胞數目，計算抗細菌活性，其為按對數單位計的相對滅活(=log₁₀N₀/N_i，其中N₀=未處理的細胞數目，且N_i=經處理的細胞數目，均在溫育後計數)(表12)。

將所有樣品重複三次。呈現平均值+/-標準偏差。觀察到的最大降低取決於10個細胞/ml的檢測水準和初始細胞密度。

實施例7：惡臭假單胞菌噬菌體OBP的經修飾的內溶素變體依照SEQ ID NO: 7的OBPgpLYS是一種源自惡臭假單胞菌噬菌體OBP的328個氨基酸殘基的模組內溶素，其具有推定的N端肽聚糖結合域和C端催化性幾丁質酶域。如通過BLASTp和Pfam分析所預測的，OBPgpLYS內溶素包含範圍為約氨基酸殘基126至約氨基酸殘基292的其催化域和範圍為約氨基酸殘基7至96的N端肽聚糖結合域。

使用下列PCR參數，在用Pfu聚合酶(Fermentas,Ontario,Canada)的標準PCR反應中使用噬菌體OBP的純化的基因組DNA作為範本來擴增OBPgpLYS的可讀框(ORF)：

因此，使用標準的5’引物(5’ATGAAAAATAGCGAGAAGAAT 3’(SEQ ID NO: 58))和標準的3’引物(5’ AACTATTCCGAGTGCTTTCTTTGT 3’(SEQ ID NO: 59))。為了用編碼聚陽離子9聚物肽Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys(SEQ ID NO: 11)的基因片段延伸編碼OBPgpLYS的ORF的5’端，用延伸的5’引物(5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAAAAATAGCGAGAAGAAT 3’(SEQ ID NO: 60))和依照SEQ ID NO: 59的標準的3’引物應用尾部PCR(與上文的標準PCR具有相同參數)。通過遵循製造商的TA克隆方案來將初始的未修飾的OBPgpLYS PCR片段和延伸的片段兩者在pEXP5CT/表達載體(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中連接。

在於37℃用1mM IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導一段4小時的時間後在指數生長的大腸桿菌BL21(λDE3)pLysS細胞(Invitrogen)中實施依照SEQ ID NO: 7的OBPgpLYS和依照SEQ ID NO: 61的PKOBPgpLYS的重組表達。使用由pEXP5CT/表達載體編碼的C端6xHis標籤通過Ni²⁺親和層析(Akta FPLC,GE Healthcare)來純化這兩種蛋白質。在4個隨後的步驟中實施Ni²⁺親和層析，均於室溫進行：1.　以流速0.5ml/分鐘用10個柱體積的清洗緩衝液(60mM咪唑、0.5mM NaCl和20mM NaH₂PO₄-NaOH，pH 7.4)平衡Histrap HP 1ml柱(GE Healthcare)。2.　以流速0.5ml/分鐘將總體溶胞物(具有想要的內溶素)載入於Histrap HP 1ml柱上。3.　以流速1ml/分鐘用15個柱體積的清洗緩衝液洗柱。4.　以流速0.5ml/分鐘用10個柱體積的洗脫緩衝液(500mM咪唑、5mM NaCl和20mM NaH₂PO₄-NaOH，pH 7.4)自該柱洗脫結合的內溶素。

表14中顯示了每升大腸桿菌表達培養物的這兩種純化的重組蛋白的總收率。通過以波長280nm用分光光度法測量純化的儲備溶液的蛋白質濃度和總體積來測定數值。分別由洗脫緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；500mM咪唑)中的OBPgpLYS和PKOBPgpLYS組成的純化的儲備溶液是至少90%純的，如在SDS-PAGE凝膠上視覺測定的。

為了測定依照SEQ ID NO: 61的PKOBPgpLYS內溶素的抗革蘭氏陰性譜，對臨床多抗性銅綠假單胞菌菌株Br667、惡臭假單胞菌G1(噬菌體OBP的宿主)和一系列其他革蘭氏陰性病原體(大腸桿菌WK6、鼠傷寒沙門氏菌LT2和類鼻疽伯克霍爾德氏菌)(參見表16)測試1.315μM PKOBPgpLYS內溶素和0.5mM EDTA的組合。將指數生長的細菌細胞(OD_600nm為0.6)稀釋100倍至終密度約10⁶/ml每種菌株，將其於室溫在不搖動的情況中與各自不與和與0.5mM EDTA組合的未修飾的內溶素OBPgpLYS(SEQ ID NO: 7)和經修飾的內溶素PKOBPgpLYS(SEQ ID NO: 61)一起溫育30分鐘。對於溫育，將內溶素各自在緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；0.5M咪唑)中使用，並以終濃度1.315μM的內溶素進行溫育。作為對照，還將每種菌株與0.5mM EDTA(在與上文所概述相同的緩衝液中)但無內溶素一起溫育30分鐘。溫育後，將細胞懸浮液稀釋三次(分別為10⁵-10⁴-10³個細胞/ml)，並將100μl每種稀釋物在LB培養基上鋪出。在於37℃過夜溫育後對殘留的菌落計數。基於計數的細胞數目，計算抗細菌活性，其為按對數單位計的相對滅活(=log₁₀N₀/N_i，其中N₀=未處理的細胞數目，且N_i=經處理的細胞數目，均在溫育後計數)(表15)。將所有樣品重複三次。呈現平均值+/-標準偏差。觀察到的最大降低取決於10個細胞/ml的檢測水準和初始細胞密度。

雖然OBPgpLYS處理的整體功效是物種依賴性的，但是表16中的結果顯示在沒有和存在0,5mM EDTA的這兩種情況中，對於所測試的所有細菌物種，與未修飾的OBPgpLYS相比PKOBPgpLYS的添加效應。對於假單胞菌和伯克霍爾德氏菌物種，對PKOBPgpLYS活性觀察到與EDTA的明顯的協同效應。

實施例8：不同EDTA濃度對OBPgpLYS和PKOBPgpLYS的抗細菌活性的影響為了測定EDTA對未修飾的和經修飾的內溶素的抗細菌活性的影響，使用不同濃度的EDTA和內溶素對銅綠假單胞菌PAO1p細胞(Pirnay JP等J Clin Microbiol.,41(3):1192-1202(2003))測試未修飾的OBPgpLYS內溶素(SEQ ID NO: 7)和PKOBPgpLYS內溶素(SEQ ID NO: 61)的抗細菌活性。將指數生長的細菌細胞(OD_600nm為0.6)稀釋100倍至終密度約10⁶/ml，並將其於室溫在不搖動的情況中與未修飾的內溶素OBPgpLYS(SEQ ID NO: 7)和經修飾的內溶素PKOBPgpLYS(SEQ ID NO: 61)一起溫育30分鐘。對於溫育，以終濃度0.013μM、0.131μM和1.315μM的內溶素將內溶素各自在緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4：0.5M NaCl：0.5M咪唑)中使用。由此，使用下列不同EDTA濃度：0mM、0.05mM、0.5mM和10mM。作為對照，還將一份樣品在無內溶素的情況中溫育30分鐘，取而代之的是添加緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；0.5M咪唑)。溫育後，將細胞懸浮液稀釋三次(分別為10⁵-10⁴-10³個細胞/ml)，並將100μl每種稀釋物在LB培養基上鋪出。在於37℃過夜溫育後對殘留的菌落計數。基於計數的細胞數目，計算抗細菌活性，其為按對數單位計的相對滅活(=log₁₀N₀/N_i，其中N₀=未處理的細胞數目，且N_i=經處理的細胞數目，均在溫育後計數)(表17)。將所有樣品重複三次。呈現平均值+/-標準偏差。觀察到的最大降低(5.69個對數單位)取決於10個細胞/ml的檢測水準和初始細胞密度。“Δ”給出各OBPgpLYS和PKOBPgpLYS樣品之間的活性差異。

如表17中所顯示的，與陰性對照相比，未修飾的內溶素OBPgpLYS以超過2.5個對數單位(對於1.315μM)和以+/-1個對數單位(對於0.013μM)顯著降低細胞數目。經修飾的內溶素PKOBPgpLYS導致指數生長的PAO1p細胞降低額外的0.5個對數單位。通過組合PKOBPgpLYS與0.5和10mM EDTA濃度的外膜透化劑(permeabilizer)EDTA-Na₂能將觀察到的抗細菌效果提高至超過5.69個對數單位降低(在檢測水準下)。通過提高所添加的內溶素的量(0.013-1.315μM內溶素)，未修飾的OBPgpLYS和PK修飾的OBPgpLYS之間的活性差異增加。

實施例9：經修飾的phiKZgp144變體對不同革蘭氏陰性細菌的抗細菌活性為了測試並比較phiKZgp144和其他內溶素的聚陽離子肽變體的潛力，合成編碼基因，其在蛋白質的N端末端具有聚陽離子肽。

將不同產物在pET32b表達載體(Novagen,Darmstadt,德國)中克隆。使用pET32b來降低聚陽離子肽對大腸桿菌宿主的潛在毒性。載體編碼的融合蛋白(硫氧還蛋白)掩飾聚陽離子肽，並且可以在純化方法過程中消除。將編碼smi01(YP_001712536)和KRK9_smi01(SEQ ID NO: 75)的基因完全合成(Entelechon,Regensburg,德國)，並克隆入pET32b中。

因而，在大腸桿菌BL21(DE3)細胞中於37℃表達下列經修飾的內溶素變體，直至達到光密度OD600nm=0.6：smi01(YP_001712536)、KRK9_smi01(SEQ ID NO: 75)、phiKZgp144(SEQ ID NO: 1)、pKKZ144pET32b(SEQ ID NO: 43)和POLYKZ144(SEQ ID NO: 35)。用1mM IPTG(終濃度)誘導蛋白質表達，並將表達實施4小時。然後，通過以6000g離心20分鐘來收穫大腸桿菌細胞，並使用S-Tag^TM rEK純化試劑盒(Novagen,Darmstadt,德國)來實施細胞破壞和蛋白質純化。使用pET32b載體，所表達的蛋白質對於宿主是無毒性的，這導致所生成蛋白質的高產率。純化的儲備溶液顯示高純度。

為了測試並作為比較的參照，如實施例1中所描述的那樣合成並純化phiKZgp144和POLYgp144。將銅綠假單胞菌PAO1p(燒傷創面隔離群，Queen Astrid醫院，Brussels;Pirnay JP等(2003),J Clin Microbiol.,41(3):1192-1202)、鮑氏不動桿菌(DSMZ 30007)或茄伯克霍爾德氏菌(由C. Michiels教授提供的隔離群)的指數(約10⁶/ml)生長細胞稀釋100 x(終密度是約10⁶/ml)，將其於室溫與緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.40.5M NaCl；0.5M咪唑)中終濃度100 μg/ml的各10μg未透析的如上文所列的蛋白質一起溫育。1小時後，將細胞懸浮液稀釋1:100，並在LB上鋪板。另外，使用緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；0.5M咪唑)對陰性對照鋪板。在於37℃過夜溫育後對殘留的菌落計數。基於計數的細胞數目，計算抗細菌活性，其為相對滅活(%)(=100-(N_i/N₀)*100，其中N₀=未處理的細胞數目，且N_i=經處理的細胞數目(表18)。將所有樣品重複四次。

與陰性對照相比，未修飾的內溶素phiKZgp144和smi01(YP_001712536)沒有顯著降低細胞數目。此觀察結果再次例示外膜作為內溶素降解革蘭氏陰性細菌細胞壁的屏障的功效。比較而言，如表18中所顯示的，與經修飾的內溶素KRK9_smi01、pKKZ144pET32b和POLY-gp144一起溫育對鮑氏不動桿菌(對於KRK_smi01為50%；對於pKKZ144pET32b為99.9%)、銅綠假單胞菌(對於pKKZ144pET32b為90-99.9%)和茄伯克霍爾德氏菌(對於POLYKZ144為90-99.9%)引起細菌細胞數目的顯著降低。這些實驗表明陽離子/聚陽離子融合方法對於其他內溶素的適用性。此外，實驗表明經修飾的內溶素對多種細菌有活性。

實施例10：銅綠假單胞菌生物膜的減少在本實驗中，針對銅綠假單胞菌菌株2572和2573的生物膜測試經修飾的內溶素變體SMAP29-KZ144和PK-OBP、內溶素OBP和KZ144和肽PK的抗微生物活性。使用結晶紫測定法來量化生物膜減少(Peeters等,J Microbiol Methods 72: 157-165(2008))。生物膜形成：將銅綠假單胞菌2572(患者隔離群)、銅綠假單胞菌2573的粘液樣菌株和非粘液樣大腸桿菌BL21(DE3)的過夜液體培養物稀釋至OD600=0.1。以100μl培養物/孔接種聚苯乙烯96孔板。于37℃溫育4小時後，棄去上清液，並使用100μl生理鹽水(PS)清洗粘附細胞。用100μl液體LB培養基填充接種的孔，並再溫育24小時時段。棄去上清液後，用100μl PS再清洗形成的生物膜。

生物膜處理：使用與2x LB(沒有NaCl)培養基一份對一份稀釋的50μg/孔PKKZ144或20u/孔海藻酸裂合酶或50μg/孔SMAP29-KZ144和KZ144或25μg/孔PK-OBP和OBP或1,25μg PK肽(均在具有500mM NaCl的緩衝液中)處理生物膜，並溫育12小時。完成未處理的系列作為陰性對照(一份蛋白質緩衝液對一份沒有NaCl的2x LB)。棄去上清液後，用100μl PS再次清洗形成的生物膜。

生物膜量化：將清洗過的生物膜用300μl甲醇(99%；15分鐘)固定，並風乾。使用100μl 0.3%結晶紫進行染色。20分鐘後，用自來水漂洗孔，並使用300μl 33%乙酸，其對生物膜的胞外基質溶出結合的結晶紫。20分鐘後，進行1:10稀釋，並測量吸收(590 nm)。

統計學分析顯示與經海藻酸裂合酶處理的或未處理的接種物相比，使用PKKZ144實現檢測出的生物膜的大量減少。使用PKKZ144，有可能將生物膜降低至非粘液樣大腸桿菌實驗室菌株的水準。

與內溶素OBP和KZ144相比，經修飾的內溶素變體SMAP29-KZ144和PK-OBP也顯示銅綠假單胞菌生物膜的大量減少。相反地，PK肽似乎增強銅綠假單胞菌生物膜的形成。實施例11：鮑氏不動桿菌生物膜的減少在本實驗中，針對鮑氏不動桿菌菌株DSMZ30007的生物膜測試經修飾的內溶素變體PK-OBP、內溶素OBP和肽PK的抗微生物活性。

使用結晶紫測定法來量化生物膜減少(Peeters等,J Microbiol Methods 72: 157-165(2008))。

如實施例10中所描述的那樣實施生物膜形成、處理和量化。與內溶素OBP相比，經修飾的內溶素變體PK-OBP顯示鮑氏不動桿菌生物膜的大量減少。相反地，PK肽似乎增強鮑氏不動桿菌生物膜的形成。實施例12：金黃色葡萄球菌生物膜的減少在本實驗中，針對金黃色葡萄球菌菌株KS13的生物膜測試融合蛋白Ply2638-PK和PK-溶葡萄球菌素、酶溶葡萄球菌素和Ply2638及肽PK的抗微生物活性。使用結晶紫測定法來量化生物膜減少(Peeters等，J Microbiol Methods 72:157-165(2008))。如實施例10中所描述的那樣實施生物膜形成、處理和量化。只是對於生物膜處理，使用25μg/孔Ply2638A-PK和Ply2638A或18μg/孔PK-溶葡萄球菌素和溶葡萄球菌素或1，25μgPK肽。與酶溶葡萄球菌素和Ply2638相比，融合蛋白PK-溶葡萄球菌素和PK-Ply2638顯示金黃色葡萄球菌生物膜的大量減少。相反地，PK肽似乎增強金黃色葡萄球菌生物膜的形成。

實施例13：單核細胞增生利斯特氏菌生物膜的減少在本實驗中，針對單核細胞增生利斯特氏菌菌株ScottA的生物膜測試經修飾的內溶素變體五肽-Ply511的抗微生物活性。

使用結晶紫測定法來量化生物膜減少(Peeters等，JMicrobiol Methods 72: 157-165(2008))。如實施例10中所描述的那樣實施生物膜形成、處理和量化。只是對於生物膜處理，使用25μg/孔五肽-Ply511。經修飾的內溶素變體PK-Ply511顯示單核細胞增生利斯特氏菌生物膜的大量減少。

<110>　利山鐸控股公司

<120>　減少生物膜的方法

<130>　LYS-006 PCT

<140>　未知

<141>　2010-04-27

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<170>　PatentIn version 3.3

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<223>　phiKZgp144

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<212>　PRT

<213>　未知

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<223>　ELgp188

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<212>　PRT

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<220>

<223>　沙門氏菌屬內溶素

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<223>　溶葡萄球菌素

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<213>　未知

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<223>　N4-gp61截短

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<213>　未知

<220>

<223>　Parasin 1

<400>　111

<210>　112

<211>　39

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Buforin I

<400>　112

<210>　113

<211>　34

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Dermaseptin 1

<400>　113

<210>　114

<211>　12

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Bactenecin 1

<400>　114

<210>　115

<211>　21

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Thanatin

<400>　115

<210>　116

<211>　19

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Brevinin 1T

<400>　116

<210>　117

<211>　26

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Ranateurin 1

<400>　117

<210>　118

<211>　46

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Esculentin 1

<400>　118

<210>　119

<211>　17

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Tachyplesin

<400>　119

<210>　120

<211>　25

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Androctonin

<400>　120

<210>　121

<211>　30

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　α-防衛素

<400>　121

<210>　122

<211>　38

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　β-防衛素

<400>　122

<210>　123

<211>　18

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　θ-防衛素

<400>　123

<210>　124

<211>　40

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　防衛素(sapecin A)

<400>　124

<210>　125

<211>　46

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　硫素(crambin)

<400>　125

<210>　126

<211>　50

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　來自蘿蔔的防衛素

<400>　126

<210>　127

<211>　44

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Drosomycin

<400>　127

<210>　128

<211>　25

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Hepcidin

<400>　128

<210>　129

<211>　44

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Bac 5

<400>　129

<210>　130

<211>　39

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　PR-39

<400>　130

<210>　131

<211>　20

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Pyrrhocoricin

<400>　131

<210>　132

<211>　24

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Histatin 5

<400>　132

<210>　133

<211>　34

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　sushi 1

<400>　133

<210>　134

<211>　18

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Walmagh 1

<400>　134

<210>　135

<211>　5

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　五肽

<400>　135

<210>　136

<211>　13

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　T4-溶菌酶的α4-螺旋

<400>　136

<210>　137

<211>　27

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　WLBU2-變體

<400>　137

<210>　138

<211>　25

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Walmagh2

<400>　138

<210>　139

<211>　291

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　SMAP29-KZ144

<400>　139

<210>　140

<211>　500

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　Ply2638-PK

<400>　140

<210>　141

<211>　348

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　五肽-Ply 511

<400>　141

<210>　142

<211>　264

<212>　PRT

<213>　未知

<220>

<223>　PK-溶葡萄球菌素

<400>　142

圖1是顯示用於重組生成(POLY)ⁿ-gp144((POLY)ⁿ-KZ144)的質粒構建的示意性概述。先前，通過尾部PCR(在5’尾部引物中具有BamHI限制性位點和第一聚陽離子盒)來構建pEXP5CT/POLY-gp144(pEXP5CT/POLY-KZ144)。將質粒用BamHI線性化，脫磷酸化，並與含有懸突的BamHI末端的盒連接。此盒源自兩個互補寡核苷酸的雜交，並且編碼9個帶正電荷的殘基。與絲氨酸一起在第一和第二盒之間的接合位點處創建一個額外的正電精氨酸殘基。通過重複的迴圈類似地構建更長的pEXP5CT/(POLY)ⁿ-gp144(pEXP5CT/(POLY)ⁿ-KZ144)變體。

圖2顯示了巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達並分泌POLY-gp144。將30μl量的巴斯德畢赤酵母X33表達培養物[1天(正方形)、3天(三角形)和4天(圓形)後]的上清液添加至270μl經氯仿透化的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)PAO1p細胞。緩衝條件是POLY-gp144的最佳酶條件(KH₂PO₄/K₂HPO₄)I=120mM pH 6.2)。隨後，用分光光度法記錄光密度。光密度的降低指明巴斯德畢赤酵母分泌胞壁質水解酶。作為陰性對照，包括沒有表達質粒的巴斯德畢赤酵母X33(菱形)。

圖3以圖示顯示了未修飾的phiKZgp144和ELgp188內溶素、經修飾的含有包含9個帶正電荷的氨基酸殘基的肽的內溶素變體POLY-gp144和POLY-gp188及經修飾的含有包含18個帶正電荷的氨基酸殘基的肽的變體(POLY)²-gp144和(POLY)²-gp188對銅綠假單胞菌PAO1p細胞的抗細菌活性。誤差棒給予均值的標準偏差。

圖4顯示了經考馬斯染色的SDS-PAGE的照片，其顯示了未修飾的內溶素PSP3gp10及其經修飾的內溶素變體PKPSP3gp10的表達和純化的結果。道LMW屬於大小標誌物(LMW梯)。後三道屬於Ni²⁺親和層析後在洗脫緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；500mM咪唑)中的純化的蛋白質的蛋白質級分。道FT屬於流過物，而道W屬於廢物級分。在純化的蛋白質級分中僅可見少量的次要條帶，指明重組蛋白的高純度(大於90%)。

圖5A至D以圖示顯示了不同組合物中的未修飾的PSP3gp10和經修飾的PKPSP3gp10在於室溫且在不搖動的情況中溫育後對數種指數生長革蘭氏陰性細菌的抗細菌活性。將革蘭氏陰性細菌的每個物種與包含0.5mM EDTA但無內溶素的組合物、包含1.315μM未修飾的PSP3gp10但無EDTA的組合物、包含1.315μM經修飾的PKPSP3gp10但無EDTA的組合物、包含1.315μM未修飾的PSP3gp10和0.5mM EDTA的組合物和包含1.315μM經修飾的PKPSP3gp10和0.5mM EDTA的組合物一起溫育30分鐘。在圖5A中，呈現對銅綠假單胞菌PAO1p細胞的抗細菌活性，在圖5B中，呈現對銅綠假單胞菌Br667細胞的抗細菌活性，在圖5C中，呈現對大腸桿菌WK6細胞的抗細菌活性，而在圖5D中，呈現對鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)細胞的抗細菌活性。“Δ”給出各PSP3gp10和PKPSP3gp10樣品之間的活性差異。誤差棒給予均值的標準偏差。

圖6顯示了經考馬斯染色的SDS-PAGE的照片，其顯示了未修飾的內溶素P2gp09及其經修飾的內溶素變體PKP2gp09的表達和純化的結果。道LMW屬於大小標誌物(LMW梯)。後三道屬於Ni²⁺親和層析後在洗脫緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；500mM咪唑)中的純化的蛋白質的蛋白質級分。道FT屬於流過物，而道W屬於廢物級分。在純化的蛋白質級分中僅可見少量的次要條帶，指明重組蛋白的高純度(大於95%)。

圖7A至F以圖示顯示了不同組合物中的未修飾的P2gp09和經修飾的PKP2gp09在於室溫且在不搖動的情況中溫育後對數種指數生長革蘭氏陰性細菌的抗細菌活性。將革蘭氏陰性細菌的每個物種與包含0.5mM EDTA但無內溶素的組合物、包含1.315μM未修飾的P2gp09但無EDTA的組合物、包含1.315μM經修飾的PKP2gp09但無EDTA的組合物、包含1.315μM未修飾的P2gp09和0.5mM EDTA的組合物和包含1.315μM經修飾的PKP2gp09和0.5mM EDTA的組合物一起溫育30分鐘。在圖7A中，呈現對銅綠假單胞菌PAO1p細胞的抗細菌活性，在圖7B中，呈現對銅綠假單胞菌Br667細胞的抗細菌活性，在圖7C中，呈現對大腸桿菌WK6細胞的抗細菌活性，在圖7D中，呈現對類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomallei)細胞的抗細菌活性，在圖7E中，呈現對惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)G1細胞的抗細菌活性，而在圖7F中，呈現對鼠傷寒沙門氏菌LT2(SGSC N° 2317)細胞的抗細菌活性。“Δ”給出各P2gp09和PKP2gp09樣品之間的活性差異。誤差棒給予均值的標準偏差。

圖8顯示了經考馬斯染色的SDS-PAGE的照片，其顯示了未修飾的內溶素OBPgpLYS及其經修飾的內溶素變體PKOBPgpLYS的表達和純化的結果。道LMW屬於大小標誌物(LMW梯)。後三道屬於Ni²⁺親和層析後在洗脫緩衝液(20mM NaH₂PO₄-NaOH pH7.4；0.5M NaCl；500mM咪唑)中的純化的蛋白質的蛋白質級分。道FT屬於流過物，而道W屬於廢物級分。在純化的蛋白質級分中僅可見少量的次要條帶，指明重組蛋白的高純度(大於90%)。

圖9A至F以圖示顯示了未修飾的OBPgpLYS和經修飾的PKOBPgpLYS的不同組合物在於室溫且在不搖動的情況中溫育後對數種指數生長革蘭氏陰性細菌的抗細菌活性。將革蘭氏陰性細菌的每個物種與包含0.5mM EDTA但無內溶素的組合物、包含1.315μM未修飾的OBPgpLYS但無EDTA的組合物、包含1.315μM經修飾的PKOBPgpLYS但無EDTA的組合物、包含1.315μM未修飾的OBPgpLYS和0.5mM EDTA的組合物和包含1.315μM經修飾的PKOBPgpLYS和0.5mM EDTA的組合物一起溫育30分鐘。在圖9A中，呈現對大腸桿菌WK 6細胞的抗細菌活性，在圖9B中，呈現對鼠傷寒沙門氏菌LT2(SGSC N° 2317)細胞的抗細菌活性，在圖9C中，呈現對銅綠假單胞菌PAO1p細胞的抗細菌活性，在圖9D中，呈現對銅綠假單胞菌Br667細胞的抗細菌活性，在圖9E中，呈現對惡臭假單胞菌G1細胞的抗細菌活性，而在圖9F中，呈現對類鼻疽伯克霍爾德氏菌細胞的抗細菌活性。“Δ”給出各OBPgpLYS和PKOBPgpLYS樣品之間的活性差異。誤差棒給予均值的標準偏差。

圖10 A和B以圖示顯示了PolyKZ144(Art-014)對銅綠假單胞菌2573的粘液樣生長臨床隔離群(來源Uniklinikum Regensburg,nicht nher definiert)的生物膜減少活性。將銅綠假單胞菌2573於37℃在聚苯乙烯微量滴定板中培養至少24小時以容許生物膜形成。為了顯現生物膜含量，實施結晶紫染色。在圖10 A中，然後將生物膜與海藻酸裂合酶(10u/ml)或PolyKZ144(50μg/ml)一起溫育。將這兩種酶的效果與作為對照的未處理的生物膜或被清洗並在LB培養基中再溫育的生物膜比較。在圖10 B中，將PolyKZ144的效果與作為對照的未處理的生物膜或被清洗並在LB培養基中再溫育的生物膜和用於指明非特異性背景染色的非粘液樣生長大腸桿菌實驗室菌株比較。

圖11A至G以圖示顯示了數種融合蛋白對不同革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌菌株的生物膜減少活性。將金黃色葡萄球菌KS13(A和B)、單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ScOtt A(C)、鮑氏不動桿菌DSMZ30007(D)、銅綠假單胞菌2572(E、F)和銅綠假單胞菌2573(G)於37℃在聚苯乙烯微量滴定板中培養至少24小時以容許生物膜形成。為了顯現生物膜含量，實施結晶紫染色。在圖11A中，然後將生物膜與PK肽(1.25μg/孔)或內溶素Ply2638(25μg/孔)或融合蛋白Ply2638-PK(25μg/孔)一起溫育。將所述肽、內溶素和融合蛋白的效果與以LB標示的未處理(一份蛋白質緩衝液與一份沒有NaCl的2x LB)的生物膜比較。在圖11B中，然後將生物膜與細菌素溶葡萄球菌素(18μg/孔)或細菌素變體PK-溶葡萄球菌素(18μg/孔)一起溫育。將細菌素和細菌素變體的效果與以LB標示的未處理(一份蛋白質緩衝液與一份沒有NaCl的2x LB)的生物膜比較。在圖11C中，然後將生物膜與經修飾的內溶素變體五肽-Ply511(25μg/孔)一起溫育。將經修飾的內溶素變體的效果與以LB標示的未處理(一份蛋白質緩衝液與一份沒有NaCl的2x LB)的生物膜比較。在圖11D和E中，然後將生物膜與PK-肽(1.25μg/孔)或內溶素OBP(25μg/孔)或經修飾的內溶素變體PK-OBP(25μg/孔)一起溫育。將所述肽、內溶素和經修飾的內溶素變體的效果與以LB標示的未處理(一份蛋白質緩衝液與一份沒有NaCl的2x LB)的生物膜比較。在圖11F和G中，然後將生物膜與內溶素KZ144(50μg/孔)或經修飾的內溶素變體SMAP29-KZ144(50μg/孔)一起溫育。將所述肽、內溶素和經修飾的內溶素變體的效果與以LB標示的未處理(一份蛋白質緩衝液與一份沒有NaCl的2x LB)的生物膜比較。

Claims

一種消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，包括a)提供包含與具有膜或LPS破壞活性的肽融合的內溶素的融合蛋白；及b)使材料、液體、表面或生物學材料與所述融合蛋白接觸，其中所述方法不是用于治療人體或動物體的疾病的目的，其中與所述內溶素融合的所述肽是合成的陽離子的、合成的聚陽離子的、合成的疏水性的、合成的雙親性的或天然存在的抗微生物的肽，且其中所述抗微生物的肽展現出依照SEQ ID NO：93至133中任一項的氨基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中所述與所述內溶素融合的肽是具有6至39個氨基酸殘基的長度的合成的或天然存在的肽。
如申請專利範圍第1或2項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中所述肽與所述內溶素的N和/或C端融合。
如申請專利範圍第3項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中所述肽與所述內溶素的N端融合。
如申請專利範圍第1或2項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中所述內溶素具有降解革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌的細胞壁的活性。
如申請專利範圍第5項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中所述內溶素具有降解選自下組的革蘭氏陰性細菌的細胞壁的活性：腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、檸檬酸杆菌屬(Citrobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、摩根氏菌屬(Morganella)、變形菌屬(Proteus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、耶爾森氏菌屬(Yersinia))、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)(假單胞菌屬(Pseudomonas)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas))、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、布魯氏菌屬(Brucella)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、博多特氏菌屬(Bordetella)、軍團菌屬(Legionella)、巴爾通氏體屬(Bartonella)、考克斯氏體屬(Coxiella)、嗜血菌屬(Haemophilus)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、曼海姆氏菌屬(Mannheimia)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、加德納氏菌屬(Gardnerella)、螺旋體科(Spirochaetaceae)(密螺旋體屬(Treponema)和疏螺旋體屬(Borrelia))、鈎端螺旋體科(Leptospiraceae)、彎曲杆菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、螺菌屬(Spirillum)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)(擬桿菌屬(Bacteroides)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas))、不動桿菌屬(Acinetobacter)，且其中所述革蘭氏陽性細菌選自下組：單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、變异鏈球菌(Streptococcus mutans)、馬鏈球菌(Streptococcus equi)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)、瘡疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)、結核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphteriae)、肺炎枝原體(Mycoplasma pneumoniae)、放線菌屬(Actinomyces)。
如申請專利範圍第6項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中所述內溶素具有降解選自下組的革蘭氏陰性細菌的細胞壁的活性：大腸杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、和鮑氏不動杆菌(A.baumannii)。
如申請專利範圍第1或2項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中所述內溶素選自下列所構成的群組：如SEQ ID NO：1的phiKZgp144、如SEQ ID NO：2的ELgp188、如SEQ ID NO：3的沙門氏菌屬內溶素、如SEQ ID NO：4的腸細菌噬菌體T4內溶素、如SEQ ID NO：5的鮑氏不動桿菌內溶素、如SEQ ID NO：6的大腸桿菌噬菌體K1F內溶素、如SEQ ID NO：7的OBPgpLys、如SEQ ID NO：8的PSP3沙門氏菌屬內溶素、如SEQ ID NO：9的大腸桿菌噬菌體P2內溶素、如SEQ ID NO：85的Ply511、如SEQ ID NO：92的Ply2638。
如申請專利範圍第1或2項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中所述陽離子/聚陽離子肽展現出如SEQ ID NO：10至30和32至34的氨基酸序列，或其中所述疏水性肽展現出如SEQ ID NO：134和135的氨基酸序列；或其中所述雙親性肽展現出如SEQ ID NO：136至138的氨基酸序列。
如申請專利範圍第1或2項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中所述內溶素變體包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID NO：35至49、53、57、62至64、66至78和139至142。
如申請專利範圍第1或2項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中與所述融合蛋白接觸的所述材料是石塊、岩石、土壤、沉積物、食物、飼料或化妝品。
如申請專利範圍第1或2項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中與所述融合蛋白接觸的所述液體是水，溫泉、海、湖、河、任何種類的水性系統，隱形眼鏡、假牙、植入物、假體或支具的清潔和貯存溶液。
如申請專利範圍第12項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中與所述融合蛋白接觸的所述液體是飲用水、地下水或廢水。
如申請專利範圍第1或2項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中與所述融合蛋白接觸的所述液體是自活的生物體衍生的或獲得的任何物質。
如申請專利範圍第14項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中與所述融合蛋白接觸的所述液體是自植物和哺乳動物衍生的或獲得的任何物質。
如申請專利範圍第15項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中所述哺乳動物是人。
如申請專利範圍第1或2項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中與所述融合蛋白接觸的所述液體是醫學裝置、工業或飲用水系統管道和天然水生系統的表面。
如申請專利範圍第1或2項所述之消除、減少或阻止細菌生物膜的方法，其中與所述融合蛋白組合或在所述融合蛋白外，可以添加抗生素。
一種內溶素變體用于製造用于治療與細菌生物膜有關的革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌感染的藥物的用途，所述內溶素變體包含與具有膜或LPS破壞活性的肽融合的內溶素。
如申請專利範圍第19項所述之用途，其中與抗生素組合或在抗生素外使用所述內溶素變體。
一種內溶素變體用於除去、減少和/或阻止食品、食物加工設備、食物加工廠、與食品接觸的表面、醫學裝置、醫院和診所表面的與細菌生物膜有關的革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌污染的用途，所述內溶素變體包含與具有膜或LPS破壞活性的肽融合的內溶素。
一種內溶素變體作為在與細菌生物膜有關的醫學、食物或飼料或環境診斷的診斷手段、作為消毒劑或化妝用物質的用途，所述內溶素變體包含與具有膜或LPS破壞活性的肽融合的內溶素。
如申請專利範圍第21或22項所述之用途，其中與抗生素組合或在抗生素外使用所述內溶素變體。